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CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR DE ENSENADA, BAJA CALIFORNIA Programa de Posgrado en Ciencias en Acuicultura Maduración sexual de la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus mykiss nelsoni evaluada mediante un método no invasivo Tesis para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura Presenta: Paul Alberto Vásquez Gallegos Ensenada, Baja California, México 2014
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DE ENSENADA, BAJA CALIFORNIA
Programa de Posgrado en Ciencias
en Acuicultura
Maduración sexual de la trucha de San Pedro Mártir
Oncorhynchus mykiss nelsoni evaluada mediante un método
no invasivo
Tesis
para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura
Presenta:
Paul Alberto Vásquez Gallegos
Ensenada, Baja California, México 2014
Tesis defendida por
Paul Alberto Vásquez Gallegos
y aprobada por el siguiente Comité
Dra. Carmen Paniagua Chávez
Dr. Gorgonio Ruiz Campos
Co-Director del Comité Co-Director del Comité
Dr. Manuel Segovia Quintero Miembro del Comité
Dr. Gustavo Olague Caballero Miembro del Comité
Dr. Benjamín Barón Sevilla Miembro del Comité
Dra. Beatriz Cordero Esquivel Coordinadora del Posgrado en
Ciencias en Acuicultura
Dr. Jesús Favela Vara Director de Estudios de Posgrado
Julio 2014
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Resumen de la tesis de Paul Alberto Vásquez Gallegos, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura.
Maduración sexual de la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus mykiss nelsoni evaluada mediante un método no invasivo
Resumen aprobado por: ______________________________
Dra. Carmen Paniagua Chávez Co-Director de Tesis
______________________________
Dr. Gorgonio Ruiz Campos Co-Director de Tesis
La trucha de San Pedro Mártir (Oncorhynchus mykiss nelsoni) es una subespecie exclusiva de la Sierra de San Pedro Mártir (SPM), Baja California, la cual en los últimos años ha generado muchas expectativas debido a su gran potencial de cultivo. El conocimiento de su biología reproductiva es fundamental para determinar sus requerimientos y posibilidades de cultivo. Considerando que la trucha de SPM es una especie protegida, se vuelve necesario generar métodos alternativos no invasivos para evaluar su madurez sexual. En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue desarrollar un protocolo no invasivo para la evaluación del sexo y la madurez sexual de la trucha de San Pedro Mártir. Sesenta y nueve truchas fueron recolectadas en el arroyo San Rafael, al noroeste de la Sierra de San Pedro Mártir, las cuales fueron transportadas vivas al Departamento de Acuicultura de CICESE para su acondicionamiento y mantenimiento en un sistema de recirculación acuícola. Las truchas fueron alimentadas primeramente con una dieta a base de mísidos por tres semanas antes de hacer un cambio de dieta gradual a alimento comercial. Durante el experimento los parámetros físico-químicos de la calidad del agua se mantuvieron dentro de los intervalos óptimos para la trucha arcoíris de cultivo. Igualmente, se registró el peso (g) y la longitud total (mm) de las truchas y se calculó su tasa de crecimiento somático (0.46 g/día y de 0.03 mm/día), relación peso-longitud (W = 0.000005052 LT3.136), factor de condición de Fulton (1.04 ± 0.14) y factor de condición relativo (1.01 ± 0.14). Las truchas continuaron con su ciclo reproductivo natural bajo condiciones de fotoperiodo y temperatura recreadas en el laboratorio. En estas condiciones, el 80% de las truchas alcanzaron su madurez sexual en enero. Las hembras tuvieron una fecundidad de 2.1 ovocitos/g de peso corporal y los machos produjeron entre 0.12 y 0.45 mL de esperma. Después del desove, los organismos fueron inducidos a una segunda maduración sexual con un ciclo reproductivo acortado mediante el control del fotoperiodo y temperatura. Después de siete meses bajo estas condiciones, las truchas desovaron por segunda ocasión en el mismo año. El porcentaje de las truchas que maduraron fue superior (~90%) que aquél de las truchas en ciclo reproductivo natural. También aumentó la fecundidad de las hembras a 2.82 ovocitos/g y del volumen de esperma (entre 0.11 y 1.5 mL) producido por los machos. Durante el ciclo reproductivo acortado se desarrolló un protocolo de ultrasonido para evaluar el estado de madurez sexual y diferenciar el sexo de las truchas de SPM, el cual fue estandarizado mediante la comparación de las ecografías tomadas y
ii
disecciones para corroborar la anatomía de los órganos y la localización de las gónadas. También se definió la configuración de los parámetros del ultrasonido adecuados para esta trucha, tales como frecuencia (9 MHZ), modo de escaneo (B), ganancia (102), imagen dinámica (27), entre otros. Se tomaron ecografías mensuales y se validaron midiendo la concentración de vitelogenina (VTG) o testosterona en el plasma sanguíneo de los organismos y visualizando en fresco el desarrollo de las gónadas. La concentración de VTG o testosterona fueron altos debido al ciclo reproductivo abreviado. La mayor concentración de VTG en hembras fue >106 mg/mL en julio y de 50.3 ng/mL de testosterona en machos durante agosto. Las concentraciones de VTG y testosterona, las imágenes de ultrasonido y los desoves obtenidos coincidieron con los procesos reproductivos observados en los organismos. Palabras clave: Oncorhynchus mykiss nelsoni, trucha de San Pedro Mártir,
maduración, fotoperiodo, ultrasonido, sistema recirculación.
iii
Abstract of the thesis presented by Paul Alberto Vasquez Gallegos, as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Aquaculture.
Sexual maturation of the San Pedro Martir trout Oncorhynchus mykiss nelsoni evaluated using a non-invasive method
Abstract approved by:
______________________________ Dra. Carmen Paniagua Chávez
Co-Director de Tesis
______________________________ Dr. Gorgonio Ruiz Campos
Co-Director de Tesis
The San Pedro Martir trout (Oncorhynchus mykiss nelson) is a subspecies endemic to the Sierra de San Pedro Martir (SPM), Baja California, which in recent years has been generated many expectations due to its great potential for aquaculture. The knowledge of the reproductive biology for this trout is essential to determine their requirements and possibility of culture. Due to SPM trout is a protected species, it is necessary to generate alternative noninvasive methods to determine sex and sexual maturity. Therefore, the objective of this study was to develop a noninvasive protocol to evaluate sex and sexual maturity of the San Pedro Martir trout. Sixty nine trout were captured at San Rafael stream, in the northwestern part of the Sierra of San Pedro Martir. The trout were transported alive to the Department of Aquaculture in CICESE and maintained in a recirculation aquaculture system. Trout were fed with a diet of mysids for 3 weeks before changing gradually to a commercial feed. During the experiment, water quality parameters were maintained within the optimal ranges for rainbow trout culture. Also, trout weight (g) and total length (mm) was recorded and somatic growth rate (0.46 g/day and 0.3 mm/day), weight-length relationship (W = 0.000005052 LT3.136), Fulton condition factor (1.04 ± 0.14) and relative condition factor (1.01 ± 0.14) were calculated. Trout continued their natural reproductive cycle under artificial photoperiod and temperature conditions. Therefore, ~80% of the trout reached the sexual maturity in January. Females had a fecundity of 2.1 ovocytes per gram of body weight and males produced between 0.12 and 0.45 mL of sperm. After spawning, the organisms were allowed to mature for a second time, shortening the reproductive cycle by controlling the temperature and photoperiod. After seven months under these new conditions, the trout spawned for the second time in the same year. The percentage of trout that matured was higher (~90%) than that trout maintained in natural reproductive cycle. Fecundity of females increased to 2.82 ovocytes per gram of body weight. Also, sperm volume increased between 0.11 and 1.5 mL. An ultrasound protocol was developed to determine the state of sexual maturity and differentiate the sex of the SPM trout, which was standardized by comparing echography shoot and dissections to corroborate the anatomy of organs and the location of the gonads. Configuration of ultrasound parameters appropriate for this trout, such as frequency (9 MHz), scan mode (B), gain (102), dynamic image (27), among others where defined. Echography where taken each
iv
month and validated by measuring the concentration of vitellogenin (VTG) or testosterone in blood plasma and viewing fresh samples of gonads during the second reproductive cycle. The concentration of VTG or testosterone was high due to the shortening of the reproductive cycle. The highest concentration of VTG in females was > 106 mg/mL in July and of testosterone (50.3 ng/mL) in males during August. Concentration of VTG and testosterone, ultrasound images and spawning coincided with the reproductive processes observed in the trout. Keywords: Onchorhynchus mykiss nelsoni, San Pedro Martir trout, maturation, photoperiod, ultrasound, recirculating aquaculture system.
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Dedicatoria Primeramente le doy gracias a Dios por todo.
A mis Padres: Alicia Gallegos Hurtado y Alejandro Vásquez Pila, por su amor,
confianza, apoyo y comprensión, que sin su instrucción no sería la persona que soy
ahora.
A mis Hermanos: Alejandro y Adrián Vásquez Gallegos, que me dieron fuerzas para
seguir adelante y por ser mi inspiración para seguir superándome.
A mi compañera de tiempos Belén, por su compañía, amor, ternura, comprensión y
ánimos incondicionales en cada situación y decisión tomada para lograr mis metas.
vi
Agradecimientos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por haberme brindado el
apoyo económico para la realización de mis estudios de maestría.
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE), y
al Departamento de Acuicultura por su valioso apoyo en mi formación académica como
Maestro en Ciencias en Acuicultura.
A mis Directores de Tesis, Dra. Carmen Paniagua Chávez y Dr. Gorgonio Ruíz
Campos, por haberme brindado la oportunidad de ser parte de su grupo de estudiantes,
por su paciencia y su valioso aporte de conocimientos en esta formación, son un
ejemplo a seguir. Por otorgarme la oportunidad de realizar mi tesis con la trucha de San
Pedro Mártir, Muchas Gracias.
A los miembros del comité de tesis, Dr. Manuel Segovia, Dr. Benjamín Barón Sevilla y
Dr. Gustavo Olague Caballero por sus valiosas sugerencias, orientaciones y apoyo
profesional para la realización del presente trabajo.
A todos los académicos y empleados del Departamento de Acuicultura por compartirme
sus conocimientos y anécdotas durante este periodo de formación.
A mis compañeros, amigos y cómplices de generación: Luis Miguel Molina (Luisito
papaaa), Jorge Madrid (Jorsh de la selva alias el monote), Pablo Fuentes (El Mae),
David Guzmán (Dayvids), Rigoberto Delgado (Jilberto), Roberto Cruz (Mr. bíceps),
Omar Montes (…), Raquel Escuredo (Joder tío), Miriam Lecuanda (Chica pulpo), Araceli
Cazares (Hija de Bety), una familia que junto con ellos aprendí mucho y me enseñaron
de lo que somos capaces de lograr y que esto no termina aquí...
A las generaciones de Acuicultura y de otras áreas que tuve la oportunidad de conocer
y pudimos compartir conocimientos y experiencias.
Y a todos aquellos que colaboraron en el desarrollo de este trabajo y a aquellos que me
brindaron su amistad…
GRACIAS TOTALES Y DIOS LOS BENDIGA A TODOS…
vii
Contenido
Página
Resumen en español………………………………..………..……...…….……….. i
Resumen en ingles…………………………………………………….........………. iii
Dedicatorias………………………………………………………..…............……... v
Agradecimientos…………………………………………………..………............... vi
Lista de Figuras…………………………………………………….…..……...…….. xi
Lista de Tablas……………………………………………………….………..…….. xiii
Capítulo 1. Introducción……...…..……………..........................................…….. 1
1.1 Introducción……………………………………………………………...…….. 1
1.2 Antecedentes…………………………………….…………………...……….. 3
1.2.1 Producción de trucha arcoíris………..……..……..….....……..……….. 3
1.2.2 Generalidades de la trucha arcoíris….………..……..……..……..…… 6
1.2.3 Ecología de la trucha de la Sierra de San Pedro Mártir…….…..……. 7
1.2.4 Reproducción……...……..……..……..……..……..……..……..………. 10
1.2.5 Métodos para evaluar el estado de madurez sexual en truchas……. 12
1.2.5.1 Índice gonadosomático……..……...……..……..……..……..…….. 12
1.2.5.2 Biopsias ováricas……….....……..……..……..……..……..……..… 13
1.2.5.3 Histología…………………..……..……..……..……..……..……..… 14
1.2.5.4 Análisis de la variación hormonal y de vitelogenina en la maduración de la trucha...….……..……..……..……..……..……..……..………..
15
1.2.5.5 Ultrasonido……..……..……..……..……..……..……..……..……… 16
1.3 Justificación…………………………………………………….………..…….. 19
Capítulo 2. Hipótesis y objetivos………………….....................................……... 21
2.1 Hipótesis...….………………………………………………..………………… 21
2.2 Objetivo general……………………………………………………………….. 21
viii
Contenido Página
2.3 Objetivos particulares…………………………………………………..…….. 21
Capítulo 3. Metodología….........................................................………...……… 22
3.1 Recolección de organismos………………………………………….………. 22
3.1.1 Zona de captura………………………………..………...………...…….. 22
3.1.2 Recolección de organismos……………………………………………... 22
3.1.3 Parámetros ambientales de la zona de captura………………………. 22
3.2 Acondicionamiento y mantenimiento organismos……….………….…….. 24
3.2.1 Sistema de recirculación acuícola………..…………..………………… 24
3.2.2 Registro de los parámetros físico-químicos del sistema de recirculación acuícola……………………………………….…………..…………...
24
3.2.3 Régimen alimenticio………………………………………..…………….. 25
3.2.4 Registros biométricos……….…………..…………..…………..……….. 25
3.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura……………….…………..…………..……………….
28
3.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo…………..…………..…………..………….
28
3.3.1.1 Sistema y condiciones de fotoperiodo……….…………..………… 28
3.3.1.2 Régimen de temperatura…….…………..…………..…………..….. 30
3.3.1.3 Alimento para estimular la maduración sexual…………..……….. 30
3.3.1.4 Desoves……….………………..…………..…………..…………..… 30
3.3.2 Acortamiento del ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura………………………………………………………...
31
3.3.2.1 Sistema, condiciones de fotoperiodo y régimen de temperatura…………………………………..………………………..……………...
31
3.3.2.2 Alimentación………………………..…………………………………. 32
3.3.2.3 Desoves………………………..………………………..…………….. 32
ix
Contenido Página
3.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido…..….………….. 32
3.4.1 Descripción del equipo utilizado………………………………………… 32
3.4.2 Estandarización del método………………………..……………………. 33
3.4.3 Registro ecográfico de gónadas mediante ultrasonido………………. 34
3.5 Evaluación de los cambios de vitelogenina en plasma sanguíneo..... 33
3.5.1 Extracción y purificación de vitelogenina………...…………………….. 36
3.5.2 Determinación de la concentración de vitelogenina en plasma sanguíneo mediante el método ELISA….………………………..………………..
37
3.6 Evaluación de los cambios de testosterona en plasma sanguíneo……… 37
3.6.1 Extracción y purificación de testosterona……………………………… 37
3.6.2 Medición de la concentración de testosterona en plasma sanguíneo mediante el método ELISA………………………..………………………………...
38
3.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez sexual……………………………..………………………..………………………….
39
Capítulo 4. Resultados……………..…............................................................... 40
4.1 Recolección de organismos…………………………………………...…….. 40
4.2 Acondicionamiento y mantenimiento de truchas de SPM………………… 40
4.2.1 Parámetros de calidad de agua….……………………………………… 42
4.2.2 Registros biométricos…………………………………………………….. 42
4.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la temperatura…….......................…………………………..……...
48
4.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la continuación del ciclo reproductivo………….…………………………………..
48
4.3.2 Acortamiento el ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la temperatura………………………………...………………………
48
4.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido………..…….….. 49
4.5 Evaluación de los cambios en la concentración de vitelogenina en el plasma sanguíneo…………………………………………………………………....
50
x
Contenido Página
4.6 Evaluación de los cambios en la concentración de testosterona en el plasma sanguíneo…………………………………..…………….…….……………
51
4.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez sexual de la trucha SPM.…...……………………………………………………….
52
Capítulo 5. Discusiones…………………………………………………………..…. 59
Conclusiones…………………………………………………………………..……... 72
Recomendaciones……………………………………………………....…………… 73
Referencias bibliográficas……………….………...…………………………..…… 74
Anexos………………………………………………………………………............. 80
xi
Lista de figuras
Figura Página
1 Producción acuícola de trucha arcoíris a nivel mundial en toneladas
anuales del 2000 al 2011……………………………..…………………
4
2 Producción de trucha arcoíris a nivel nacional en el periodo de
2000 a 2010………………………………………...……………………..
5
3 Diagrama de flujo de la producción de trucha arcoíris………………. 6
4 Imagen ilustrativa de la estructura externa de trucha arcoíris
Oncorhynchus mykiss hembra………………………………………….
7
5 Localidades donde se distribuye la trucha de San Pedro Mártir
Oncorhynchus mykiss nelsoni…………………………………………..
8
6 Ejemplar de trucha de San Pedro Mártir con un patrón de
coloración típico del medio silvestre…………………………………....
10
7 Evolución del índice gonadosomático y diámetro de ovocitos de la
trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en la granja piscícola de Río
Blanco, Chile (1992-1993)……………………………..………………..
13
8 A) Captura de truchas de San Pedro Mártir con equipo de
electropesca y red. B) Preparación las bolsas de plástico con agua
y oxígeno para el transporte de las truchas capturadas……………..
