CCY Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

IDENTIFICACIÓN DE LOS miARNs PRESENTES EN

EL DESARROLLO DE LA EMBRIOGÉNESIS

SOMÁTICA DE Coffea canephora.

Tesis que presenta

SARA HERNÁNDEZ CASTELLANO

En opción al título de

MAESTRO EN CIENCIAS

(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México

.2014

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENT{FICA DE YUCA TAN, A. C.

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CICY RECONOCIMIENTO

POSGRAOOE

CIIE:NCIAS BIOLÓGICAS

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado IDENTIFICACIÓN

DE LOS miARNs PRESENTES EN EL DESARROLLO DE LA EMBRIOGÉNESIS

SOMÁTICA DE Coffea canephora, fue realizado en los laboratorios de la Unidad de

Biotecnología y La Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del Centro de

Investigación Científica de Yucatán , A.C., bajo la dirección de la Dra. Clelia De la Peña

Seaman, dentro de la opción de Biotecnología de plantas, perteneciente al Programa de

Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.

Dr. Felipe Augusto Vázquez Flota

Director de Docencia

Mérida, Yucatán, México, Junio 2014.

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los

servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos

de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece

patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le

pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en

el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o

desarrollos tecnológicos, en lo especial , estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por

la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo

expuesto en la presente Declaración.

QFB. Sara Hernández Castellano

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar especialmente mi agradecimiento a Dios, a mi familia, amigos y amigas que me han apoyado en las buenas y en las malas, así como a todas las personas que prestaron su colaboración y tiempo durante el desarrollo de este trabajo de investigación.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por la beca otorgada No. 334675 para la realización de mis estudios de maestría, y el financiamiento otorgado a través del proyecto de ciencia básica CONACYT-CB2012-178149.

Al Centro de investigación Científica de Yucatán por las instalaciones prestadas, en especial a la unidad de Biotecnología y la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas por haber proporcionado los equipos y espacios para la realización de este trabajo.

A mi asesora de tesis la Dra. Clelia De la Peña Seaman, por haberme dado la oportunidad de desarrollar este trabajo, su dirección, sus consejos, el tiempo y el apoyo durante la realización de esta tesis.

Al comité tutora! integrado por el Dr. Stefan De Folter, Dr. Enrique Castaño De la Serna y la Dra. Clelia De la Peña Seaman, por sus consejos, observaciones y dirección durante los dos años de trabajo experimental y los cuatro exámenes tutorales.

Al comité evaluador y revisor de tesis integrado por el Dr. Víctor M. Loyola Vargas, El Dr. Stefan De Folter, Dr. Enrique Castaño De la Serna, la Dra. Virginia A. Herrera Valencia y la Dra. Clelia De la Peña Seaman, por sus valiosas observaciones real izadas durante la redacción del documento.

Al Dr. Víctor M. Loyola Vargas por el lugar de trabajo en su laboratorio y el apoyo otorgado para el establecimiento y el mantenimiento del cultivo in vitro de Coffea canephora.

A la Dra. Flor de Fátima Rosas Cárdenas y la M.C. Naivy Gamboa, por el tiempo y las asesorías realizadas en las técnicas de hibridación y marcaje radiactivo .

Al Laboratorio de Epigenética y cromatina de plantas, integrado por el técnico Eduardo Castillo Castro, la M.C. Rosa Y. Us Camas, el I.B.T. Víctor J. Cancino Gárcia, la M.C. Fátima P. Duarte Ake, el Dr. Geovany l. Nic Can y el M.C. Juan Juarez, por su apoyo y comentarios realizados en los seminarios, pero sobre todo, por la amistad que me han brindado durante en estos años.

Al Dr. Geovany l. Nic Can y la M.C. Fátima P. Duarte Ake, por su ayuda técnica, sus consejos y su valiosa amistad que me han brindado.

