Diapositiva 1

CINTICA ENZIMTICA1INTRODUCCION Se deriva del griego que significa en las levadurasFue hasta la dcada de los setenta que se conoci la composicin precisa de las enzimas mediante la secuencia de la ribonucleasa y estudios de conformacin tridimensional por cristalografa de rayos X.Ribonucleasa./ cataliza la hidrlisis del ARN en componentes ms pequeos.2Estudio de conceptos fundamentales de la catlisis enzimtica, ecuaciones de velocidad de reacciones catalizadas por enzimas.Las enzimas son sustancias proteicas elaborada por una clula viva que catalizan una reaccin especfica. Biotecnolgicamente su importancia radica en el estudio de estas reacciones, as como, las transformaciones enzimticas in vitro catalizadas por enzimas aisladas que permiten las biotransformaciones de productos de inters en la industria farmacutica, qumica, alimentaria, etc.

3Un catalizador influye en la rapidez mas no en el equilibrioAplicaciones de las Enzimas.AmidasasProduccin de aminocidos.AmilasasDetergencia. Hidrlisis de almidn.AmiloglucoxidasaHidrlisis de almidn.CatalasaProduccin de cido glucnico.CelulasaDetergencia, Hidrlisis de celulosa.HemicelulasasHidrlisis de hemicelulosa.LipasasDetergencia. Biotransformaciones.PectinasasClarificacin de bebidas.4Catlisis Enzimtica.EstructuralProtenas

CinticoCatalizadores

aminocidosProtenas (enzimas) +grupos prostticos (orgnicos inorgnicos)5

PROPIEDADES PODER CATALITICOMs rpidas Acta a condiciones de presin y temperaturas moderado.ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMASA la naturaleza del sustrato y al tipo de reaccin.REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICAMediante iones o molculas pequeas

ENZIMA Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, qumicamente son protenas , las enzimas actan en pequea cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin.

CATALIZADOR Un catalizador es una sustancia que acelera una reaccin qumica, hasta hacerla instantnea o casi instantnea. Un catalizador acelera la reaccin al disminuir la energa de activacin.La catlisis implica la formacin de un complejo entre el sustrato y la enzima (ES) en un proceso de equilibrio.(ES) Complejo de Michaelis

Formacin de Producto:

E + SESEPE + P

(EP) Complejo enzima-producto.9La principal caracterstica de las enzimas es su especificidad lo que hace que sean diferentes de los catalizadores sintticos.

Modelo de llave-cerradura10El sustrato se une a una regin especfica de la enzima, denominado Sitio Activo, en cada ciclo cataltico, y la catlisis ocurre solo en este sitio. La formacin de complejos se debe a la accin de efectos inicos, puentes de hidrgeno y ocasionalmente enlaces covalentes. La mayora de catalizadores sintticos no son especficos, catalizan varias reacciones involucrando diferentes reactivos.

Enzimas estereoespecficas: Reconocen solo una configuracin molecular.Enzimas regioespecficas: reconocen un grupo entre otros de la misma molcula.Frecuente necesidad de cofactores

11El modelo indica que el sitio activo es el complemento geomtrico del sustrato y nicamente forman el complejo de Michaelis los sustratos que posean la forma complementaria adecuada.El grado de especificidad en la accin cataltica de las enzimas es una consecuencia de la accin biolgica en la clula.

CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS

Cofactor: sustancia no proteica que se combina con una protena que no acta sola como catalizador (apoenzima), para formar un complejo catalticamente activo.Apoenzima + Cofactor holoenzima Grupos de Cofactores:a) iones metlicos: Fe+2, Zn+2, etc. b) Molculas orgnicas (coenzimas): NAD (Nicotinamida adenina dinucletido), FAD (Flavina adenina dinucletido).

12Grupo Prosttico: Unin irreversible del cofactor a la enzima.