23
9 Ejemplar macho de trucha de San Pedro Mártir colocado en una
balanza digital (0.1 g) para su pesaje (A) y en un ictiómetro (0.1
cm) para la medición de su longitud total (B)….………………………
27
10 Sistema de iluminación utilizado para modificar el fotoperiodo en el
sistema de recirculación acuícola………………………………………
29
11 Luxómetro utilizado en la medición de luxes en el sistema de
iluminación y temporizador utilizado para encender y apagar las
lámparas del sistema de iluminación………………..………………….
29
12 Equipo de ultrasonido utilizado para el registro del desarrollo
gonadal de la trucha de San Pedro Mártir mediante la
interpretación de ecografías……………………………………………..
34
xii
Figura Página
13 Estandarización del método del ultrasonido en la trucha de SPM. a)
Trucha de SPM anestesiada con aceite de clavo y colocada en un
ictiómetro; b) disección de la parte ventral de la trucha de SPM; c)
visualización de los órganos de la trucha de SPM; d) localización
de la gónada de la trucha de SPM; e) trucha de SPM disecada
cargada con ovocitos maduros; f) ovocitos de trucha de SPM
extraídos para su conteo y medición; g) visualización de los
testículos de una trucha macho…………………………………………
35
14 Posición de la trucha al momento de manejar la sonda para la toma
de las ecografías de las gónadas……………………………………….
36
15 Extracción de sangre de la vena caudal de una trucha……………… 37
16 Placa para el desarrollo del ELISA para testosterona de 96 pozos
siendo llenada con la curva de calibración……….…….……………...
38
17 Truchas de SPM ya acondicionadas a los tanques de cultivo……… 41
18 Truchas en tratamiento con oxitetraciclina…………………..………... 41
19 Relación peso-longitud de truchas de SPM adultas mantenidas en
condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un
sistema de recirculación acuícola………………………………………
43
20 Factor de condición de Fulton calculado para las truchas de SPM
adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de
12 meses, en un sistema de recirculación acuícola..…………………
44
21 Factor de condición relativo (Kn) calculado para las truchas de
SPM adultas mantenidas en condiciones de cautiverio por un
periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola…..…
45
22 Crecimiento en peso de truchas de SPM adultas mantenidas en
condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un
sistema de recirculación acuícola.……………………………………...
46
23 Crecimiento en longitud total (LT) de truchas de SPM adultas
mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12
meses, en un sistema de recirculación acuícola.…………..…………
47
24 Jeringas con esperma y ovocitos obtenidos de los desoves..………. 49
xiii
Figura Página
25 Captura de imagen de un ovocito de la trucha de SPM mediante
ultrasonido y verificación de su tamaño con el uso de un vernier.….
50
26 Concentración de vitelogenina (VTG) detectada en el plasma
sanguíneo de truchas hembras de SPM, durante el ciclo
reproductivo acortado ………………………………………………...…
51
27 Concentración de testosterona detectada en el plasma sanguíneo
de truchas macho de SPM, durante el ciclo reproductivo acortado...
52
xiv
Lista de tablas
Tabla Página
1 Principales características de los ovocitos en la etapa de
Vitelogénesis Endógena (estadios I, II y III) de las hembras de
trucha arcoíris…………………………………………………………..
15
2 Principales características de los ovocitos en la etapa de
Vitelogénesis Exógena (estadios IV, V, VI y VII) de las hembras
de trucha arcoíris….............…………………………………………..
15
3 Especies de peces en las que se ha implementado el ultrasonido
en cuestiones reproductivas………………………………................
18
4 Parámetros del equipo de ultrasonido estandarizados para la
observación de las gónadas…………………………………………..
34
5 Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez
sexual femenina de las truchas de San Pedro Mártir
(Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: el tamaño
de los ovocitos, la concentración de vitelogenina, descripción de
las gónadas en las ecografías y las imágenes de ultrasonido más
representativas de los muestreos realizados………………….……
53
6 Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez
sexual masculina de las truchas de San Pedro Mártir
(Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: la
concentración de testosterona, la descripción del tejido y las
imágenes de ultrasonido más representativas de los muestreos
realizados………………………………………………………………
56
7 Comparación de métodos comúnmente utilizados en la
evaluación del estado de madurez sexual comparados con el
ultrasonido…………………………………………………………...….
69
1
Capítulo 1. Introducción
La trucha (Oncorhynchus mykiss nelsoni) o trucha de San Pedro Mártir (SPM) es una
subespecie de la trucha arcoíris, endémica de la Sierra de San Pedro Mártir, Baja
California (Ruiz-Campos y Pister, 1995). Debido a que es una subespecie endémica
con una distribución restringida y a la abundancia que presenta en su hábitat natural,
tiene un estatus de protección especial por la NOM-ECOL-059 (Semarnat, 2010), que le
confiere el estatus de especie protegida y restringe la obtención de ejemplares
silvestres para iniciar su cultivo a nivel piloto.
La reproducción de esta trucha nativa en cautiverio es una buena opción para producir
en forma constante ejemplares sin depender de organismos del medio silvestre. Sin
embargo, debido a que se consideran organismos muy preciados, es necesario generar
estrategias no invasivas o mortales para el monitoreo de los mismos en condiciones de
cautiverio.
En el proceso de reproducción de la trucha, las hembras y los machos no liberan sus
gametos de manera espontánea, por lo que para efectuar la fertilización controlada es
necesario extraer los óvulos y el semen aplicando presión abdominal; sin embargo,
para que este procedimiento sea exitoso, es necesario que los gametos hayan
alcanzado su grado de madurez completo (Harvey y Hoar, 1980). Así mismo, si el
procedimiento de obtención de gametos no se realiza de modo apropiado en tiempo y
forma, el poro urogenital se puede obstruir y ocasionar la muerte de los reproductores o
los gametos pueden quedar inviables para su fertilización.
Las técnicas más comunes utilizadas para evaluar el estado de madurez sexual en
peces salmónidos son las siguientes: (1) observación del abultamiento del vientre,
coloración y dilatación de la papila genital, (2) extracción de los ovocitos utilizando
sondas o jeringas gruesas en hembras o realizando presión abdominal en los machos,
(3) análisis histológicos de las gónadas, (4) Medición de la concentración de hormonas
y otros precursores indicadores del estado de la madurez sexual para ambos sexos,
entre otros (Bromage y Cumaranatunga, 1988; Daza-Ardila y Bejarano-Montero, 1996;
Bonnet et. al., 1997). En el caso de las observaciones del vientre de los organismos, se
puede confundir el abultamiento ocasionado por los gametos con el alimento retenido
2
en el vientre y la coloración y dilatación de la papila genital con una irritación de la
misma. Por otro lado, la extracción de los gametos es un método muy estresante para
los organismos. El análisis histológico es un método de evaluación muy efectivo; sin
embargo, esto representa el tener que sacrificar a los organismos, lo cual no es una
opción apropiada para la trucha endémica de SPM. Finalmente, la medición de la
concentración de hormonas para la evaluación de la madurez sexual es costosa y al
igual que el análisis histológico consume tiempo y no brinda la información en el mismo
momento.
En los últimos años, la utilización del ultrasonido se ha convertido en una herramienta
nueva en el sector acuícola. Esta herramienta presenta un potencial importante para ser
utilizado en la evaluación del estado reproductivo de los reproductores de trucha de
SPM, siendo además un método no invasivo relativamente sencillo y que proporciona
información al instante (Moghim, et al., 2002).
Así mismo, la inducción a la maduración gonádica de la trucha de SPM mediante el
control del fotoperiodo y la temperatura, auxiliado con el monitoreo de dicho proceso vía
ultrasonido y su debida estandarización, permitirá incorporar eventualmente esta
técnica no invasiva en la futura producción comercial de esta subespecie nativa.
3
1.2 Antecedentes
1.2.1 Producción de trucha arcoíris
La trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se distribuye de manera natural desde el
suroeste de Alaska (Río Kuskokwim) hasta el Río Presidio, México, con registros
puntuales en las islas Commander en la península de Kamchatka en Eurasia (Behnke,
2002). Esta trucha ha sido introducida desde 1874 en muchas partes del mundo,
especialmente para pesca deportiva y actividades acuiculturales. La pesquería y el
cultivo de trucha arcoíris se practica en las cuencas altiplánicas de muchos países
tropicales y sub-tropicales de Asia, este de África y Sudamérica, dando como resultado
el desarrollo de varios linajes o cepas locales domesticadas, mientras que otras han
surgido a través de selección masiva y entrecruzamiento para mejorar la calidad de la
producción (FAO, 2009).
El cultivo de la trucha arcoíris se ha venido desarrollando de manera importante desde
la década de 1950 con la incorporación de alimento peletizado en los sistemas de
cultivo. Actualmente, los sistemas de cultivo se encuentran bien establecidos y muchos
aspectos para su cultivo son altamente eficientes. Sin embargo, la investigación y el
desarrollo actual continuamente intentan aumentar la eficiencia de la producción y las
ventas por medio del aumento de las densidades de cultivo, mejoramiento de la
tecnología de los sistemas de cultivo, desarrollo de líneas genéticas para mejorar el
crecimiento, el control de la maduración y del género; el mejoramiento de las dietas,
reducción de las concentraciones de fósforo en los efluentes y el desarrollo de mejor
comercialización (FAO, 2013).
La truticultura ha tenido un crecimiento exponencial desde 1950, especialmente en
Europa y más recientemente en Chile, quien es actualmente el mayor productor a nivel
mundial. Otros países productores importantes son: Noruega, Francia, Italia, España,
Dinamarca, EE.UU., Alemania, Irán y el Reino Unido (FAO, 2013). Esta actividad ha
tenido un considerable crecimiento desde 447 mil toneladas el año 2000, hasta 770 mil
toneladas el año 2011, lo que representó un crecimiento anual de más de 3.6% a nivel
mundial sobre la acuicultura de esta especie (Figura 1).
4
Figura 1. Producción acuícola de trucha arcoíris a nivel mundial en toneladas anuales del
2000 al 2011 (Fuente: FAO, 2013).
El cultivo de trucha arcoíris en México comenzó a finales del siglo XIX con el fin de
repoblar cuerpos de agua nacionales, iniciando con la introducción de ejemplares de
trucha en Chimela Lerma, Estado de México. En 1937 se formalizó la cría de trucha
arcoíris en cautiverio cuando el entonces presidente Lázaro Cárdenas decretó la
creación de un centro piscícola en Salazar, Estado de México, que en 1943 se convirtió
en el Centro Acuícola El Zarco, que fue el instrumento que facilitó la dispersión del
cultivo de la trucha en muchos cuerpos de agua del país (Gómez y Sarmiento, 2011).
En el año de 2010, la producción pesquera y acuícola de trucha ocupó el lugar 18 en
cuanto a volumen, con 9,212 toneladas en peso vivo, de las cuales aproximadamente el
75% provino de la acuicultura. Sin embargo, por su valor económico, la producción de
trucha se encuentra en el octavo lugar. La tasa media de crecimiento anual de la
producción en los últimos 10 años ha sido positiva con un 3.82%, con el Estado de
México y Tamaulipas como los principales productores (CONAPESCA, 2010). La
producción Nacional de trucha arcoíris proveniente de acuicultura ha aumentado
considerablemente de 2,622 toneladas en 2000, a 6,919 toneladas en 2010 (Figura 2).
5
Figura 2. Producción de trucha arcoíris a nivel nacional en el periodo de 2000 a 2010
(fuente: Anuarios Estadísticos de Pesca y Acuacultura, CONAPESCA 2010).
Actualmente existen cuatro Centros Acuícolas Federales que producen trucha:
Guachochi, en Chihuahua; el Zarco, en Estado de México; Pucuato, en Michoacán; y
Apulco en Puebla (CONAPESCA 2011). En estos centros se produce el pie de cría
(huevo oculado y crías de trucha) que sustenta la producción nacional; sin embargo, es
necesaria la importación de huevo oculado para satisfacer la demanda, que es superior
a la producción nacional, así como la importación de producto final de la engorda para
satisfacer la demanda de pescado en las temporadas de mayor consumo. Para 2010,
se registró la importación de 11,570,000 crías (Fuente: SENASICA, 2011).
El cultivo de la trucha se desarrolla preferentemente en localidades aledañas a ríos o
lagos que tienen agua de buena calidad (pureza y oxígeno), en estanques rústicos,
estanques rectangulares de concreto, o canales de flujo continuo (raceways) y tanques
circulares de concreto o de geomembrana (Figura 3).
En México la trucha arcoíris es la especie más cultivada; sin embargo, se ha
considerado una amenaza debido a su potencial invasor ya que puede competir con
otras especies de truchas y peces nativos, puede diseminar enfermedades e hibridarse
con truchas nativas.
6
Figura 3. Diagrama de flujo de la producción de trucha arcoíris (tomado de FAO, 20014).
1.2.2 Generalidades de la trucha arcoíris
La trucha arcoíris es un pez eurihalino perteneciente a la familia Salmonidae. Esta
trucha debe su nombre a la peculiar coloración que presenta, siendo de dorso verdoso
con flancos más claros; banda irisada en todo el cuerpo. Presenta numerosas manchas
negras en el dorso, flancos y sobre las aletas dorsal, adiposa y caudal (Figura 4).
También puede variar según el sexo, grado de madurez, ambiente y tamaño.
La longitud máxima de la trucha es de 60 cm, aunque se han registrado longitudes
mayores. Tiene de 3 a 4 radios suaves en la aleta dorsal, al igual que en la anal, con el
cuerpo alargado y cilíndrico en los individuos jóvenes y comprimido lateralmente en los
de mayor edad. Los machos adultos tienen la cabeza más alargada que las hembras,
mandíbula ganchuda, y coloración más acentuada. La anatomía externa detallada de la
trucha arcoíris se indica en la Figura 4.
7
Figura 4. Imagen ilustrativa de la estructura externa de una trucha arcoíris hembra
(fuente: http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/lesionguide/, modificada).
1.2.3 Ecología de la trucha de la Sierra de San Pedro Mártir
La trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss nelsoni es una subespecie endémica de la
pendiente occidental de la Sierra San Pedro Mártir, Baja California, México (Ruiz-
Campos y Pister, 1995) que presenta ciertas cualidades biotecnológicas (rápido
crecimiento en cautiverio, no migratoria y soporta un amplio intervalo de temperaturas).
Es importante mencionar que ya se cuenta con la información biológica y ecológica
necesaria para desarrollar su cultivo, y con esto disminuir el riesgo que presenta la
introducción de la trucha arcoíris importada de los centros truitícolas del país a los
cuerpos de agua del Estado de Baja California.
Varios autores concuerdan que la trucha de la Sierra de San Pedro Mártir (en lo
sucesivo denominada trucha de San Pedro Mártir) es una población confinada que
derivó de la trucha arcoíris costera Oncorhynchus mykiss (Hubbs, 1946; Needham y
Gard, 1959; Smith, 1984, 1991; Berg et al., ms). Esta trucha quedó aislada de otras
poblaciones de trucha arcoíris desde hace aproximadamente 10,000 años, durante el
periodo de desglaciación (o interglaciar), lo cual es evidenciado por la pureza de su
genotipo y su adaptación a los frecuentes bajos flujos y altas temperaturas que
caracterizan este hábitat sureño (Ruiz-Campos, 1993).
8
La trucha de San Pedro Mártir (SPM) se distribuye en los dos ríos principales, el Río
Santo Domingo (arroyos San Antonio de Murillos, La Zanja, El Potrero, La Grulla y La
Misión) y el Río San Rafael (Arroyo San Rafael), a través de un intervalo de altitud de
540 - 2030 metros sobre el nivel del mar (Figura 5) (Ruiz-Campos y Pister, 1995).
Figura 5. Localidades donde se distribuye la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus
mykiss nelsoni (Fuente: Ruiz-Campos, 1993).
La trucha de SPM, al igual que otros salmónidos que habitan los ríos de latitudes
septentrionales, tiene un comportamiento territorial, ya que defiende las zonas de los
arroyos más favorables, tales como las áreas de mayor profundidad, cobertura y
densidad de alimento, que favorecen su crecimiento. Los requerimientos alimenticios de
esta trucha se basan en una dieta insectívora, dominada en un 90% por larvas y pupas
del díptero Simuliidae y larvas de tricópteros (Ruiz-Campos y Cota-Serrano, 1992).
9
La densidad de truchas por unidad de área reportada para el Arroyo San Rafael es de
0.023 a 0.088 truchas/m2. Esta densidad puede ser afectada por catástrofes naturales,
tales como incendios y sequías. A pesar de esto, se encontró que esta trucha es capaz
de recuperarse tiempo después de suceder la catástrofe (Ruiz-Campos, 1989). La
densidad poblacional de esta trucha también se ve afectada por la hidrología del arroyo,
así como por las características hidrológicas que influyen en la cantidad del alimento y
en la calidad del sustrato (en este caso sustrato arenoso) (Ruiz-Campos, 1990). Las
truchas adultas prefieren pozas cuya profundidad oscila entre 30 y 150 cm. Entre los
depredadores naturales de la trucha de SPM destacan el mapache Procyon lotor, la
garza azul Ardea herodias, el martín pescador Megaceryle alcyon y la culebra acuática
de dos rayas Thamnophis hammondii (Ruiz-Campos, 1993).
La trucha de SPM tiene una tasa de crecimiento baja en su medio natural, la cual puede
deberse a varios factores, tales como la baja disponibilidad de alimento, alta
temperatura del agua y a la variación de las características geomorfológicas y de flujo
de los arroyos. La tasa de crecimiento somático de esta subespecie en términos de
longitud es mayor durante el primer año de vida, al igual que ocurre con otras especies
de trucha en el medio natural (Ruiz-Campos, 1993).
