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Clonación Manipulación de DNA Curso 2011-12

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Clonación

Manipulación de DNA

Curso 2011-12

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El problema básico

¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula?

Uniéndolo a un vector de clonacion

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Vector de clonacion

Fenotipo seleccionable

Dianas de restricción unicas

Multicopia

DNA de replicación autónoma

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Diana única

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Plásmidos recombinantes

Quimeras

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Pasos en la clonación

•Ligación

•Crecimiento en placas de agar en medio selectivo

•Restricción del vector y del inserto

•Transformación

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Fragmentación de DNA

Enzimas de restricción

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Werner Arber

Premio Nobel de Medicina en 1978

"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/
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Eje de simetría doble

dabalearrozalazorraelabad

DIANAS de restricción

Secuencias palindrómicas

ana anna

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Romos Protuberantes

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Probabilidad de corte

1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256

(1/4)6 = 1/4096

(1/4)8 = 1/65536

~ 12.5x106 fragmentos

~ 781250 fragmentos

~ 48828 fragmentos

Nº fragmentos en genoma humano

Enzimas de restricción

nomenclatura

4

4

8

6

6

1/4

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IsosquizómerosEnzimas de restricción que reconocen la misma sequencia

Pueden cortar en el mismo sitio

Como NdelI y MboI GATC

O no

NarI GG CGCC

BbeI GGCGC C

EheI GGC GCC

KasI G GCGCC

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Ligación de DNA

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5´3´

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Animaciones> manipulación de DNA> techniques> cutting & pasting

http://www.dnai.org/b/index.html
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Truco para favorecer laformación de recombinantes

Impedir la religación del vector

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Extremos cohesivos compatibles

¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?

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….NGAT ATCN…..

….NCTA TAGN…..

….NGAT….NCTA

ATCN…..TAGN…..

….NCTA….NGAT CCTN…..

GGAN…..

….NCTA….NGATCCTN…..

GGAN…..

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Animación > Manipulation >Revolution > Players

http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html

Premio Nobel de Química 1980

http://www.dnai.org/b/index.html
http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1980/
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Vectores de clonacion

Vectores plasmídicos

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Características de los vectores de clonación

•Pequeño tamaño

•Marcador genético de selección

•Sitios únicos de restricción

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ColE1

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•Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula

•Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)

Vectores mejorados

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MCS (Multi Cloning Site)

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(polylinker)

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MCS de pUC18

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MCS de pUC19

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•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

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pUCPlac O N-lacZ

pUCPlac O N-lacZ

IPTGXGal

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pUCPlac O N-lacZ

pUCPlac O N-lacZ

IPTGXGal

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Allolactosa

Isopropil D tiogalctósido IPTG

INDUCTORno hidrolizable

Inductor

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X-gal

Ensayo de -galactosidasa

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•MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

•Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.

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Colonias blancas Colonias azules

+ X-gal + X-gal

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+ IPTG

Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jhermoso/documents/vectoresplasmido.swf
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+ inserto

- inserto

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Vectores lanzadera

Shuttle

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