Isoenzimas.- varias formas de enzimas que catalizan la misma reaccin, difieren en la secuencia de aminocidos. las aloenzimas representan enzimas de diferentes alelos de un mismo gen y las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes Clasificacin de las Enzimas.Tradicionalmente para nombrarlas se agrega el sufijo asa al nombre del sustrato sobre el que actan (proteasa, lipasa, etc) y en otros casos el de la reaccin que catalizan (alcohol deshidrogenasa, cataliza la deshidrogenacin oxidativa de un alcohol).La nomenclatura tradicional es poco prctica, no sistemtica y poco informativa.La Enzyme Commission las ha clasificado sistemticamente basndose en la naturaleza de la reaccin catalizadas, sin embargo por la complejidad de algunos nombres, se sigue utilizando sus nombres tradicionales.14Cintica de las Reacciones Enzimticas.Reacciones con un solo sustrato:

E + S E S E + P

Modelo de Michaelis-Menten, que relaciona la velocidad de reaccin con la concentracin del sustrato suponiendo un solo complejo central.

k1K-1

k2

15En un reactor discontinuo a volumen constante, considerando:- ecuaciones de balance de las distintas especies,- con la hiptesis de que el complejo ES se encuentra en estado pseudo-estacionario,- suponiendo que la concentracin molar de enzima es mucho menor que la del sustrato,

se tienen que,

r = k2 . Eo . S kM + S

r: velocidad de reaccin (mol/l.s)k2: constante de velocidad (min-1)Eo: concentracin inicial de enzimaS: sustrato/concentracin de sustrato (mol/l)KM: constante de Michaelis (mol/l)

Esta ecuacin predice un comportamiento cintico de primer orden para concentraciones bajas de sustrato y de orden cero para concentraciones elevadasActividad Enzimtica.Los extractos enzimticos que se emplea como biocatalizadores se prepara a partir de un proceso de purificacin de cultivos microbianos y tejidos vegetales o animales. Estos contienen protenas no catalticas siendo difcil determinar con exactitud la masa de biocatalizador; por lo tanto la concentracin de enzima se expresa en unidades de actividad en lugar de concentracin molar.Una unidad se define como la cantidad de enzima que produce una cantidad de producto en una reaccin y condiciones determinadas que se utilizan como patrn para los ensayos de actividad. La actividad especfica se define como:

Actividad enzimtica = unidades de actividad/mg de proteina = mmol de producto/(mg de protena).(ml.min)

ACCIN DE EFECTORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA1. Activadores.2. Inhibidores .- Irreversible; reversible

Tres tipos principales de inhibicin enzimtica.CompetitivaIncompetitivaNo competitiva

Reacciones con inhibicin:Se llaman inhibidores, las sustancias que hacen que una reaccin enzimtica transcurra ms lentamente. Lo cual puede producirse debido a:Un anlogo del sustrato que se une (reversible o irreversiblemente) al centro activo, reduciendo la actividad enzimtica,Mediante la unin de un inhibidor a otra parte de la molcula enzimtica provocando cambios conformacionales que reducen la capacidad de la enzima para unirse al sustrato.

Tipos de Inhibicin..I. Irreversible: El inhibidor se combina con la enzima dando un complejo estable pero inactivo. E + S E S E + P + I

E I (inactivo)

b) I. Reversible:

C) I. por el Sustrato: En algunas reacciones con un solo sustrato se observa un comportamiento diferente al propuesto por el mecanismo de Michaelis de forma que la velocidad de reaccin presenta un mximo con la concentracin del sustrato.Reacciones con ms de un sustrato.Muchas enzimas catalizan reacciones entre dos o mas sustratos para llegar a formar dos o mas productos.Los mecanismos de esta reacciones se clasifican en dos tipos:Todos los sustratos se unen a la enzima antes de la catlisis (mecanismo de formacin de un complejo ternario).Se libera un producto a partir de un primer complejo binario antes de la unin con el segundo sustratoMecanismos de Rx con ms de un sustrato1. Secuenciales.- Enzima se une a ambos sustratos para dar origen a la reaccin:OrdenadoAleatorio