A mis amigos de seminarios extra oficiales, a mis compañeras (os) de generación 2012-1 y amigas (os) , especialmente a Laura Espinoza, Teresita Valencia, lleana Carrillo , Gamaliel ltza, Fátima Duarte, Rosa Us, Rosita Galaz, Marisa Morales, Miguel Uc, Víctor Cancino, Jorge Xool , Jorge Sonora, Gerardo Manuels, Ulises y a mis amigos tabasqueños (as).

·.·.,.

DEDICATORIAS

El presente trabajo de investigación se encuentra dedicado a papá Dios y a mi familia.

A mi padre y a mi madre pues son la base y fortaleza de mi vida, gracias por ayudarme, por creer en mí, por cada consejo y regaño, pero sobre todo gracias por su amistad y el amor que han compartido con nosotros sus hijos, mamá y papá los amo.

Amis hermanas y hermanos, gracias por ser parte de esta alegría y por el apoyo que me han dado aun en la distancia, por ser más que hermanos (as) mis amigos (as).

A mis princesas, mis hermosas sobrinas Guadalupe y Fátima dos bellos motivos que me impulsaron para alcanzar esta meta.

A mi príncipe, mi bello sobrinito Angel Jesus (+) un ser especial que si bien no se encuentra fisicamente junto ami su amor y enseñanza seguirán siempre en mi vida. Mi bello angel te amo.

A mis tias y tios mas cercanos, gracias por sus palabras de motivación y el cariño que me brindan siempre.

Finalmente le agradezco a Dios por cada prueba, cada lección , cada alegría, cada tristeza que fueron parte de una gran enseñanza que he pasado en estos años de preparación acádemica y personal.

"El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia logra abrir"

Albert Eintein

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INDICE GENERAL

INDICE GENERAL

RESUMEN .... .. . . ... . ........ .. ......... .. . ......... .. ... .. .. ... .... .. .. ... .. ......... ..... ......... .. .. . . . ...... . ...... .. 1

ABSTRACT ............. .. ....... ....... .. . .. .. .... .. ............................ . ...................... .................. III

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1

CAPITULO 1: ANTECEDENTES GENERALES .••....••.......•••••••.••....••.••.•.•.••.•..•••.•.•••••••.•.•••. 3

1.1. LOS ARN PEQUEÑOS NO CODIFICANTES . ..... . . .. .... . . .... . .. . .. . ... . ... ........ ..... ... .... .. . .......... 3

1.1.2 BIOGÉNESIS DE LOS MIARNs EN PLANTAS .. .. .... .... .... .. .... .. ................ .. .. .. ...... .. ......... 5

1.1.3 PARTICIPACIÓN DE LOS MIARNS EN EL DESARROLLO DE LAS PLANTAS ............ .. .... .. .. .. . 7

1.1.4 MIARNS Y DESARROLLO EMBRIOGÉNICO IN VITRO ................ .. .............. .. .. .. ............... 8

1.1.5 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA .............. .. ........ ...... ...... .... ..................... .... ...... .......... .. 9

1.1.6 EL CAFETO ............... ............ .. ... ..... ..... . ....................... ... ... . .. . .......... .. . . . ...... ...... 11

1.1 . 7 EL CULTIVO IN VITRO DE C. CANEPHORA .... .. .. .......... .. .. .. ...... .. .. ................ .. ............ 14

1.2 PREGUNTAS ............................................................................................................ 15

1.3 HIPÓTESIS ................................................................................................................ 16

1.4 OBJETIVOS .............................................................................................................. 16

1.4.1 GENERAL ......................... .. . . .. ... . .. ............. ......... .. . . . ......... .... .... . ....... .. . ............. 16

1.4.2 ESPEC[FICOS .................. .. . .. ... ... .. ... . .. .................. .. .... ........ .. . ......... . ............... ... 16

1.5 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 16

!NO/CE GENERAL

1. 7 REFERENCIAS ......................................................................................................... 18