Esta trucha en su ambiente natural tiene un tamaño pequeño comparado con la trucha
arcoíris Oncorhynchus mykiss, ya que alcanza una longitud patrón de hasta 220 mm y
su crecimiento que es de tipo alométrico (las proporciones somáticas cambian en
función de la talla), y tiene una longevidad menor a cinco años (Ruiz-Campos, et. al.,
1997).
Las hembras se pueden diferenciar de los machos debido a que el tamaño de sus ojos
es similar a la longitud del rostro, a diferencia de los machos que presentan un tamaño
del ojo comparativamente menor que su longitud rostral. Los machos más longevos
desarrollan una protuberancia oscura en la parte apical de la maxilar inferior (Ruiz-
Campos, 1993). Estas diferencias morfológicas no son notorias en tallas pequeñas.
10
La coloración de este organismo depende del sustrato en que se encuentra. Esta
coloración exhibe dos fases: una clara, característica de zonas con corriente rápida y la
otra oscura, típica de zonas de remanso (Figura 6) (Ruiz-Campos, 1993).
Figura 6. Ejemplar de trucha de San Pedro Mártir con un patrón de coloración típico del
medio silvestre.
1.2.4 Reproducción
En general, la reproducción de la trucha arcoíris se da una vez al año durante los
meses de octubre a marzo. El desove lo hacen sobre arena o grava en aguas con
temperaturas de 8 a 13 °C (CONAPESCA, 2009).
En el caso de la trucha de SPM, la madurez gonadal ocurre a partir del primer año de
edad cuando tienen entre 103 y 112 mm longitud patrón (LP); sin embargo, es a partir
del intervalo de 123-132 mm LP cuando el 100% de las truchas están maduras (Ruiz-
Campos, 1993). Los machos maduran a los 15-18 meses, mientras que las hembras
después de los dos años. El ciclo reproductivo de esta trucha se inicia con el
incremento de la actividad hormonal y desarrollo de ovocitos que ocurre 12 meses
antes de la ovulación.
El mayor desarrollo gonadal se observa en invierno, siendo más alto en noviembre para
machos y en enero para hembras. El mayor desarrollo gonadal se observa en invierno,
en noviembre para los machos y en enero para las hembras, el desove de ocurre una
vez al año, de enero a marzo (Ruiz-Campos, 1993) y es controlado principalmente por
11
el fotoperiodo y la temperatura. La manipulación de estas variables ha sido utilizada con
éxito en el cultivo de salmónidos para adelantar, retrasar o inhibir la maduración.
Debido a que el fotoperiodo y la temperatura son los principales factores ambientales
que inciden sobre el sistema nervioso central y en particular, sobre el eje hipotálamo-
hipófisis-gónada de los peces, varios autores han modificado el fotoperiodo de la trucha
arcoíris para adelantar o atrasar los desoves (Bromage et al., 1984; Bon et al., 1997;
Elliot et al., 1984; Scott et al., 1984; Bonnet et al., 2007; Klempau, 2008; Wilkinson et
al., 2010).
Scott et al. (1984) y Elliot et al. (1984), adelantaron los desoves de trucha arcoíris hasta
seis meses antes de la temporada normal de reproducción. Juárez-Aguilar (2011)
realizó la inducción a la madurez sexual de machos de la trucha de SPM en un sistema
de recirculación con fotoperiodo artificial y control de la temperatura.
La técnica más común de fertilizar los óvulos de las truchas que se mantienen en
cautiverio es el método en seco (Leitritz, 1963). Esta técnica consiste en seleccionar los
reproductores que están listos para desovar luego de ser anestesiados, las hembras
son sujetadas por la aleta caudal y en una posición en la que la cabeza quede en un
nivel superior al de la aleta caudal, ya en esta posición, se procede a secar
completamente al organismo para después realizar un masaje abdominal que, cuando
las hembras han ovulado y están listas para desovar, hacen que los huevos fluyan
fácilmente hasta el recipiente de recolección.
Para la extracción del esperma se procede con un manejo similar al descrito para las
hembras. Se recibe directamente sobre la masa de huevos e inmediatamente se sigue
con la mezcla de ambos gametos utilizando para su efecto una pluma de ave, un
accesorio plástico o la mano.
Una vez realizada la mezcla, la fertilización es inmediata por lo que dejarlos reposar por
cinco minutos es suficiente antes de continuar con la hidratación y lavado. La adición de
agua después de este tiempo tiene como objetivo permitir la hidratación de los huevos,
lo que les dará turgencia y la resistencia suficiente para proceder con los lavados
finales y los correspondientes conteos.
12
Posteriormente los huevos son colocados en las incubadoras que pueden ser verticales
a contraflujo u horizontales con flujo ascendente, en donde tardarán aproximadamente
30 días en eclosionar. La alimentación de los alevines inicia cuando terminan de
absorber su saco vitelino para proceder a su engorda (FAO, 2014).
1.2.5 Métodos para evaluar el estado de madurez sexual en truchas
Evaluar el estado de madurez sexual sin lastimar o estresar a los reproductores es una
tarea difícil. Esta actividad debe realizarse a intervalos regulares para evitar el riesgo de
perder puestas por efectos de sobremaduración, ya que la utilización de huevos con
algún grado de sobremaduración tiene un efecto negativo sobre las tasas de
fertilización globales, las cuales disminuyen conforme transcurre el tiempo contado a
partir de la ovulación (Daza, et.al., 2005).
Hay una gran variedad de técnicas para evaluar la madurez. Se han desarrollado y
estandarizado índices gonadosomáticos para determinar el tiempo en que los
reproductores están listos para desovar, análisis histológicos de las gónadas y pruebas
para la detección y evaluación de esteroides sexuales que permiten observar los
cambios hormonales y determinar el estado de madurez sexual. Recientemente, el
empleo del equipo de ultrasonido ha permitido la observación indirecta de las gónadas,
sin la necesidad de utilizar métodos invasivos como la canulación o la extracción de las
gónadas para análisis histológico y ha sido de gran utilidad práctica (Novelo y Tiersch,
2012).
1.2.5.1 Índice gonadosomático
Para el cálculo del índice gonadosomático (IGS) es necesario extraer las gónadas de
una cierta cantidad de reproductores para estimar el estado de madurez sexual de
todos los reproductores.
El índice gonadosomático se calcula como el cociente entre el peso de la gónada y el
peso total del organismo (Lagler, 1978), de tal manera que se puede obtener una
13
gráfica que muestre la tendencia que tiene este índice a través del tiempo y así
determinar la temporada de desove. Paralelamente a la evolución del IGS, los ovocitos
tienen un desarrollo continuo que conduce a su maduración. Esto se traduce en una
serie de cambios a nivel hormonal y celular, los cuales se ven reflejados en el aumento
de tamaño, mismos que se utilizan para definir estados de maduración ovocitaria
(Figura 7) (Toledo et.al., 1994).
Figura 7. Evolución del índice gonadosomático y diámetro de ovocitos de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en la granja piscícola de Río Blanco, Chile (1992-1993)
(fuente: Toledo et al., 1994).
1.2.5.2 Biopsias ováricas
Existen varios métodos para extraer ovocitos, uno de ellos consiste en introducir una
sonda plástica a través del oviducto y mediante succión se extrae una muestra. Otro
método es mediante una jeringa de calibre grueso conectada a un tubo plástico flexible,
el cual es introducido a un costado de la aleta pélvica para realizar la succión. Un tercer
método es aquel que se basa en la aplicación de presión en la región abdominal del pez
14
para facilitar la expulsión de los huevos. Estos procedimientos pueden ser traumáticos
para la hembra, pero permiten observar los ovocitos en fresco. En el caso de la trucha
arcoíris se considera que los ovocitos con un diámetro mayor a 3.2 mm están maduros
y listos para ser ovulados y fertilizados (Bromage y Cumaranatunga, 1988).
Por otro lado, recientemente se ha venido utilizando otro método de selección de
reproductores basado en el factor de condición somático relativo (Kn o índice de
robustez) de los individuos, el cual se obtiene mediante el cociente del peso total
registrado y el peso teórico esperado (Pt/Pe) de cada individuo (Arias-Castellanos et.
al., 2002). Este índice ha sido correlacionado con el ciclo de desarrollo gonadal en
peces. Este método disminuye la manipulación excesiva de los individuos mejorando el
bienestar de los mismos (Senhorini y Landines-Parra, 2004).
1.2.5.3 Histología
Esta técnica se ha utilizado por mucho tiempo gracias a que provee información valiosa
y precisa que otras técnicas no pueden; sin embargo, es necesario matar a los
organismos para obtener las muestras de las gónadas. A pesar de ser una técnica
valiosa y precisa, ésta también puede ser muy cara. Para la utilización de esta técnica
es necesario tener como marco de referencia las estructuras gonadales y las
características celulares de los ovocitos de la especie a lo largo de su ciclo reproductivo
(Tablas 1 y 2).
15
Tabla 1. Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis
Endógena (estadios I, II y III) de las hembras de trucha arcoíris (Daza-Ardila y Bejarano-
Montero, 1996).
CARACTERÍSTICAS DESCRIPCIÓN
Diámetro en micras Mayores de 20 y menores de 400
Relación del núcleo con H&E Débilmente basofílico
Forma del núcleo Circular prominente
Nucléolos En promedio 20
Reacción del citoplasma con H&E Desde basofílico a débilmente acidofílico
Organización de citoplasma Homogéneo
Presencia de zona radiata No
Presencia de capa folicular Si
Presencia de teca SI, (excepto en el ovocito I)
Tabla 2. Principales características de los ovocitos en la etapa de Vitelogénesis Exógena (estadios IV, V, VI y VII) de las hembras de trucha arcoíris (Daza-Ardila y Bejarano-Montero, 1996).
CARACTERÍSTICAS DESCRIPCIÓN
Diámetro en micras Mayores de 400 y menores de 2500
Reacción del núcleo con H&E Débilmente basofílico
Forma del núcleo Ovalado con contornos irregulares
Nucléolos En promedio 20
Reacción del citoplasma con H&E Acidofílico
Organización del citoplasma Desde vesículas hasta lamina de vitelo
Presencia de zona radiata Si
Estrías en la zona radiata Si, perpendiculares al ovocito
1.2.5.4 Análisis de la variación hormonal y de vitelogenina en la maduración de la
trucha
Estos tipos de análisis son relativamente sencillos y proveen información del desarrollo
gonadal. La vitelogenina es un indicador directo del estadio reproductivo de las
hembras, por ello se han desarrollado diferentes métodos para su evaluación. Por
ejemplo, fósforo, fosfoproteína, contenido de proteína total y calcio, entre otros, han
sido utilizados como indicadores indirectos de niveles de vitelogenina (Bon et al., 1997).
16
Debido a la necesidad de desarrollar una técnica de medición directa de vitelogenina se
han generado técnicas como la inmuno-difusión radial, inmuno-aglutinación, o inmuno-
electroforésis, que a pesar de ser específicos no son muy precisos. De esta manera se
desarrollaron radio-inmunoensayos (RIA), que son más sensibles pero que requieren de
equipo caro y sofisticado. Otro método importante es el ensayo inmuno-absorbente
ligado a enzimas (ELISA) que cubre las desventajas de las otras técnicas de
inmunodetección, además de ser rápido y muy sensible (Bonnet et al., 1997); sin
embargo, este último método sigue siendo costoso.
Actualmente se cuentan con un procedimiento de diagnóstico ELISA para medir
hormonas en trucha. En el caso de los machos, el andrógeno que habitualmente se
considera para evaluar características sexuales es la testosterona y más
específicamente la 11-ketotestosterona (11-KT), que se aisló primeramente de
incubaciones de salmón del Atlántico (Idler y MacNab, 1967). Desde entonces se ha
identificado en el plasma de los machos de numerosos teleósteos, y está involucrado
en la espermatogénesis, en el desarrollo de características sexuales secundarias y en
el comportamiento reproductivo (Shultz, et.al., 2005).
Existen además en el mercado paquetes de diagnóstico desarrollados para medir
fácilmente la vitelogenina y/o la testosterona en el plasma de peces, y mejor aún
específicos para salmónidos como la trucha arcoíris.
1.2.5.5 Ultrasonido
Se han desarrollado métodos no invasivos para diagnosticar el estado de madurez
gonádico y evitar la muerte o el daño de los reproductores. El ultrasonido es una
herramienta que permite diagnosticar el sexo de los peces, verificar la presencia de
gametos (en el caso de las hembras) y evaluar su grado de desarrollo, sin la necesidad
de dañar a los organismos. Esta herramienta consiste en un transductor que convierte
señales en ondas sonoras de alta frecuencia y recibe las ondas que regresan o rebotan
(eco), las convierte en señales eléctricas y las envía a una computadora donde son
analizadas para generar imágenes (en tonos de gris).
17
Novelo y Tiersch (2012) utilizaron el método de ultrasonido como una herramienta para
identificar el sexo en los peces y sugieren procedimientos para estandarizar índices
cualitativos y cuantitativos para estimar el grado de madurez en especies acuáticas,
mediante la evaluación del tamaño de las gónadas y del tamaño de los ovocitos. Otra
forma de diferenciar los cambios en las gónadas es la densidad del tejido al observarlos
en las ecografías, dependiendo de los tonos de grises, los tejidos se clasifican en:
Anecoico: ausencia de señal de sonido (Negro); Hiperecoico: señales de mayor
intensidad de sonido (blanco); Hipoecoico: señal de menor intensidad (más negro que
gris); Isoecoico: señal de intensidad intermedia (tonalidad de grises) (Moghim et al.,
2002).
El uso de ecografías para la identificación del sexo y del estadio de madurez en las
hembras ha resultado ser un método de fácil aplicación, rápido y no invasivo (Evans et
al., 2004). La identificación del sexo es directa en los individuos adultos, las gónadas en
hembras se observan como dos masas de apariencia granular y de color gris claro,
mientras que en los machos los testículos se observan más pequeños y oscuros
(Moghim et al., 2002). En la Tabla 3 se muestran algunas especies de peces con las
que se ha trabajado implementando el ultrasonido en cuestiones de reproducción.
18
Tabla 3. Especies de peces en las que se ha implementado el ultrasonido en cuestiones
reproductivas (Novelo y Tiersch, 2012, modificada).
Especie Referencia
Peces de agua dulce
Esturión estrellado Acipenser stellatus Moghim et al. (2002)
Esturión nariz de pala Scaphirhynchus platorynchus Colombo et al. (2004)
Esturión nariz de pala y esturión pálido S. albus Wildhaber et al. (2005)
Esturión nariz de pala Wildhaber et al. (2007)
Esturión nariz de pala y esturión pálido Bryan et al. (2007)
Noturus placidus Bryan et al. (2005)
Bacalao Maccullochella peelii Newman et al. (2008)
Peces marinos y anádromos
Arenque del pacífico Clupea pallasii Bonar et al. (1989)
Bacalao del atlántico Gadus morhua Karlsen and Holm (1994), Davie et al.
(2003) y McEvoy et al. (2009)
Platija Verasper moseri Matsubara et al. (1999)
Halibut Hippoglossus hippoglossus Shields et al. (1993)
Halibut del atlántico, lenguado Pseudopleuronectes
americanus, platika aleta amarilla Limanda
ferruginea y el eglefino Melanogrammus aeglefinus.
Martin-Robichaud and Rommens (2001)
Salmon del atlántico Salmo salar Mattson (1991)
Salmon coho Oncorhynchus kisutch Martin et al. (1983)
Trucha arcoiris O. mykiss Evans et al. (2004), Evans et al. (2004)
Robalo Morone saxatilis Will et al. (2002), Blythe et al. (1994) y
Jennings et al. (2005)
Tiburón nodriza Jennings et al. (2005) Carrier et al. (2003)
Tiburon gato Scyliorhinus canicula y raya Raja
clavata
Whittamore et al. (2010)
19
1.3 Justificación
Entre las diferentes especies de truchas nativas que se encuentran en México, la trucha
arcoíris Oncorhynchus mykiss nelsoni presenta un gran potencial para ser cultivada, ya
que puede tener una alta tasa de crecimiento en condiciones favorables, es una
especie no migratoria y además, soporta variaciones amplias de flujo y temperatura en
su medio natural. Sin embargo, son pocos los esfuerzos que se han realizado por
desarrollar la técnica de su cultivo.
Para desarrollar la técnica de cultivo es necesario contar con la información básica de la
biología y ecología de la especie. Actualmente se cuenta con información suficiente
sobre la biología y ecología de esta trucha, que favorece el desarrollo de su cultivo. En
Baja California, se mantuvo a la trucha de SPM en condiciones de laboratorio con fines
reproductivos en la Universidad Autónoma de Baja California (UABC), lográndose la
reproducción ex situ y la descripción del desarrollo ontogénico (Ruiz-Campos, 1994).
Garduño-Franco (1995) llevó a cabo la fertilización e incubación ex situ de manera
simultánea de la trucha de SPM y de la trucha arcoíris (importada de la piscifactoría de
El Zarco, Estado de México) y evaluó de modo comparativo la tasa de fertilización,
supervivencia, y crecimiento somático hasta la fase de juvenil.
Aguilar-Juárez (2010), mantuvo ejemplares de la trucha de SPM en condiciones de
laboratorio, utilizando un sistema de fotoperiodo artificial y un sistema cerrado de
recirculación que permitió desarrollar metodologías de conservación de los
espermatozoides a corto y largo plazo. Sin embargo, tuvo problemas con la maduración
de las hembras, por lo que falta afinar la técnica de maduración de esta trucha con el
control del fotoperiodo y la temperatura.
El control del fotoperiodo y la temperatura combinado con una buena alimentación y
condiciones de cultivo favorecen la maduración sexual de la trucha, en condiciones de
cautiverio, la modificación del fotoperiodo y la temperatura pueden modificar el ciclo
reproductivo, retrasándolo o adelantándolo, lo cual puede resultar en dos ciclos de
reproducción al año. Dando como resultado el poder producir esta trucha con fines de
acuicultura. De esta manera, el desarrollo del cultivo de esta especie podría tener un
efecto positivo en el sector social y económico de la región como lo es la producción de
20
alimentos, la contribución a los medios de subsistencia y la generación de ingresos para
los diferentes sectores interesados en la actividad acuícola de esta especie. Si esta
actividad se adopta, las comunidades locales se verán beneficiadas con una nueva
alternativa de subsistencia aumentando su nivel económico. Este cultivo también puede
ser una alternativa para reforzar a corto plazo la población natural mediante el
suministro de semilla al medio en caso de que el número de truchas de SPM se vea
drásticamente reducida.
Un aspecto importante en el manejo de la trucha de SPM es el poder determinar las
etapas de madurez sexual sin necesidad de matar a los peces para obtener las
gónadas, considerando que se trata de una subespecie endémica que se encuentra
legalmente protegida y no es conveniente la utilización de los organismos estos fines.
Por otro lado, esta subespecie contiene un gran potencial para su cultivo y de alguna
manera es necesario obtener información de su biología reproductiva para mejorar su
cultivo y apoyar su conservación. Por tanto, es necesario generar métodos alternativos
para determinar su madurez gonadal sin causar ningún daño a los organismos. En este
caso, el uso de la técnica de ultrasonido juega un papel importante, porque a diferencia
de los otros métodos tales como la medición de hormonas, es mucho más barato y si se
ofrece un buen entrenamiento a los usuarios puede ser un método práctico, barato,
rápido de ejecutar y sobretodo no invasivo. Finalmente, la estandarización del uso del
ultrasonido para evaluar la madurez sexual de esta trucha endémica y su utilización
como una técnica no invasiva es un paso importante en su conservación y cultivo.
21
Capítulo 2. Hipótesis y Objetivos
2.1 Hipótesis
El uso del ultrasonido es una técnica rápida y no invasiva para la determinación del
sexo y el estado de desarrollo gonádico de la trucha de San Pedro Mártir,
Oncorhynchus mykiss nelsoni.
2.2 Objetivo General
Desarrollar un protocolo para la determinación del sexo y la evaluación de madurez
sexual de la trucha de San Pedro Mártir Oncorhynchus mykiss nelsoni utilizando el
ultrasonido.
2.3 Objetivos particulares
1. Acondicionar y mantener ejemplares de la trucha de SPM silvestres en un sistema
de recirculación acuícola.
2. Madurar sexualmente a la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y la
temperatura en un sistema de recirculación acuícola.
3. Estandarizar la técnica del ultrasonido para la determinación del sexo y la
evaluación del estado de desarrollo gonádico de la trucha de SPM.
4. Evaluar los cambios de la concentración de vitelogenina y testosterona en el plasma
sanguíneo de la trucha de SPM, durante su ciclo reproductivo para la validación del
método de ultrasonido.
22
Capítulo 3. Metodología
3.1 Recolección de organismos
3.1.1 Zona de captura
Las truchas fueron recolectadas en el Arroyo San Rafael en el sitio conocido como
Rancho Mike´s Sky, en la región noroeste de la Sierra de San Pedro Mártir, Baja
California (coordenadas geográficas: 31°05´49.7´´ N y 115°37´18.4´´ W; Figura 5). Este
arroyo se encuentra a una altura de 1,233 metros sobre el nivel del mar (msnm) y se
caracteriza por ser estrecho (5.58 m) y poco profundo (0.34 m).
3.1.2 Recolección de organismos
El día 28 de Septiembre de 2012, un total de 69 truchas fueron capturadas con un
equipo de electropesca (AC Smith-Root 15-B POW, Vancouver, Washington, USA)
utilizando un potencia de descarga entre 400 y 600 volts en un tramo del arroyo de 500
metros. Las truchas inmovilizadas y atraídas hacia el ánodo del equipo de electropesca
fueron capturadas con una red de mano e inmediatamente colocadas en cubetas con
agua del arroyo, y de ahí transferidas a una jaula colocada en el mismo arroyo (Figura
8A).
Posteriormente, los organismos capturados fueron colocados en bolsas de plástico con
agua del arroyo y suplementadas con oxígeno para mantener las condiciones de
concentración a saturación. Las bolsas debidamente selladas fueron colocadas en
hieleras con hielo para su transporte al laboratorio húmedo del Departamento de
Acuicultura del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de
Ensenada, B. C. (CICESE), en donde fueron colocadas en un sistema de recirculación
acuícola (SRA) (Figura 8B).
3.1.3 Parámetros ambientales de la zona de captura
Los parámetros ambientales tales como la temperatura (°C), la salinidad (ppt), el pH, los
sólidos disueltos totales (g/L) y la conductividad (mS/cm) fueron registrados con un
equipo multi-analizador Hydrolab Surveyor 4a en la zona de captura de los organismos.
23
Figura 8. A) Captura de truchas de San Pedro Mártir en el Arroyo San Rafael (Rancho
Mike´s Sky) con equipo de electropesca y red de mano. B) Preparación las bolsas de
plástico con agua y oxígeno para el transporte de las truchas capturadas.
A
B
24
3.2 Acondicionamiento y mantenimiento de organismos
3.2.1 Sistema de recirculación acuícola
Una vez en el laboratorio húmedo, las bolsas con las truchas (n= 69) se colocaron en
los tanques de cultivo del sistema de recirculación acuícola (SRA) y se liberaron cuando
que la temperatura del agua de la bolsa y el agua de los tanques fue igualada.
El SRA consistió en cuatro tanques de fibra de vidrio de 540 litros de color azul de
fondo plano conectados a un mismo drenaje que lleva el agua a un tanque de
compensación de 300 litros. El agua era circulada por una bomba magnética de 1/12 hp
(3MD-SC) hacia un biofiltro de medio granular de cuentas plásticas de 0.026 m3 de
capacidad (BBF1, Aquatic Ecosystem) con el fin de remover compuestos nitrogenados y
capturar sólidos. El agua pasaba por una bomba de calor de ½ caballo de fuerza
(Aqualogic, 4x) a fin de mantener la temperatura. La aireación se suministró en forma
constante utilizando las líneas de aire del departamento de Acuicultura.
El mantenimiento del SRA se realizó diariamente con recambios de agua del 10%
después de haber proporcionado la segunda ración alimenticia. Debido a que el agua
utilizada en los recambios provenía del sistema de agua municipal, ésta se mantenía en
otro tanque con aireación constante por 24 horas para eliminar el cloro (ver anexo 1
para leer acerca del procedimiento operacional para el mantenimiento de los
ejemplares).
3.2.2 Registro de los parámetros físico-químicos del sistema de recirculación
acuícola
Diariamente se midieron los parámetros de temperatura y concentración de oxígeno
disuelto con ayuda de un multiparámetros portátil YSI (Modelo #55-12 FT, Ohio, USA) y
el pH con un potenciómetro (pH plus direct, USA). Semanalmente se midieron las
concentraciones de nitrógeno amoniacal total (NAT) mediante la técnica del fenato de
Parsons et al., (1984), en la cual todo el amonio es convertido a amoniaco con la
adición de fenol-nitroprusiato en medio alcalino (pH 12), midiendo el producto de la
reacción en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 640 nm. Los nitritos (NO2)
25
se midieron por el método de diasociación de Griess y Llosvay (1989), donde el ácido
nitroso se convierte en un compuesto rosado cuya absorbancia es proporcional a la
cantidad de nitritos inicialmente presente. La alcalinidad (mg de CaCO3/L) se midió
mediante titulación con una solución de ácido sulfúrico de normalidad conocida y
utilizando fenolftaleína y verde de bromocresol como indicadores. Todos los parámetros
determinados semanalmente se hicieron de acuerdo al manual de Standards Methods
(Dean-Adams, 1990).
3.2.3 Régimen alimenticio
Las truchas fueron alimentadas los primeros días ad libitum con mísidos congelados
(Mysis relicta, Aquatic Ecosystem). Después de tres semanas las truchas se
alimentaron con una mezcla de mísidos descongelados y alimento extruido a saciedad
aparente. Una semana después se proporcionó el alimento con una tasa de
alimentación del 2% de su peso corporal húmedo en una proporción 1:1 (mísidos:pelet).
La proporción de alimento extruido se fue modificando gradualmente hasta que las
truchas aceptaron el alimento balanceado (aproximadamente dos meses) (para ver el
acondicionamiento de las truchas a alimento comercial revisar Anexo 2).
3.2.4 Registros biométricos
Las truchas fueron anestesiadas con aceite de clavo antes de realizar las biometrías
para evitar estrés. En una cubeta de 5 litros se agregaron aproximadamente 3 litros de
agua de los tanques de cultivo a la cual se le agregaron 0.1 mL de aceite de clavo
grado reactivo (95% Sigma-Aldrich). Una vez preparada la solución anestésica las
truchas se colocaron de manera individual en la cubeta (1 minuto aproximadamente)
hasta que éstas quedaron adormecidas y se podían manipular fácilmente para registrar
el peso (g) y la longitud total (mm) (Figura 9).
Este procedimiento se llevó a cabo mensualmente con las truchas mantenidas en el
fotoperiodo natural para evitar el estrés ocasionado por la manipulación de los
organismos. En el caso de las truchas sometidas al ciclo reproductivo acortado, el
26
registro biométrico se realizó al mismo tiempo que los muestreos de ultrasonido y de los
niveles de vitelogenina y testosterona en el plasma sanguíneo.
Una vez que se tuvieron todos los datos de peso y longitud se determinó la relación
peso-longitud mediante la ecuación: W = a Lb, con el programa FISHPARM (Saila et al.,
1988); donde W = peso calculado (g), L = longitud total (mm), “a” y “b” son constantes
obtenidas a partir de los datos de peso y longitud observados. Para determinar si el
crecimiento es de tipo isométrico (b = 3.0) o alométrico (b > 3.0 o b < 3.0), se utilizó una
prueba t Student (Sokal y Rohlf, 1981).
El factor de condición se calculó utilizando dos modelos diferentes (Anderson y
Gutreuter, 1983): (1) factor de condición de Fulton: KLT = W / L3 * 100 000; donde W =
peso (g) y L = longitud total (mm); y (2) factor de condición relativo Kn = W = / aLb,
donde W = peso (g), L = longitud total (mm) y a y b, son constantes de la regresión
peso-longitud para estos ejemplares.
27
Figura 9. Ejemplar macho de trucha de San Pedro Mártir colocado en una balanza digital
(0.1 g) para su pesaje (A) y en un ictiómetro (0.1 cm) para la medición de su longitud total
(B).
A
B
28
3.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y
la temperatura
3.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la
continuación del ciclo reproductivo
Las truchas capturadas ya habían iniciado su proceso de maduración sexual natural,
por lo que se les dieron las condiciones necesarias de fotoperiodo y temperatura para
que continuaran con su ciclo reproductivo en un SRA.
3.3.1.1 Sistema y condiciones de fotoperiodo
Para inducir a los organismos a la maduración sexual se diseñó y construyó un sistema
de iluminación, el cual constó de lámparas de luz blanca y luz blanca cálida (25 y 20
watts, respectivamente) conectadas a un temporizador (marca Brinks) atornilladas a
una base de metal (Figura 10). El cuarto donde se encontraban los tanques fue aislado
de la entrada de luz natural. Las lámparas se colocaron por encima del centro de los
tanques a una distancia de 1 m sobre la superficie del agua, de tal forma que los
tanques recibían de 500 a 1000 luxes de iluminación. Los luxes fueron medidos con un
luxómetro (Tradecable®, Cotrol Company) cada 15 días para reacomodar las lámparas
en el sistema de iluminación (Figura 11).
El fotoperiodo que se aplicó fue similar al natural de la época de captura (otoño) con 13
horas de luz y 11 horas de oscuridad (13L: 11O) y posteriormente se cambiaron las
condiciones de fotoperiodo para simular la estación de invierno con 6 horas de luz y 18
horas de oscuridad (6L: 18O) para continuar con el proceso de maduración natural.
Este fotoperiodo fue basado en las horas luz y de oscuridad determinadas para esta
latitud en las estaciones de otoño e invierno.
29
Figura 10. Sistema de iluminación utilizado para modificar el fotoperiodo en el sistema de
recirculación acuícola.
Figura 11. Luxómetro utilizado en la medición de luxes en el sistema de iluminación
(izquierda) y temporizador utilizado para encender y apagar las lámparas del sistema de
iluminación (derecha).
30
3.3.1.2 Régimen de temperatura
La temperatura que se utilizó para estimular el desarrollo gonádico fue de 17°C durante
la temporada de otoño y de 11°C durante la temporada de invierno. La temperatura se
controló con ayuda de una bomba de calor de ½ caballo de fuerza (Aqualogic, 4x). Este
régimen de temperatura fue basado en las temperaturas promedio registradas
estacionalmente y en ciclos de 24 horas en el Arroyo San Rafael de la Sierra San Pedro
Mártir (Ruiz-Campos, 1993, 1994).
3.3.1.3 Alimento para estimular la maduración sexual
La alimentación se proporcionó diariamente ad libitum dos veces al día: una por la
mañana y otra por la tarde. El alimento suministrado a las truchas fue el salmonado
extruido flotante de 4.8 mm con 42% de proteína y 10% de grasa, de la marca
NUTRIPEC (Purina México).
3.3.1.4 Desoves
Una vez alcanzada la madurez sexual de los organismos (finales de enero de 2013), las
truchas maduras fueron desovadas mediante el método en seco (Leitritz, 1980). Para
esto, las truchas de cada tanque fueron anestesiadas y se les secó el vientre y
mediante presión abdominal se obtuvieron los gametos. Las primeras presiones dieron
como resultado la obtención de heces y orina, las cuales fueron limpiadas hasta que se
obtuvieron los gametos. Finalmente, la cantidad de esperma de los machos y el número
y diámetro de huevos expulsado de cada hembra fue registrado.
31
3.3.2 Acortamiento del ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la
temperatura
Una vez probado el SRA y las condiciones de fotoperiodo y de temperatura se procedió
a acortar el ciclo reproductivo de las truchas de SPM para realizar la estandarización del
ultrasonido y evaluar el estado de madurez sexual de estas truchas desde el inicio del
ciclo reproductivo. La maduración sexual se monitoreó mensualmente mediante la
visualización de los órganos sexuales de las truchas utilizando el ultrasonido y se
corroboró el estado de madurez sexual con la medición de testosterona en machos y
vitelogenina en hembras.
3.3.2.1 Sistema, condiciones de fotoperiodo y régimen de temperatura
Después del primer desove, las truchas fueron marcadas con elastómeros en el
párpado adiposo para diferenciar el sexo y redistribuidas en los cuatro tanques de
cultivo a una misma biomasa (966.75 g/tanque).
Para modificar el fotoperiodo en el SRA se utilizó el sistema de iluminación antes
descrito. Después de dos semanas del desove de las truchas mantenidas con el
fotoperiodo natural (a mediados de febrero de 2013), se simuló el fotoperiodo de verano
(fotoperiodo largo) siendo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad (8L: 16O) durante dos
meses. Posterior a estos dos meses se cambió drásticamente el fotoperiodo para
simular invierno (fotoperiodo corto) siendo de 8 horas luz con 16 horas de oscuridad
(16L: 8O), el cual se mantuvo hasta que las truchas desovaron de nuevo. Para
estimular el desarrollo gonádico, los organismos fueron mantenidos a 18°C durante los
días largos y a 11°C durante los días cortos. La temperatura se cambió gradualmente
para evitar estrés térmico y fue regulada con ayuda de la bomba de calor.
32
3.3.2.2 Alimentación
El alimento se proporcionó diariamente a saciedad aparente dividida en dos raciones:
una por la mañana y otra por la tarde. El alimento utilizado para la maduración de las
truchas fue extrusado flotante de tamaño 4.8 mm con una composición proximal de
42% de proteína y 10% de grasa (NUTRIPEC, Purina México).
3.3.2.3 Desoves
Del 25 al 28 de octubre de 2013 se realizaron los desoves de las truchas y se
fertilizaron mediante el método en seco descrito previamente. Los huevos obtenidos de
cada trucha hembra fueron estimados mediante la relación entre el número de huevos
por gramo multiplicado por el peso total de los huevos. Los huevos producidos por las
hembras confinadas en un tanque se colocaron en una charola de incubación. Una vez
cuantificados los huevos, se determinó la fecundidad relativa de las truchas en función
del peso y la longitud total.
3.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido
3.4.1 Descripción del equipo utilizado
Para evaluar la madurez sexual, se utilizó un equipo de ultrasonido de uso veterinario
(Digital Palmtop Veterinary Ultrasound Scanner, modelo: BW520 V) marca BONDWAY,
seguridad: Clase II Tipo B, voltaje: AC 220/50HZ AC 110/60HZ, SHENEZHEn
BONDWAY ELECTRONICS CO., TTD (Figura 12). Las especificaciones del ultrasonido
se muestran en el Anexo 3.
33
Figura 12. Equipo de ultrasonido utilizado para el registro del desarrollo gonadal de la trucha de San Pedro Mártir mediante la interpretación de ecografías.
3.4.2 Estandarización del método
Para configurar el equipo de ultrasonido y así optimizar la resolución y facilitar la
visualización de los órganos y localizar la región de las gónadas, se disecaron tres
truchas hembras en diferentes meses (Figura 13a-f). Los ovocitos de las hembras en
diferentes etapas de maduración fueron medidos directamente con el ultrasonido y
extraídos para corroborar el tamaño con un vernier. En el caso de los machos, se
disecaron dos ejemplares para observar la forma, tamaño y ubicación de los testículos
(Figura 13g).
La observación de la anatomía de los órganos de la cavidad abdominal en los
ejemplares disecados sirvió como referencia para la localización de las gónadas con el
uso del equipo de ultrasonido. Se modificaron y optimizaron los parámetros del
ultrasonido y se definió la configuración para el proceso de observación de las gónadas
(Tabla 4).
34
Tabla 4. Parámetros del equipo de ultrasonido estandarizados para la observación de las
gónadas.
Parámetros: valor
Frecuencia (MHz): 9 MHz Correlación del marco (FC): 75%
Ganancia: 102 Procesamiento de imagen (IP): 2
Cercanía (Near): -16 IE: 0
Lejanía (Far): 08 ZOOM: *2.4 y 3
Imagen dinámica (Dyn): 27 Modo de escaneo: Modo-B
Enfoque (Focus): 1
3.4.3 Registro ecográfico de gónadas mediante ultrasonido
Una vez estandarizado el método de ultrasonido, las truchas anestesiadas se colocaron
en un recipiente con agua en posición dorsal (con el vientre hacia arriba) para capturar
las imágenes de las gónadas en posición transversal, utilizando la sonda a 9 MHz
(Figura 14). Con movimientos anteriores y posteriores de la sonda se visualizaron los
ovocitos o los testículos en hembras y machos, respectivamente.
El estado de maduración se evaluó en función del tamaño, ubicación y la densidad del
tejido de las gónadas, todo ello siguiendo los criterios ecográficos de clasificación
obtenidos por Evans et al. (2004). Las ecografías se realizaron mensualmente al
momento de realizar la extracción de plasma sanguíneo.
35
Figura 13. Estandarización del método del ultrasonido en la trucha de SPM. a) Trucha de
SPM anestesiada con aceite de clavo y colocada en un ictiómetro; b) disección de la
parte ventral de la trucha de SPM; c) visualización de los órganos de la trucha de SPM; d)
localización de la gónada de la trucha de SPM; e) trucha de SPM disecada cargada con
ovocitos maduros; f) ovocitos de trucha de SPM extraídos para su conteo y medición; g)
visualización de los testículos de una trucha macho.
36
Figura 14. Posición de la trucha al momento de manejar la sonda para la toma de las
ecografías de las gónadas.
3.5 Evaluación de los cambios de vitelogenina en plasma sanguíneo
3.5.1 Extracción y purificación de vitelogenina
Mensualmente se extrajo sangre de la vena caudal con una jeringa para insulina
heparinizada (5,000 UI/mL). Se colectó aproximadamente 0.5 mL de sangre de cinco
truchas hembra anestesiadas con aceite de clavo (Figura15) y se colocó en tubos
cónicos de 1.5 mL con aprotinina (4 UI de aprotinina por cada mL de sangre, para
inhibir la acción de las proteasas). Los tubos fueron agitados y centrifugados a 3000
rpm durante 10 minutos a 4°C para separar el plasma de la sangre. El sobrenadante
(plasma) fue transferido a un tubo limpio y almacenado en nitrógeno líquido hasta que
fue utilizado en el análisis de concentración de vitelogenina (protocolo sugerido por el
proveedor) (ver Anexo 4).
37
Figura 15. Extracción de sangre de la vena caudal de una trucha.
3.5.2 Determinación de la concentración de vitelogenina en plasma sanguíneo
mediante el método ELISA
La concentración de vitelogenina sérica se determinó mediante el ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo a la metodología descrita por el
proveedor (Biosense, Laboratories). La lectura de la reacción ELISA se realizó en un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Las concentraciones de
vitelogenina fueron calculadas a partir de una curva de calibración y expresadas en
mg/mL.
3.6 Evaluación de los cambios de testosterona en plasma sanguíneo
3.6.1 Extracción y purificación de testosterona
Mensualmente se extrajo sangre de la vena caudal con una jeringa para insulina
heparinizada (5,000 UI/mL). Se colectó aproximadamente 0.5 mL de sangre de cada
organismo y se centrifugó a 1500 rpm durante 10 min a 5°C para separar el plasma de
la sangre (Pavlidis et al., 1994). El plasma se transfirió a otro tubo y se almacenó en
nitrógeno líquido hasta que fue evaluado (ver Anexo 5).
38
3.6.2 Medición de la concentración de testosterona en plasma sanguíneo
mediante el método ELISA
Se determinó la concentración de testosterona mediante el ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo a la metodología descrita por el
proveedor (ABRAXIS) (Figura 16). La lectura de la reacción ELISA se realizó en un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Las concentraciones de
testosterona fueron calculadas a partir de la curva de calibración promedio y
expresadas en pg/mL.
Figura 16. Placa para el desarrollo del ELISA para testosterona de 96 pozos siendo
llenada con la curva de calibración.
39
3.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de madurez
sexual
Con el propósito de corroborar el alcance del método de ultrasonido y conocer su
eficiencia para la determinación del estado de madurez sexual de la trucha de SPM, se
procedió a confeccionar una tabla con los datos obtenidos de las disecciones, las
imágenes de ultrasonido y las concentraciones de vitelogenina y testosterona (Tablas 5
y 6), siguiendo los criterios para las imágenes de ultrasonido establecidos por Bon et al.
(1997), Evans et al., (2004), Novelo y Tiersch (2012), y Soivio et al. (1982), entre otros.
En este caso se consideraron los criterios de tamaño de los ovocitos, ecogenicidad del
tejido, concentración de vitelogenina, concentración de testosterona y la forma de las
gónadas de las truchas en las imágenes de ultrasonido para los meses muestreados.
40
Capítulo 4. Resultados
4.1 Recolección de organismos
Todos los ejemplares de trucha transportados llegaron de manera exitosa al laboratorio
del Departamento de Acuicultura de CICESE para su consecuente aclimatación en los
tanques de cultivo. Los valores promedio de los parámetros físico-químicos registrados
durante la captura fueron: temperatura de 21.5°C, pH 9.75 y conductividad de 0.321
mS/cm (en el Anexo 1 se resume el procedimiento operacional para el mantenimiento
de las truchas).
4.2 Acondicionamiento y mantenimiento de truchas de SPM
La aclimatación de las truchas a las condiciones del sistema de recirculación acuícola
(SRA) duró aproximadamente media hora. Después de ser colocadas en el sistema, las
truchas estuvieron estresadas un par de días, lo cual fue notorio debido a la coloración
oscura que presentaron, para posteriormente regresar a su coloración normal
característica de esta subespecie. Después de este tiempo las truchas se habituaron al
tamaño y forma de los tanques de cultivo, ya que no se observaron inquietas.
La adaptación de los individuos silvestres a las condiciones de cautiverio se vio
reflejada en una alimentación activa. Una vez que las truchas aceptaron el alimento
comercial (dos meses aproximadamente) éstas se acercaban a la superficie cuando
notaban la presencia de alguien ya que lo relacionaron con la alimentación (Figura 17).
En el mes de septiembre de 2013, durante un muestreo se observó que algunas
truchas presentaban lesiones en las aletas ocasionadas por interacciones sociales, por
lo que se les dio baños salinos (5 g/Kg) y tratamiento con oxitetraciclina (40 mg/L) para
las truchas con lesiones y un tratamiento preventivo para aquellas sin lesiones. Los
baños salinos se realizaron en el mismo sistema de recirculación acuícola agregando la
sal poco a poco en el tanque de compensación. Este proceso se repitió cada 72 horas
tres veces. Para el tratamiento con oxitetraciclina se preparó un contenedor con agua y
la oxitetraciclina en polvo se disolvió para dar baños por inmersión de una hora a las
truchas de cada tanque por un periodo de 10 días (Figura 18). Después de este
tratamiento las truchas restablecieron su salud (ver anexo 5).
41
Figura 17. Truchas de SPM ya acondicionadas a los tanques de cultivo.
Figura 18. Truchas en tratamiento con oxitetraciclina.
42
La supervivencia final de las truchas de SPM fue de 63.8%. Esta supervivencia se debió
a que saltaron fuera de los tanques. Las truchas muertas fueron disecadas para hacer
la verificación de los órganos con respecto a su disposición y contrastar con las
imágenes del ultrasonido. No se encontraron mortalidades asociadas a enfermedades o
mala calidad del agua en el SRA.
4.2.1 Parámetros de calidad de agua
Durante el periodo de doce meses que duraron las truchas en cautiverio en el SRA
(septiembre de 2012 a septiembre de 2013), los parámetros de la calidad del agua
fueron los siguientes: 0.086 ± 0.056 mg/L de NAT, 0.099 ± 0.089 mg/L para nitritos y 53
± 18.77 mg/L para nitratos. Los valores de alcalinidad y pH fueron 135.29 ± 4.10 mg
CaCO3/L y 7.56 ± 0.19 respectivamente. En cuanto a la concentración de oxígeno, esta
se mantuvo en 6.39 ± 0.18 mg/L (las fluctuaciones de los parámetros de calidad de
agua se pueden ver en el Anexo 7).
4.2.2 Registros biométricos
La ecuación de la relación peso-longitud, para los organismos mantenidos en cautiverio
durante 13 meses fue: W = 0.000005052 LT3.136 (r2 = 0.964) (Figura 19). El factor de
condición de Fulton promedio encontrado en estas truchas fue de 1.04 ± 0.14 (Figura
20). El factor de condición relativo (Kn) para las truchas mantenidas en estas
condiciones registró un promedio de 1.01 ± 0.14 (Figura 21), siendo similar al factor de
condición de Fulton.
El factor de condición relativo fue utilizado debido a que esta trucha exhibe un
crecimiento de tipo alométrico (b diferente de 3.0), tanto en el medio silvestre como en
condiciones de cautiverio (b = 3.136 > 3.0; Prueba t = 4.37, p < 0.005). Valores ≥ 1.0
representan condiciones fisiológicas y ecológicas óptimas para los individuos (Ruiz-
Campos et al., 1997), por lo que los valores promedio registrados en este trabajo
estuvieron en el óptimo indicando la buena salud de los organismos.
Durante el mes de enero se observó un descenso notable en el índice de condición que
coincidió con la fecha cuando se realizaron los desoves. Así mismo se observó que el
43
peso de las truchas disminuyó en esta misma fecha, que coincidió con la expulsión de
los gametos (óvulos y esperma), mientras que la longitud aumentó.
Al momento de la captura, las truchas pesaron en promedio 37.5 ± 15 g (intervalo de 16
a 88 g) y midieron 149 ± 18.8 mm (intervalo de 121 a 206 mm) en longitud total.
Después de 12 meses en condiciones de cautiverio, los organismos alcanzaron un peso
de 203.4 ± 11.7 g (intervalo de 191.5 a 215.6 g) y midieron 267 ± 12 mm (intervalo de
255 a 284 mm) en longitud total (Figuras 22 y 23). La tasa de crecimiento en peso fue
de 0.46 g/día y en longitud de 0.3 mm/día. El crecimiento somático en peso y longitud
de las truchas se incrementó notablemente a partir del octavo de mes en condiciones
de cautiverio.
El aceite de clavo resultó ser un anestésico eficaz y seguro para esta trucha. La
recuperación de las truchas en un tanque de recuperación fue rápida (~5 minutos) y
total en todas las truchas.
Figura 19. Relación peso-longitud de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones
de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. Los
puntos negros indican los valores observados y los puntos blancos indican los valores
calculados.
44
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
KLT
Figura 20. Factor de condición de Fulton calculado para las truchas de SPM adultas
mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de
recirculación acuícola. El símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica
el error estándar.
45
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
Kn
Figura 21. Factor de condición relativo (Kn) calculado para las truchas de SPM adultas
mantenidas en condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de
recirculación acuícola. El símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica
el error estándar.
46
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
Peso (
g)
Figura 22. Crecimiento en peso de truchas de SPM adultas mantenidas en condiciones de
cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación acuícola. El
símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica el error estándar.
47
10-12 12-12 02-13 03-13 05-13 07-13 09-13
Fecha
120
140
160
180
200
220
240
260
280
LT
(m
m)
Figura 23. Crecimiento en longitud total (LT) de truchas de SPM adultas mantenidas en
condiciones de cautiverio por un periodo de 12 meses, en un sistema de recirculación
acuícola. El símbolo cuadro indica el promedio y el intervalo vertical indica el error
estándar.
48
4.3 Maduración sexual de la trucha de SPM mediante el control del fotoperiodo y
la temperatura
4.3.1 Condiciones de fotoperiodo y temperatura aplicadas para estimular la
continuación del ciclo reproductivo
Se logró continuar con el ciclo natural de maduración sexual de la trucha mediante las
condiciones mantenidas en el SRA. El 79.2% de las hembras maduraron y la
fecundidad promedio de éstas fue de 2.1 huevos por cada gramo de peso corporal. La
fecundidad absoluta promedio alcanzada fue de 163 ± 55 huevos. Los huevos maduros
expulsados presentaron un promedio de 4.1 mm de diámetro. El 78.9%, de los machos
liberaron esperma al momento de aplicar una presión abdominal. El volumen de
esperma obtenido por macho osciló entre 0.12 y 0.45 mL. Se logró realizar la
fertilización de los huevos de trucha de SPM y se produjeron 49 alevines de esta trucha
en cautiverio con el fotoperiodo natural.
4.3.2 Acortamiento el ciclo reproductivo mediante el control del fotoperiodo y la
temperatura.
Las truchas alcanzaron la madurez sexual por segunda vez el mismo año en octubre de
2013. Un 94.1% de ellas contenían huevos. La fecundidad de estas fue de 2.82 huevos
por gramo de peso corporal y 21.3 huevos por cada centímetro de longitud total. La
fecundidad absoluta promedio alcanzada fue de 454 ± 145 huevos, y en total se
obtuvieron más de 7,000 huevos de las 15 hembras. Los huevos midieron en promedio
3.8 ± 0.2 mm de diámetro. En el caso de los machos, un 84.6% de los machos y
liberaron esperma. El volumen de esperma osciló entre 0.11 y 1.5 mL por macho.
49
Figura 24. Jeringas con esperma y ovocitos de la trucha de SPM obtenidos de los
desoves.
4.4 Evaluación de madurez sexual mediante el ultrasonido
En todas las hembras disecadas se observaron ovocitos. De acuerdo al grado de
madurez sexual se encontraron ovocitos de diferentes tamaños. Fue posible realizar
una identificación del sexo (hembras: dos tejidos con forma granular; y machos: dos
tejidos con forma lobular, posicionados entre el estómago y el riñón de la trucha en
ambos casos) y determinar su desarrollo de madurez midiendo los ovocitos con el
ultrasonido y comparando dichas mediciones con los mismos ovocitos medidos con el
vernier. En general, las mediciones realizadas a los ovocitos con el ultrasonido
coincidieron con las mediciones realizadas con el vernier a los ovocitos extraídos
(Figura 25).
En los machos la evaluación del estado de madurez sexual fue difícil ya que en las
ecografías no se mostró una diferencia progresiva en el color de la imagen debido a la
densidad del tejido; sin embargo, al final de los muestreos cuando las truchas se
encontraban maduras, fue posible observar los testículos como una imagen más clara y
con apariencia estriada.
En general, fue posible diferenciar fácilmente truchas recién desovadas de truchas aún
maduras, siendo evidente en las hembras desovadas la presencia de ovocitos
remanentes en la región ventral (ver ecografías en Anexo 8).
50
Figura 25. Captura de imagen de un ovocito de la trucha de SPM mediante ultrasonido y verificación de su tamaño con el uso de un vernier.
4.5 Evaluación de los cambios en la concentración de vitelogenina en el plasma
sanguíneo
En el mes de mayo de 2013 se registró una concentración de VTG de 28.4 mg/mL en la
muestra de plasma sanguíneo de hembras de la trucha de SPM. La concentración de
VGT se incrementó y el mayor valor fue registrado en el mes de julio (106 mg/mL).
Después del mes de julio, la concentración de VTG fue superior al límite de detección
del método (200 mg/mL), y no se contó con una muestra adicional de plasma para
repetir el análisis con una dilución adecuada, por lo que no se pudo conocer con
precisión la concentración de VTG de los siguientes meses (Figura 26); sin embargo,
estas concentraciones tan elevadas confirman que las truchas se encontraban en
proceso de maduración sexual.
51
Figura 26. Concentración de vitelogenina (VTG) detectada en el plasma sanguíneo de
truchas hembras de SPM, durante el ciclo reproductivo acortado. El círculo indica el
promedio y el intervalo vertical indica el error típico.
4.6 Evaluación de los cambios en la concentración de testosterona en el plasma
sanguíneo
Las concentraciones encontradas para machos de la trucha de SPM expuesta a un
ciclo de maduración acortado fueron desde 1.6 hasta 50.3 ng/mL.
Se observó un incremento notable en la concentración de testosterona en el plasma
sanguíneo a partir de julio. La menor concentración se registró en abril (1.6 ng/mL). El
pico más alto de testosterona se encontró en agosto con una concentración de 50.3
ng/mL, para luego descender a 31.7 ng/mL en el mes siguiente, lo que indica que estas
truchas se encontraron maduras a partir de agosto (Figura 27).
52
Figura 27. Concentración de testosterona detectada en el plasma sanguíneo de truchas macho de SPM, durante el ciclo reproductivo acortado. El círculo indica el promedio y el
intervalo vertical indica el error típico.
4.7 Validación del método de ultrasonido para la determinación de la madurez
sexual de la trucha SPM
Para corroborar la eficiencia del método de ultrasonido para la determinación del sexo y
el desarrollo gonádico de la trucha de SPM, con los datos obtenidos de las disecciones,
imágenes de ultrasonido y concentraciones de vitelogenina y testosterona, se elaboró
una tabla tomando como base los criterios de Bon et al. (1997), Evans et al. (2004),
Novelo y Tiersch (2012), Soivio et al. (1982), entre otros; mismos que consideran el
tamaño de los huevos, ecogenicidad del tejido, concentración de vitelogenina,
concentración de testosterona y las imágenes de ultrasonido de los meses muestreados
(Tablas 5 y 6).
53
Tabla 5. Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez sexual femenina de las truchas de San Pedro Mártir (Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: el tamaño de los ovocitos, la concentración de vitelogenina, descripción de las gónadas en las ecografías y las imágenes de ultrasonido más representativas de los muestreos realizados. Las imágenes de ultrasonido obtenidas mensualmente se pueden observar en el Anexo 8.
Criterio
Concentración
promedio de
vitelogenina
Tamaño
de los
ovocitos
Descripción
del tejido
en las
ecografías
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía) Tiempo
en
meses
Mes 1
(Marzo) < 25 mg/mL
No se detecta
presencia
No es posible ver los ovarios.
54
Tabla 5. Continuación
Criterio
Tiempo en meses
Concentración
promedio de
vitelogenina
Tamaño
de los
ovocitos
Descripción del
tejido en las
ecografías
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía)
Mes 5 (Julio)
106.07 mg/mL 1.7 mm
Los ovarios son fácilmente
visibles en la cavidad visceral. A partir de este mes se pueden
medir los ovocitos. La
membrana de los ovocitos se
observa más blanca debido a que su densidad es mayor que la del resto de los
tejidos en la imagen. Se
considera un tejido Hiperecoico
55
Tabla 5. Continuación.
Criterio
Tiempo en meses
Concentración promedio de vitelogenina
Tamaño de los
ovocitos
Descripción del tejido en las ecografías
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía)
Mes 7 (Septiembre)
> 200 mg/mL 3.8 mm
Los ovarios son muy evidentes en
la cavidad visceral. Los ovarios se encuentran de mayor tamaño
debido al crecimiento de los
ovocitos. Presentan una forma elíptica
hacia las paredes de la cavidad
visceral. No se alcanzan a
visualizar los dos ovarios completos en la imagen. Los ovarios compiten
por espacio con el resto de los
órganos. En esta etapa los ovarios se consideran un
tejido Hiperecoico.
56
Tabla 6. Criterios para clasificar del estado de desarrollo de madurez sexual en machos de la trucha de San Pedro Mártir (Oncorhynchus mykiss nelsoni), utilizando ultrasonido: la concentración de testosterona, la descripción del tejido y las imágenes de ultrasonido más representativas de los muestreos realizados. Las imágenes de ultrasonido obtenidas mensualmente se pueden observar en el Anexo 8.
Criterio
Tiempo en meses
Concentración
promedio de
testosterona
Descripción del
tejido
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía)
Mes 1
(Marzo) < 1 ng/mL
Los testículo se observan un poco
más claros que los órganos
circundantes, debido a que se encuentra sólo el
lóbulo de los testículos que es
más denso
57
Tabla 6. Continuación.
Criterio
Tiempo en meses
Concentración
promedio de
testosterona
Descripción del
tejido
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía)
Mes 5
(Julio) 46.13 ng/mL
Se observan claramente los
lóbulos.
Los testículos presentan líquido seminal por lo que
se observan partes de los
testículos como Hipoecoico
58
Tabla 6. Continuación.
Criterio
Tiempo en meses
Concentración promedio de testosterona
Descripción del tejido
Imagen tomada con el ultrasonido
(ecografía)
Mes 7
(Septiembre) 31.7 ng/mL
Los testículos se observan
inflados llenos de esperma con una coloración
más clara, siendo
Hiperecoico en comparación
con el músculo.
Los testículos compiten por
espacio con el resto de los
órganos.
59
Capítulo 5. Discusión
Mantenimiento de ejemplares en condiciones de cautiverio
El sistema de recirculación acuícola (SRA) utilizado en el presente trabajo resultó ser
adecuado para el mantenimiento de las truchas, y al mismo tiempo permitió el
acondicionamiento en cautiverio. Resultados similares fueron también reportados por
Aguilar-Juárez (2010), quien utilizó un SRA del mismo tipo para la trucha de SPM. Los
resultados de la supervivencia indican que es posible mantener a la trucha de SPM en
cautiverio bajo condiciones controladas. La capacidad de esta subespecie de adaptarse
a condiciones más cálidas, propias de su área de distribución, le confieren una ventaja
sobre la trucha arcoíris que actualmente se cultiva; por lo cual, el desarrollo de su
cultivo puede representar un freno a la introducción de la trucha arcoíris a la región
noroeste de Baja California.
Durante el proceso de maduración, algunos organismos presentaron irritación en la piel,
probablemente debido a la conducta agresiva de los ejemplares más grandes, por lo
que se aplicaron tratamientos preventivos con solución salina y oxitetraciclina. Estos
tratamientos resultan efectivos para el control de las enfermedades, tal como ocurre de
manera común en la prevención y tratamiento de enfermedades en la industria trutícola
(Haug et al., 2000; Jacobsen, 1989), como también para la trucha de SPM (Aguilar-
Juárez, 2010).
Por otro lado, son conocidos los casos en que algunas especies de peces silvestres no
aceptan del todo el alimento comercial después de su captura y experimentan una
disminución de su índice de condición somática, y en casos extremos mueren. Esta
fase de transición es crítica en la supervivencia de los organismos. No se encontraron
reportes de mortalidad de organismos silvestres debida al cambio de alimentación, sin
embargo, la disminución del índice gonadosomático o mortalidades son muy comunes
cuando a los alevines se les cambia la dieta de alimento vivo (e.g. artemia, rotíferos) a
alimento comercial (i.e. peletizado o extruido). Por ejemplo, en el robalo rayado (Morone
saxatilis) y el bacalao (Gadus morhua) se han registrado altas tasas de mortalidad y
canibalismo durante la fase de transición de alimento vivo a dieta inerte (Otteraa y Lie,
60
1991; Paller y Lewis (1987). Los intentos de adelantar este proceso llevan a un
descenso progresivo del crecimiento y la supervivencia. No obstante, con la trucha de
SPM fue relativamente fácil y rápido este cambio de dieta y se pudo observar que se
alimentaban en forma activa y no se registraron mortalidad ni enfermedades
relacionadas con la inanición.
Crecimiento somático
A pesar de haber trabajado con truchas adultas, su crecimiento fue más alto que el
reportado en truchas silvestres de la misma subespecie. En este estudio alcanzaron
una longitud total de 267 mm y 203.4 g de peso. En contraste, la talla y peso máximo
registrado por Ruiz-Campos (1993) y Ruiz-Campos et al. (1997) en organismos
silvestres con una edad máxima de cuatro años fue de 241.6 mm LT y 151.8 g,
respectivamente Aguilar-Juárez (2010) mantuvo ejemplares de esta subespecie por
13.2 meses y observó una talla máxima de 290 mm y un peso máximo de 360 g.
El factor de condición de Fulton se utilizó con el propósito de comparar el estado de la
TSPM con otras poblaciones de la trucha arcoíris, donde han asumido un crecimiento
de tipo isométrico. El factor de condición de Fulton promedio encontrado en la trucha de
SPM fue de 1.04 ± 0.14. El factor de condición relativo fue utilizado debido a que esta
trucha exhibe un crecimiento de tipo alométrico (b diferente de 3.0), tanto en el medio
silvestre (Ruiz-Campos, 1993) como en condiciones de cautiverio (b = 3.136 > 3.0;
Prueba t = 4.37, p < 0.005). El factor de condición relativo calculado en este estudio
para la trucha de SPM (Kn = 1.01 ± 0.14) fue similar que el registrado en el medio
silvestre (Kn = 1.003 ± 0.129) por Ruiz-Campos et al. (1997), indicando en ambos casos
condiciones óptimas para su desarrollo (Anderson y Gutreuter, 1983). Similares
resultados han sido encontrados por Sheethan et al. (1999) con truchas arcoíris
hembras diploides y triploides, y Bastardo y Sofía (2003) con hembras revertidas
sexualmente.
Durante el mes de enero se observó un descenso en el factor de condición que fue muy
notorio. Esta fecha coincide con la fecha en que se realizaron los desoves, lo que
explica el descenso en el peso mientras que el crecimiento en longitud se mantuvo.
61
Esta condición también fue registrada para la trucha de SPM en su ambiente natural
(Ruiz-Campos, 1993).
La tasa de crecimiento en peso y longitud registrada en este estudio (0.46 g/día y de 0.3
mm/día, respectivamente), fue ligeramente mayor que la registrada por Aguilar-Juárez
(2010), de 0.29 g/día y 0.26 mm/día. Así mismo, la tasa de crecimiento obtenida en el
presente trabajo fue mayor a la máxima reportada en el medio natural para truchas
silvestres de un año de edad (cf. Ruiz-Campos, 1993). Arredondo-Figueroa et al.
(1996), reportaron una de las más altas tasas de crecimiento para la trucha arcoíris en
la etapa de engorda (menores de un año de edad), con 3.6 g/día y 1 mm/día para
organismos mantenidos en un SRA a baja densidad. La diferencia entre la trucha
arcoíris y las truchas SPM mantenidas en cautiverio, son el producto de la selección
genética de reproductores durante muchas generaciones, que ha redituado en
ejemplares más vigorosos y con mayor tasa de crecimiento somático.
Cabe mencionar que un ejemplar macho de trucha de SPM mantenido en cautiverio por
6 años después de la captura (longitud y peso inicial aproximados de 125 mm y 20 g
respectivamente) alcanzó una talla de 373 mm y un peso de 529.9 g (G. Ruiz-Campos,
comunicación personal). Este ejemplar se encuentra depositado en la colección
ictiológica de la Universidad Autónoma de Baja California (No. catalogo: UABC-2884).
El dato anterior permite pensar que a pesar de ser una subespecie aislada de trucha
arcoíris costera, aún tiene el potencial genético para su crecimiento en condiciones
óptimas de alimentación, fotoperiodo y temperatura.
La tasa de crecimiento somático anual registrada para la trucha de SPM, en términos de
longitud y peso, es mayor durante el primer año de edad en condiciones silvestres
(Ruiz-Campos, 1993; Ruiz-Campos et al., 1997), por lo que se esperaría que las
truchas juveniles mantenidas en cautiverio tengan una mayor tasa de crecimiento y
alcancen un mayor peso en un menor tiempo.
Ruiz-Campos (1993) y Ruiz-Campos et al. (1997), sugieren que el lento crecimiento de
las truchas silvestres se puede deber a la poca disponibilidad de alimento y a las
temperaturas más altas del agua que se presentan en el extremo más sureño de su
distribución nativa, lo cual incrementa la tasa metabólica y reduce el crecimiento
62
somático. En este trabajo, el alimento y la temperatura no fueron limitantes, ya que la
temperatura se mantuvo dentro de los intervalos establecidos en su ambiente y el
alimento fue constante, lo que pudo favorecer el crecimiento de estos organismos en
cautiverio. Esto reafirma el potencial que presenta la trucha de SPM para su cultivo.
Calidad del agua
La calidad del agua es uno de los principales factores que regulan la salud de los peces
en condiciones de cultivo. Por tanto, el control y el monitoreo de la calidad del agua
fueron factores importantes para el mantenimiento de la buena salud de estos peces. El
SRA utilizado mantuvo la buena calidad del agua, misma que junto con el alimento se
vio reflejada en la salud y el crecimiento de los organismos.
Los parámetros críticos son la temperatura, el oxígeno disuelto, el NAT, los nitritos, la
alcalinidad, el dióxido de carbono y los sólidos suspendidos (Timmons et al., 2002). De
estos, el oxígeno disuelto es el parámetro más importante debido a que estos peces
requieren concentraciones de 6 a 8 mg/L (Timmons et al., 2002). En el sistema utilizado
para las truchas en este trabajo, el oxígeno disuelto se mantuvo en promedio en 6.39
mg/L y la concentración nunca llegó a ser menor a 5 mg/L, que es el límite inferior que
soportan las truchas (Godoy, 2002).
La temperatura se mantuvo estable a pesar de que en algunas ocasiones se
interrumpió la electricidad por varias horas, lo que evitó el funcionamiento de los
equipos de bombeo, enfriamiento e iluminación. Sin embargo, debido a que los tanques
tenían aislamiento termal se logró mantener la temperatura del agua de los tanques,
evitando así que ascendiera de manera súbita. Durante este experimento, la
temperatura se mantuvo entre 10 y 20°C y el pH entre 7 y 8 (7.56). Estos valores
estuvieron dentro de los intervalos adecuados para esta trucha (Ruiz-Campos, 1994),
así como también en el intervalo óptimo reportado para el proceso de nitrificación en
agua dulce (Timmons et al., 2009).
Por su parte, las concentraciones de NAT se mantuvieron en niveles bajos (promedio
0.086 mg/L) como resultado de la eficiencia de nitrificación del biofiltro. El NAT se
vuelve más tóxico a temperatura y pH elevados, debido a que en estas condiciones la
forma más abundante es la no ionizada (NH3), la cual tiene la propiedad regresar a los
63
tejidos por su gradiente de concentración entre el agua de cultivo y la sangre (Timmons
et al., 2009).
Los nitritos son un producto intermediario de la descomposición aeróbica de
compuestos orgánicos nitrogenados resultantes del metabolismo de las bacterias
quimioautótrofas presentes en el biofiltro y contrario al nitrógeno amoniacal se torna
tóxico a pH bajo. Es por esto que es necesario mantener una temperatura y pH
adecuados en los sistemas de cultivo. En este estudio, la concentración de nitritos
también se mantuvo baja (0.09 mg/L) lo que nos indica que el biofiltro estuvo trabajando
eficientemente.
En lo que respecta a los nitratos, éstos son el producto final de la nitrificación
(descomposición aeróbica de los nitritos por baterías autótrofas, nitrobacter) y no
representan ningún peligro para los peces en cultivo a no ser que se presenten en
concentraciones muy altas (100 mg/L) (Godoy, 2002). Las altas concentraciones de
este compuesto en conjunto con el ion H+ pueden favorecer la producción de ácido
nítrico en el agua, bajando el pH, además de limitar la regulación osmótica en los peces
(Stickney, 2000). La concentración de nitratos medida en este trabajo, a pesar de ser
alta (53 mg/L), no tuvo un efecto negativo aparente en la salud de los organismos. La
alcalinidad se mantuvo en una concentración adecuada (135 mg de CaCO3/L), lo que
permitió que trabajara como amortiguador del pH en el agua, además de servirle como
sustrato (fuente de carbono) a las bacterias nitrificantes del biofiltro.
Un factor importante que hay que recalcar en el mantenimiento de estos organismos es
que se utilizó agua de la ciudad para los sistemas. El agua de ciudad contiene cloro, el
cual puede provocar daños crónicos en las branquias o ser letal para los peces si se
encuentra en concentraciones de 0.1 a 0.3 mg/L o de 0.05 mg/L si la exposición es
prolongada (Holland et al., 1960; Stickney, 2000). Además, el cloro puede tener un
efecto negativo en la carga bacteriana del biofiltro, por lo que es muy importante su
remoción constante. El método de remoción por aireación utilizado en este trabajo fue
eficaz y mantuvo el agua del sistema sin residuos de cloro.
64
Maduración sexual y desove de la trucha de SPM
La manipulación del fotoperiodo y la temperatura es una técnica de uso frecuente para
alterar los ritmos reproductivos y lograr desoves exitosos en calidad y cantidad. Sin
embargo, para cada especie hay que desarrollar una serie de ajustes o calibraciones
metodológicas que están en función de las estrategias reproductivas de la especie en
cuestión. Los beneficios de la manipulación de dichos parámetros se han visto
reflejados principalmente en la obtención de puestas en el intervalo de tiempo
programado fuera de la temporada natural de desove.
En la trucha arcoíris se han utilizado diferentes condiciones de fotoperiodo y
temperatura para producir desoves fuera de temporada, tanto para adelantarlos como
para retrasarlos (Scott et al. 1984; Elliot et al. 1984; Bon et al., 1997; Ingle-De La Mora
et al., 2005; Bonnet et al., 2007; Klempau, 2008; Wilkinson et al., 2010; Aguilar-Juárez,
2010). En este trabajo, la trucha de SPM fue inducida a la maduración y a la liberación
de gametos efectivamente mediante la manipulación del fotoperiodo y la temperatura.
El sistema de fotoperiodo y la temperatura recrearon las condiciones ambientales más
importantes para que las truchas continuaran con el ciclo reproductivo natural.
La trucha de SPM desova anualmente entre enero y marzo, con una mayor intensidad
en febrero (Ruiz-Campos, 1993, 1994). Bajo las condiciones de fotoperiodo y
temperatura recreadas en el SRA, las truchas maduras fueron desovadas mediante la
aplicación de presión abdominal a finales de enero, ya que en esas fechas varios
organismos empezaron a expulsar óvulos en los tanques de cultivo. Todas las truchas
maduras fueron desovadas el mismo día sin necesidad de inducción hormonal.
Bromage y Cumaranatunga (1988), mencionan que en los salmónidos, a pesar de que
algunas hembras maduran y ovulan en cautiverio, no son capaces de desovar en forma
espontánea, por lo que se requiere de la inducción hormonal para que desoven. Es
importante mencionar que los parámetros ambientales como la temperatura y el
fotoperiodo, coordinan los procesos fisiológicos reproductivos de los peces, esto se
hace gracias a las interacciones del sistema cerebro-hipófisis-gónada. Existe otro
método actualmente utilizado en la maduración sexual y desove de salmónidos, que es
la inducción hormonal, la cual se basa en la administración de hormonas naturales o
65
sintéticas como la GnRHa, y que se aplica poco antes de la maduración final de los
peces para conseguir los desoves (Zohar y Mylonas, 2001).
Los desoves de la trucha de SPM ya se habían logrado anteriormente, inyectando
gonadotropina coriónica humana a ejemplares adultos grávidos capturados en el Arroyo
San Rafael (Ruiz-Campos 1994), o bien manipulando el fotoperiodo y la temperatura
(Aguilar-Juárez 2010); sin embargo, Aguilar-Juárez (2010) tuvo problemas para
madurar a las truchas el primer año debido a que no estaba administrando el alimento
adecuado para que los organismos maduraran. En el presente trabajo se tuvo el
cuidado de mantener condiciones óptimas todos los parámetros de cultivo, y de ese
modo coadyuvar al proceso de maduración y desove exitoso en el primer año. En virtud
de lo anterior, es posible llevar a cabo el acondicionamiento, el mantenimiento, la
inducción a la maduración y el desove de esta trucha nativa en un SRA, a través del
control del fotoperiodo y la temperatura.
De acuerdo con las medidas de los huevos de la trucha de SPM registrados por Aguilar-
Juárez (2010) y los registrados en este trabajo, el diámetro promedio es de 4 mm,
mayor que el observado en condiciones silvestres de 3.14 mm (Ruiz-Campos, 1993).
En cuanto al volumen de esperma producido, se pudo observar que se incrementó con
respecto al tiempo de acondicionamiento de los machos en los tanques, ya que estos
tenían un mayor tamaño y mejor condición nutricional.
En este trabajo se reportó una fecundidad absoluta promedio de 162 huevos y la
fecundidad relativa fue de 2.1 huevos/g, mientras que Ruiz-Campos (1993), reportó una
fecundidad absoluta promedio mayor, siendo de 192 huevos.
Después de haber obtenido el primer desove al recrear las condiciones de fotoperiodo y
temperatura naturales para esta subespecie, se decidió acortar el ciclo reproductivo,
con la finalidad de adelantar el evento reproductivo y tener dos desoves al año, lo cual
puede ser una técnica útil para el desarrollo de la acuicultura de esta trucha nativa,
porque así se pueden producir alevines en cualquier época del año y sin depender de la
captura de organismos del medio silvestre.
La fecundidad obtenida de las truchas cuando se les acortó el ciclo reproductivo fue
superior a la obtenida durante el ciclo reproductivo natural. Esta fecundidad fue de 2.82
66
huevos/g de peso corporal y 21.3 huevos/cm LT, siendo superior al valor obtenido con
el ciclo reproductivo natural, de 15.3 huevos/cm (Ruiz-Campos, 1993). La fecundidad
absoluta obtenida con el ciclo reproductivo acortado, fue mayor a la obtenida con el
ciclo reproductivo natural, con un promedio de 454 huevos y en total se obtuvieron más
de 7,000 huevos provenientes de 15 hembras. El aumento en la producción de huevos
pudo deberse al mayor tamaño de las truchas al momento del segundo desove, debido
a que la fecundidad absoluta aumenta en relación directa con el tamaño del pez (Ruiz-
Campos, 1993). En los machos, la cantidad de esperma en este estudio aumentó de
0.45 mL con el ciclo reproductivo natural a 1.5 mL con el ciclo reproductivo acortado,
seguramente debido al mayor tamaño de los organismos. Aproximadamente unos 15
días antes de realizar el desove, el agua de los estanques se tornó turbia debido a que
algunos machos expulsaron esperma indicando que estaban totalmente maduros;
desafortunadamente la ausencia de hembras totalmente maduras impidió realizar una
fertilización.
Los huevos obtenidos del desove con el ciclo reproductivo acortado tuvieron un
diámetro menor (3.8 ± 0.2 mm) con respecto a los huevos obtenidos con el ciclo
reproductivo natural (4 mm). Existen diversos factores que pueden influir en el tamaño y
la calidad de los huevos, como la edad y talla de los reproductores, las condiciones de
cautiverio y la calidad y cantidad del alimento. No obstante, el acortamiento del ciclo
reproductivo no está exento de efectos negativos sobre la calidad y tamaño de los
huevos (Bromage, 1996).
Es de suma importancia conocer el momento en que las truchas están listas para
desovar, debido a que solo se cuenta con algunos días (no más de siete
preferentemente) después de la ovulación para realizar la fertilización. En experimentos
previos realizados en el CICESE, las truchas de SPM no desovaron naturalmente,
debido a que el poro genital no se dilató lo suficiente obstruyéndolo y murieron debido a
que no pueden reabsorber los huevos (Carmen Paniagua, comunicación personal).
En general, las truchas presentan un dimorfismo sexual más acentuado durante el
periodo reproductivo. Las hembras maduras se caracterizan por tener el vientre
abultado y la papila urogenital dilatada, pero se debe tener cuidado para no confundir el
vientre abultado con un estómago lleno de alimento. Aunque la técnica de observación
67
de las características externas es en general adecuada y ofrece un indicio de cuales
reproductores están aptos para ser inducidos al desove, si no se cuenta con personal
especializado se pueden cometer errores. Una forma recomendada para determinar la
maduración en hembras es la canulación mediante la biopsia ovárica. El diámetro de
los huevos y la posición de su núcleo indican si están listas para ser desovadas. La
canulación lleva a cabo introduciendo una sonda plástica (que puede estar conectada a
una jeringa), por el poro genital, a través del conducto ovárico, hasta el ovario, para
succionar una muestra de tejido que contiene los ovocitos. Este método, aunque
efectivo puede ser traumático para las hembras. En los machos se utiliza comúnmente
la presión abdominal para verificar su madurez; sin embargo, si los organismos no
están maduros, esta presión puede ocasionar daños a las gónadas. En otras especies
es imposible utilizar esta técnica, debido a la conformación de las gónadas, lo que
dificulta la evaluación de la madurez.
Estandarización y validación del ultrasonido
La trucha arcoíris presenta rasgos físicos que ayudan a diferenciar el sexo; sin
embargo, debido al tamaño pequeño que alcanzan naturalmente las truchas de SPM,
se dificulta mucho diferenciarlo. El ultrasonido es una herramienta que puede ayudar a
identificar el sexo y el estado de madurez sexual. Un aspecto importante del uso del
ultrasonido en el manejo de especies en peligro de extinción o especies protegidas, es
que el diagnóstico de la madurez sexual no requiere el sacrificio de los peces (Moghim,
et al., 2002); sin embargo, para que el ultrasonido sea eficiente para este diagnóstico,
es necesario estandarizar y validar su uso. Existen varios métodos para la validación
del método, los cuales presentan ventajas y desventajas. Entre los métodos se
encuentran la verificación de los índices gonadosomáticos, la medición de esteroides
sexuales, el uso de cortes histológicos, la canulación y biopsias entre otras técnicas ya
estandarizadas (Tabla I). En este trabajo se utilizó la disección e inspección de las
gónadas como un método de estandarización de los parámetros del ultrasonido para la
identificación de organismos maduros. Es importante definir los criterios a evaluar con el
ultrasonido y describir sus características para unificar criterios y que de esta forma los
estudios puedan ser duplicados (Novelo y Tiersch, 2012). Para esto, se modificaron los
parámetros del ultrasonido (mega Hertz, zoom, contraste, brillo, modo, etc.), de tal
68
forma que se lograron mejorar las imágenes en la computadora del ultrasonido y se
grabaron para tomar todas las imágenes de las gónadas y testículos con los mismos
parámetros. Una vez estandarizada la técnica de ultrasonido, fue sencillo diferenciar
con alta precisión el sexo de las truchas en proceso de maduración sexual, así como
también diferenciar entre truchas maduras o recién desovadas.
En cuanto a la validación de la técnica del ultrasonido, se realizó mediante la medición
de la concentración de vitelogenina y testosterona para corroborar los cambios en el
desarrollo de la gónada y testículos visualizados mediante el ultrasonido.
En el primer muestreo realizado a las hembras (marzo) se encontró una concentración
de VTG menor a 25 mg/mL debido a que estas se encontraban aun inmaduras. Esto
mismo se pudo observar en las imágenes del ultrasonido ya que no fue posible
encontrar las gónadas. El valor más alto que se logró medir fue tres meses antes del
desove (julio) con un valor de 106 mg/L indicando que la trucha continuaba madurando
y próxima a desovar. A partir de este momento fue posible la visualización y medición
de los ovocitos mediante el ultrasonido. El último día de muestreo en septiembre
(séptimo mes), la concentración de VTG fue demasiado alta para ser detectada en la
curva de calibración preparada para su cuantificación (más de 200 mg/L), por lo que no
se logró medir esta hormona a pesar de haber trabajado con las diluciones
recomendadas para trucha arcoíris con el ciclo reproductivo acortado. No obstante, en
este momento fue cuando la visualización de las gónadas se tornó más sencilla ya que
éstas se encontraban bien desarrolladas con la evidencia de la presencia de los
ovocitos (óvulos) maduros (tamaño de 3.8 mm).
Las concentraciones de vitelogenina en plasma más altas se reportan justo cuando las
truchas van a desovar. La literatura indica que para trucha arcoíris con ciclo
reproductivo acortado a 9 y 6 meses las concentraciones de testosterona que se
alcanzan van de 83 a 116 mg/L respectivamente (Bon et al., 1997). Por ello, la curva de
calibración de la prueba de ELISA se manejó en el intervalo de 25 a 200 mg/L. Cabe
señalar que los valores de vitelogenina fueron mayores en esta subespecie. Esto puede
ser debido a que el tamaño de los huevos de la trucha de SPM es menor que aquellos
de la trucha arcoíris actualmente cultivada, estando más concentrada la cantidad de
VTG en el huevo. Sin embargo, las condiciones de fotoperiodo y temperatura fueron
69
determinantes en la maduración sexual de las hembras, corroborado con las altas
concentraciones de VTG, la presencia ovocitos maduros y los desoves realizados.
Tabla 7. Comparación de métodos comúnmente utilizados en la evaluación del estado de madurez sexual comparados con el ultrasonido.
Método de evaluación
Mortalidad de los
ejemplares
Tiempo de evaluación
Ventajas Desventajas Costo $ US
Histología Siempre 8 a 10 días
varias muestras
Diagnóstico preciso
Requiere envío de muestras al
laboratorio, requiere matar
ejemplares valiosos, invasivo
10 o +por muestra
Índice gonadosomático
Siempre 5 minutos
por ejemplar
Preciso, se realiza en
campo
Requiere matar ejemplares
valiosos -
Kits ELISA No
requerida 1 a 2 días
96 muestras
Sólo se requiere una muestra de
sangre
Muchos factores afectan el
análisis, invasivo, corto tiempo de caducidad, se
requiere equipo
1000 a 3000 por 96 a 480 muestras
Ultrasonido No
requerida
30 segundos
por ejemplar
Portátil, 90% preciso, no invasivo
Se requiere personal
capacitado
2000 a 10000
muestras indefinidas
En el caso de los machos, desde el primer muestreo se distinguieron los testículos,
aunque fue difícil ubicarlos debido a su tamaño. La concentración de testosterona
medida en ese momento quedó por debajo de la curva de calibración. Conforme el ciclo
reproductivo fue avanzando, los testículos se observaron con más facilidad con el
ultrasonido, ya que presentaron un mayor tamaño. El aumento en la concentración de
testosterona fue evidencia del incremento en el grado de madurez sexual. Al sexto mes
del ciclo reproductivo acortado, la concentración de testosterona llegó a su pico,
indicando así que los machos ya se encontraban sexualmente maduros, lo que se
observó en el tamaño y claridad de los testículos con respecto a las imágenes
anteriores.
70
Los resultados de concentración de testosterona en el plasma de la trucha de SPM son
similares a las concentraciones de testosterona de la trucha arcoíris, en el orden de 2.5-
11.6 ng/mL a 25.4-78.7 ng/mL, siendo superior cuando alcanzan la madurez sexual al
momento de espermiación y desove (Holloway et al., 1999; Evans et al., 2004). Esto
corrobora que las condiciones de fotoperiodo y temperatura funcionaron en la
maduración sexual de los machos.
Es importante mencionar que la utilización del ultrasonido para el diagnóstico del estado
de madurez sexual se complicó con los machos, debido a que la densidad del tejido no
permitió una diferencia progresiva en el color de la imagen. En este sentido, Newman
(2008) mencionó que en contraste con las hembras, la identificación de testículos de
bacalaos macho es más problemático, principalmente debido al relativo pequeño
tamaño de los testículos y a la similitud ecogénica del tejido testicular y las vísceras que
los rodea. En el caso de la trucha se SPM en una etapa avanzada de maduración
gonádica, los testículos se observaron menos obscuros y con una apariencia estriada.
El uso del ultrasonido para la determinación del sexo y del estado de madurez en las
hembras resultó ser un método de fácil aplicación, rápido y no invasivo. La clasificación
del grado de madurez sexual fue directa en los adultos. Los ovarios se observan como
dos masas de apariencia granular, de color gris claro, mientras que los testículos son
más pequeños y oscuros, ambos fácilmente diferenciables cuando se encuentran en
proceso de maduración. Resultados similares fueron reportados cuando se implementó
la evaluación de madurez sexual con ultrasonido en machos de esturión por Moghim et
al. (2002).
Conforme las truchas de SPM fueron creciendo, la calidad de las imágenes tomadas
con el ultrasonido mejoró y al mismo tiempo aumentó la precisión en la identificación del
sexo y en la evaluación del estado de madurez sexual. El uso de imágenes del
ultrasonido es una herramienta útil para determinar el sexo en los paiches amazónicos
(Arapaima gigas) (Porto-Carreiro, 2012). Además, se ha demostrado que la eficacia del
ultrasonido para la determinación del estado de madurez sexual es del 90% (McAuley
et al., 2010). Además, este análisis puede reducir el número de muestreos requeridos
para conocer el estado de desarrollo de la gónada (Newman, 2008).
71
La inversión económica para la adquisición de un ultrasonido puede ser considerable,
pero se vuelve redituable en el corto plazo, sobre todo cuando se compara con otros
métodos de diagnóstico, como la cuantificación de niveles de hormonas y la histología
convencional. Por ejemplo, un paquete de diagnóstico hormonal para 96 a 480 pruebas,
cuesta entre 1,000 y 3,000 dólares, mientras que el equipo de ultrasonido portátil cuesta
alrededor de tres mil dólares, dependiendo de la marca y modelo. Por otra parte, la
histología es una técnica de diagnóstico costosa y no se pueden obtener resultados al
instante ya que es necesario mandar las muestras a un laboratorio especializado para
obtener el diagnóstico. En términos prácticos, el uso de un método diagnóstico sencillo,
rápido y que no implique el sacrificio de los reproductores, se puede lograr con el
ultrasonido. Otras ventajas del ultrasonido es que con un equipo portátil los
diagnósticos se pueden hacer directamente en el sitio en donde se encuentran los
peces y no es un proceso invasivo. Además este método se puede complementar con
otros métodos para hacer más precisa la de terminación del estado de madures sexual
en esta subespecie (e.g. biopsia ovárica y presión abdominal).
Las concentraciones de vitelogenina y testosterona medidas en el plasma de las
truchas indicaron que las truchas silvestres de la Sierra de San Pedro Mártir mantenidas
en cautiverio se acondicionaron al SRA en un ciclo reproductivo acortado mediante el
control del fotoperiodo y la temperatura. Así mismo, las mediciones de VTG y
testosterona ayudaron a la validación de la técnica del ultrasonido en esta especie.
72
Conclusiones
1. El sistema de recirculación acuícola resultó ser efectivo para el
acondicionamiento y mantenimiento en cautiverio de la trucha de SPM y permitió
buenas condiciones sanitarias para los peces.
2. El control y el monitoreo de la calidad del agua fueron factores importantes para
el mantenimiento de la buena salud de estos peces.
3. Las condiciones del SRA y del sistema de iluminación y temperatura fueron
adecuadas para la inducción a la maduración sexual y desoves de la trucha de
SPM.
4. Se demostró que el potencial reproductivo de la trucha de SPM en condiciones
de cautiverio es mayor en comparación con ejemplares silvestres.
5. El método de ultrasonido resultó ser un buen método no invasivo para la
determinación de estado de madurez sexual de la trucha de SPM.
6. El uso de ecografías permitió diferenciar el sexo de la trucha de SPM durante su
época reproductiva.
7. Las pruebas de vitelogenina y testosterona demostraron la madurez sexual de la
trucha de SPM observada con el ultrasonido.
73
Recomendaciones
- Realizar un estudio comparativo del análisis de concentración de vitelogenina y
testosterona en plasma sanguíneo en truchas de SPM mantenidas en un ciclo
reproductivo natural y mantenidas en un ciclo reproductivo acortado mediante el
control del fotoperiodo y la temperatura.
- Realizar un estudio con desoves para reportar datos de fertilidad en condiciones de
cautiverio de la trucha de SPM.
- Realizar estudios de sobrevivencia y tasa de crecimiento de juveniles de trucha de
SPM obtenidos de desoves en cautiverio.
- Se recomienda realizar una dilución más alta a las muestras de plasma sanguíneo
en hembras cuando se trabaja con organismos con ciclo reproductivo acortado
debido a que la concentración esperada supera los 120 mg/mL que maneja la curva
de calibración del ELISA durante los meses más próximos al desove.
- Se recomienda utilizar aceite de clavo como anestésico (ver Anexo 4) ya que para
este trabajo fue eficaz y no provocó daños aparentes en los ejemplares de trucha
de SPM.
- Se recomienda el uso de solución salina y oxitetraciclina para la prevención de
enfermedades (infecciones por bacterianas y hongos) en la trucha de SPM.
74
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80
ANEXOS
81
Anexo 1
Procedimiento operacional para el mantenimiento de reproductores
1. Revisión del sistema de recirculación acuícola antes de realizar el mantenimiento
diario:
La válvula de presión del biofiltro no debe de exceder los 9 psi.
El tanque de compensación debe tener buen nivel de agua.
La bomba de agua en funcionamiento apropiado.
La temperatura en bomba de calor programada.
Piedras difusoras con aireación.
Revisión de la salud de los organismos (presencia de lesiones,
comportamiento anormal etc.).
Retiro de organismos muertos de los estanques y envío de los mismos a
revisión patológica.
2. Proporcionar la primera ración de alimento a saciedad y 4 horas después la
segunda ración. Después de cada alimentación, esperar 15 min y retirar el
alimento no consumido con una red.
3. Medir y registrar los parámetros de calidad del agua:
Diariamente:
Concentración de oxígeno
Temperatura
pH
Semanalmente
Concentración de nitrógeno amoniacal total
Concentración de nitritos
Alcalinidad
4. Cada tercer día realizar retrolavado del biofiltro de la siguiente forma:
a) Apagar la bomba.
b) Cambiar la llave del biofiltro para su vaciado hacia el drenaje.
c) Abrir la llave del tanque de compensación para su vaciado.
82
d) Esperar a que se vacíe toda la materia orgánica del biofiltro y el agua del
tanque de compensación.
e) Devolver la llave del biofiltro y del tanque de compensación a su posición
normal.
f) Llenar a la mitad el tanque de compensación y encender la bomba de
agua.
g) Purgar manualmente el biofiltro para eliminar la primera parte del agua
cargada de materia orgánica faltante (aproximadamente 10 litros).
h) Abrir inmediatamente la llave del tanque reservorio y colectarla con un
recipiente de 20 litros para eliminar la mayor parte del agua sucia restante
que sale del biofiltro después de hacer el retrolavado.
i) Cerrar la llave del tanque reservorio para permitir que el agua comience a
circular en los tanques de cultivo.
j) Rellenar el tanque de compensación con agua dulce y mantenerla con
aireación constante durante 24 horas para eliminar el cloro del agua.
5. Revisar nuevamente que todo el sistema de recirculación acuícola funcione
correctamente antes de dejar el laboratorio.
83
Anexo 2
Procedimiento operación estándar para el acondicionamiento de los organismos
a una dieta con alimento comercial
1. Alimentar a saciedad a los organismos con una dieta compuesta de mísidos y
larvas de mosquito por 2 semanas.
2. A la tercera semana alimentar con una mezcla de mísidos descongelados y un
poco de alimento extruido a saciedad aparente cortado al tamaño de la boca de
los peces.
3. A la cuarta semana proporcionar alimento a una tasa de alimentación del 2% de
su peso húmedo, con una proporción 1:1 (mísidos:extruído).
4. A la quinta semana preparar pequeñas croquetas con una mezcla de ambos
alimentos. Para esto, se remoja el alimento extruido con el líquido presente en el
empaque de mísidos y larvas de mosquito. Una vez adquirida una consistencia
masuda, se procede a mezclar el alimento y fabricar pequeñas croquetas para
ser utilizado ese mismo día.
5. El alimento debe ser suministrado a las truchas tres veces al día, y esperar
media hora después de cada alimentación para retirar el alimento no consumido.
6. La proporción de alimento extruido se debe modificar gradualmente hasta que
las truchas acepten el alimento balanceado (aproximadamente 2 meses).
84
Anexo 3
Especificaciones del equipo de ultrasonido utilizado
Equipo de ultrasonido de uso veterinario (Digital Palmtop Veterinary Ultrasound
Scanner, modelo: BW520 V) marca BONDWAY, seguridad: Clase II Tipo B, voltaje: AC
220/50HZ AC 110/60HZ, SHENEZHEn BONDWAY ELECTRONICS CO., TTD (Figura
12). Las especificaciones del ultrasonido se muestran en el Anexo 3:
- Tecnología de imagen completamente digital, con alta resolución y alta
penetración.
- Imágenes dinámicas en tiempo real, con teclado ergonómico.
- Sonda: multifrecuencia de 6.5, 7.5 y 9 megahertz.
- Monitor: 6,4'' pantalla SVGA no entrelazado de alta resolución.
- Escala de grises: 256 niveles.
- Modos de visualización: B (bidimensional), B/B, B/M, M (movimiento) o 4B.
- Velocidad en el modo M: 1s, 2s, 3s, 4s, 5s, 6s, 7s y 8s.
- Ampliación: * 0,8 * 1,0 * 1,2 * 1,5 * 1,6 * 2,0 * 2,4 * 3,0.
- Métodos de centrado: un solo punto, transmisión de múltiples etapas, enfoque
dinámico.
- Película continua: 256-frame (sucesión de imágenes).
- Zoom: zoom local inteligente en tiempo real y en modo congelado.
- Almacenamiento y transferencia de imágenes: almacenamiento de 100
imágenes, en estación de trabajo y transferencia de imágenes a USB.
- Procesamiento de imágenes: función pan (mejoramiento de profundidad), girar
izquierda/derecha, positivo/negativo y vertical/horizontal, conversión B/W, cambio
de ángulo, congelación y descongelación de imagen, corrección Gamma
(codifica y decodifica luminancia), realce de bordes para una imagen post-
procesamiento, transformación de color gris.
85
- Función de correlación del marco, ajuste y visualización de campo cercano y
lejano, ganancia total y rango dinámico (margen entre nivel de referencia y nivel
de ruido).
- Pre-procesamiento: selección de IP, rango dinámico, realce y suavizado de
bordes, un promedio de marco, selección de ángulo de exploración y selección
de densidad de línea.
- Medidas: Modo B: distancia, circunferencia, área, volumen, proporción, ángulo,
% de estenosis, histograma, perfil, etc.,
- Modo M: distancia, tiempo, velocidad y frecuencia cardiaca.
- Paquetes de software generales: para Abdomen, OB / GYN, piezas pequeñas,
urología, cardiología, paquete obstétrico.
- Documentación: documentación en pantalla completa, nombre del evento,
nombre del paciente, fecha / hora.
86
Anexo 4
Procedimiento operacional estándar para la extracción y purificación de
vitelogenina en plasma
El plasma se extrae de la vena caudal con una jeringa para insulina de 1mL impregnada
de heparina. Se colecta aproximadamente 0.5 mL de sangre de cada trucha y se coloca
en tubos cónicos de 1.5 mL con aprotinina (4 UI de aprotinina por cada mililitro de
sangre).
Los tubos se agitan y centrifugan para separar el plasma de la sangre. El sobrenadante
(plasma) se transfiere a un tubo cónico de 1.5 mL y se almacena en nitrógeno líquido
hasta ser utilizado para su análisis de concentración de vitelogenina mediante ELISA.
Procedimiento
1. Preparar tubos de 1.5 mL con 40 µL de aprotinina concentrada (5UI/1000ul) para
obtener 2UI en 0.5 mL de sangre y colocarlos en la hielera.
2. Impregnar las jeringas con heparina [5000UI/ mL] mediante la succión y
devolución en la ampolleta de heparina.
3. Seleccionar una trucha marcada como hembra del tanque de reproductores. De
ser posible corroborar el sexo mediante la obtención de huevos por el método de
presión abdominal.
4. Colocar la trucha en una cubeta 5 litros de agua y 0.1 mL de aceite de clavo
(grado reactivo) para anestesiarla.
5. Introducir la jeringa por detrás de la aleta anal en dirección a la columna hasta
alcanzar la vena caudal y extraer 0.5 mL de sangre.
6. Colocar la muestra de sangre en un tubo de 1.5 mL con la aprotinina a 4°C.
7. Centrifugar la muestra de sangre a 3000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
8. Transferir sobrenadante a otro tubo 1.5 mL limpio y colocarlo en una hielera con
nitrógeno líquido para su congelado.
9. Almacenar en nitrógeno líquido hasta ser utilizado.
87
Anexo 5
Procedimiento operacional estándar para la extracción y purificación de
testosterona en plasma
El plasma se extrae de la vena caudal con una jeringa para insulina de 1 mL
impregnada de heparina. Se colecta aproximadamente 0.5 mL de sangre de cada
trucha y se centrifuga en un tubos cónicos de 1.5 mL para separar el plasma de la
sangre. El sobrenadante (plasma) se transfiere a otro tubo y se almacena en nitrógeno
líquido hasta ser utilizado.
Procedimiento
1. Impregnar las jeringas con heparina [5000UI/mL] mediante la succión y
devolución a la ampolleta de heparina.
2. Seleccionar una trucha marcada como macho del tanque de reproductores. De
ser posible corroborar el sexo mediante la obtención de esperma por el método
de presión abdominal.
3. Colocar la trucha en una cubeta con 5 litros de agua y 0.1 mL de aceite de clavo
(grado reactivo) para anestesiarla.
4. Introducir la jeringa por detrás de la aleta anal en dirección a la columna hasta
alcanzar la vena caudal y extraer 0.5 mL de sangre.
5. Colocar la muestra de sangre en un tubo de 1.5 mL con la aprotinina a 4°C.
6. Centrifugar la muestra de sangre a 1500 rpm durante 5 minutos a 5°C.
7. Transferir sobrenadante a otro tubo limpio y colocarlo en una hielera con
nitrógeno líquido para su congelado.
8. Almacenar en nitrógeno líquido hasta ser utilizado.
88
Anexo 6
Medidas preventivas para evitar enfermedades
1. Monitorear diariamente las truchas de cada tanque de cultivo sin estresarlas para
localizar truchas con lesiones en las aletas.
2. Dar un baño salino utilizando sal de grano. Este debe darse en el mismo sistema
de recirculación acuícola.
3. Calcular la cantidad de sal requerida para alcanzar una concentración de 5
gramos de sal por cada litro de agua en el sistema.
4. Agregar la sal diluida en agua poco a poco en el tanque de compensación para
que la bomba de agua reparta el agua en todos los tanques.
5. Repetir este proceso cada 72 horas tres veces.
En caso de necesitar un tratamiento con antibiótico realizar el siguiente
procedimiento:
a) Preparar un contenedor con agua del mismo sistema (puede ser una hielera
grande) y aireación constante.
b) Calcular la cantidad de antibiótico, en este caso oxitetraciclina (marca Pfizer)
para el volumen de agua en el contenedor y se diluye la oxitetraciclina en
polvo a una concentración de 40 mg/L (agente activo).
c) Preparar un contenedor con agua del mismo sistema y diluir la oxitetraciclina
en polvo para dar baños por inmersión de una por 10 días.
89
Anexo 7
Registro de los parámetro de la calidad de agua monitoreados durante 13 meses.
Figura 1. Temperatura promedio registrada durante el tiempo en mese de mantenimiento
de la trucha de SPM.
Figura 2. Concentración promedio de oxígeno (en miligramos por litro) registrada durante
el tiempo en meses de mantenimiento de la trucha de SPM.
90
Figura 3. pH promedio registrado durante el tiempo de mantenimiento de la trucha de
SPM.
Figura 4. Concentración promedio de nitrógeno amoniacal total (en miligramos por litro)
registrado durante el tiempo de mantenimiento de la trucha de SPM.
91
Figura 5. Concentración promedio de nitritos (en miligramos por litro) registrado durante
el tiempo en meses de mantenimiento de la trucha de SPM.
Figura 6. Concentración promedio de nitratos (en miligramos de carbonato de calcio por
litro) registrado durante el tiempo en meses de mantenimiento de la trucha de SPM.
92
Figura 7. Alcalinidad promedio (en miligramos de carbonato de calcio por litro) registrado
durante el tiempo en meses de mantenimiento de la trucha de SPM.
93
Anexo 8
Imágenes de ultrasonido obtenidas de los organismos examinados durante el
experimento
Hembras:
Ecografía 1. Imagen de una trucha hembra inmadura al inicio del ciclo reproductivo
acortado. Imagen capturada transversalmente en posición ventral de la trucha durante el
mes de marzo. En la parte inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la
ecografía.
94
Ecografía 2. Imagen de la gónada de una trucha hembra inmadura durante el segundo
mes del ciclo reproductivo acortado. Apenas se observa uno de los ovarios. Imagen
capturada transversalemete y en posición ventral de la trucha durante el mes de abril. En
la parte inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
95
Ecografía 3. Imagen de la gónada de una trucha hembra al tercer mes del ciclo
reproductivo acortado. Imagen capturada transversalmente y en posición ventral de la
trucha durante el mes de mayo. En la parte inferior izquierda se indican las estructuras
visibles en la ecografía.
96
Ecografía 4. Imagen de la gónada de una trucha hembra al cuarto mes del ciclo
reproductivo acortado. Se observa el estómago y los ovarios. Imagen capturada
transversalemete y en posición ventral de la trucha durante el mes de junio. En la parte
inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
97
Ecografía 5. Imagen de la gónada de una trucha hembra al cuarto mes del ciclo
reproductivo acortado. Se observan perfectamente los ovarios. Imagen capturada
transversalemete y en posición ventral de la trucha durante el mes de julio. En la parte
inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
98
Ecografía 6. Imagen de la gónada de una trucha hembra al quinto mes del ciclo
reproductivo acortado. Se observan los dos ovarios. Imagen capturada transversalemete
y en posición ventral de la trucha tomada durante el mes de agosto. En la parte inferior
izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
99
Ecografía 7. Imagen de la gónada de una trucha hembra al séptimo mes del ciclo
reproductivo acortado. Los ovocitos miden entre 3.3 y 3.5 mm de diámetro. Imagen
capturada transversalemete y en posición ventral de la trucha tomada durante el mes de
septiembre. En la parte inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la
ecografía.
100
Ecografía 8. Imagen de la gónada de una trucha hembra antes de ser desovada, ovocito
mide 3.7 mm. Imagen capturada longitudinalmente y en posición ventral lateral de la
trucha tomada durante el mes de octubre. En la parte inferior izquierda se indican las
estructuras visibles en la ecografía.
101
Ecografía 9. Visualizacion de gónada de trucha hembra recien desovada. Se observa un
ovocito remanente. Imagen capturada transversalemete de la seccion posterior y en
posición ventral de la trucha tomada durante el mes de septiembre.
102
Machos:
Ecografía 10. Imagen de los testículos inmaduros de una trucha macho al primer mes del
ciclo reproductivo acortado. Imagen capturada transversalemete y en posición ventral de
la trucha tomada durante el mes de marzo. En la parte inferior izquierda se indican las
estructuras visibles en la ecografía.
103
Ecografía 11. Imagen de los testículos inmaduros de un macho al segundo mes del ciclo
reproductivo acortado. Imagen capturada transversalemete y en posición ventral de la
trucha tomada durante el mes de abril. En la parte inferior izquierda se indican las
estructuras visibles en la ecografía.
104
Ecografía 12. Imagen de los testículos inmaduros de un macho al tercer mes del ciclo
reproductivo acortado. Imagen capturada transversalemete y en posición ventral de la
trucha tomada durante el mes de mayo. En la parte inferior izquierda se indican las
estructuras visibles en la ecografía.
105
Ecografía 13. Imagen de los testículos de un macho con presencia de líquido seminal al
cuarto mes del ciclo reproductivo acortado. Imagen capturada transversalemete y en
posición ventral de la trucha tomada durante el mes de junio. En la parte inferior
izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
106
Ecografía 14. Imagen de los testículos de trucha macho con presencia de líquido seminal
al quinto mes del ciclo reproductivo acortado. Imagen capturada transversalemete y en
posición ventral de la trucha tomada durante el mes de julio. En la parte inferior izquierda
se indican las estructuras visibles en la ecografía.
107
Ecografía 15. Imagen de los testículos de un macho maduro al sexto mes del ciclo
reproductivo acortado. Los testículos se observan menos obscuras y algo estriados. El
testículo izquierdo mide 6.6 mm de ancho y 7 mm de alto. Imagen capturada
transversalemete y en posición ventral de la trucha tomada durante el mes de agosto. En
la parte inferior izquierda se indican las estructuras visibles en la ecografía.
108
Ecografía 16. Testículos de una trucha macho maduro con presencia de líquido seminal
al séptimo mes del ciclo reproductivo acortado. Los testículo se observan mas blancos
en la imagen y con apariencia estriada. El testículo derecho mide 12.9 mm de ancho y 6.4
mm de alto. Imagen capturada transversalemete y en posición ventral de la trucha
tomada durante el mes de septiembre. En la parte inferior izquierda se indican las
estructuras visibles en la ecografía.