2. Oscilatorio.- La enzima se une a un sustrato luego cambia la configuracin para unirse al segundo sustrato.

EFECTO DEL pH Y TEMPERATURA

Efecto del pH. Al comprobar experimentalmente la influencia del pH en la velocidad de las reacciones enzimticas se obtienen curvas que indican que los enzimas presentan un pH ptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras: El centro activo puede contener aminocidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH. La ionizacin de aminocidos que no estn en el centro activo puede provocar modificaciones en la conformacin de la enzima. El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH. Algunos enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estmago, presenta un ptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12 La temperatura. Influye en la actividad. El punto ptimo representa el mximo de actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rgidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50) la actividad cae bruscamente porque, se desnaturaliza. Enzimas Inmovilizadas - adsorcin Unin - covalente

- inclusin en geles Contencin - retencin en membranas

- CLEC Agregacin - CLEA Efectos conformacionales (c) Efectos microambientales: particin (p) rest. difusionales (rd)cE sol.EIc. intrsecac. intrsecac. inherentec. efectivaprdCintica Enzimtica en Fase HeterogneaRestricciones difusionales internas0Ls0s0Restricciones difusionales externasp0ps0s

(-) Kap < K(+) Kap > Ks0ss0sEfectos de Particin

(+) pH > pH0 (-) pH < pH0apH0

qs0Restricciones difusionales externasp0s0s

Restricciones Difusionales Externas

1/v

Zona 1Zona 2

1/s01=K/V2=K(1+)/V 0

Determinacin de parmetros

x = 0s = s0 x = L/2ds/dx = 0I)II)0Lxx+xs0s0Restricciones Difusionales Internas

z = 0 = 0I) z = 0.5d /dz = 0II)

0.20.40.60.801.00.01

0.11.0101.00.21000.40.60.81.0

=1=2=5=0.50=00=10=100=0.1

I) r = R s = s0II) r = 0ds/dr = 0rr+rs0s0RRestricciones Difusionales Internas

= 1 = 0 = 0d /d = 0I)II)

s0Rrr+rs0

ICPINCP

IAS

K/KP = 1X = 0.9K/K= 11/s001/v1/V1/V-1/KDeterminacin de parmetrosDeterminacin del coeficiente de difusin efectiva (Def)C = 0C = CtC = C

ctc

membranaesfera

s0sSs0sS

RDE + RDITECNOLOGA DE ENZIMASEnzima: Protena - Catalizador BiolgicoEnzimas son molculas orgnicas complejas que se encuentran presentes en las clulas de organismos vivos donde actan como catalizadores produciendo cambios qumicos en ciertas sustancias.

Actividad enzimtica: Expresa el incremento en la velocidad de reaccin por la intervencin de la enzima.

Funcionalidad cataltica, reside en el centro activo S + E ES P + E

Enzimas que requieren cofactores: # ligados o catalticos (iones metlicos)# disociables o estequiomtricos ( vitaminas)48INGENIERA DE ENZIMASDesde el punto de vista tecnolgico las enzimas son catalizadores de procesos. Se utilizan en transformar materias primas en productosUso terico: indefinidoSon protenas: lbiles - uso no indefinidoVentajas:* Especificidad* Eficiencia de conversinDesventajas:* Costo de separacin* Uso restringido a procesos que involucren pocos pasos bioqumicos. 49INGENIERA DE ENZIMASEs el rea de la Ingeniera Bioqumica abocada al anlisis, diseo y operacin de procesos para la produccin y utilizacin de enzimas como catalizadores de proceso.50FUENTES DE ENZIMASLa mayora de las enzimas originalmente se obtuvieron de plantas y animales.

Actualmente la mayora de las enzimas se obtienen de microorganismos. Las razones son:

1) Tienen normalmente una alta actividad especfica

2) No inciden fluctuaciones en la produccin debido al clima, las cosechas, etc.

3) Existe una amplia gama de enzimas microbianas, con caractersticas de accin diversas: pH, temperatura .

4) La gentica industrial ha incrementado grandemente las posibilidades de aumentar los rendimientos y el tipo de enzima que se necesite producir (seleccin, induccin, mutacin, transferencia de genes).51Enzimas de origen animalSe obtienen a partir de animales sacrificados.Se remueve todo el tejido y posteriormente es troceado, y luego es purificado.Enzimas de origen VegetalEl proceso es complejo y dficil. Requiere equipos pesados para macerar y moler.Los microorganismos son muy verstiles y tericamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto.

Los microorganismos pueden ser modificados genticamente para producir mayor cantidad de enzima.

La recuperacin de las enzimas microbianas suele ser fcil, puesto que, generalmente, son extracelulares.

La produccin de enzimas microbianas requiere materias primas fciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos.

Los microorganismos son fciles de cultivar, tienen velocidades de crecimiento y de produccin de enzimas muy alta (baratas, abundantes)

La tecnologa a gran escala para su produccin se encuentra hoy bien establecida. Fcil escalado

Las enzimas microbianas son ms estables que sus homlogas de plantas y animales.Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicacin industrial. Presentan numerosas ventajasMECANISMOS DE BIOSNTESIS DE LAS ENZIMASFactores que pueden afectar la sntesis de la enzima:1. Sistemas inducibles2. Mecanismos de represin.

ENZIMAS INDUCIBLESLa sntesis de las enzimas se ve influenciada por sustancias inductoras. La mayoria de enzimas que se utilizan en la industria.MECANISMOS DE REPRESINMediante la represin de los catabolitos, el organismo puede hacer mejor uso de los sustratos disponibles.

54Regulacin de la sntesis de enzimas Mecanismos controlados por el ambiente en el que crece el micoorganismo:

RepresinLas enzimas no son sintetizadas si est presente el producto. Es un efecto especfico de la va que lleva al producto. Vas de sntesis de aminocidos, purinas y pirimidinas. Muy comn en bacterias

InduccinLas enzimas se sintetizan slo si est presente el sustrato. Ej. B-galactosidasa. Otros: enzimas involucradas en la metabolizacin de las fuentes de carbono y energa.55OPTIMIZACIN DEL POTENCIAL GENTICO DE LAS CEPAS DE ENZIMAS DE INTERS INDUSTRIALDos tipos de eventos se oponen a la produccin o acumulacin gratuita de una enzimaen las clulas:

DEGRADACIN ENZIMTICA: las bacterias producen variadas enzimas proteolticas que degradan rapidamente polipptidos

REGULACIN METABLICA: las bacterias son capaces de adaptar la actividad de sus genes estructurales a las necesidades del medio ambiente gracias a la existencia de genes de regulacin. Ej. Opern lactosa56OPERN LACTOSA Y SU REGULACINEl opern lactosa reagrupa los genes necesarios para la utilizacin de lactosa por E. coli. Los genes involucrados codifican para una b-galatosidasa, una permeasa y una tiogalactosidasa acetilasa.Si existe lactosa en el medio de cultivo , los tres genes funcionan y las tres enzimas se sintetizan (enzimas inducibles)La ausencia del inductor (lactosa) inhibe la sntesis de enzimas: modelo de control negativo.Si se evita la sntesis de la protena represora, o disminuimos fuertemente su afinidad por el operador, se tendr la sntesis permanente de las enzimas: se obtuvo una cepa constitutiva para las enzimas consideradas.

57POSIBLES ESTRATEGIAS GENTICASCriterio o tcnica de seleccin

Mutagnesis

Seleccin58PRODUCCIN DE ENZIMASDiferentes alternativas segn el origen y localizacin de la enzima, del grado de pureza requerido y del sistema cataltico a utilizar.

59APLICACIONESProcesos industriales

Anlisis

Clnicas60APLICACIONES INDUSTRIALESIndustria de Alimentos

Industria Farmacutica

Industria Textil

Industria de Detergentes

Industria del Cuero

Biorremediacin y tratamiento de efluentes

61CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS PARA USO INDUSTRIALUso masivo

Estructura simple

Extracelulares

Estables

Sin requerimientos de cofactores disociables62APLICACIONES ANALTICASPor incorporacin en lnea del reactor enzimtico con un aparato analtico convencional

Por inclusin del sistema enzimtico como parte del sistema analtico63CARACTERSTICAS DE LAS ENZIMAS UTILIZADAS PARA ANLISISAlta especificidad

Alta sensibilidad

Alta pureza

Baja estabilidad en condiciones operacionales

Alto costo64ELECTRODOS ENZIMTICOSSe proyectan como elementos registradores y controladores de procesos. El uso de enzimas inmovilizadas permite aumentar la vida media del electrodo.

Ejemplos:* Electrodo de glucosaoxidasa en anlisis de glucosa ( Detector: O2 disuelto)* Electrodo de penicilinasa (Detector: pH)* Electrodo de ureasa (Detector: NH4+)65APLICACIONES CLNICASConvencionales:* Ayuda digestivos (Diastasa pancretica* Antiinflamatorios (Papana - Bromelina)* Antimicrobianos (Lisozima)Otras:* Enfermedades congnitas hereditarias (suministro exgeno de la enzima deficitaria)* Remocin de metabolitos potencialmente txicos (ureasa en riones artificiales)* Tratamiento de ciertos tipos de cancer (asparaginasa en ciertos cnceres sanguneos)66PRODUCCIN DE ENZIMASLa produccin para ser competitiva exige un rendimiento mximo./Desafortunadamente los mtodos de purificacin para pasar de un rendimiento de 90 a 95% son muy onerosos y pesan fuertemente en el costa del producto)Se modifica los m.o con el fin de aumentar la produccin.: Ingeniera Gentica y Biologa Molecular*Obtener un funcionamiento gentico ptimo de la va metablica deseada (suprimir las inhibiciones o represiones o bloquear las vas de degradacin) * Mejorar el potencial gentico de las cepas, aumentando el nmero de genes que codifican la enzima de inters (clonage de genes con la intervencin de vectores biolgicos capaces de multiplicarse en el interior de la clula)

67PREPARACONES INDUSTRIALES DE ENZIMASLas enzimas industriales se obtienen por extraccin de clulas animales, vegetales o microorganismos.Slo las enzimas microbianas producidas por fermentacin han conocido una expansin significativa.Tienen gran importancia econmica por el valor agregado que aportan a los productos transformados, sin embargo representan un pequeo porcentaje de las industrias de fermentacin.Las especies microbianas utilizadas industrialmente son poco numerosas: Bacillus y Aspergillus son las ms importantes.68PRODUCCIN MASIVA DE ENZIMAS ENZIMA COMERCIAL: preparado en general impuroMaterial contaminante: origen proteico y no proteico (excipientes, conservadores, etc.)En aplicaciones industriales masivas, el criterio de produccin es al mnimo nivel de pureza, no sacrificables por razones de costo.

OBTENCIN: * Extraccin de tejidos vegetales* Extraccin de tejidos animales*Fermentacin microbiana ( 80% del mercado mundial)69ETAPAS DEL PROCESO PRODUCTIVOGENERACIN

RECUPERACIN

PURIFICACIN

FORMULACIN

70ENZIMAS PRODUCIDAS POR FERMENTACINLa mayora de las enzimas comerciales son el producto del metabolismo aerobio y cumplen en general con una funcin catablica, por lo tanto son producidas en forma asociada al crecimiento

El medio de cultivo debe proporcionar los nutrientes necesarios para el crecimiento y para la produccin de la enzima: inductores y cofactores, as como eliminacin de represores.

pH y Temperatura: compromiso entre el crecimiento y la produccin. Es posible incorporar alteraciones programadas de pH y Temperatura.

71GENERACINENZIMAS DE ORIGEN VEGETAL:sub-productos de la actividad agrcola

ENZIMAS DE ORIGEN ANIMAL: sub-productos de matadero

ENZIMAS MICROBIANAS: productos metablicos en un proceso de fermentacin.72RECUPERACINLa recuperacin y la purificacin son pasos crticos del proceso productivo, porque involucran operaciones costosas y difciles de escalar.E. Extracelulares E. IntracelularesFermentacin Fermentacin

torta separacin separacin Caldoresidual slido - lquido slido - lquido agotado

Concentracin Tejido Vegetal/Animal

Purificacin Extraccin

Separacin Fragmentos slido-lquido celulares

Concentracin

Purificacin73RECUPERACINENZIMA EXTRACELULAR: fase lquida.ENZIMA INTRACELULAR: fase slidaTCNICAS:* A gran escala: Filtracin: Preferida para m.o. Filamentosos. Filtros rotatorios Centrifugacin: m.o. unicelulares (Floculacin) Centrfuga de discos.EQUIPOS: * Contnuos (preferidos a escala industrial).* Discontnuos. En el caso de enzimas intracelulares se complican estos mtodos porque el tamao de partcula es menor que el de un microorganismo.74EXTRACCIN DE ENZIMAS INTRACELULARESRuptura de la envoltura celular:*Clulas animales: fcil, molienda es suficiente.

*Clulas vegetales y microbianas: pared rgida, ms difcil,Ruptura por aplicacin de esfuerzoscortantes. Digestin qumica o bioqumica de la pared celular.

Los mtodos de ruptura deben compatibilizar alta eficiencia de ruptura con preservacin de la actividad enzimtica. Este aspecto es importante para todas las etapas y es crtico en la etapa de extraccin.

75CONCENTRACIN DEL EXTRACTO ENZIMTICO EVAPORACIN AL VACIO

CRISTALIZACIN

LIOFILIZACIN

ESPUMACIN

76PURIFICACINPara enzimas de uso industrial es rudimentaria.Generalmente se requieren varios pasosSe considera:* Factor purificacin* Rendimiento (ms enfatizado a nivel industrial)Tendencia: purificar con pocas etapas

Sistemas de fraccionamiento proteico:* Separacin en base a solubilidad.* Separacin en base al tamao.* Separacin por retencin selectiva (cromatografa).

77FORMULACINEs una operacin importante en el caso de enzimas usadas masivamente, en la industria de procesos

Incluye: ACABADO: forma definitiva del producto. Debe asegurar la preservacin de la actividad durante el almacenamiento. NORMALIZADO: especifica actividad y estabilidad78ACABADOINCLUYE: Desalinacin. Esterilizacin. Concentracin y/o secado. Estabilizacin por agregado de conservadores. Recubrimiento.

CONSERVADORES: Sales inorgnicas Protenas inertes Polialcoholes Azcares Glicoles

79OTROS CONSERVADORES DE USO INDUSTRIALLa accin conservadora se basa fundamentalmente en la disminucin de la actividad de agua (aw) en el preparado enzimtico.

OTROS CONSERVADORES: Sustratos. Cofactores e inhibidores disociables. Reactivos sulfhidrilo. Agentes quelantes. Inhibidores de proteasas Agentes antimicrobianos80NORMALIZACINDEBE CONTENER: Actividad Especfica Estabilidad al almacenamiento

ACTIVIDAD ESPECFICA:

En Unidades DEFINIDAS.

ESTABILIDAD: Funcin de la Temperatura Vida Media. (No inferior a..)

81

_1278497701.unknown

_939448586.unknown

_939448520.unknown

_939448851.unknown

EMBED Equation.3 _939454179.unknown

_939454253.unknown

_939454264.unknown

_939463854.unknown

_939464886.unknown

_939464378.unknown

_939464723.unknown

_939464795.unknown

_939468618.unknown

_939471656.unknown

_939467679.unknown

_939467729.unknown

_939464995.unknown

_939467544.unknown

_939473638.unknown

_939473476.unknown

_939473590.unknown

_939475589.unknown

_939476649.unknown

_939476861.unknown

('

(0

(

1

0.8

0.6

10

0.4

5

0.2

0

10

5

0

0

('

(0

(

1

0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

10

5

10

5

0