CAPÍTULO 11 IDENTIFICACIÓN DE miARNs CANDIDATOS EN EL DESARROLLO

EMBRIOGÉNICO DE Coffea canephora ........................................................................ 29

2.1 INTRODUCCIÓN ... ... ... ... . .... . .. ........ ... ...... .. . .. .. ........ .. .. . .. . .. ...... . . . .. .. ...................... . .. 29

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 30

2.2.1 CULTIVO IN VITRO DE COFFEA CANEPHORA ...... ... . .. ..... ... .. .. .... ........ ... .......... ..... .... .. 30

2.2.2 INDUCCIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA A PARTIR DE EXPLANTES FOLIARES DE

COFFEA CANEPHORA ...... . .... ...... . ..... .... ......... .. .. .. . .......... . .. .. . .... .. . .. .. ......... . ... ... ...... .. . .. 31

2.2 .3 EXTRACCIÓN DE LOS ARNS PEQUEÑOS ........ .. .. ..... .. .... ...... .. ................. .......... ...... 31

2.2.4 ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE MIARNS .... .... .............. .. ... .. .. ....... .... ... .......... .... .. . 32

2.2.5 ANÁLISIS IN SIL/CO DE SECUENCIAS Y DISEÑO DE SONDAS PARA LOS MIARNS DE COFFEA

CANEPHORA . ....... ... . .. .... ... . .... . . . . .. .. . . .. .. .... .. . ... .. ... . .. . . .. . .................. .. . . ... . . . .. . . . .... .. ..... .. 33

2.3 RESULTADOS .......................................................................................................... 34

2.3.1 INDUCCIÓN, DESARROLLO MORFOLÓGICO Y RENDIMIENTO DE LA ES EN COFFEA

CANEPHORA . .......... . . .. .... .. . .. .. . . ......... . .... . . . .......... . ... ........... . .. . ..... .. . ... . ........ ...... .. ... .. .. 34

2.3.2 AISLAMIENTO DE LOS ARN PEQUEÑOS Y MIARNS EN EL PROCESO EMBRIOGÉNICO DE C.

CANEPHORA .. . .. . ..... . ..... ... ........... . .... .. . .............. . .... . ..... . . ... . ..... .. ..... .. .. ......... . .. . . . .. . .... . 36

2.2.3 BúSQUEDA IN SIL/CO DE LOS MIARNS PRESENTES DURANTE EL PROCESO EMBRIOGÉNICO

DE C. CANEPHORA ... .. ... ... . . .. .. . .. .. . . .. .. ................. .. . .. ...... ... .. .... . ..... . ... . ..... ....... ....... . ... .. 37

2.3 DISCUSIÓN .................................................................................... ........................... 38

2.5 REFERENCIAS ......................................................................................................... 44

CAPITULO 111 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE miARNs DURANTE LA

{NO/CE GENERAL

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE C. canephora ........................................................... 53

3.1 INTRODUCCIÓN ...... . . .... .......... ......... .... . . ........ .. .. ... ...... . . ... .. .. . .... . .. . ..... . . . ... .. .......... . 53

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS .. .. .. .. ........ . .... . ... . . . . . . ........ . . .... .. . ... . . . .. .. . .. . . . . . .. ... . .. . . .......... . 55

3.2.1 RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS PEQUEÑOS (17 -25 NT) DE ARN ..... . 55

3.2.2 DESFOSFORILACIÓN A PARTIR DE LOS FRAGMENTOS PURIFICADOS DE C. CANEPHORA .. 55

3.2.3 PREPARACIÓN DE MEMBRANAS PARA EL NORTHERN BLOT REVEERSO (NBR) .. . .. . .. . .... 56

3.2.4 ANÁLISIS POR NBR: MARCAJE RADIACTIVO E HIBRIDACIÓN ........................... . . . . . . . ... . . 56

3.2.5 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS DEL NORTHERN BLOT

CONVENCIONAL (NBC) ........ . .. .... . ....... . . . .. . . .. ... . . .. .. ............................ . ........... . .. . .. .. . .... 57

3.2.6 PREPARACIÓN DE LAS MEMBRANAS PARA EL NBC ... . .. . . .. ...... . .. ............ . .. . . .. ..... . ...... 57

3.2.7 MARCAJE RADIACTIVO Y PROCESO DE HIBRIDACIÓN .. .... .. . .. . .. .... . .. ...... . . . ... . .... .. .. . .. . .. 57

3.2.8 REVELADO DE LAS PELfCULAS DEL NBR Y NBC .... ... . .... ........ ... .... ...... ..... . .. .. ...... . .... 58

3.2.9. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN RELATIVA DE LOS MIAR NS DURANTE LA ES ............. .. ..... 58

3.2.9.1 SINTESIS DEL ADN COMPLEMENTARIO (ADNC) Y REACCIÓN DE POLIADENILACIÓN ... . 58

3.2.9.2 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS MIAR NS POR PCR TIEMPO REAL (QPCR) .. ....... . 59

3.2 .9.3 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LOS MIARNs . .. .. . .... . ........ . . ..... 59

3.2.1 0 ANÁLISIS ESTADISTICO .... ..... ...... . . ... ... . .. . ....... ... .. . .... . . ... .. . . ... . ...... .... . .. . . .. ..... . . .. .. 59

3.3 RESULTADOS .............................................................................................. ............ 60

3.3.1 ANÁLISIS DEL PATRÓN DE EXPRESIÓN DE LOS MIARNS CANDIDATOS POR NORTHERN BLOT

REVERSO (NBR) ... ..... .............. .... . . . ..... . . .. . . .. . . .... . ... ........... . . . .. .. . . .. . .. ... .... .......... .. .... . .. 60

fNDICE GENERAL

3 .3.2 DETERMINACIÓN DE LOS PATRONES DE EXPRESIÓN POR RT-QPCR DE 16 MIARNS EN

TEJIDOS EMBRIOG~N ICOS DE C. CANEPHORA ............. . . . ......... . .... .. ......... ................ . ....... 64

3 .3 .3 ANÁLISIS DE PATRONES DE EXPRESIÓN SEMI-CUANTITATIVOS POR NORTHERN BLOT

CONVENCIONAL (NBC) ......... .. ..... .. ... . .... .. . .... . .... ............. .......... .... .... . ....... .......... . ...... 71

3.4 DISCUSIÓN .. ... ...... ... .. ......... ...... . ................................... . ....... . ... ...... ... ...... .. .. ........ 72

3.5 REFERENCIAS .. . ... ... . ........ .. ... .... ... . .. .. ........ ... ... .... . .. ..... .. .. ..... .. ..... ...... .. . .. .. . ... ... ... . 79

CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN GENERAL, CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .... ........ 85

4.1 DISCUSIÓN GENERAL ... ....... .. . .... ...... ..... . .. .. ..... .. .......... .. .. ..... . ....... .. . ......... .. .... . 85

4 .2 CONCLUSIÓN GENERAL .. .......... . ...... . ....... .. .. ............ ..... .. .... .. ............. . .. ... ....... . 89

4 .3 PERSPECTIVAS DEL TRABAJO .... ..... ... . ......... ......... ... .. .. ......... . ..... .. .. .. .... .... .. . ... 90

4 .4 REFERENCIAS ......... .. ........ . .......... ..................... ... ... .. ........................ ....... ........ 91

CAPÍTULO V ANEXO: CURVAS DE CALIBRACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA

EFICIENCIA DEL qPCR TIEMPO REAL. ...... .................................... ............................ .. 95

/NO/CE DE FIGURAS

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1.1 Primera clasificación general de los pequeños ARN ...... . .. ... . ..... .... ..... . ... .. 5

FIGURA 1.2. Biogénesis y mecanismo de acción de los miARNs en plantas ...... ........... 6

FIGURA 1.3 Representación del proceso embriogénico somático ... . ... . ... .. .......... .. .. .. .. 11

FIGURA 2.1 Proceso de la ES en Coffea canephora a partir de explantes foliares in vitro ..... .. .... .. .... .. .... . ... ..... . ...... ....... ............... .. ..... . . .. .. .... .... .. .. . ... ..... .. ........... .. 35

FIGURA 2.2 Aislamiento y cuantificación de los embriones somáticos en C. anephora .... 36

FIGURA 2.3 Perfil de bandeo de las extracciones de los pequeños ARN . . .. ... ...... ...... 37

FIGURA 3.1 Niveles relativos de expresión de miARNs conservados en el sistema embriogénico de C. canephora .. . ...... .... ... .. ... .. .. ...... .. ........ .. .. .. ......... ... .. ..... .. .. ... 68

FIGURA 3.2 Niveles relativos de expresión de miARNs conservados en el sistema embriogénico de C. canephora . ... .... .. . .. .. . .... .. ... .... .... . ... . .. ..... .... ..... . . ... ... ..... .. .. . 69

FIGURA 3.3 Niveles relativos de expresión de miARNs divergentes en el sistema embriogénico de C. canephora . .. . ...... ... . ... .. ..... ..... ....... .. .. .. ... ...... .. ... . ... ..... ........ 70

FIGURA 3.4 Detección de los miARNs utilizando el análisis del northern blot convencional durante la ES de C. canephora . ... . ........ . .. .. .. ..... .. .. . . .... ......... ... ... .. ... ... ...... .. .... . .... . 72

FIGURA 4.1 Modulación epigenética de los miARNs en la embriogénesis somática (ES) de Coffea canephora ..... . .. . .. . .. .... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .. .. ... ... ... ... ... ... .... . . ... .. 88

{NO/CE DE CUADROS

ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO 2.1 Lista sondas sintetizadas correspondientes a secuencias maduras de miARNs ... .. . .. . .. .. .... . .. ... ..... ... ... ......... .. ...... .................. ... ..... ... ... .. .. ....... .... ..... ... 33

CUADRO 2.2 miARNs conservados e involucrados en el desarrollo de las plantas y su papel durante el proceso de ES .. . .... ... .. ... .. . ....... .. .... .. ............. .. .. . .. .. ................. 41

CUADRO 2.3 miARNs divergentes en el desarrollo de las plantas y su papel durante el proceso embriogénico ..... . ...... .... .. .... ... .. .......... ...... ........ ......................... .. ... . .. 42

CUADRO 2.4 miARNs divergentes involucrados en el desarrollo de las plantas y extremos ambientales .......... ........... .. ... .......... ...... .............. .......... ..... ......... .... .. ................. .. ..... 43

CUADRO 3.1 Patrones de expresión cual itativos mediante la presencia(+) y ausencia(-) de los miARNs evaluados en el proceso embriogénico de C. canephora ........... ........ .. .. . 63

CUADRO 3.2 Clasificación general de los miARNs candidatos analizados en el proceso embriogénico de C. canephora por NBR ..... .... .. ............ .. ...... .. .. .. .... .. .................. .. 64

CUADRO 3.3 Patrones de expresión cuantitativa (qPCR-tiempo real) mínimas (+) ,

intermedias (++) , abundantes (+++)y ausentes (ND) durante el proceso embriogénico de

Coffea canephora .. ......... . .. . .. . ......... ....... .. .. . ........ . .... ......... .......... ........ . ... . ......... 67

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ANEXO

ANEXOS

ANEXO 1 Estandarización las curvas de calibración 5.8'S y snU6 y determinación

de la eficiencia ......................................................................................... 111

RESUMEN

RESUMEN

La embriogénesis somática (ES) es un proceso biológico por el cual las células somáticas

pueden desdiferenciarse y diferenciarse a través de una reprogramación epigenética en

su genoma, estableciendo de esta manera el medio ambiente genético apropiado para el

desarrollo de embriones somáticos con la capacidad de generar una nueva planta. Los

microARNs (miARNs), considerados como elementos claves durante el desarrollo

vegetativo, han sido identificados como elementos esenciales que regulan la respuesta

temprana de la inducción embriogénica somática, sin embargo, el conocimiento acerca de

su papel en el desarrollo de la ES ha sido poco entendido. En el presente trabajo se

analizó el patrón de expresión de 40 miARNs conservados y divergentes durante el

proceso de la ES Coffea canephora.

En los tejidos analizados durante el proceso embriogénico de C. canephora se

identificaron 16 miRNAs por qPCR, sugiriendo su posible función en la ES. Por ejemplo,

m iR 164, miR535, m iR 157 y miR2119 están relacionados con la primera respuesta

generada en los explantes de hojas expuestas al proceso embriogénico. También se

observó que miR164, miR168, miR535 y miR2119 estaban relacionados con la

diferenciación y formación del estadio globular; miR166, miR168, miR393, miR397,

miR398, miR1524 y miR2119 se observaron durante el estadio de corazón, mientras que

la presencia de miR164, miR159 y miR482 se relacionaban con la transición de corazón a

torpedo, y finalmente los m iR 167 y m iR 157 se asociaron con el desarrollo del estadio

cotiledonar. También se observó que la expresión de miR390, miR171, miR156 y miR535

se mantuvieron constantes en la transición del estadio de corazón al de cotiledón. Los

resultados encontrados en este trabajo ponen de manifiesto la importancia de la posible

participación de estos miARNs durante el proceso de ES en C. canephora y proporciona

las bases para el esclarecimiento de la participación de los miARNs en la totipotencialidad

celular en las plantas.

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ABSTRACT

ABSTRACT

Somatic embryogenesis (SE) is a biological process by which the somatic cells can be

differentiated and undifferentiated throughout an epigenetic reprogram of the genome,

establishing an appropriate genetic environment to development somatic embryos with the

capacity to generate a new plant. MicroRNAs (miRNAs), considered as key elements

during the vegetative development, have been identified as essential elements regulating

early responses during somatic embryogenic induction. However, the knowledge about the

role of these small molecules during the SE development is poorly understood. In the

present work, it was analyzed the expression pattern of 40 miRNAs, conserved and

divergent, during the SE process of Coffea canephora.

In the analyzed tissues during the embryogenic process of C. canephora, it was identified

16 miRNAs by qPCR, suggesting their possible role in the SE. For instance, m iR 164,

miR535, miR157 and miR2119 were related to the first response generated in the leaf

explants submitted to the embryogenic process. lt was also observed that miR164,

miR168, miR535 and miR2119 were related with the differentiation and the formation of

the globular stage, while that miR166, miR168, miR393, miR397, miR398, miR1524 and

miR2119 were observed during the heart stage development. The presence of miR164,

miR159 and miR482 were related to the transition of the heart to the torpedo stage while

miR167 y miR157 were associated with the development of the cotyledonar stage. lt was

also found that miR390, miR171 , miR156 and miR535 expression were unchanged from

heart to cotyledonar stage. The results found in this work highlight the importance of a

possible role of these miRNAs during the SE process in C. canephora providing the

foundations to elucidate the involvement of these small molecules in the cellular

totipotency of plants.

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INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Entre los ARN no codificantes se encuentra los ARN pequeños, los cuales tienen

funciones regulatorias muy importantes (Kutter y Svoboda, 2008; Finnegan y Matzke,

2003). Los tres tipos de ARNs reguladores pequeños, actualmente descritos, son los

microARNs (miARNs), los ARNs de interferencia pequeños (siARNs) y los Piwi ARNs

interactivos (piARNs) . