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Clasificación taxonómica de microalgas presentes en un consorcio microbiológico que biorremedia el efluente

de una planta de sacrificio de bovinos y porcinos

por

Stefany Ayala Montaño

Un trabajo de grado presentado en cumplimiento parcial para el título de

Microbióloga

Facultad de Ciencias

Departamento de Ciencias Biológicas

Noviembre 2015

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Declaración de autoría Yo, STEFANY AYALA MONTAÑO, declaro que este trabajo de grado titulado, ‘CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LAS MICROALGAS UTILIZADAS PARA BIORREMEDIAR UN EFLUENTE PROVENIENTE DE UNA PLANTA DE SACRIFICIO DE BOVINOS Y PORCINOS’ es de mi

autoría. Yo confirmo que:

El trabajo es original, es decir, de producción total intelectual propia.

Inédito, es decir, que no ha sido publicado ni aceptado en otra publicación.

Los datos y textos tomados de documentos publicados y no publicados de otros

autores están debidamente citados e indicados en la bibliografía al final del documento, de acuerdo con las normas APA.

Firma:

Fecha:

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“Si al franquear una montaña en la dirección de una estrella, el viajero se deja absorber

demasiado por los problemas de la escalada, se arriesga a olvidar cuál es la estrella que lo guía.”

ANTOINE DE SAINT-EXUPERY

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

Facultad de Ciencias

Departamento de Ciencias Biológicas

Título de Microbióloga por

Stefany Ayala Montaño

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Agradecimientos

A Dios y mis padres por ser la luz de mi camino. A mi esposo por ser mi mejor maestro y a mi hija por ser fuente de inspiración. . .

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Contenidos Resumen Introducción

2.1 Características de las microalgas

2.1.2 Clasificación filogenética de las microalgas

2.2 Características de las cianobacterias

2.3 Aplicaciones biotecnológicas de las microalgas

2.3.1 Producción de biocombustibles

2.3.2 Producción de suplementos vitamínicos y nutraceúticos

2.3.3 Producción de cosméticos

2.3.4 Producción de químicos y de alimentación para animales

2.3.5 Biorremediación de aguas contaminadas

2.4 Ficorremediación

2.4.1 Ficorremediación en laboratorio: medios de cultivo

2.5 Proceso de ficorremediación en Biotecnología y Bioingeniería Core S.A.

Objetivos

3.1 Objetivo general

3.2 Objetivos específicos

Metodología

4.1 Caracterización fisicoquímica del efluente

4.2 Recolección de muestras

4.3 Cultivo de las muestras recibidas

4.4 Identificación por clave taxonómica

4.5 Cálculo índice de Biodiversidad diatomeas (IBD) e índice de polusensibilidad específica (IPS)

Resultados

5.1 Identificación por clave taxonómica

5.1.2 Consorcio microalgal antes de la ficorremediación

5.1.3 Consorcio microalgal durante la ficorremediación

5.2 Parámetros fisicoquímicos

5.3 Índices fisicoquímicos calidad del agua (ICA)

5.4 Índices biológicos calidad del agua (IBD, IPS)

Discusión Conclusiones Bibliografía

Anexos

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Lista de claves taxonómicas (Género) Limnothrix

Gloeothece, Synechocystis, Synechococcus, Pseudoanabaena Chroococcus, Borzia, Arthrospira, Oscillatoria Phormidium, Microcoleus Desmodesmus, Scenedesmus, Chlorococcum

Oocystis, Chlorella , Asterococcus Coelastrum , Westella

Golenkinia, Raphidonema, Stichococcus, Microspora Micractinium, Glaucocystis Gloeococcus, Radiococcus Gloeomonas, Chloromonas, Chlamydomonas Dinematomonas Closterium Lutherella, Raphidiella Navicula, Gomphonema, Hantzschia Fragilaria, Nitzschia, Achanthidium Amphora, Synedra, Pinnularia

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Resumen

Las microalgas son microorganismos eucariotas unicelulares o multicelulares, autótrofos, heterótrofos o mixotróficos (Ruiz, 2013), que tienen la capacidad de usar químicos residuales y metales pesados como recurso energético; así como de tolerar compuestos altamente tóxicos provenientes de diversas fuentes como la industria textil, la cual genera el 15% de la contaminación del agua y el sector ganadero y agrícola, los cuales son responsables del 85% de la contaminación de los cuerpos acuáticos (Abdel-Roauf et al., 2012). La ficorremediación es una estrategia de biorremediación de contaminantes que hace uso de algas y microalgas para su remoción, disminución y/o biotransformación (Olguín, 2009). En este estudio se identificó por medio de la clave taxonómica Bicudo y Menezes, 2006, las microalgas presentes en el consorcio microalgal que ficorremedió el efluente de CAMAGUEY (planta de sacrificio de bovinos y porcinos en el municipio de Galapa Atlántico), en el contexto de una prueba piloto cuya duración fue de seis meses y que manejó un volumen de 17000 litros y un tiempo de retención hidráulico de 4 horas. Así mismo, fueron identificadas por medio de las claves taxonómicas Spaulding, Lubinski y Potapova, 2010; Wehr & Sheath, 2003, las diatomeas observadas durante la ficorremediación. Antes de la ficorremediación, fueron identificadas 30 microalgas: 18 a nivel de especie, 12 a nivel de género, de las cuales el 46.6% también fueron identificadas en el consorcio microalgal durante la ficorremediación: Microcoleus subtorulosus, Oscillatoria sp., Synechococcus sp., Chroococcus sp., Scenedesmus sp., Desmodesmus sp., Gloeococcus sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp., Chlorella sp., Scenedesmus acuminatus, Neospongiococcum irregulare, Chlorococcum humícola e Interfillum paradoxum. Durante la ficorrmediación fueron identificadas 13 especies de microalgas que no se encontraron presentes antes del proceso de biorremediación y 17 diatomeas penadas: Hantzschia amphyoxys, Fragilaria capucina, Tibetiella pulchra, Amphora, Fragilaria vaucheriae, Kobayasiella micropunctata, Achnanthidium minutissimum, Nitzschia communis, Navicula gregaria, Nitzschia dissipata, Tabularia fasciculata, Gomphonema parvulum, Nitzschia amphibia, Synedra famelica, Synedra acus, Pinnularia nodosa, muy importantes para el análisis biológico de la calidad del agua. Se analizaron los resultados encontrados con base en índices de calidad de agua: físicoquímicos (ICA) y biológicos (IBD, IPS). Con éstos se encontró que el efluente ingresó al tratamiento de ficorremediación con agua de calidad pobre y salió ficorremediado con agua de buena calidad; y que adicionalmente cumplió con la normativa establecida en la resolución 0631 del 2015. Lo anterior, nos indica que el proceso de ficorremediación del efluente proveniente de CAMAGUEY, tuvo excelentes resultados en la remoción de los contaminantes allí presentes gracias a los mecanismos biológicos de absorción y adsorción que tienen las microalgas y diatomeas presentes en el consorcio microalgal. Para futuros estudios se sugiere la implementación de técnicas moleculares que permitan confirmar la identificación realizada y complementar el estudio con análisis metagenómicos que permitirán tener una aproximación más exacta de este consorcio microbiológico.

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Introducción

2.1 Características de las microalgas

Las microalgas son microorganismos eucariotas unicelulares o multicelulares, autótrofos, heterótrofos o mixotróficos con presencia de flagelo o ausencia de éste durante alguna etapa de su ciclo de vida (Ruiz, 2013). Se caracterizan por suplir la demanda energética diaria mediante la recepción de energía lumínica en un régimen de fotoperiodos de luz y oscuridad. Durante la fase lumínica producen ATP y NADPH, en cambio en ausencia de luz sintetizan moléculas esenciales para el crecimiento (Al-Qasmi, Raut, Talebi, Al-Rajhi, & Al-Barwani, 2012). Su tamaño varía entre 1μm y 2 mm de diámetro y se encuentran ampliamente distribuidas en los diversos ecosistemas acuáticos (Gualtieri, 2001). Su diversidad es tan grande que se calculan la existencia de más de 100.000 especies, de las cuales 40.000 han sido identificadas (Castellanos, 2012).

Estos organismos conocidos como productores primarios son de gran importancia tanto en ambientes acuáticos como terrestres. En los ecosistemas acuáticos existen dos grandes grupos de algas: algas planctónicas que se encuentran flotando en el agua, y las algas bentónicas las cuales se sedimentan y se adhieren firmemente a rocas en ambientes de agua dulce y corales en ambientes marinos (Bellinger & Sigee, 2010). La cantidad de las microalgas en los diferentes ambientes acuáticos determina la cantidad de peces y crustáceos (principalmente) que se estarían alimentando de estos recursos energéticos. Por ende, una disminución en la diversidad y abundancia de estos organismos se encuentra directamente relacionado con un descenso en la población de organismos acuáticos vertebrados e invertebrados (Aquatic Biologist, 2015).

Factores ambientales como la calidad e intensidad de luz, pH, nutrientes disponibles y temperatura afectan la fotosíntesis, el metabolismo y por último la producción de biomasa (Ruiz, 2013). Al igual que las plantas, el aparato fotosintético de las microalgas se organiza en organelos especializados llamados cloroplastos. Éstos están compuestos por una fase acuosa, membranas lipoprotéicas (tilacoides) y pigmentos captadores de luz (Ruiz, 2013). Estos organismos poseen pigmentos fotosintéticos primarios como la clorofila a, otros pigmentos como los Beta-caroteno y fucoxantina (carotenoides), así como pigmentos accesorios: ficocianina y ficoeritrina (Martínez-Silva, 2010). De acuerdo a la presencia o ausencia de pigmentos, las microalgas pueden ser clasificadas en tres grandes grupos: aquellos que presentan clorofila a y b (algas verdes/Chlorophytes), clorofila a y ficobilinas (algas rojas/Rhodophytes), clorofila a y c (algas pardas-amarillas/Chromophytes), éstas últimas al ser un grupo polifilético se encuentra subdividido en cuatro taxones: Haptophytas, Dinoflagelados,

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Criptophytas y algas heterocontas o Xanthophytas (Ben Ali et al., 2001)

Tabla 1. Clasificación de las microalgas de acuerdo a la presencia de pigmentos. *También presenta ficobilinas como pigmentos accesorios

El transporte de electrones permite reducir a NAD(P)+ en NADP(H)+ a partir de la ferredoxina, permitiendo la formación de azúcares a partir de la asimilación de los nutrientes disponibles, y de esta forma la obtención de la energía (Ruiz, 2013). En la búsqueda de recursos energéticos lumínicos, el organelo conocido como estigma le permite a las microalgas poder detectar intensidades de luz (incluso si éstas son bajas), para poder generar fototáxis mediante la transmición de la información a las diferentes estructuras encargadas de la locomoción (Gualtieri, 2001). En fuentes de energía diferente a la lumínica, se conoce que las microalgas necesitan tres macronutrientes esenciales para llevar a cabo procesos celulares y metabólicos: Nitrógeno, Fósforo y Potasio; así como nutrientes en cantidades suficientes como el Oxígeno, Hidrógeno, Calcio, Azufre y Magnesio. Adicionalmente algunas de ellas requieren micronutrientes como Hierro, Manganeso, Cobre, Molibdeno y Cobalto que actúan como cofactores de enzimas involucradas en los diferentes procesos celulares (Martínez-Silva, 2010). 2.1.2 Clasificación filogenética de las microalgas Existen tres aproximaciones distintas de clasificar a las microalgas: métodos artificiales, naturales y filogenéticos. El primero de ellos hace referencia a un sistema de clasificación en el cual se escogen caracteres de forma arbitraria que permita establecer similitudes y diferencias entre los microorganismos (Bicudo & Menezes, 2006). En un sistema natural, se

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tienen en consideración toda la información disponible sobre cada una de las especies a clasificar, es decir: morfología, citología, tipos de pigmentos, naturaleza de los productos de reserva y pared celular, estructura de los flagelos, proceso de formación del núcleo, características del envoltorio del cloroplasto y técnicas moleculares (Martínez-Silva, 2010). Desde una aproximación filogenética, se tienen en cuenta los grados de ancestría y de descendencia de cada uno de los microorganismos a clasificar mediante la construcción de árboles filogenéticos con base en datos morfológicos, así como datos moleculares (Bicudo & Menezes, 2006). En 1995, Hoek, Mann y Jahns proponen la división de las microalgas de acuerdo al tipo de estructura en celular en dos grandes grupos. Microalgas con estructura celular procariota: Cyanophyta y Prochlorophyta y microalgas con estructura celular eucariota: Chlorophyta, Euglenophyta, Rhodophyta, Prymnesiophyta, Cryptophyta y Dinophyta, de acuerdo a la clasificación de (Martínez-Silva, 2010). En el año 2000, Graham and Wilcox usando la clasificación de Hoek, Mann y Jahns, proponen una nueva clasificación de las algas en 12 grandes grupos: Cianobacteria, algas rojas, algas verdes, Euglénidos, algas verdes-amarillas, Crisófitas, Haptófitas, Sinurófitas, Diatomeas, Dinoflagelados, Criptomónadas y algas pardas (Sheath & Wehr, 2003). A partir de ese año, diferentes clasificaciones se han propuesto con base en secuencias de ADN, sin embargo aun siguen inconclusas las relaciones filogenéticas existentes entre algunos clados (líneas punteadas, Figura 1) (Lewis & Mccourt, 2004)

Figura 1. Representación filogenética de las relaciones entre los mayores linajes de las algas

verdes con base en análisis de secuencias de ADN.

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2.2 Características de las cianobacterias

Son organismos procariotas cuya morfología es variable, existen desde formas unicelulares (cocos y bacilos) hasta organismos filamentosos. Tienen un papel fundamental en el ciclado de nutrientes y en el funcionamiento del ecosistema gracias a las estrechas relaciones de simbiosis que pueden establecer con organismos invertebrados, plantas, hongos y bacterias. Su origen data hace 3500 millones de años a comienzos del precámbrico en donde fueron los organismos responsables de la oxigenación del planeta (su contribución fue determinante a la formación de especies superiores) (Loza Calvo, 2011). Las cianobacterias poseen pigmentos fotosintéticos como la clorofila a, carotenoides y las ficobilinas (presentes solo en cianobacterias y algunas algas). Éstas últimas están compuestas por aloficocianinas o ficocianinas (responsables de concederles el color azul que las caracteriza). Son organismos fotosintéticos similares a las microalgas con los mismos requerimientos de macronutrientes para el funcionamiento de su sistema metabólico. La fuente principal de reserva de carbono de estos organismos es el glucógeno, el cual lo acumulan mediante el ciclo oxidativo de las pentosas fosfato en el que interviene la enzima Rubisco (esencial para la fijación de carbono inorgánico). La fijación de nitrógeno atmosférico lo realizan mediante la enzima nitrogenasa localizada en los heterocistos o incorporándolo a su metabolismo en forma de ion amonio. En adición, el fosfato pueden tomarlo tanto en su forma orgánica (mediante enzimas fosfatasas) como inorgánica a través del transporte molecular activo o pasivo (Loza Calvo, 2011). La mayoría de las cianobacterias presentan una vaina mucilaginosa en su membrana externa, la cual está constituida por polisacáridos y representa una ventaja evolutiva contra la desecación, además de favorecer la formación de agregados celulares. La adaptación a distintos hábitats se debe a la capacidad que tienen estos organismos de diferenciar sus células vegetativas en células altamente especializadas. Un ejemplo de ello es la formación de heterocistos en ausencia de ion amonio, este tipo de célula les permite fijar con alta eficiencia el nitrógeno atmosférico. De la misma forma, pueden dar lugar a la formación de acinetos cuando las condiciones ambientales son hostiles, estas estructuras de resistencia les permiten sobrevivir largos periodos hasta que las condiciones ambientales favorezcan su germinación. Así mismo la formación de hormogonios (estructuras móviles) contribuyen en la dispersión y reproducción de estos microorganismos (Loza Calvo, 2011). Análisis filogenéticos de las secuencias de ADN, revelan que las cianobacterias que tienen la facilidad de diferenciar sus células en heterocistos y acinetos, se encuentran agrupadas en un grupo monofilético (Figura 2A, IV-V) con un valor de bootstrap del 97% (Tomitani, Knoll, Cavanaugh, & Ohno, 2006).

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Figura 2. Relaciones filogenéticas de las cianobacterias a partir de 16S rRNA, secuencia gen cloroplastídico rbcl y

el gen regulador hetR. Los números romanos indican la subsección de la cyanobacteria. En negrilla se encuentran las secuencias obtenidas en el estudio. Construcción árbol NJ y MP con valores de bootstrap (solo los valores mayores

al 50% son mostrados) (Tomitani et al., 2006)

2.3 Aplicaciones biotecnológicas de las microalgas 2.3.1 Producción de biocombustibles Es por esto que la producción de biocombustibles surge como una alternativa que busca reemplazar el combustible fósil, haciendo uso de fuente primaria a las microalgas gracias a que estos microorganismos pueden llegar a generar un alto número de biomasa, consecuencia de la transformación de la energía solar en compuestos carbonados, la acumulación de lípidos y triacilgliceroles que pueden ser transformados en bioetanol, biometanol y biodiesel (Maity, et al., 2014). En la actualidad existen políticas públicas y privadas que apoyan su fabricación, se

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estima que por año se producen 35 millones de litros de biodiesel (Mata, Nio, Martins, & Caetano, 2010). 2.3.2 Producción de suplementos vitamínicos y nutraceúticos Además de las propiedades nutricionales que ofrecen los suplementos a base de microalgas, existen reportes en los cuales se documentan beneficios directos para el sistema inmune y de prevención en enfermedades cardiovasculares, así como patologías asociadas con cáncer. El uso de Chlorella, Dunaliella, Haematococcus, Aphanizonmenon y Spirulina presenta gran acogida en el mercado mundial debido a la presencia de compuestos como proteínas, grasas, carbohidratos, magnesio, beta-caroteno, tiamina, riboflavina, niacina, ácido pantotéico, piridoxina, ácido fólico, cobalamina, entre otros (Bishop & Zubeck, 2012). 2.3.3 Producción de cosméticos Las microalgas están siendo usadas para productos cosméticos debido a su alto contenido en lípidos, adicionalmente son microorganismos no patogénicos ideales para la producción de aceites y biomasa económica en la fabricación de polvos, copos, jabones, sueros de belleza, shampoo, cremas anti-envejecimiento, entre otros. Entre los microorganismos más destacados se encuentran Chlorella sp., Parachlorella sp., Neochloris sp., Bracteacoccus sp., Scenedesmus sp., Anabaenasp., Ankistrodesmus sp., Chlorococcum sp., Schizochytrium sp., Spirulina sp., Crypthecodinium sp., Cryptomonadas sp., Isochrysis sp., Rhodococcus sp., Nannochloropsis sp. (Oilgae, 2012). 2.3.4 Producción de químicos y de alimentación para animales La biomasa extraída de los cultivos masivos de microalgas pueden ser empleados como fertilizadores orgánicos. Las microalgas están siendo empleadas como materia prima para la creación de productos químicos como pigmentos y agentes colorants, así como resinas, compuestos isotópicos estables y polihidroxilos alcanolados (Oilgae, 2012). Sumado a esto también tienen gran importancia en producción de comida esencial para variadas especies marinas (ostras, caracoles, peces pequeños, camarones, rotíferos y zooplancton) y ganados bovinos (Benemann, 2013). 2.3.5 Biorremediación de aguas contaminadas El uso de microalgas permite la remoción de fósforo y nitratos presentes en cuerpos de agua contaminada a gran escala. El consumo de estos compuestos inorgánicos como fuente de energía, disminuyen la probabilidad de eutroficación del agua en los casos en los cuales la concentración de cianobacterias es elevada (Abdel-Roauf et al., 2012). No obstante el consorcio que forman las microalgas con las cianobacterias, permiten la remoción de nutrientes y metales pesados con alta eficiencia, así como la degradación de petróleo crudo y

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benzo[a]pireno. Microalgas reportadas en este tipo de consorcios y que son usadas en diversos estudios pertenecen a los géneros Chlorella sp., Scendesmus sp., Nannocloris sp., Fischerella sp., Phormidium sp., y Spirulina sp. (Ferrera-cerrato et al., 2006). Estos microorganismos usan también químicos residuales y metales pesados como recurso energético. Son capaces de tolerar compuestos altamente tóxicos de diversas fuentes como la industria textil, la cual genera el 15% de la contaminación del agua y el sector ganadero y agrícola los cuales son responsables del 85% de la contaminación de los cuerpos acuáticos. Sin las microalgas, el cambio de pH y el aumento en la demanda bioquímica de oxígeno (BOD) y demanda química de oxígeno (COD), serían los responsables de la reducción del más del 50% de las especies presentes en el agua (Abdel-Roauf et al., 2012). 2.4 Ficorremediación La ficorremediación es una estrategia de biorremediación de contaminantes provenientes de diversas fuentes (residuales, industriales, agrícolas, mineros, entre otros), mediante el uso de algas y microalgas que los biotransforman, remueven y disminuyen (Olguín, 2009). El desempeño de estos microorganismos da lugar a resultados superiores en comparación con los métodos tradicionales de remediación estándar: químicos y físicos (Suresh Kumar, Dahms, Won, Lee, & Shin, 2015). La ficorremediación surge como una alternativa sostenible para el sector público y privado, debido a su relación positiva costo-beneficio y a la variedad de aplicaciones con elevado valor commercial que presentan las microalgas (producción de biodiesel, fabricación de químicos y cosméticos, suplementos vitamínicos y nutracéuticos, entre otros) (Oilgae, 2012). En adición, bajo la adversidad de nuevos ambientes contaminados, las microalgas tienen la facilidad de adaptarse mediante la formación de consorcios con otros microorganismos, sin generación de productos peligrosos para el ambiente (Renuka, Sood, Prasanna, & Ahluwalia, 2015) Los procesos de ficorremediación a gran escala pueden llevarse a cabo en camas de agua o fotobiorreactores, éstos últimos permiten tener un control más preciso de los parámetros ambientales que conllevará al aumento de la eficiencia. En especial cuando las especies se inducen a la producción de pigmentos, enzimas, carbohidratos y lípidos de gran valor comercial. Estos cultivos se pueden realizar en agua marina o dulce, así como el cuerpos de agua no convencionales y de fuentes contaminadas (Martínez, 2010) 2.4.1 Ficorremediación en laboratorio: medios de cultivo Los medios de cultivo son sustancias alimenticias artificiales que permiten el crecimiento y mantenimiento de microorganismos (microalgas) en el laboratorio, por periodos cortos de tiempo. Su preparación constituye una etapa previa esencial al momento de identificar uno o varios microorganismos (Anguita, 2012)

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Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a su estado físico (sólido o líquido) y según su utilización: medios comunes, medios de enriquecimiento, medios selectivos, inhibidores, diferenciales, de identificación, multiplicación, conservación y medios de transporte. Igualmente la composición y el origen del medio son parámetros que permiten clasificar estas sustancias (Anguita, 2012) Los medios utilizados en el laboratorio para el crecimiento del consorcio microalgal son CHU10, BG11 y SWM3 (ver anexos). Estos según su composición se clasifican como medios sintéticos, en los cuales la composición química exacta es conocida. Según su utilización, el medio CHU10 y BG11 preparados en el laboratorio son medios nutritivos de multiplicación, a partir de los cuales se busca aumentar la celularidad con respecto a la muestra inicial (Anguita, 2012). El medio SWM3 es un medio enriquecido debido a que su preparación incluye la adición de vitaminas B1, B12 y Biotina, indispensables para el crecimiento de las diatomeas (Yamasaki, Shimasaki, Oshima, & Honjo, 2013) 2.5 Proceso de ficorremediación en Biotecnología y Bioingeniería Core S.A. El efluente que ingresa al tratamiento de biorremediación es un efluente que ha tenido un tratamiento preliminar básico por parte de la planta de sacrificios de bovinos y porcinos. Una vez este ingresa al proceso, el primer biorreactor es un reactor anaerobio de flujo ascendente (UASB), en donde no existe consorcio microalgal debido a la condición anaeróbica que impide la viabilidad de las microalgas, por consiguiente el consorcio predominante es de carácter bacteriano. Seguido de este, están conectados reactores aerobios que funcionan por rebosamiento denominados Estándar. Durante la duración del piloto existió otro reactor anaerobio con modificaciones que favorecían el aumento de la celularidad de la muestra, el cual fue llamado BFPLUS, sin embargo luego fue reemplazado por un reactor Estándar. Al final del proceso se encuentra la centrífuga que permite recuperar la biomasa generada durante el ciclo (ver Figura 3).

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Figura 3. Esquema proceso de ficorremediación de la empresa B&B Core S.A. Puntos de muestreo para identificación por clave taxonómica

Puntos de muestreo parámetros fisicoquímicos

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Objetivos

3.1 Objetivo general Identificar y clasificar por clave taxonómica las microalgas y cianobacterias más abundantes del consorcio microbiológico, utilizado para biorremediar el efluente proveniente de la planta de sacrificio de bovinos y porcinos, en el municipio de Galapa Atlántico. 3.2 Objetivos específicos Aislar e identificar las microalgas y cianobacterias del consorcio microbiológico previa biorremediación del efluente Aislar e identificar las microalgas y cianobacterias del consorcio microbiológico presentes durante la biorremediación del efluente Analizar las características fisicoquímicas del efluente presente en el fotobiorreactor y su relación en la composición del consorcio microbiano utilizado para la bioremediación

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Metodología

4.1 Caracterización fisicoquímica del efluente Este procedimiento fue realizado por la empresa Laboratorios de microbiología de Barranquila Ltda. Algunos de los parámetros más relevantes que incluye el reporte de esta caracterización son la cantidad de sólidos sedimentables, DBO, DQO, fenoles totales, fosfatos, nitritos, nitrógeno amoniacal, sulfatos, sulfuros, tensoactivos aniónicos, entre otros, medidos en escala mg/L. Estos parámetros fisicoquímicos fueron analizados con base en los índices fisicoquímicos ICA, que nos permite tener una vision global de la calidad del agua antes y después de la ficorremediación. Su valoración cuantitativa se basa en la siguiente ecuación:

𝐼𝐶𝐴 = 𝐼!𝑊!

!!!!

𝑊!!!!!

Donde 𝐼! es el índice de calidad para el parámetro i, 𝑊! es el coeficiente de ponderación del parámetro i (Reolon, 2010).

4.2 Recolección de muestras

La recolección de muestras proviene de los fotobiorreactores de recirculación que se encuentran conectados entre sí. Sin embargo, hay variaciones en la toma de la muestra entre los dos diferentes eventos: antes y durante la ficorremediación del efluente. Las muestras que corresponden al momento previo de la biorremediación fueron tomadas de los fotobiorreactores Estándar y BFPlus. Durante el proceso de la ficorremediación, las muestras se tomaron del fotobiorreactor Estándar en dos puntos distintos: el primer punto proviene del interior del reactor, el segundo punto de toma son los tapetes o biopelículas generadas en las tejas del mismo (la toma se hace a nivel superficial). La toma que se realizó al interior de los fotobiorreactores (en ambos momentos) se realizó de la misma forma, en la cual el personal toma aproximadamente 500 mL del agua que circula 15 cm por debajo del nivel superficial.

4.3 Cultivo de las muestras recibidas

Las muestras de los fotobiorreactores correspondientes antes de la ficorremediación del efluente fueron recibidas y reconstituidas en los medios nutritivos CHU10 y BG11, en erlenmeyer de 100 a 125 mL, en los cuales se agregó cada medio por separado en un volumen correspondiente al 25% del volumen total del erlenmeyer. El volumen agregado de la muestra corresponde al 10% de la totalidad del frasco. Por otro lado, las muestras correspondientes al proceso durante

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la ficorremediación fueron reconstituidas en el medio enriquecido SWM3 y los medios nutritivos anteriormente mencionados. Cada 10 días se renovaban los medios, tomando de la muestra crecida presente en el erlenmeyer el 10% del volumen total.

4.4 Identificación por clave taxonómica

De las muestras en las cuales se observó crecimiento de microalgas, en condiciones de asepsia se tomó 1 gota de la muestra y se aplica directamente sobre una lámina de vidrio con su respectiva laminilla, cuidando de que no haya exceso de agua. Se observa en microscopio de luz a magnificación 10X, 40X y 100X. Se hizo un registro fotográfico de las muestras para posteriormente poder usar las claves de clasificación taxonómica: Bicudo y Menezes, 2006 para microalgas; Spaulding, Lubinski y Potapova, 2010 y Wehr & Sheath, 2003 para la identificación de diatomeas. Para la identificación de diatomeas se realizó un lavado previo del frústulo para que su clasificación taxonómica se facilite. Se partió con 2g de muestra y se suspendió en 1 mL de HCl 1M en un tubo de ensayo con tapa hermética. Se expuso la muestra al calor del mechero durante 5 períodos de 30 segundos, entre cada uno de éstos se dejó enfriar la muestra 10 segundos. Se dejó sedimentar y se lavó con agua destilada procurando eliminar todo el ácido clorhídrico. El mismo procedimiento se repitió con 5mL de peróxido de hidrógeno al 20% (Moreno et al., 2012). Una vez realizado el procedimiento, se observó al microscopio a una magnificación de 40X y luego 100X.

4.5 Cálculo índice de Biodiversidad diatomeas (IBD) e índice de polusensibilidad específica (IPS) Se incluyó en el análisis el índice de polusensibilidad específica IPS e índice biológico de diatomeas, descritos a continuación:

𝐼𝑃𝑆 = 𝐴!𝑣!

!

!!!

𝑖! 𝐴!𝑣!

!

!!!

𝐴!: 𝑎𝑏𝑢𝑛𝑑𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑗 𝑣!: 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑗

𝑖!: 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑗

𝐼𝐵𝐷 = 𝐴!𝑃!(𝑖)!

!!!

𝑣! 𝐴!𝑣!

!

!!!

𝐴!: 𝑎𝑏𝑢𝑛𝑑𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑥

𝑃! 𝑖 : 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑥 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑐𝑙𝑎𝑠𝑒 𝑖

𝑣!: 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑎𝑥ó𝑛 𝑥

(Desrosiers et al., 2013)

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Resultados

5.1 Identificación por clave taxonómica 5.1.2 Consorcio microalgal antes de la ficorremediación Fueron identificados 31 morfotipos de microalgas diferentes, las diatomeas no fueron identificadas por clave taxonómica ya que su abundancia relativa en el consorcio fue de 1%. Del consorcio microalgal identificado el 84% de un conteo total de 3683 microorganismos, estaba compuesto por microalgas pertenecientes a la case Chlorophycea, 11% Cyanophyceae y 1% Trebouxiophyceae (Figuras 4-9). Adicionalmente, se presenta en la Figura 10, las abundancias relativas de cada uno de los morfotipos identificados (solo fueron incluídos aquellos con un porcentaje mayor o igual a 1). El índice de Shannon para los microorganismos identificados presentes en la muestra es de 0,76.

A.

B.

C.

D.

E.

Figura 4. Microalgas de la clase Cyanophyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A.Synechococcus (100X) B. Chroococcus (100X) C. Pseudoanabaena

limnética (100X) D. Microcoleus subtorulosus (100X) E. Oscillatoria (100X) A.

B.

C.

D. E.

F.

3

G.

H.

I.

J.

K.

L.

M.

N.

O.

P.

Q.

R.

Figura 5. Microalgas de la clase Chlorophyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A. Desmodesmus (100X) B. Scenedesmus (100X) C. Gloeococcus (40X) D.

Chlorococcum (100X) E. Oocystis (100X) F. Asterococcus (100X) G. Chlorococcus (100X) H. Kirchneriella (100X) I. Scenedesmus acuminatus var. acuminatus (100X) J. Desmodesmus

armatus var. armatus (100X) K. Scenedesmus acutus (100X) L. Scenedesmus dimorphus (100X) M. Glaucocystis (40X) N. Coelastrum (100X) O. Westella botroydes (40X) P.

Neospongiococcum irregulare (100X) Q. Chlorococcum humícola (100X) R. Interfillum paradoxum (100X)

4

A.

B.

C.

Figura 6. Microalgas de la clase Chlamidiophyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A. Chloromonas (100X) B. Gloeomonas (100X) C. Chlamydomonas

(100X)

A.

Figura 7. Microalgas de la clase Euglenophyceae identificadas en el consorcio antes de la

ficorremediación: A. Dinematomonas griseolum (100X)

A.

Figura 8. Microalgas de la clase Zygnemaphyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A. Closterium (100X)

A.

Figura 9. Microalgas de la clase Trebouxiophyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A. Elliptochloris bilobata (100X)

5

Figura 10. Abundancia relativa de las clases de microalgas y de los morfotipos identificados

relevantes en el consorcio (≥1%). 5.1.3 Consorcio microalgal durante la ficorremediación Fueron identificados 28 morfotipos de microalgas diferentes y 17 diatomeas diferentes entre sí de la clase Bacillariophyceae las cuales tuvieron un rol preponderante durante la ficorremediación del agua residual, su abundancia relativa en el consorcio fue del 52%, seguido de las microalgas verdes azuladas pertenecientes a la clase Cyanophyceae (35%), Chlorophyceae (9%) y Zygnematophyceae (1%). En la Figura 16 se presenta la abundancia relativa de los microorganismos identificados de un conteo total de 494. El índice de Shannon calculado con base en estos resultados es de 1,1.

A.

B.

C.

D. E. F.

86%Chlorophyceae

1%Bacillariiophyceae

1%Trebouxiophyceae

Abundanciarelativa(%)antesdela>icorremediación

Total3683

6

G.

H.

I.

Figura 11. Microalgas de la clase Cyanophyceae identificadas en el consorcio durante de la ficorremediación: A.Synechococcus (100X) B. Arthrospira jenneri (100X) C. Oscillatoria

(100X) D. Borzia (100X) E. Phormidium crouani (100X) F. Microcoleus subtorulosus (100X) G. Gloeothece (40X) H. Limnothrix redekei (100X) I. Synechocystis aquatilis (100X)

A.

B.

C.

D.

E.

F.

G.

H.

I.

J.

K.

L.

7

M.

N.

O.

P.

Q.

Figura 12. Microalgas de la clase Chlorophyceae identificadas en el consorcio durante de la

ficorremediación: A. Golenkinia (40X) B. Raphidonema nivale (100X) C. Oocystis (100X) D. Chlorella (100X) E. Scenedesmus (100X) F. Chlorococcum (100X) G. Desmodesmus (100X)

H. Chlorococcus (100X) I. Stichococcus (100X) J. Chlorococcum humicola (100X) K. Interfillum paradoxum (100X) L. Scenedesmus acuminatus var. acuminatus (100X) M.

Microspora (40X) N. Gloeococcus (40X) O. Micractinium pusillum (40X) P. Glaucocystis nostochinearum var. nostochinearum (100X). Q. Neospongiococcum irregulare (100X)

A.

B.

C.

D. E.

F.

8

G.

H.

I.

J.

K.

L.

M.

N.

O.

P. Q.

9

Figura 13. Microalgas de la clase Bacillariophyceae identificadas en el consorcio durante de la ficorremediación: A. Hantzschia amphioxys (100X) B. Fragilaria capucina (100X) C.

Tibetiella pulchra (100X) D. Amphora (100X) E. Fragilaria vaucheriae (100X) F. Kobayasiella micropunctata (100X) G. Achnanthidium minutissimum (100X) H. Nitzschia communis (100X) I. Navicula gregaria (100X) J. Nitzschia dissipata (100X) K. Tabularia

fasciculata (100X) L. Gomphonema parvulum (100X) M. Navicula capitata (100X) N. Nitzschia amphibia (100X) O. Synedra famelica (100X) P. Synedra acus (100X) Q. Pinnularia

nodosa (100X)

A.

Figura 14. Microalgas de la clase Xanthophyceae identificadas en el consorcio durante de la

ficorremediación: A. Lutherella bicudoi

A.

Figura 15. Microalgas de la clase Zygnemaphyceae identificadas en el consorcio antes de la ficorremediación: A. Closterium (100X)

10

Figura 16. Abundancia relativa de las clases de microalgas y de los morfotipos identificados

relevantes en el consorcio (≥1%). 5.2 Parámetros fisicoquímicos Diferentes parámetros fisicoquímicos fueron tomados por duplicado en diferentes momentos, durante el proceso de la biorremediación. Todos ellos son relevantes para el análisis del estado del efluente y algunos son incluídos en normativas que permiten calcular índices de calidad. De cada uno de los parámetros se calculó el porcentaje de remoción de acuerdo a los valores de entrada y salida del proceso, éstos son presentados a continuación:

Cyanophyceae36%

Chlorophyceae9%

Zygnematophyceae1%

Bacillariophyceae54%

Abundanciarelativa(%)durantela>icorremediación

Total494

11

Gráfica 1. Porcentaje de remoción y no remoción de contaminantes durante el proceso de

ficorremediación.

5.3 Índices fisicoquímicos calidad del agua (ICA) El análisis de la evaluación de la calidad del agua permite tomar desiciones sobre el tratamiento que se requiere para mejorar su calidad. Una de estas herramientas, es el uso de índices de calidad (ICA) (Torres et al., 2009). De los diferentes parámetros fisicoquímicos tomados durante el piloto, el cálculo del índice de calidad del agua (ICA) se hizo con base en los parámetros que fueron establecidos desde 1970: Sólidos disueltos totales, fosfatos, DBO5, nitratos, turbidez, oxígeno disuelto, temperatura, pH y coliformes totales (SNET, 2006). Con el cálculo de estos índices, se encontró que el efluente que ingresa al proceso de ficorremediación es de mala calidad con un valor ICA=24,2; no obstante, al final del proceso el agua es de buena calidad con un valor ICA= 74,6 según los rangos propuestos para la evaluación de la calidad del agua (Tabla 1, anexos). Tabla 2. Parámetros fisicoquímcos relevantes para el cálculo del ICA: se presentan los valores

a la entrada del proceso de ficorremediación y al final del proceso. Los coeficientes de ponderación de cada parámetro también son presentados

Parámetros Unidades

Entrada proceso (UASB)

Salida proceso (centrifugación) Wi

Entrada UASB

Centrifugación

DBO5 mg/L 3,30E+03 9,09E+01 1,00E-01 0,2 0,2

97,2

6

100

97,7

8

98,7

4

98,8

5

59,5

9 98,3

8

78,2

5

83,4

2

100

13,1

90

100

100

2,74 2,22 1,26 1,15

40,41

1,62

21,75 16,58

86,9

10

DB0

5

GRA

SAS

Y/O

AC

EITE

S

SÓLI

DO

S SE

DIM

ENTA

BLES

SÓLI

DO

S D

ISU

ELTO

S TO

TALE

S

SÓLI

DO

S TO

TALE

S

DET

ERG

ENTE

S SA

AM

NIT

RATO

S

NIT

RÓG

ENO

AM

ON

IAC

AL

NIT

RÓG

ENO

TO

TAL

KJED

AH

L

SULF

URO

S

CLO

RURO

S

DQ

O

CO

LIFO

RMES

FEC

ALE

S

CO

LIFO

RMES

PORCENTAJE DE REMOCIÓN

PORCENTAJE REMOCIÓN PORCENTAJE NO REMOCIÓN

12

Sólidos disueltos totales mg/L 3,97E+03 5,00E+01 8,00E-02 0,24 7,2

Fosfatos mg/L 5,60E-01 3,22E+00 1,00E-01 5,5 8

Nitratos mg/L 2,59E+02 4,20E+00 1,00E-01 0,2 8

Turbidez FAU 5,29E+03 0,00E+00 8,00E-02 0,4 8

Oxígeno disuelto % Saturación >140% 100 (%) 1,70E-01 7,99 17

Temperatura ºC 3,68E+01 2,79E+01 1,00E-01 3,2 8

pH Unidades pH 8,95E+00 7,50E+00 1,20E-01 6 11,16

Coliformes fecales

NMP/100 mL 1,60E+14 2,30E+02 1,50E-01 0,45 7,05

VALOR ICA 24,2 74,6

De los parámetros fisicoquímicos evaluados al inicio y en la finalización del proceso de ficorremediación, la relación que existe entre la demanda química de oxígeno (DQO) y la demanda biológica de oxígeno (DBO) es de 1.43 y 2.84 respectivamente. Estos valores indican que el agua residual ingresa al proceso de remediación con una cantidad elevada de materia orgánica que es muy degrable, y sale luego de la centrifugación con materia orgánica que presenta menor facilidad degradativa. En la tabla 3 se resumen los parámetros fisicoquímicos y la norma de la resolución 0631 del 2015 con su respectivo límite máximo permitido. Tabla 3. Parámetros fisicoquímcos establecidos por la 0631 del 2015: aguas no domiciliares de

efluentes de bovinos y porcinos

Parámetros Unidades Resultado Límite máximo Norma

DBO5 mg /L 92,95 450 CUMPLE

Grasas y aceites mg/L NO DETECTABLE 30 CUMPLE

Sólidos sedimentables ml/L <1,00 5 CUMPLE

Detergentes SAAM mg /L 1,56

Análisis y reporte

Fósforo total mg P/L 1,96

Análisis y reporte

Nitratos mg /L 4,20

Análisis y reporte

Nitritos mg /L 172,484

Análisis y reporte

Nitrógeno amoniacal mg /L 40,07

Análisis y reporte

Nitrógeno total Kjedahl mg /L 42,44

Análisis y reporte

Sulfatos mg /L 385,88 500 CUMPLE

Cloruros mg /L 285,70 600 CUMPLE

DQO mg /L 263,84 800 CUMPLE

pH <8,5 9 CUMPLE 5.4 Índices biológicos calidad del agua (IBD, IPS)

13

Se calcularon dos índices basados en el consorcio de diatomeas identificado: IBD e IPS, los cuales son índices estandarizados originarios en Francia y España (respectivamente). Sin embargo su uso como indicadores de la calidad de los cuerpos de agua se encuentra limitado debido a la dificultad que implica la identificación de las diatomeas (Rivas, Gómez, Monterrosa, 2010). Una vez esta limitación es superada, el uso de estos microorganismos trae consigo un estimativo de la calidad del agua sensible, ya que las diatomeas son sensibles a la eutroficación, contaminación de fuentes orgánicas y minerales (aunque estas fuentes de contaminación no sean producidas de forma continua); adicionalmente, reaccionan de forma rápida a las eventuales modificaciones que pueda tener el cuerpo de agua (Rivas, Gómez, Monterrosa, 2010). Para el cálculo del índice biológico de diatomeas (IBD) se hizo uso del software de excel conocido como OMNIDIA (http://omnidia.free.fr/omnidia_english.htm). El cálculo del índice de polusensibilidad específica o IPS, se realizó mediante el programa de Access conocido como TAXAGUA (http://www.magrama.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/aguas-superficiales/programas-seguimiento/TAXAGUA.aspx). Ambos totalmente gratuitos. Para el consorcio de diatomeas identificado durante el proceso de ficorremediación, el IBD fue de 7,44 y el IPS fue de 7,41.

Discusión

El efluente proveniente de la planta de sacrificio de bovinos y porcinos, inicia el proceso de biorremedación en el reactor anaerobio de flujo ascendente UASB (consorcio bacteriano predominante), con un carga orgánica muy elevada de 3300 mg/L (DBO5), coherente con el nivel de contaminación allí presente; y continúa con la ficorremediación en los reactores anaerobios en donde el consorcio predominante es el microalgal. Según los resultados del índice de calidad del agua ICA, el agua que ingresa para ser remediada es de calidad pobre y sale un efluente ficorremediado con calidad de agua buena, de acuerdo con la clasificación establecida por Tyson & House en 1989 (ver tabla 1, Anexos). Los resultados obtenidos son consecuencia de la planeación estratégica del orden de los reactores. En línea con lo anterior, la presencia del UASB como primer bioreactor es determinante, ya que es el responsable de la remoción de coliformes totales, microorganismos potencialmente patógenos, la reducción significativa de la demanda biológica de oxígeno y la degradación parcial de compuestos orgánicos e inorgánicos debido a procesos de reducción química de iones y de procesos metabólicos que usan esta clase de compuestos como aceptores de electrones (EPA, 2015). Los procesos más representativos que se llevaron a cabo en el UASB fueron la metanogénesis, acetanogénesis y denitrificación. De la Figura 10, se observa la abundancia relativa porcentual de cada uno de los morfotipos identificados antes de la ficorremediación, siendo la clase Chlorophyceae la de mayor abundancia: 86% de un conteo de 3683 individuos. En esta clase, las microalgas más representativas en términos de abundancia son: Chlorococcus sp. (26%), Gloeococcus sp.

14

(15%), Neospongiococcum irregulare (13%), Synechococcus sp. (9%), Oocystis sp. (7%) y Chorella sp. (6%). Así mismo, otra clase representativa es Cyanophyceae con un 12% de abundancia relativa en la cual tres grandes géneros de microalgas la representan: Synechococcus sp. (77%), Chroococcus sp. (17%) y Microcoleus subtorulosus (6%). De la Figura 16, se observa una conformación totalmente distinta del consorcio en el cual la clase Chlorophyceae disminuye drásticamente su abundancia en un 77%; en cambio la clase Cyanophyceae aumenta en un 24% su abundancia en el consorcio; es congruente con la literatura encontrar una abundancia relativa de Cyanophyceae del 36%, debido a que son microorgamisnos presentes en un amplio rango de condiciones extremas (Kireeva, Dubovik & Yakupova, 2011). En adición la clase Bacillariophyceae surgió como clase predominante del consorcio durante la ficorremediación con una abundancia del 54% de un conteo total de 494 organismos. Al interrior de las clases Cyanophyceae y Clorophyceae, domina en abundancia Synechocystis aquatilis (46%) y Scenedesmus sp. (59%) respectivamente, las cuales producen polímeros extracelulares que permiten la captación y absorción de contaminates, algunos de ellos finalmente incorporados a procesos metabólicos que facilitan su remoción y/o biotransformación (Chekroun et al., 2014) Las diatomeas pertenecientes a la clase Bacillariophyceae también incorporan y absorben los diferentes contaminantes mediante cambios que realizan en la relación sílice:nitrógeno y sílice:carbono presente en su estructura celular (Marchetti & Cassar, 2009). De estos organismos Amphora sp. Es la más abundante (19%) seguida de Hantzschia amphyoxys (16%), Nitzschia communis (8%), Nitzschia dissipata (7%), Synedra acus (6%) y así sucesivamente en un gradiente de disminución en abundancia de géneros Navicula sp., Tibetiella sp., Gomphonema sp., Pinnularia sp., y Fragillaria sp. (ver Figura 15). Todos ellas bioindicadoras de contaminación del efluente contaminado, sin embargo para las diatomeas más abundantes: Amphora sp. y Hantzschia amphyoxys ya existen reportes del elevado grado de tolerancia que presenta en cuerpos de agua contaminados (Miho, Hysko & Duka, 2010). Y las diatomeas del género Navicula sp. y Nitzchia sp. tienen alta capacidad de adaptación en aguas residuales industriales (Bhatnagar, et al., 2012). En su conjunto, la frecuencia de las diatomeas permitió alimentar el software de OMNIDIA y TAXAGUA para el cálculo de los índices biológicos. A excepción de las especies Synedra famelica y Kobayasiella micropunctata, las cuales no se encuentran en la base de datos de estos programas. También, con la abundancia relativa de las especies antes y después de la ficorremediación, se calculó el índice de diversidad de Shannon debido a que el conteo de microorganismos fue 3683 y 494 respectivamente. Como se esperaba los índices indican que el consorcio durante la ficorremediación fue más diverso (1,1) en comparación con el consorcio antes de la ficorremediación (0,76). A pesar de que el consorcio durante el proceso de biorremediación tuvo un conteo 7,5 veces menor comparado con el consorcio antes del proceso, su diversidad en cuanto al número de organismos distintos que contribuyen a la remoción de contaminantes es mayor. Por otro lado, la disminución del conteo celular en el consorcio durante la ficorremediación responde a condiciones fisicoquímicas adversas que causan los contaminantes presentes en el efluente, como por ejemplo los sólidos suspendidos y la turbidez que tienen un

15

efecto directo sobra la disminuición en la celularidad de las muestras (Miho, Hysko & Duka, 2010). Durante el proceso de ficorremediación cuya duración es de 24 horas, la remoción de coliformes fecales se da con alta eficiencia gracias al reactor anaerobio UASB. Los niveles de reducción de estos microorganismos pasa de 2E+14 (NMP/100mL) a 280 (NMP/100mL). Resportes de literatura indican la reducción de coliformes en un 88.8% (Malina & Yousef, 1964) y reducción del 99% con grupos altamente estabilizadores como Chlorella sp., Ankistrodesmus sp., Scenedesmus sp., Euglena sp., Chlamydomonas sp., Oscillatoria sp., Micractinium sp. y Golenkinia sp. (Cooke et al., 1978; Pichai & Govindan, 1980; Colak & Kaya, 1988) (Abdel-Raouf, Al-Homaidan & Ibraheem, 2012). Al finalizar el proceso de biorremediación, hubo una remoción del 100% de grasas y aceites presentes en el efluente, sulfuros, coliformes totales y fecales. En un 98% aproximandamente fueron removidos los sólidos totales, sólidos disueltos, sedimentales y nitratos. Dos parámetros en particular no tuvieron una remoción casi total: Detergentes SAAM y cloruros (60% y 13% respectivamente), el primero de ellos, muy importante como fuente de fósforo para el crecimiento microalgal (macronutriente) y los cloruros para el mantemiento osmótico del agua y el intercambio iónico. En particular tres parámetros fisicoquímicos presentaron no una remoción sino un aumento en la lectura: fosfatos, nitritos y sulfatos. Los fosfatos presentaron un aumento de 5,75 unidades; nitritios 7499,304 unidades y sulfatos 32,64. Estos resultados tienen una razón de ser, debido a que altas concentraciones de nitritos estimulan la floración de las diatomeas; así como, concentraciones altas de fosfatos coinciden con un aumento en la tasa de crecimiento de los organismos pertenecientes a la clase Cyanophyceae (Shaari et al., 2011). En cambio, el nitrógeno, el cual tuvo una reducción del 78,25%, presenta un efecto negativo sobre la abundancia de Cyanophyceae (Shaari et al., 2011). El aumento de los sulfatos es supremamente importante debido a que es un macroelemento esencial, que es obtenido por parte de las microalgas a partir de fuentes inorgánicas. Además de esto, en literatura se reporta que el aumento en la concentración disminuye el efecto tóxico de diversos contaminantes como los metales pesados gracias a que el sulfato actúa como un sustrato inhibidor por competencia, de esta forma el proceso de ingreso de sustancias tóxicas a las microalgas es inhibido. Como se mencionó su aumento es de 32,64 unidades, congruente con lo reportado debido a que un exceso de este elemento tiene efectos negativos sobre las poblaciones microalgales (Mera, Torres & Abalde, 2014). De acuerdo a la resolución 0631/2015, capítulo VI, artículo 9, la cual dispone los límites máximos permitidos para efluentes contaminados no domésticos de actividad bovina y porcina; los parámetros DBO5, grasas y aceites, sólidos sedimentables, nitrógeno total Kjedahl, sulfatos, cloruros, DQO y pH, no exceden los límites permitidos y por tanto cumplende forma satisfactoria la norma establecida (Minanmbiente, 2015). De los índices biológicos de calidad del agua, dos fueron calculados: IBD e IPS, de los cuales los resultados obtenidos (IBD=7,44; IPS=7,41) presentan una diferencia del 3%. Es de esperar que los valores hallados sean así de cercanos debido a que los parámetros que los rigen son esencialmente los mismos, de la misma forma, la escala que contiene el criterio de calidad es

16

igual para ambos. Lo único que diferencia estos índices es el hecho de que IBD es un índice originario en Francia e IPS en España. Por lo demás, con el resultado de uno u otro es suficiente para poder determinar que el agua en donde se encontraban las diatomeas ejerciendo un papel de resistencia y degradación era de mala calidad (Tabla 2, Anexos). En estudios de aguas residuales porcinas que fueron previamente estabilizadas por digestión anaeróbica, se identificó el potencial de las cianonbacterias Phormidium sp., Anabaena sp. y oscillatoria sp. (identificadas en el consorcio), junto con la acción de las microalgas Prototheca zopfii, Selenastrum capricornutum, Scenedesmus acutus y Ankistrodesmus braunii, Chlamydomonas ulvaensis, Chlorella pyrenoidosa y Scenedesmus brasiliensis (la mayoría de los cuales fueron identificados), en la disminución de la demanda química de oxígeno (DQO) y remoción de contaminantes. Se ha reportado para estas microalgas su aplicación como indicadores de contaminación ambiental que pueden complementar de forma adecuada los índices biológicos basados en diatomeas (Ferrera-Cerrato et al., 2006).

17

Conclusiones

Para el efluente contaminado proveniente de la planta de sacrificio de bovinos y porcinos, el proceso de ficorremediación se llevó a cabo con resultados de alta eficiencia, en el contexto de un proceso en el cual no existe intervención de sustancias o compuestos químicos que son potencialmente tóxicos y nocivos para el ambiente y las personas que viven en él. Esta eficiencia es traducida en porcentajes de remoción de contaminantes que oscilan entre un 80% y 100% aproximadamente. Durante el proceo en mención, solo se presentaron dos parámetros en los cuales la remoción no fue totalmente satisfactoria, correspondiente a detergentes SAAM y cloruros, los cuales son esenciales para el crecimiento microalgal y la estabilidad osmótica y de intercambio iónico del cuerpo de agua. Adicionalmente, al final de proceso de biorremediación se presentó un aumento en los niveles de sulfatos, fosfatos y nitritos (mg/L). Se identificó que el aumento de fosfatos y nitritos responden a la necesidad de generar la proliferación de diatomeas y cianobacterias que contribuyen en la degradación de la contaminación orgánica e inorgánica (Shaari et al., 2011). De forma similar, el aumento en los compuestos de sulfatos, tienen la labor de facilitar los mecanismos de protección contra compuestos altamente tóxicos que están en el efluente (Mera, Torres & Abalde, 2014). De acuerdo a la resolución 0631/2015, capítulo VI, artículo 9, los parámetros DBO5, grasas y aceites, sólidos sedimentables, nitrógeno total Kjedahl, sulfatos, cloruros, DQO y pH, no exceden los límites permitidos y por tanto cumplende forma satisfactoria la norma establecida (Minanmbiente, 2015). Se realizaron diferentes cálculos que nos suministraran información acerca del estado ecológico y de calidad del efluente que ingresó al proceso de tratamiento: índice de Shannon, ICA, IBS e IPS. Con los índices del ICA, se pudo determinar que el agua pasó de ser de calidad pobre a agua de buena calidad, en donde el consorcio microalgal y de diatomeas se encontraban presentes tanto resistiendo como generando mecanismos de degradación de contaminantes en aguas pobres en cuanto a calidad se refiere (IBD e IPS), mediante la producción de polímeros y cambios en la relación Si:N-Si:C, respectivamente (Chekroun et al., 2014; Marchetti & Cassar, 2009). Alineado con lo anterior, el consorcio de microorganismos involucrados en la ficorremediación fue un grupo más diverso (aumento 15%, índice de Shannon) en comparación con el consorcio antes de que el proceso iniciara. Del consorcio microalgal antes de la ficorremediación, fueron identificadas 30 microalgas distintas entre ellas, de las cuales el 46.6% también fueron identificadas en el consorcio durante la ficorremediación: Microcoleus subtorulosus, Oscillatoria, Synechococcus, Chroococcus, Scenedesmus, Desmodesmus, Gloeococcus, Chlorococcum, Oocystis, Chlorella, Scenedesmus acuminatus, Neospongiococcum irregulare, Chlorococcum humícola e Interfillum paradoxum. Durante la biorrmediación fueron identificadas 27 microalgas: 13 especies nuevas y 14 provenientes del consorcio anterior, adicionalmente, fueron identificadas 17 diatomeas penadas: Hantzschia amphyoxys, Fragilaria capucina, Tibetiella pulchra, Amphora, Fragilaria vaucheriae, Kobayasiella micropunctata, Achnanthidium minutissimum, Nitzschia communis, Navicula gregaria, Nitzschia dissipata, Tabularia fasciculata, Gomphonema parvulum,

18

Nitzschia amphibia, Synedra famelica, Synedra acus, Pinnularia nodosa. Estas últimas (diatomeas) incluídas en el análisis biológico de la calidad del agua (IBD, IPS). Para futuros estudios, adicional de la exhaustiva identificación que debe llevarse a cabo, sería ideal poder tomar mediciones de los parámetros fisicoquímicos a lo largo de cada estación que compone el proceso, para poder tener suficiente información que permita correlacionar la variación en abundancia y diversidad de los consorcios en cada bioreactor, con los valores de cada uno de los parámetros fisicoquímicos. Esto también permitiría un seguimiento más cercano a través del tiempo, del decaimiento de las concentraciones de cada uno de ellos. Adicionalmente según lo observado durante el proceso de identificación, el consorcio observado en campo difiere del consorcio identificado en laboratorio, debido a cambios en las condiciones ambientales y en la composición del medio en el cual los microorganismos fueron cultivados (BG11, CHU10, SWM3). Por lo tanto, para futuros estudios es importante realizar análisis metagenómicos de las muestras recien colectadas en campo y compararlas con las muestras de laboratorio por la razón anteriormente mencionada y además porque existe un fracción no cultivable en laboratorio que no pudo ser identificada. Análisis de las secuencias de ADN y bioinformáticos permitirá tener una aproximación más cercana de este consorcio microbiológico.

19

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BD Falcon TM Cell Culture Inserts to Evaluate Allelopathic Effects Among, 1.

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Anexos

Tabla 1. Escala de calidad del agua ICA (Tyson y House, 1989)

Clasificación Rango

Excelente 91-100

Buena 71-90

Promedio 31-70

Pobre 11 - 30 Muy pobre 0 - 10

Tabla 2. Criterio índice polusensibilidad específica (IPS) e índice biológico de diatomeas (IBD)

(1982) Clasificación Rango

17-20 Excelente

13-16 Buena

9-12 Promedio

5-8 Pobre 0-4 Muypobre

CYANOPHYCEAE 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ………………………………….. 2 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas; tricomas finos (en general 3 µm de diámetro como máximo) …………………………………………………………………………… 44 44. Tricomas sin vaina o apenas con mucilágino difluente ………………. ……………...50 50. Tricomas más largo, curvo y sigmoide o están espirelados ………………………….. 51 51. Tricomas cilíndricos, células con o sin aerótopos …………………………………… 52 52. Células siemre con aertopos, localizados en los polos y no en el centro…... Limnothrix

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1. Células aisladas, agregadas o formando colonias ……………………………………… 2 2. División celular por fisión binaria con producción de células hija o por fisión binaria y multiple producción de células hija baeócitas; generalmente células isopolares …………. 3 3. División celular en 1 a 3 planos por fisión binaria ……………………………………... 4 4. División celular en un plano ……………………………………………………………. 5 5. Células formando colonias ……………………………………………………………... 8 8. Colonias irregulares o reticuladas …………………………………………………….. 10 10. Colonias con células dispuestas en todo su interior ……………………………….... 11 11. Colonias sin sistema de astas mucilaginosas ………………………………………... 12 12. Colonias no reticuladas ……………………………………………………………… 13 13. Células o grupo de células con envoltura mucilaginosa individual ……….. Gloeothece 1. Células aisladas, agregadas o formando colonias ……………………………………… 2 2. División celular por fisión binaria con producción de células hija o por fisión binaria y multiple producción de células hija baeócitas; generalmente células isopolares …………. 3 3. División celular en 1 a 3 planos por fisión binaria ……………………………………... 4 4. División celular en dos o tres planos ………………………………………………….. 18 18. División celular en dos planos ……………………………………………………….. 19 19. Células solitarias ………………………………………………………... Synechocystis 1. Células aisladas, agregadas o formando colonias ……………………………………… 2 2. División celular por fisión binaria con producción de células hija o por fisión binaria y multiple producción de células hija baeócitas; generalmente células isopolares …………. 3 3. División celular en 1 a 3 planos por fisión binaria ……………………………………... 4 4. División celular en un plano ……………………………………………………………. 5 5. Células solitarias ………………………………………………………………………... 6 6. Células cilíndricas; contenido celular homogéneo o granuloso …………. Synechococcus 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ………………………………….. 2 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas; tricomas finos (en general 3 µm de diámetro como máximo) …………………………………………………………………………… 44 44. Tricomas sin vaina mucilaginosa o apenas con mucilágeno difluente ….…………... 50 50. Tricomas largos, cuando son cortos, siempre rectos ………………………………..... 51 51. Tricomas cilíndricos, células con o sin aerótopos ……………………………………. 52 52. Células generalmente sin aerótopos, o si está presente, se encuentran localizados en los polos ……………………………………………………………………… Pseudoanabaena

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1. Células aisladas, agregadas o formando colonias ……………………………………… 2 2. División celular por fisión binaria con producción de células hija o por fisión binaria y multiple producción de células hija baeócitas; generalmente células isopolares …………. 3 3. División celular en más de 3 planos por fisión binaria y multiple ……………………. 30 30. División celular exclusivamente por fisión binaria con producción de células hija …. 31 31. Colonias isopolares, raro células solitarias …………………………………………... 32 32. Colonias sin sistema de tallos mucilaginosos ………………………………………... 33 33. Colonias solitarias o formando colonias que no se forman en paquetes densos …….. 34 34. Cubierta mucilaginosa amplia o acompañando la forma de las células, sin cualquier ornamentación en la superficie; células esféricas o semisféricas ……………. Chroococcus 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ………………………………….. 2 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas, tricomas más largos (en general 4 µm de diámentro como mínimo) ………………………………………………………………... 53 53. Células cuadráticas o subcuadráticas ………………………………………………... 69 69. Tricomas siempre cortos (generalmente hasta 8 células) ……………………….. Borzia 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ………………………………….. 2 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas, tricomas más largos (en general 4 µm de diámentro como mínimo) ………………………………………………………………... 53 53. Células cuadráticas o subcuadráticas ………………………………………………... 69 69. Tricomas más largos ………………………………………………………………… 70 70. Tricomas regularmente espiralados …………………………………………………. 71 71. Tricomas con septos bien evidentes, frecuentemente granulados ………… Arthrospira 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias …………………………………..42 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas, tricomas más largos (en general 4 µm de diámentro como mínimo) ………………………………………………………………... 53 53. Células muy cortas; un mínimo de 4 veces más anchas que largas ……………..…... 54 54. Tricomas sin vaina mucilaginosa ………………………………………..… Oscillatoria

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1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ……………………………….... 42 42. Tricomas homocitados …………………………………………………………...….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas, tricomas más largos (en general 4 µm de diámentro como mínimo) ………………………………………………………………... 53 53. Células cuadráticas o subcuadráticas ………………………………………………... 69 69. Tricomas más largos ………………………………………………………………… 70 70. Tricomas rectos, flexuosos, ondulados, o en pocos casos apenas con espiras irregulares ………………………………………...…………………………………………………. 72 72. Células sin aerotopos ……………………………………………………………….. 73 73. Tricomas sin ramificaciones ………………………………………………………... 75 75. Vaina presente ……………………………………………………………………… 76 76. Apenas 1 tricoma/vaina …………………………………………………………….. 77 77. Vaina fina, homogénea, generalmente hialina ………………………….. Phormidium 1. Filamentos aislados, agregados o formando colonias ………………………………….. 2 42. Tricomas homocitados ……………………………………………………………….. 43 43. Células cuadráticas más largas que anchas, tricomas más largos (en general 4 µm de diámentro como mínimo) ………………………………………………………………... 53 53. Células cuadráticas o subcuadráticas ………………………………………………... 69 69. Tricomas más largos ………………………………………………………………… 70 70. Tricomas rectos, flexuosos, ondulados, o en pocos casos apenas con espiras irregulares ………………………………………...…………………………………………………. 72 72. Células sin aerotopos ………………………………………………………………... 73 73. Tricomas sin ramificaciones ……………………………………………………….... 75 75. Vaina presente ………………………………………………………………………. 76 76. Más de 1 tricoma/vaina ………………………………………………………….….. 78 78. Algunos (2-5) a muchos tricomas/vaina ………………………………………….… 79 79. Filamentos enmarañados formando masas ……………………………………….… 80 80. Vaina homogénea ……………………………………………………….. Microcoleus

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CHLOROPHYCEAE 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular con rugosidades, espinos o setas …………………………………… 114 114. Reproducción por autosporos …………………………………………………… 115 115. Colonias con un mínimo de 4 células …………………………………………… 119 119. Cenobio con células de un solo tipo …………………………………………...... 120 120. Cenobio plano, tetraédrico o estrellado …………………………………………. 121 121. Cenobio con forma de rectángulo, tetraédrico o estrellado …………………...... 130 130. Células dispuestas en un solo plano …………………………………………...... 131 131. Células ornamentadas con espinos …………………………………... Desmodesmus 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular con rugosidades, espinos o setas …………………………………… 114 114. Reproducción por autosporos …………………………………………………… 115 115. Colonias con un mínimo de 4 células …………………………………………… 119 119. Cenobio con células de un solo tipo …………………………………………...... 120 120. Cenobio plano, tetraédrico o estrellado …………………………………………. 121 121. Cenobio con forma de rectángulo, tetraédrico o estrellado …………………....... 130 131. Células no ornamentadas con espinos ………………………………... Scenedesmus

1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos en general ausentes, pueden ocurrir raramente …………………………... 22 22. Pared celular adherente al citoplasma ………………………………………………. 23 23. Célula esférica, elíptica, cordada o lunada ………………………………………….. 24 24. Un cloroplastidio en forma de copa o revestido casi toda la cara interna de la pared celular …………………………………………………………………………………… 25 25. Colonias formadas por numerosos individuos (incontables) ………….. Chlorococcum

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1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular lisa o con gránulos …………………………………………………... 46 46. Células pigmentadas con cianelas o cloroplastidios ……………………………….. 47 47. Cloroplastidios presentes (células verdes) …………………………………………. 48 48. Pirenoide presente ………………………………………………………………….. 49 49. Un cloroplastidio; sin pista o cruz oscura que separe las células en la colonia ……. 50 50. Célula elipsoidal ……………………………………………………………………. 51 51. Células elipsoidales, cilíndricas o reniformes …………………….. Oocystis (en parte) 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular lisa o con gránulos …………………………………………………... 46 46. Células pigmentadas con cianelas o cloroplastidios ……………………………….. 47 47. Cloroplastidios presentes (células verdes) ………………………………………..... 48 48. Pirenoide presente ………………………………………………………………….. 49 49. Un cloroplastidio; sin pista o cruz oscura que separe las células en la colonia ……. 50 50. Célula esférica o casi ………………………………………………………………. 52 52. Pared celular fina, sin cualquier granulación ………………......... Chlorella (en parte) 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o coloniales, con vacuolas contráctiles ………………... 3 3. Células sin pseudoflagelos ……………………………………………………………. 7 7. Formas coloniales envueltas por mucilágeno abundante ……………………………... 8 8. Cloroplasto estrellado …………………………………………………….. Asterococcus

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1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular con rugosidades, espinos o setas …………………………………… 114 114. Reproducción por autosporos …………………………………………………… 115 115. Colonias con un mínimo de 4 células …………………………………………… 119 119. Cenobio con células de un solo tipo …………………………………………...... 120 120. Cenobio esférico o casi …………………………………………………. Coelastrum 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células ovales, elipsoidales o subesféricas ………………………………………… 45 45. Pared celular con rugosidades, espinos o setas …………………………………… 114 114. Reproducción por autosporos …………………………………………………… 115 115. Colonias con un mínimo de 4 células …………………………………………… 119 119. Cenobio con células de un solo tipo …………………………………………...... 120 120. Cenobio plano, tetraédrico o estrellado …………………………………………. 121 121. Cenobio con la forma de cruz o paralelograma …………………………………. 122 122. Célula sin espinos ……………………………………………………………….. 123 123. Células con apéndices membranosos …………………………………………… 124 124. Cenobio globoso o con forma aproximada de rectángulo ………………………. 125 125. Cenobio más o menos rectangular ………………………………………………. 127 127. Cenobio de contorno cuadrado o casi …………………………………………… 128 128. Meato central intercelular cuadrado o rectangular ……………………………… 129 129. Meato central rectangular ………………………………………………….. Westella

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1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos coloniales o cenobiales …………………………………………………. 76 76. Células esféricas o subesféricas; pared con sectos muy largos …………………….. 77 77. Sectos con o sin espesamiento en la base, dismiuyendo gradualmente hacia el ápice 78 78. Pirenoide presente ………………………………………………………………….. 79 79. Espesamiento mucilaginoso en la base de espinos o sectos ausente ……………….. 80 80. Pirenoide reniforme ……………………………………………………….. Golenkinia

1. Formas multicelulares filamentosas, tubulares o foliáceas ………………………... 137 137. Formas filamentosas …………………………………………………………….. 138 138. Filamentos simples, no ramificados …………………………………………….. 139 139. Cloroplastidio estrellado, anillado, o indistinto ………………………………… 140 140. Cloroplastidio anillado ………………………………………………………….. 141 141. Filamentos libres ………………………………………………………………... 145 145. Filamentos puntiagudos en las extremidades ………………………………….... 146 146. Filamentos más largos cuyas células no se disocian ……………….. Raphidonema 1. Formas multicelulares filamentosas, tubulares o foliáceas ………………………... 137 137. Formas filamentosas …………………………………………………………….. 138 138. Filamentos simples, no ramificados …………………………………………….. 139 139. Cloroplastidio estrellado, anillado, o indistinto ………………………………… 140 140. Cloroplastidio anillado ………………………………………………………….. 141 141. Filamentos libres ………………………………………………………………... 145 145. Filamentos no puntiagudos en las extremidades ……………………………....... 147 147. Pirenoide ausente …………………………………………………...… Stichococcus 1. Formas multicelulares filamentosas, tubulares o foliáceas ………………………... 137 137. Formas filamentosas …………………………………………………………….. 138 138. Filamentos simples, no ramificados …………………………………………….. 139 139. Cloroplastídio reticulado ……………………………………………..… Microspora

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1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………..... 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células de otras formas …………………………………………………………….. 53 53. Células tetraédricas ……………………………………………………………….... 54 54. Varios cloroplastos por célula ……………………………………………………... 55 55. Individuo de vida libre ……………………………………………………………... 56 56. Pared celular con 1 círculo de gránulos situado próximo a los polos y costillas más o menos longitudinales en el ecuador ……………………………………………….…. 57 57. Individuos envueltos por mucílago más o menos copioso ……………………….... 84 84. Individuos coloniales ……………………………………………………………..... 85 85. Individuos reunidos en colonias de otras formas …………………………………... 88 88. Células no unidas entre sip or restos de pared celular madre …………………….... 92 92. Pared celular con sectos ……………………………………………………………. 93 93. Colonia constituída por 2-32 células dispuestas tetraédricamente ….… Micractinium 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células de otras formas …………………………………………………………….. 53 53. Células tetraédricas ……………………………………………………………….... 54 54. Varios cloroplastos por célula …………………………………………………….... 55 55. Individuo de vida libre ……………………………………………………………... 56 56. Pared celular con 1 círculo de gránulos situado próximo a los polos y costillas más o menos longitudinales en el ecuador ………………………………………………...…. 57 57. Individuos envueltos por mucílago más o menos copioso ……………………….... 84 84. Individuos coloniales ……………………………………………………………..... 85 85. Individuos reunidos en colonias de otras formas ………………………………….. 88 88. Células no unidas entre sip or restos de pared celular madre ……………………... 92 92. Pared celular en general lisa, a veces con verrugas, espesamientos o incrustaciones ……………………………………………………………………………………….…. 94 94. Células al interior de mucílago producido externamente o por gelitinización de la pared de la célula madre ………………………………………………………………. 95 95. Cianelas presentes (célula verde-azulada) …………………... Glaucocystis (en parte)

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1a. Células formando crecimiento macroscópico ………………………………………. 2 2b. Usualmente unidas a la superficie …………………………………………………... 4 4a. Colonias en forma de hoja o saco/matriz gelatinosa ………………………………... 5 5b. Colonia en saco o matriz gelationsa ……………………………………………….... 6 6b. Colonias no en paquetes de a cuatro, células debilmente mótiles en la matriz gelatinosa ……………………………………………………………………. Gloeococcus 1. Formas unicelulares aisladas o en colonias …………………………………………... 2 2. Formas unicelulares aisladas o en colonias, con vacuolas contráctiles ………………. 9 9. Zoosporos siempre presentes ……………………………………………………….. 10 10. Zoosporos no revestidos por escamas o sin pared celular …………………….......... 35 35. División celular ausente …………………………………………………………….. 43 43. Individuos aislados …………………………………………………………………. 44 44. Células de otras formas …………………………………………………………...... 53 53. Células tetraédricas ……………………………………………………………….... 54 54. Varios cloroplastos por célula …………………………………………………….... 55 55. Individuo de vida libre ……………………………………………………………... 56 56. Pared celular con 1 círculo de gránulos situado próximo a los polos y costillas más o menos longitudinales en el ecuador ………………………………………………….... 57 57. Individuos envueltos por mucílago más o menos copioso ……………………….... 84 84. Indivíduos cenobiales .............................................................................................. 108 108. Colonias com células distribuídas em grupos irregulares o tetraédricos o en perpendiculares ................................................................................. (Radiococcaceae) 109 109. Mucílago colonial com fragmentos de pared de las células-madre ....................... 110 110. Fragmentos de pared de las células madre presentes en las formas jóvenes y ausentes en las formas adultas ........................................................................ Radiococcus

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CHLAMYDOPHYCEAE 1. Individuo de hábito aislado, solitario ………………………………………………... 2 2. Célula con 2 flagelos ………………………………………………………………… 3 3. Célula pigmentada ………………………………………………………………….... 4 4. Célula desnuda, no lórica en el interior ……………………………………………… 8 8. Célula con pared celular ……………………………………………………………... 9 9. Célula lisa sin cualquier proyección, lobos o verrugas ……………………………... 11 11. Célula de otras formas …………………………………………………………….. 12 12. Protoplasma justapuesto en pared celular ………………………………………… 14 14. Flagelos emergiendo distantes uno de otro ……………………………. Gloeomonas 1. Individuo de hábito aislado, solitario ………………………………………………... 2 2. Célula con 2 flagelos ………………………………………………………………… 3 3. Célula pigmentada ………………………………………………………………….... 4 4. Célula desnuda, no lórica en el interior ……………………………………………… 8 8. Célula con pared celular ……………………………………………………………... 9 9. Célula lisa sin cualquier proyección, lobos o verrugas ……………………………... 11 11. Célula de otras formas …………………………………………………………….. 12 12. Protoplasma justapuesto en pared celular ………………………………………… 14 14. Flagelos emergiendo próximos unos de otros ……………………………………. 15 15. Polo celular anterior sin tal depression mediana …………………………………. 16 16. Cloroplastidio sin pirenoide ………………………………………….. Chloromonas 1. Individuo de hábito aislado, solitario ………………………………………………... 2 2. Célula con 2 flagelos ………………………………………………………………… 3 3. Célula pigmentada ………………………………………………………………….... 4 4. Célula desnuda, no lórica en el interior ……………………………………………… 8 8. Célula con pared celular ……………………………………………………………... 9 9. Célula lisa sin cualquier proyección, lobos o verrugas ……………………………... 11 11. Célula de otras formas …………………………………………………………….. 12 12. Protoplasma justapuesto en pared celular ………………………………………… 14 14. Flagelos emergiendo próximos unos de otros …………………………………….. 15 15. Polo celular anterior sin tal depression mediana ………………………………….. 16 16. Cloroplastidio con pirenoide ………………………………….….. Chlamydomonas

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EUGLENOPHYCEAE 1. Célula móvil en la fase vegetativa, siempre solitaria, jamás formando colonias arborescentes ………………………………………………………………………….... 2 2. Célula con 1 o 2 flagelos (en el ultimo caso, 1 flagelo va dirigido hacia al frente: natatorio. En el otro caso va dirigido hacia atrás: orientador del movimiento); núcleo lateral …………………………………………………………………………………... 21 21. Gránulo refringentes ausentes justo debajo de la película ……………………….... 22 22. Aparato paravestibular no es visible bajo microscopio óptico ……………………. 26 26. Flagelos insertados subapicalmente en la célula …………………... Dinematomonas

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ZYGNEMAPHYCEAE 1. Individuos unicelulares aislados o reunidos en colonias …………………………. 2 2. Individuos de hábito aislado, solitarios …………………………………………... 3 3. Pared celular construída por dos piezas que se encajan en la región mediana de la célula ………………………………………………………………………………. 10 10. Célula no constreñida en la región mediana ………………………………….... 11 11. Célula sin espino en cada polo ……………………………………….. Closterium

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XANTHOPHYCEAE 1. Individuo unicellular solitario, colonial o agregado ……………………………. 6 6. Individuo no ameboide, jamás formando pseudópodos ………………………… 8 8. Célula aislada o formando grupos ………………………………………………. 9 9. Célula sin espinos en los polos …………….……………………………………10 10. Individuo fijo a algún sustrato ……………………………………………..…. 11 11. Célula sin vacuolas pulsátiles ……………………………………….…………12 12. Célula sésil, fija directamente a un sustrato …………………………. .Lutherella 1.Indivíduo unicelular solitario, colonial o gregario ............................................................................ 6 6. Indivíduo no ameboide, jamás formando pseudópodos ................................................................... 8 8. Célula aislada o formando ………………………………................................................................ 9 9.Célula sin espinos en los polos ....................................................................................................... 10 10. Indivíduo de vida libre .................................................................................................................. 14 14. Indivíduo de vida libre................................................................................................................... 15 15. Parede celular formada por 1 o 2 piezas ....................................................................................... 16 16. Pared celular formada apenas por 1 pieza ................................................................... Raphidiella

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BACILLARIOPHYCEAE

1b. Frústulos carecen de septos ……………………………………………………… 3 3b. Forma no sigmoidal de la valva y el rafe ………………………….…………….. 6 6b. Estría compuesta de estrías claramente puntiformes ……………………………. 9 9b. Líneas longitudinales no presentes …………………………………………….. 13 13b. Rafe no elevado sobre la cara de la valve ……………………………………... 14 14b. Rafe no contenido entre rugosidad engrosada ………………………………… 16 16b. Área central no con stauros ……………………………………………………. 20 20b. Área central sin estigma ……………………………………………………….. 21 21b. Estría de otra manera ………………………………………………………….. 22 22b. Estría de otra manera ………………………………………………………….. 23 23b. Valva de otra manera ………………………………………………………….. 24 24b. Valva de otra manera ………………………………………………………….. 25 25a. Estría lineada, areolada orientada en largos ejes paralelos hacia el eje apical de la valva …………………………………………………………….…………… Navicula

1b. Valva de contorno simétrico alrededor del eje apical …………………………….. 9 9b. Valvas de otra manera …………………………………………………………… 10 10b. Rafe largo con una longitud similar en ambas valvas …………………………. 12 12b. Fisura próxima al rafe de forma no anclar ……………………………………... 13 13a. Valvas sin líneas longitudinales y con 0, 1 o aveces 2 estigmoides en un lado del área central ………………………………………...……………….….... Gomphonema 1a. Células vegetativas con dos valvas silíceas………………………………………. 44 44a. Valvas con rafe o pseudo-rafe……………………………………………………56 56a. Rafe verdadero en una o ambas valvas ………………………………………….68 68a. Valvas con un rafe bien desarrollado y nódulo central presente al menos en una de las valvas …………………………………………………………………………..69 69a. Ambas valvas con rafe …………………………………………………………..72 72a. Rafe encerrado en una quilla o canal rafidiano ………………………………….91 91a. Rafe dispuesto de otra manera, ubicado en el eje apical o algo desplazado hacia un lado …………………………………………………………………………………....95 95. Rafe encerrado en una quilla, estructuras tipo alas ausentes ……………………..96 96a.Rafe desplazado hacia un lado, células aisladas …………………………………97 97.Rafe de ambas valvas situados en posición diagonal no opuesta ………..Hantzschia

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1a. Células vegetativas con dos valvas silíceas …………………………………………….44 44a. Valvas con rafe o pseudo-rafe ………………………………………………………...56 56. Ambas valvas sin rafe…………………………………………………………………. 57 57a. Septos ausentes ………………………………………………………………………..59 59a. Costillas ausentes y estrías presentes ………………………………………………….61 61a. Eje transapical isopolar ………………………………………………………………..64 64a. Eje apical derecho ……………………………………………………………………..67 67a. Frústulos formando filamentos ……………………………………………….Fragilaria 1b. Las células generalmente singulares; si son coloniales, la colonia no es dinámica ……… 2 2b. Células lineales, sigmoid, o de alguna otra forma………………………………………….4 4b. Frústulo no retorcido ………………………………………………….…………………...5 5b.Proyecciones fibulares no completes a lo largo de la cara de la válvula …………..………6 6a. Las células normalmente estrechas, lineales o sigmoides, plastidios en cada extremo de la célula; estrías no interrumpidas por la esterna …………………….........………….....Nitzschia 1.Frústulos rectangulares; valvas lineares, de forma elíptica con ornamentación de disposición bilateral; rafe presente o ausente ……………………………………………………..…… 12 12. Sistema de rafe presente en por lo menos dos válvulas del frústulo ………..………..... 13 13. Rafe presente en apenas 1 de las superficies valvares del frústulo ………….....……… 14 14. Valva con rafe recto …………..…………………………………………………..…… 15 15. Valvas lineares, lanceoladas, estrictamente elípticas a elípticas-lineares, valva con rafe con estrías nunca interrumpidas por línea longitudinal, valva sin rafe con estrias radiadas .…………………………………………………………………………………………..… 16 16. Valva sin área hialina en forma de herradura …………………..……………………... 17 17. Estauro asimétrico ausente en la valva con rafe …………………………..…….……. 18 18. Patrón de estriación semejante en las valvas con o sin rafe; arreglo inconspicuo, externo, siempre central a la valva sin rafe …………………….………………………………..…. 19 19. Área central de la valva con rafe lateralmente expandida, extremo de la valva sin rafe linear, sin granulaciones esparci……………………………………………………...…… 20 20. Valvas linares, lanceoladas a lineares- elípticas, con extremidades redondas, subcapitadas, largamente rostradas. Área central de la valva sin rafe transversalmente expandido. Costillas en el área central de la valva sin rafe ausente o limitada por el encurtamiento de 1 estría mediana ……………………………..……………………………………….. Achanthidium

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1.Frústulos rectangulares; valvas lineares, de forma elíptica con ornamentación de dispo- sición bilateral; rafe presente o ausente ……………………………………………….… 12 12. Sistema de rafe presente en por lo menos dos válvulas del frústulo …………..…...... 13 13. Rafe presente en ambas de las superficies valvares del frústulo ………………..…….21 21. Rafe no localizada en el canal, fíbulas ausentes ……………………..….………….... 29 29. Rafe no envuelta por las estrías longitudinales ……………………….………....…... 32 32. Rafe desenvuelta, estendiendose hasta el nódulo central ……………………….....… 36 36. Valvas dorsoventrales …………...……………………………………..………….… 37 37. Epiteca o hipoteca visibles en el mismo plano valvar; la presencia de cantidades más altas de cópulas en las células del manto dorsal ………………………………… Amphora

1.Frústulos rectangulares; valvas lineares, de forma elíptica con ornamentación de dispo-sición bilateral; rafe presente o ausente ………………………………………….…….. 12 12. Sistema de rafe ausente en ambas válvulas del frústulo …………………………..... 62 62. Ausencia de septos y costillas …………………………………………………….... 65 65. Esterno linear estrecho, a veces de difícil distinción; estrías delicadas; areolas porosas ……………………………………………………………………………………….….. 66 66. Valvas isopolares …………………………………………………………...………. 67 67. Estrías de dispoción opuesta frontalmente ………………………………………..... 68 68. Esterno evidente; ausencia de espinos marginales …………………………... Synedra 1.Frústulos rectangulares; valvas lineares, de forma elíptica con ornamentación de dispo- sición bilateral; rafe presente o ausente ……………………………………………..… 12 12. Sistema de rafe presente en por lo menos dos válvulas del frústulo ……………..... 13 13. Rafe presente en ambas de las superficies valvares del frú.……………...………….21 21. Rafe no localizada en el canal, fíbulas ausentes ……………………………….…... 29 29. Rafe no envuelta por las estrías longitudinales …………………………….…...…. 32 32. Rafe desenvuelta extendiéndose en el nódulo central ……………………………... 36 36. Valvas no dorsoventrales ………………………………………………………….. 41 41. Valvas isopolares ………………………………………………………………….. 42 42. Valvas no sigmoides ………………………………………………………………. 43 43. Estrías alveoladas mostrando estructuras lineares largas, sólidas y sin ornamentación al microscopio óptico …………………………………………………………………. 44 44. Estrías más gruesas, de paralelas a radiadas a lo largo de la superficie valvar, tornándose convergentes o fuertemente radiadas en las extremidades ……... Pinnularia

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