CINÉTICA ENZIMÁTICA

ENZIMAS: CINÉTICA Y REGULACIÓN DE ACTIVIDADES

CURSO:

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR Y TISULAR II

DOCENTE:

DRA. Q.F VIOLETA MORÍN GARRIDO

ALUMNOS:

HERNÁNDEZ PACHERRES, ARTURO

JIMÉNEZ NÚÑEZ, DALIA

AÑO DE LA PROMOCIÓN DE LA INDUSTRIA

RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMÁTICO


ÍNDICE

1. CINÉTICA ENZIMÁTICA1.1.ESTUDIO LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES QUÍMICAS QUE SON

CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS1.2.PRINCIPIOS GENERALES 1.3.ENSAYOS ENZIMÁTICOS1.4.FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE PUEDEN MODIFICAR LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA1.5.CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN

1.5.1. REPRESENTACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN1.6.SIGNIFICADO DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS1.7.CINÉTICAS NO MICHAELIANAS1.8.CINÉTICA DEL ESTADO PRE-ESTACIONARIO1.9.GRAFICO DE LINEWEAVER-BURKE1.10. INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

1.10.1. Isosterica1.10.1.1. Reversible

1.10.1.1.1. INHIBIDOR COMPETITIVO1.10.1.1.2. INHIBIDOR NO COMPETITIVO1.10.1.1.3. INHIBIDOR ACOMPETITIVO

1.10.1.2. No Reversible1.10.2. Alosterica

2. ENZIMAS REGULADORAS2.1.Importancia Biomédica2.2.Regulación del flujo metabolito2.3.CLASIFICACIÓN

2.3.1. ENZIMAS ALOSTÉRICOS2.3.1.1. ALOSTERISMO2.3.1.2. MODIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA2.3.1.3. SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS2.3.1.4. CINÉTICA DE LOS ENZIMAS ALOSTÉRICOS2.3.1.5. ASPARTATO TRANSCARBAMILASA: CINÉTICA E 2.3.1.6. INHIBICIÓN2.3.1.7. MECANISMOS DE LA ACTIVIDAD REGULADORA DE

2.3.2. MODULACIÓN COVALENTE DE LOS ENZIMAS2.3.3. REGULADORAS2.3.4. ACTIVACIÓN COVALENTE DE LOS ZIMÓGENOS2.3.5. ISOZIMAS

CINÉTICA ENZIMÁTICA

ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES QUÍMICAS QUE SON CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS

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CURSO:

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR Y TISULAR II

DOCENTE:

DRA. Q.F VIOLETA MORÍN GARRIDO

ALUMNOS:

HERNÁNDEZ PACHERRES, ARTURO

JIMÉNEZ NÚÑEZ, DALIA


El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.

Los mecanismos enzimáticos pueden ser divididos en mecanismo de único sustrato o mecanismo de múltiples sustratos. Los estudios cinéticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cinética enzimática puede mostrar también el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados.

Sin embargo, no todas las catálisis biológicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen moléculas catalíticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traducción del ARNm, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado número de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reacción y sus cinéticas pueden ser estudiados y clasificados por los mismos métodos.

PRINCIPIOS GENERALES

La velocidad de la reacción va aumentando a medida que aumenta la concentración de sustrato hasta que la enzima se satura.

La reacción catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reacción no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catálisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reacción entre sustrato y producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones químicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor número de centros catalíticos estarán ocupados, lo que incrementará la eficiencia de la reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. En ese momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se añada más sustrato, no aumentará más la eficiencia.

Las dos propiedades cinéticas más importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la máxima velocidad de reacción que pueda alcanzar.

El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cómo responderá frente a un cambio de esas condiciones.

ENSAYOS ENZIMÁTICOS

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Un ensayo enzimático es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática. Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentración de producto (que va aumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimática. También se puede utilizar la espectrometría de masas para detectar la incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es convertido en producto.

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres dirigidos a través de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reacción. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catálisis o bien unir moléculas fluorescentes en lugares específicos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catálisis. Estos estudios están dando una nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales, en oposición a los estudios de cinética enzimática tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una población de millones de moléculas de enzima.

Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica en la gráfica.

Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimáticos suelen estar estandarizados para que el período inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas más fácilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rápida de líquidos permiten llevar a cabo medidas cinéticas de períodos iniciales cuya duración puede llegar a ser inferior a un segundo. Este tipo de ensayos rápidos son esenciales para medidas de la cinética del estado estacionario, discutida más abajo.

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Curva de progreso de una reacción enzimática. La pendiente representa, en el período inicial, la velocidad de la reacción. La zona de la meseta representa el equilibrio de la reacción (no confundir con la saturación).

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Esta aproximación es muy útil como alternativa a las cinéticas rápidas, cuando el período inicial es demasiado rápido para ser medido con precisión.

FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE PUEDEN MODIFICAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas óptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima verá incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalización de la misma, que dará lugar a una reducción progresiva de dicha actividad.

pH: el rango de pH óptimo también es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio se aleja del óptimo de la enzima, esta verá modificada su carga eléctrica al aceptar o donar protones, lo que modificará la estructura de los aminoácidos y por tanto la actividad enzimática.

Concentración salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentración de sales del medio es crucial para una óptima actividad enzimática. Una elevada concentración o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimática, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentración de iones para mantener su carga y su estructura.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Gr%C3%A1fica_de_la_saturaci%C3%B3n_de_una_enzima.jpg


REACCIONES CON UN SUSTRATO

Las enzimas que presentan un mecanismo de único sustrato incluyen isomerasas, tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa. Sin embargo, existen ciertas reacciones enzimáticas de único sustrato que no pertenecen a esta categoría de mecanismos, como es el caso de la reacción catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una molécula de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molécula de sustrato. Aunque durante la reacción solo participa un sustrato, la existencia de un intermediario enzimático modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la categoría de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido más adelante.

CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura abajo. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k1, k-1 y k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción.

El modelo de cinética michaeliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Equilibrio_enzima-sustrato.png


enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es k2.

(Ecuación 1)

k2 también llamado kcat o número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción (v ≈ k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeños cambios en la [S]. En este caso, la concentración total de enzima ([E] tot) es aproximadamente igual a la concentración del complejo ES:

La ecuación de Michaelis-Menten describe como la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación:

(Ecuación 2)

Esta famosa ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único.

La constante de Michaelis Km se define como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentración de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reacción es lenta comparada con la disociación de sustrato (k2 <<< k1), la constante de Michaelis Km será aproximadamente la constante de disociación del complejo ES, aunque sea una situación relativamente rara.

La situación más común, donde k2 > k1, es denominada cinética de Briggs-Haldane. La ecuación de Michaelis-Menten aún se mantiene bajo estas

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condiciones más generales, como puede derivarse de la aproximación del estado estacionario. Durante el período inicial, la velocidad de la reacción es más o menos constante, indicando que la [ES] también se mantendrá constante:

De esta forma, la concentración de ES viene dada por la siguiente expresión:

donde la constante de Michaelis Km se define así:

Con lo cual, después de operar todos los factores, obtenemos una fórmula general para la velocidad de la reacción que coincide con la ecuación de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la definición de la

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constante de Michaelis Km, la ecuación de Michaelis-Menten podría escribirse de la siguiente forma:

Donde [E] es la concentración de enzima libre. Así, la constante de especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solución, y ronda aproximadamente un valor de 1010

M-1 s-1 a 25º C. Curiosamente, este máximo no depende del tamaño del sustrato o de la enzima. La proporción de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparación cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuación de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] << Km) también proporciona la constante de especificidad.

REPRESENTACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad.

La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmax en las gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Lineweaver-Burke_plot.PNG


de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas.

La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de arriba, el resultado de este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mínimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondería a una concentración infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax.

El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolación de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las gráficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la Km. Un modelo lineal mucho más exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones científicas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por métodos más fiables basados en análisis de regresión no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalización de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del análisis.

SIGNIFICADO DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS

La importancia del estudio de la cinética enzimática reside en dos principios básicos. En primer lugar, permite explicar cómo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se comportará esa enzima in vivo. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo.

Sin embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los sistemas más simples. Por ejemplo, la malato deshidrogenasa sintetiza, en el interior de la mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser sustrato de diversas enzimas como la citrato sintasa, en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, en la gluconeogénesis, o la aspartato aminotransferasa, en la biosíntesis de ácido aspártico. Para ser capaz de predecir cuánto oxalacetato será desviado por cada una de las

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rutas es necesario saber tanto la concentración del oxalacetato como la concentración y los parámetros cinéticos de cada una de las enzimas. Este ejemplo denota la complejidad que podemos llegar a encontrar al intentar predecir el comportamiento de rutas metabólicas completas o de organismos enteros, por medio de modelos matemáticos. Aunque estos objetivos aún no se han alcanzado en eucariotas, se han obtenido ciertos progresos en bacterias, utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.

CINÉTICAS NO MICHAELIANAS

Algunas reacciones enzimáticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser representadas en una curva de saturación, lo que suele indicar una unión cooperativa del sustrato al centro catalítico de la enzima. Esto quiere decir que la unión de una molécula de sustrato influye en la unión de las moléculas de sustrato posteriores. Este comportamiento es el más común en las enzimas multiméricas, que presentan varias zonas de interacción con el sustrato. El mecanismo de cooperación es semejante al observado en la hemoglobina. La unión de una molécula de sustrato a una de las zonas de interacción altera significativamente la afinidad por el sustrato de las demás zonas de interacción. Las enzimas con este tipo de comportamiento son denominadas alostéricas. La cooperatividad positiva tiene lugar cuando la primera molécula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto de zonas de interacción. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene lugar cuando la primera molécula de sustrato unida reduce la afinidad de la enzima por nuevas moléculas de sustrato.

Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato transcarbamilasa bacteriana y la fosfofructoquinasa y con cooperatividad negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mamíferos.

La cooperatividad es un fenómeno bastante común y puede llegar a ser crucial en la regulación de la respuesta enzimática a cambios en la concentración de sustrato. La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho más sensible a la concentración de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentración de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a pequeños cambios en la concentración de sustrato.

La ecuación de Hill suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en cinéticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n) indica cuántas de las zonas de unión de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la unión del sustrato en el resto de las zonas de unión. El coeficiente de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa. n > 1: indica cooperatividad positiva.

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Curva de saturación de una enzima alostérica, donde se puede apreciar una cinética sigmoidea.

CINÉTICA DEL ESTADO PRE-ESTACIONARIO

Al realizar un ensayo enzimático y mezclar la enzima con el sustrato, existe un breve período inicial en el que no se produce ni síntesis de producto, ni estado intermedio de la enzima. El estudio de los milisegundos siguientes a la mezcla es denominado cinética del estado pre-estacionario y está relacionado con la formación y consumo de los intermediarios enzima-sustrato (ES o E*) hasta el momento en el que se alcanzan ciertas concentraciones y comienza el estado estacionario.

La primera enzima en la que se estudió este proceso, durante la reacción de hidrólisis, fue la quimiotripsina. La detección de intermediarios suele ser la principal evidencia necesaria para saber bajo qué mecanismo actúa la enzima. Por ejemplo, al realizar un ensayo de cinética rápida de una reacción enzimática gobernada por un mecanismo de ping-pong, podremos hacer un seguimiento de la liberación de producto P y medir la formación de intermediarios enzimáticos modificados E*. En el caso de la quimiotripsina, el intermediario enzimático se produce por un ataque nucleofílico del sustrato sobre una serina del centro catalítico, lo que genera una forma intermediaria acilada de la quimiotripsina.

En la figura de abajo, se puede observar como la enzima pasa rápidamente a un estado intermedio E* durante los primeros segundos de la reacción. Posteriormente, cuando es alcanzado el estado estacionario, la velocidad disminuye. Esta primera fase de la reacción proporciona la tasa de conversión de la enzima. Por lo tanto, la cantidad de producto liberado durante esta fase (que puede obtenerse prolongando la recta correspondiente al estado estacionario hasta cortar el eje y) también da la cantidad de enzima funcional presente en el ensayo.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Enzima_alost%C3%A9rica.svg


Representación gráfica del estado pre-estacionario de una reacción enzimática donde se puede apreciar la fase inicial rápida.

MECANISMO QUÍMICO

Uno de los objetivos más importantes en los estudios de la cinética enzimática es determinar el mecanismo químico que subyace en la reacción enzimática, por ejemplo, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformación de sustrato en producto. Las aproximaciones cinéticas discutidas anteriormente pueden proporcionar información relacionada con la velocidad de reacción de los intermediarios enzimáticos formados, pero no permitirán identificar qué intermediarios son exactamente.

Con el fin de determinar la etapa limitante de la reacción o los intermediarios que se forman durante la misma, se pueden llevar a cabo ensayos enzimáticos en diversas condiciones con enzimas o sustratos ligeramente modificados, que aporten datos al respecto. Un ejemplo característico de etapa limitante de una reacción es aquella en la que se rompe un enlace covalente dando lugar a un átomo de hidrógeno. Si intercambiamos cada átomo de hidrógeno por su isótopo estable, deuterio, podremos saber cual de los posibles hidrógenos transferidos es el que determina la etapa limitante. La velocidad sufrirá una variación cuando el hidrógeno crítico sea reemplazado, debido al efecto isotópico cinético primario, cuyo origen se encuentra en la mayor estabilidad de los puentes de deuterio, más difíciles de romper que los puentes de hidrógeno.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Estado_pre-estacionario.png


También es posible medir efectos similares por medio de otras sustituciones isotópicas, tales como 13C/12C ó 18O/16O, pero los efectos producidos en estos casos son más difíciles de detectar.

Los isótopos también pueden ser utilizados para obtener información acerca del destino de diversas partes de la molécula de sustrato cuando este es transformado en producto. Por ejemplo, a veces es difícil de determinar el origen de un átomo de oxígeno en el producto final, ya que puede provenir del agua o de la molécula de sustrato. Esto puede resolverse mediante la sustitución sistemática de los átomos de oxígeno de las moléculas que participen en la reacción, por su isótopo estable 18O, llevando posteriormente a cabo una búsqueda del isótopo en el producto obtenido. El mecanismo químico también puede ser elucidado estudiando los efectos cinéticos e isotópicos bajo diferentes condiciones de pH, alterando los niveles de iones metálicos u otros cofactores, por mutagénesis dirigida de aminoácidos conservados, o mediante el estudio del comportamiento de la enzima en presencia de análogos del sustrato.

GRAFICO DE LINEWEAVER-BURKE

Cuando se grafica la velocidad de la reacción, v0, contra la concentración de substrato, [S], no siempre es posible determinar la condición en que se ha llegado a la velocidad máxima, Vmax, debido al incremento de la pendiente en la hipérbola a concentraciones de substrato elevadas.

Figura: experimento cinético para la actividad enzimática.

Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo de Michaelis.

Aún así, si se grafica una doble recíproca, es decir, el inverso de la velocidad (1/v0) contra el inverso de la concentración de substrato (1/[S]), se obtiene una línea recta. El regráfico de Lineweaver-Burke, también se denomina de “dobles recíprocas” y se utiliza para calcular la Km y la Vmax así como para determinar el mecanismo de acción de los diversos tipos de inhibidores.

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La ecuación que describe a la gráfca de Lineweaver-Burke es:

[ ] Vmax

1

SVmax

Km

v

1

0

(3)

que describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a –1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmax.

Figura: experimento cinético para la actividad enzimática. Regráfico de Lineweaver-Burke

Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo.

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que reducen o anulan la actividad enzimática. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la desaparición del inhibidor restaura la actividad enzimática) o irreversible (el inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

1. Inhibidores reversibles

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Los inhibidores enzimáticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos, acompetitivos, no competitivos y mixtos, según el efecto que produzcan en las constantes cinéticas Km y Vmax. Este efecto dependerá de que el inhibidor se una a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos, como se puede observar en la figura de abajo y en la tabla inferior. Para clasificar correctamente un inhibidor pueden llevarse a cabo estudios de su cinética enzimática en función de la concentración de inhibidor. Los cuatro tipos de inhibición dan lugar a diagramas de Lineweaver-Burke y de Eadie-Hofstee que varían de diferente forma con la concentración de inhibidor. Para abreviar, se usan dos símbolos:

y

Donde Ki y K'i son las constantes de disociación para unirse a la enzima y al complejo enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor reversible, los valores aparentes de la Km y la Vmax pasan a ser (α/α')Km y (1/α')Vmax, respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos más comunes.

Tipo de inhibición Km aparente Vmax aparente

solo Ki ( ) competitiva

solo Ki' ( ) acompetitiva

Ki = Ki' ( ) no competitiva

Ki ≠ Ki' ( ) mixta

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Los ajustes por regresión no lineal de los datos de cinética enzimática pueden proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociación Ki y Ki'.

Esquema de una reacción enzimática en presencia de un inhibidor enzimático de unión reversible.

2. Inhibidores irreversiblesLos inhibidores enzimáticos también pueden unirse e inactivar una enzima de forma irreversible, generalmente por medio de modificaciones covalentes de residuos del centro catalítico de la enzima. Estas reacciones decaen de forma exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de los niveles de saturación, mantienen una cinética de primer orden con respecto al inhibidor

MECANISMOS DE CATÁLISIS

El modelo de ajuste inducido es el más utilizado al realizar estudios de interacción enzima-sustrato. Este modelo propone que las interacciones iniciales entre la enzima y el sustrato son relativamente débiles, pero suficientes para producir ciertos cambios conformacionales en la enzima, que estabilizan e incrementan la fuerza de la interacción. Estos cambios conformacionales implican a una serie de aminoácidos catalíticos del centro activo, en los cuales se producen los enlaces químicos correspondientes entre la enzima y el sustrato. Después de la unión, uno o más mecanismos de catálisis disminuyen la energía del estado de transición de la reacción, por medio de una ruta alternativa a la reacción. Los mecanismos de catálisis se clasifican en base a diferentes criterios: catálisis covalente, catálisis por proximidad y alineación de orbitales, catálisis ácido-base general, catálisis por iones metálicos y catálisis electrostática.

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Los estudios de cinética enzimática no permiten obtener el tipo de catálisis utilizada por una enzima. Sin embargo, algunos datos cinéticos pueden proporcionar una serie de indicios que lleven a realizar otro tipo de estudios dirigidos a determinar dicho tipo de catálisis. Por ejemplo, en un mecanismo de ping-pong la cinética del estado pre-estacionario puede estar sugiriendo una catálisis de tipo covalente. Por otro lado, variaciones en el pH pueden producir efectos drásticos en la Vmax pero no en la Km, lo que podría indicar que un residuo del centro activo precisa un estado concreto de ionización para que se pueda llevar a cabo la catálisis enzimática.

La variación de energía como función de una coordenada de reacción muestra la estabilización del estado de transición cuando dicha reacción es llevada a cabo por una enzima.

ENZIMAS REGULADORES

Todos los enzimas exhiben diversas características ,que puede pensarse que contribuyen elementos de la regulación de sus actividades en las células vivas.Todos ellos poseen un pH óptimo característico, que hace posible la alteración de sus velocidades catalíticas con los cambios de pH intracelulares.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Catalisis_enzimatica1.jpg


Las velocidades de todas las reacciones enzimáticas dependen también de la concentración del sustrato ,que puede variar significativamente en las condiciones que prevalecen en el interior de las células .Además ,muchos enzimas precisan de iones metálicos como Mg 2+ o K+, o de coenzimas para su actividad ,indicando que las fluctuaciones en la concentración de estos metales o coenzimas en la célula pueden regular la actividad del enzima. Sin embargo ,además de estas propiedades comunes a todos los enzimas ,algunos de ellos poseen otras ,que les confieren específicamente papeles reguladores del metabolismo. Estas formas, mucho más especializadas ,se denominan enzimas reguladores .Existen dos tipos principales de enzimas reguladores: 1)los enzimas alostéricos ,cuya actividad catalítica es modulada por la unión no covalente de un metabolito específico a un centro de la proteína distinto del centro catalítico , y 2) los enzimas modulados covalentemente, con formas activas e inactivas interconvertidas por la acción de otros enzimas. Algunos de los enzimas de esta segunda clase responden también a moduladores alostéricos no covalentes .Ambos tipos de enzimas reguladores son responsables de alteraciones en el estado metabólico de la célula o tejido en un intervalo de tiempo relativamente corto( los enzimas alostéricos en un intervalo de segundos ,y los regulados covalentemente en unos minutos).Examinaremos a continuación las propiedades de estas clases de enzimas reguladores.

CLASIFICACIÓN

ENZIMAS ALOSTÉRICOS

Los enzimas alostéricos ,cuya actividad catalítica es modulada por la unión no covalente de un metabolito específico a un centro de la proteína distinto del centro catalítico.

ALOSTERISMO

No se deben confundir los efectores alostéricos con el efecto de los activadores e inhibidores que pueden ser moléculas o iones que alteran la velocidad de la reación enzimática. Estos activadores e inhibidores actúan sobre el sitio activo de la enzima. El activador incrementa la velocidad de reacción y el inhibidor decrece.

MODIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Este mecanismo de regulación es muy común. Se presenta por lo general en aquellas enzimas que están formadas por varias sub-unidades o polipéptidos. Consiste en que una molécula diferente al sustrato o efector alostérico, se une a la enzima en un sitio diferente al sitio activo o de catálisis (que es donde es modificado el sustrato), de manera que se altera la conformación de la enzima polimérica y resulta una nueva

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conformación espacial de ella. El efector alostérico puede resultar estimulador de la catálisis por lo que se le nombra efector alostérico positivo o bien un inhibidor de la catálisis o efector alostérico negativo. En las rutas metabólicas no falta la presencia de este tipo de enzimas que presentan alosterismo.

Un ejemplo es el de la enzima alostérica fosfofructocinasa que se en uno de los pasos de la vía glucolítica y cuyos efectores positivos son el

AMP o el ADP y el efector negativo es el ATP. En otras palabras, cuando hay presencia abundante de el AMP o del ADP quiere decir que hay poca energía disponible en la célula y por lo tanto, la vía glucolítica, que es la transformación de glucosa a piruvato con la producción neta de 2 moléculas de ATP, se ve acelerada en ese sentido. Sin embargo, si hay abundancia de ATP el uso de la vía glucolítica disminuye, inhibiendo alostéricamente la enzima fosfofructocinasa. Esto determina que esta enzima sea considerada como la más importante enzima regulatoria de esta vía o ruta metabólica.

SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS

En muchos sistemas multienzimáticos el producto final de la secuencia de reacciones puede actuar como un inhibidor específico de un enzima situado al comienzo de la secuencia o muy próximo a él, lo cual determina la velocidad de la secuencia completa de reacciones resulte condicionada por la concentración de producto final, en el estado estacionario el ejemplo clásico es la secuencia multienzimática que cataliza la conversión de L-treonina en L-isoleucina que procede en cinco etapas catalizadas enzimáticamente (Fig.9-18).

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Retroinhibición de la formación de la Isoleucina a partir de la Treonina

El primer enzima de la secuencia, la L–treonin-deshidartasa, es fuertemente inhibida por la L- isoleucina ,que es el producto final pero no lo es por ningún otro producto intermedio de la secuencia. Las características cinéticas de la inhibición por la isoleucina son atípicas; la inhibición no es competitiva con el sustrato ,la L-treonina ,ni tampoco no competitiva o acompetitiva .La isoleucina es muy específica como inhibidor ,sin embargo otros aminoácidos o compuestos relacionados no inhiben .Este tipo de inhibición se designa de diversas maneras : inhibición por el producto final, inhibición feed back y retroinhibición. El primer enzima de esta secuencia el cual es inhibido por el producto final, se llama enzima alostérico, nombre propuesto por J. Monod, J.P. Changeux y F. Jacob, del instituto Pasteur de París ,que fueron los primeros que desarrollaron una amplia teoría para la función de este tipo de enzimas reguladores. El término alostérico significa “ otro espacio” u “ otra estructura ” ; los enzimas alostéricos poseen , además del centro catalítico ,el “otro espacio” al que se enlaza de modo reversible y no covalente el efector o modulador .

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En general, el centro alostérico es tan específico para la unión del modulador, como el centro catalítico lo es para la unión del sustrato. Algún modulador por ello se les denomina moduladores inhibidores o negativos .Otros enzimas alostéricos pueden tener moduladores positivos o estimuladores. Cuando un enzima alostérico posee solamente un modulador específico, se dice que es monovalente. Algunos enzimas alostéricos responden a dos o más moduladores específicos, cada uno de ellos unido a un centro específico del enzima; se dice entonces que son polivalentes. Además un mismo enzima alostérico puede poseer tanto moduladores positivos como negativos .Dos o

más sistemas multienzimáticos pueden estar conectados mediante uno o más enzimas polivalentes, constituyendo una red de control

La primera etapa en una secuencia de reacción multienzimática, es decir, la etapa catalizada por el enzima alostérico ,por lo general, irreversible en las

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condiciones intracelulares. Con frecuencia se la designa como reacción determinante ;una vez que se ha producido, se verifican todas las demás reacciones subsiguientes de la secuencia .Desde luego ,constituye una estrategia por parte de la célula al regular una ruta metabólica en la etapa inicial, para conseguir así las máxima economía de metabolitos.

Los enzimas alostéricos poseen ,generalmente ,pesos moleculares muchos mayores, son más complejos y con frecuencia más difíciles de purificar que las enzimas ordinarios, debido a que casi todos los enzimas alostéricos conocidos son oligómeros y poseen ,por tanto dos o más subunidades constituidas por cadenas polipeptídicas ,por lo general en número par ; hay algunos que contienen muchas cadenas .Los enzimas alostéricos muestran cierto numero de propiedades anómalas .Algunos son inestables a O °C pero estables a temperatura ambiente o a la del cuerpo; en ellos se diferencian de los enzimas unicatenarios, que no muestran inestabilidad frente al frío .La mayor parte de los enzimas alostéricos exhiben una dependencia atípica de la velocidad inicial de reacción frente a la concentración del sustrato y no cumplen la clásica relación de Michaelis-Menten. Además, la inhibición producida por el metabolito modulador no se ajusta siempre a los bien conocidos prototipos de inhibición competitiva, no competitiva y acompetitiva Los enzimas alostéricos muestran dos tipos de control diferentes : heterotrópico y homotrópico ,según la naturaleza de la molécula moduladora. Los enzimas heterotrópicos son estimulados o inhibidos por la molécula de un modulador o efector distinta de la de sus sustratos. El sustrato de la treonin-deshidratasa es la treonina, mientras que su modulador es la L-isoleucina .Por otra parte, en los enzimas homotrópicos , el sustrato actúa también como modulador .Estos enzimas homotrópicos contiene dos o más centros de unión para el sustrato ; la modulación de estos enzimas depende de cuántos sean los centros del sustrato que estén ocupados sin embargo, una gran parte de los enzimas alostéricos son del tipo mixto homotrópico-heterotrópico sobre los cuales pueden actuar como moduladores ,tanto el sustrato como algún otro metabolito ( o varios).

Cinética de los enzimas alostéricos

Los enzimas alostéricos no muestran generalmente la clásica relación cinética de Michaelis-Menten entre la concentración del sustrato, V máx. y kM

.Porque su comportamiento cinético está muy alterado por las variaciones de concentración del modulador alostérico .

Fig. A : Enzima no regulador que obedece a la ecuación de Michaelis –Menten (hipérbole rectangular) .Se necesita un incremento de 81 veces en S ,para que la actividad pase desde el 10 al 90 por ciento de la máxima.

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Muchos enzimas alostéricos , especialmente los homotrópicos, muestran una curva sigmoide al relacionar gráficamente la velocidad inicial con la concentración del sustrato , en lugar de la hipérbole que aparece en la relación de Michaelis-Menten .La curva sigmoidal implica que la unión de la primera molécula de sustrato con el enzima intensifica la unión de las moléculas de sustrato subsiguientes a los otros centros a los que se fija el sustrato ,del mismo modo como la unión de una molécula de oxígeno a la hemoglobina intensifica la unión de nuevas moléculas de oxígeno .Las curvas sigmoidales son a veces muy inclinadas de suerte que un pequeño incremento de la concentración del sustrato puede provocar una aceleración muy grande de la velocidad de catálisis , mucho mayor incluso que el exhibido por un enzima sencillo no regulador que obedezca a la relación hiperbólica de Michaelis-Menten. Tal relación sigmoidal constituye un ejemplo de cooperatividad positiva ,ya que el enlace de una molécula de sustrato en un centro incrementa la unión de las moléculas subsiguientes en los demás centros. Debe aclararse sin embargo, que no todos los enzimas alostéricos exhiben curvas sigmoidales al representar VO frente a S ; además ,no todos los enzimas que muestran tales curvas son necesariamente alostéricos .

FIG. B : Enzima regulador que muestra una curva sigmoidal (cooperatividad positiva ) .Solamente de necesita que S aumente nueve veces ,para que se incremente la actividad desde el 10 al 90 por ciento de la máxima.

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Algunos enzimas alostéricos muestran un comportamiento opuesto : la unión de una molécula de sustrato provoca un descenso en la unión de las moléculas de sustrato subsiguientes.El hecho se designa por el nombre de cooperatividad negativa, la cual da por resultado una curva más aplanada en la representación de la velocidad inicial frente a la concentración del sustrato y se aproxima a la saturación mucho más lentamente que los enzimas no reguladores o que los de cooperatividad positiva.

FIG C: Enzima regulador que muestra cooperatividad negativa .La concentración del sustrato debe aumentarse unas 6000 veces para que la actividad se eleve desde el 10 al 90 por ciento de la máxima.

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Algunos enzimas alostéricos responden a la unión de un modulador con un cambio en el valor de la KM aparente para el sustrato sin que varíe la VMÁX

(fig. 9-20). Un modulador negativo producirá entonces un incremento en la KM aparente y un modulador positivo un descenso de dicho valor .(Se emplea aquí el término “ KM aparente”para designar únicamente la concentración de sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima ¸ este valor no puede emplearse para calcular la velocidad inicial de un enzima alostérico , ya que la representación de VO frente a (S( no es una hipérbole rectangular tal como requieren la hipótesis y ecuaciones de Michaelis-Menten . Por tanto , un modulador negativo disminuirá la velocidad de reacción a una concentración de sustrato no saturante y constante, mientras que un modulador positivo producirá un incremento de la velocidad .Los enzimas alostéricos que responden a los moduladores positivos o negativos con un cambio en el valor de la KM aparente , pero sin que varíe el valor de VMÁX reciben, a veces, el nombre de enzimas K .

FIG. A.- Enzimas K. Estos enzimas responden a las concentraciones crecientes de los moduladores acelerantes ,con un descenso de la KM

aparente ,y al incremento de las concentraciones de los moduladores inhibidores ,con un incremento de la KM aparente ,de modo que a una concentración fija no saturante del sustrato ,la velocidad de reacción aumenta en presencia de un modulador acelerante y disminuye en presencia de un modulador inhibidor. La VMÁX de los enzimas K permanece constante.

Inversamente,los enzimas alostéricos que muestran un cambio en la VMÁX en respuesta al modulador sin que varíe el valor de la KM aparente, se llaman enzimas M ; existen menos ejemplos de esta clase . Sin embargo , no todos los enzimas alostéricos pueden situarse en una de estas dos clases .Desde

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un punto de vista general ,la interpretación de las propiedades reguladoras de los enzimas alostéricos deducida de las representaciones de la velocidad inicial frente a la concentración del sustrato , sólo es biológicamente significativa , en el intervalo más inferior de concentraciones de sustrato , ya que las concentraciones de los metabolitos en las células intactas están muy por debajo de los niveles de saturación de los enzimas que actúan sobre ellas.

FIG. B.- Enzimas M. Estos enzimas experimentan cambios en su VMÁX ,pero no en el valor de su KM aparente ,en presencia de moduladores aceleradores o inhibidores.

Los términos KM Y VMÁX no pueden aplicarse en rigor a los enzimas que no obedecen a la relación hiperbólica de Michaelis –Menten; se emplean aquí solamente para designar la concentración de sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima y dicha velocidad , máxima respectivamente.

La capacidad de un enzima alostérico para ser activado, o inhibido , por sus moduladores específicos puede ser abolida , a veces, sin que se lesione su actividad catalítica, muchas veces por medio de la calefacción suave , por exposición a la úrea o bien tratando el enzima como un agente que se produzca una modificación química del centro modulador.Se dice entonces que el enzima se ha desensibilizado .Un enzima alostérico desensibilizado no solamente pierde su sensibilidad frente a los moduladores , sino que puede incluso mostrar una cinética normal de Michaelis-Menten .Las mutaciones genéticas producen, en ocasiones, la biosíntesis de un enzima

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alostérico defectuoso no sensible frente a su modulador normal probablemente por haberse producido una sustitución no funcional de un resto aminoácido crítico.

Aspartato trancarbamilasa- cinetica e inhibición

La Aspartato Transcarbamoilasa o carbamoil transferasa es una enzima importante en la biosíntesis de nucleótidos de pirimidina. La estructura y las propiedades alostéricas de la enzima de la bacteria E. Coli han sido extensamente estudiadas. Ella cataliza una reacción entre el ácido aspártico y el carbamoil fosfato para generar N-carbamoil aspartato con la liberación de fosfato inorgánico.

La enzima completa y activa (abreviada ATCasa) consta de no menos de 12 diferentes cadenas proteicas o subunidades. Ella contiene dos componentes catalíticas hechos de tres subuniddes idénticas. Uno de estos componentes catalíticos se muestra en el diagrama con las subunidades en diferentes tonos de azules. Estos componentes se arreglan uno al lado del otro y efectivamente formando las dos caras principales de la enzima completa.

El resto de la enzima se compone de trescomponentes regulatorios cada uno de dos subuniddes. Estos componentes forman las esquinas de la enzima la cual es mas o menos de forma triangular. Una de las esquinas es mostrada en diagrama y las dos subuniddes se muestran en diferentes tonos de verde.

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Los componentes catalíticos y reguladores pueden ser separados. Si ellos seencuentran separados entonces los componentes catalíticos serán aún capaces de catalizar la reacción en la forma usual, excepto que no tendrán ninguna de las propiedades alostéricas. No muestran signos de cooperatividad de substrato y no reaccionan con los Efectores alostéricos.

Los Componentes Regulatorios no pueden levar a cabo la catálisis, pero pueden unirse a las Efectores usuales de la ATCasa tales como el CTP (un inhibidor) y el ATP (un activador)

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RETROALIMENTACIÓN

Este mecanismo de regulación metabólica en ocasiones es confundido con la inhibición y la activación.

La inhibición o activación da cuando una molécula actúa sobre el sitio activo de una enzima modificandosu velocidad de reacción enzimática, ya sea incrementándola (activación) o decreciéndola (inhibición).

Tambien hay una retroalimentación, positiva (activadora) y una retroalimentación negativa (inhibitoria). Se presenta alterando no sólo una sino más reacciones enzimáticas secuenciales de una ruta metabólica.

Por ejemplo, en la ruta de biosíntesis de bases pirimídicas las células procarióticas como E.coli presentan retroalimentación negativa.

La retroinhibición (que también así se le conoce) se presenta cuando los niveles de CTP son altos y puede retroinhibir a la enzima aspartato transcarbamilasa o primer paso de la vía de biosíntesis de bases pirimídicas.

La retroalimentación positiva o la negativa, se presenta en la ruta de biosíntesis de bases púricas.

MODULACIÓN COVALENTE DE LAS ENZIMAS REGULADORAS

Una característica que diferencia las enzimas de los catalizadores químicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser más o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulación:

Nivel de síntesis : que haya más o menos moléculas de la enzima (ya lo veremos).

Nivel de actividad : que las moléculas de enzima existentes estén más o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrínsecos a la enzima, Ph, Tª, [S, [I, o por factores intrínsecos a la propia enzima; en este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulación. Están especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a señales externas.

En la célula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimáticos. En cada ruta hay al menos una enzima

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reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulación de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos:

o Enzimas alostéricas. Funcionan mediante la unión reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulación positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reacción (alosterismo homotrópico) o ser otra sustancia (alsoterismos heterotrópico). Normalmente se trata de enzimas multiméricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades.

o Enzimas interconvertibles Por modificación covalente reversible, como por ejemplo por fosforilación/defosforilación o modificación redox.

o Mediante proteínas reguladoras que se unen a la enzima. o Mediante la eliminación proteolítica de pequeños segmentos

peptídicos (esto es irreversible).

EFECTO DE LA MODIFICACIÓN COVALENTE SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra más activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al liberar algún grupo químico.

En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es más activa que la no fosforilada, mientras que en las vías biosintéticas ocurre lo contrario. En las figuras inferiores se ilustra la activación de una proteína por fosforilación.

Elementos de la reacción

El enzima no fosforilado es inactivo

El enzima fosforilado es activo

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MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R > T (Figura inferior):

Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos (Figura inferior izquierda).

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Activador alostérico: favorece la unión del sustrato

Inhibidor alostérico: impide la unión del sustrato

Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimática son los moduladores negativos. Si estos moduladores actúan en lugares distintos del centro activo del enzima se llaman inhibidores alostéricos (Figura superior derecha) .

ACTIVACION COVALENTE DE ZIMOGENOS

Ciertas proteínas se fabrican y secretan en forma de proteínas inactivas conocidas como proproteinas. Cuando estas son enzimas , las proproteinas correspondientes se llaman proenzima o zimogenos.

¿Cuál es la razón de que ciertas proteínas se secreten como su variante inactiva? La razón de esto es para que sirvan de reserva y esto facilite su movilización rápida en respuesta a la demanda fisiológica o fisiopatologica.

Un tipo de regulación de la actividad enzimatica algo diferente, es la activación catalizada enzimaticamente de los precursores inactivos de los enzimas (zimogenos) para dar las formas cataliticamente activas. Los ejemplos clásicos son los enzimas digestivos pepsina, tripsina y quimotripsina, que se sintetizan como zimogenos inactivos pepsinogeno, tripsinogeno y quimotripsinogeno respectivamente. Cuando estos enzimas son secretados al tracto gastrointestinal, se transforman en sus formas activas mediante la escisión hidrolitica selectiva de uno o varios enlaces peptidicos de la molécula del zimogeno . El pepsinogeno se convierte en pepsina activa en el estomago por acción de la pepsina libre a Ph bajo, que libera 42 restos aminoácidos en forma de una mezcla de peptidos, procedentes del extremo N-terminal del pepsinogeno:

pepsina

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Pepsinogeno Pepsina + peptidos

El tripsinogeno se convierte en tripsina activa por eliminación de un exapeptido del extremo N-terminal, por la accion del enzima enteroquinasa:

enteroquinasa

Tripsinogeno Tripsina + Exapeptido

La conversión del quimotripsinogeno en quimotrpsina activa se produce por la actuación de la tripsina, la cual provoca la eliminación de dos fragmentos dipeptidicos, tal como se descrio con anterioridad

tripsina

Quimotrpsinogeno Qumotripsina + 2 dipeptidos

Estos zimogenos se ven impedidos de ejercer su actividad proteolitica sobre las proteínas intracelulares en tanto que permanecen en el interior de las células en las que han sido sintetizados. Solamente se hallan en disposición de generar la forma activa cuando son secretados al tracto gastrointestinal. Sin embargo este tipo de regulación covalente solo se realiza en una sola dirección no se conocen reacciones enzimas en sus formas zimogenas respectivas.

ISOENZIMAS

Las isoenzimas son distintas formas moleculares de una misma enzima que presentan muestran especificidad por el mismo sustrato.

Las distintas formas moleculares de alcohol deshidrogenasa (ADH) se diferencian en la carga eléctrica neta, en el peso molecular o en ambas simultáneamente, pero todas ellas deshidrogenan el alcohol (sustrato) convirtiéndolo en aldehído. La principal característica de las isoenzimas es quese producen por sustitución de un aminoácido por otro de distinta polaridad, por ejemplo, cambio de un aminoácido ácido por otro básico o neutro.

Algunos autores opinan que solamente deben considerarse como isoenzimas aquellas formas moleculares que están presentes en el mismo órgano o tejido, que tienen un origen genético similar y actividades catalíticas muy similares. Las peroxidasas, las esterasas y las fosfatasas

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http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/isoenzimas/Expliso.htm#Isoenzima




presentan distintas formas moleculares en el mismo órgano o tejido, pero tienen una amplia especificidad de sustrato, de manera que pueden transformar diferentes compuestos. Además, pueden tener diferentes orígenes y, por tanto, no se las considera como verdaderas isoenzimas.

La estructura cuaternaria activa de las isoenzimas puede ser fundamentalmente de tres tipos:

1.- Monómeros: isoenzimas que poseen una sola cadena polipeptídica como estructura cuaternaria activa.

2.- Dímeros: isoenzimas cuya estructura cuaternaria activa consiste en la unión de dos polipéptidos.

3.- Tetrámeros: la estructura cuaternaria activa de estas isoenzimas consta de cuatro polipéptidos.

Las isoenzimas diméricas y tetraméricas pueden estar formadas por subunidades o polipéptidos iguales o diferentes.

1.- Homodímeros: isoenzima formada por dos polipéptidos idénticos.

2.- Homotetrámero: isoenzima constituida por cuatro cadenas polipeptídicas iguales.

3.- Homopolímeros: isoenzimas formadas por múltiples cadenas polipeptídicas idénticas.

4.- Heterodímero: isoenzima constituida por dos polipéptidos diferentes.

5.- Heterotetrámero: tetrámero constituido por la unión de cuatro polipéptidos diferentes, pudiendo ser los cuatro distintos gdba, ser tres diferentes aadb, o tener dos tipos distintos aabb.

No se han descrito, hasta el momento, isoenzimas cuya estructura cuaternaria activa conste de tres cadenas polipeptídicas (trímeros).

Un término que se emplea con bastante frecuencia es el de Patrón Isoenzimático o Zimograma, conjunto de bandas pertenecientes al mismo sistema enzimático que se observan en el mismo individuo. Deseo destacar que he utilizado la palabra banda en vez de la de isoenzima para indicar que una banda que se observa en un gel, después de llevar a cabo una electroforesis, puede ser una sola isoenzima o la superposición de varias isoenzimas diferentes con igual migración electroforética.

Otro término usado con mucha frecuencia es el de Alozimas o Alelozimas, empleado para referirse a las distintas formas moleculares de una misma enzima producidas por distintos alelos del mismo locus. Naturalmente, el vocablo isoenzima es más amplio, ya que se incluye tanto a las diferentes formas moleculares de una misma enzima producidas por alelos de mismo locus, como a las producidas por alelos de distintos loci.

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La lactato desidrogenasa aparece en cinco formas isozimicas en los tejidos de rata y de otros vertebrados.

Lactato + NAD + Piruvato + NADH + H +

En esta reacción el NAD y el NADH representan respectivamente a las formas oxidada y reducida de di nucleótido de nicotinamida y adenina. Las cinco isoenzimas poseen el mismo peso molecular alrededor de 134,000 y todos ellos contienen cuatro cadenas polipeptídicas cuyo peso molecular es de 33,500. los cinco isoenzimas están constituidas por cinco combinaciones diferentes de dos clases de cadenas polipeptídica designadas como M y H. El isozima que predomina en el músculo esquelético posee cuatro cadenas M idénticas y se designa como M ; otro que predomina en el corazón, posee cuatro cadenas H idénticas y se designa por H . Los otros tres isozimas tienen la composición M3 H, M2 H2 y MH3. Se han aislado las cadenas sencilla M y H, y se ha comprobado que difieren significativamente en su contenido en aminoácidos y en su secuencia. Cuando las cadenas M y H sencillas, inactivas por si solas se mezclan en proporciones adecuadas, pueden formarse espontáneamente ( in vitro) todos los isozimas de la lactato deshidrogenasa, poseyendo todos ellos plena actividad catalítica. La investigación genetica indica que las secuencias aminoácidos de las dos cadenas polipeptidicas diferentes M y uyuyH dela lactato deshidrogenas se hallan codificadas por dos genes diferentes. La Biosíntesis de los dos tipos de cadenas y por tanto, las cantidades relativas de los isozimas de la lactato deshidrogenasa presentes en una determinada celula se encuentran bajo regulación genética .Los isozimas de la lactato deshidrogenasa existen en diferentes proporciones en los diferentes tejidos. Además, las proporciones relativas de los isozimas de la lactato deshidrogenasa en un tejido pueden cambiar durante el desarrollo embrionario. Constituyen también un elemento importante para el diagnostico de las enfermedades del corazón y del hígado .E cuidadoso estudio cinético de los isozimas de la lactato deshidrogenasa a demostrado que aunque todos ellos canalizan la misma reacción , difieren significativamente en sus valores de Km respecto a sus sustratos , particularmente respecto al piruvato, asi como en los valores de Vmax cuando el sustrato es el piruvato. El isozima M4 característico del músculo esquelético y de los tejidos embrionarios, posee un valor relativamente bajo de Km para el,piruvato y una velocidad relativamente elevada en la reducción del piruvato a lactato. El isozima H4 es característico del corazón y de otros músculos rojos, posee una Km relativamente elevada para el piruvato y lo reduce a una velocidad relativamente baja. Además la desh hidrogenación del lactato catalizado por el isozima H4 es fuertemente inhibida por el piruvato. Los demás isozimas de la lactato deshidrogenasa poseen propiedades cinéticas intermedias entre las los lisozimas M4 y H4 en proporción a sus contenidos relativos de cadenas M y H .

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Estas características cinéticas, si se comparan con las características metabólicas de los tejidos en los que predominan los isozimas M4 Yh4

proporcionan cierta comprensión a cerca de la función de los isozimas de la lactato deshidrogenasa. El músculo esquelético y el tejido embrionario tienden a utilizar la glucosa anaerobicamente, degradándola hasta formar lactato en el proceso de la glucólisis . La lactato deshidrogenasa cataliza la ultima etapa de la glucólisis, la reducción del piruvato a lactato. De este modo el músculo esquelético en el que predomina el isozima M4 que posee una Km bajo y una Vmax elevada para el piruvato, esta bien adaptado para convertir rápidamente el piruvato en lactato. Por otra parte, el músculo cardiaco no forma normalmente lactato a partir de la glucosa; oxida el piruvato a dióxido de carbono aeróbicamente sen que tenga lugar la formación intermedia de lactato. El isozima M4 se halla bien adaptado para esta ruta diferente del metabolismo de la glucosa ya que la Km para el piruvato es elevada y la V max para la reducción del piruvato a lactato es baja, y también resulta inhibido por el exceso de piruvato; todos estos factores disminuyen en gran medida, su actividad en l dirección de la formación de lactato. Aunque el músculo cardiaco no emplea, por lo general, lactato hidrogenasa en la oxidación de la glucosa, en casos de emergencia en que el suministro de oxigeno disminuye, lka presencia de la lactato deshidrogenasa permite al corazón obtener su energía de la conversión del glucogeno en lactato.

Hoy día conocemos isozimas en un gran numero de enzimas diferentes generalmente estan constituidos por mezclas íntimamente asociadas de diferentes clases de cadenas polipeptidicas en ls que están combinadas las propiedades cinéticas y de enlace especificas aportadas por cada tipo de cadena.Mucos enzimas alostericos se encuentran en forma de dos o mas isozimas que varían en su sensibilidad respecto a sus moduladores alostericos .En otros casos pueden encontrarse diferentes isozimas en los diversos compartimientos intracelulares.El estudio delos isozimas es de fundamental significación en la investigación de la base molecular de la diferenciación celular y de la morfogénesis Muchas proteínas no solo las que tienen actividad catalítica pueden presentarse en formas múltiples en las células.

CONCLUSION

Nuestro organismo requiere en si de muchos factores que mantengan la homeostasis(normal funcionamiento de nuestro cuerpo o equilibrio) y uno de esos factores son las enzimas reguladoras las cuales cumplen una función muy importante en la síntesis de carbohidratos, lípidos , proteínas esenciales para el buen funcionamiento de nuestro cuerpo, es por eso que cuando se afecta este equilibrio por una enfermedad como la muscular en el ejemplo empleado se altera el numero de enzimas reguladoras y su funcionamiento, ahora el hallazgo del numero anormal de estas enzimas reguladoras nos ayudaran en el diagnostico de la enfermedad pues nos

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indicaran cual es el órgano afectado claro aparte de la clínica respectiva que el medico hará en su examen clínico.Es por eso que cuando se sospecha de alguna enfermedad en los análisis respectivos se piden por ejemplo transaminasas para ver como esta el número y determinar si es que la enfermedad produce una afección en las transaminasas y entonces esto ayudara a diagnosticar que el problema es regular nuevamente la cantidad y el buen funcionamiento de esa enzima.

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CINÉTICA ENZIMÁTICA

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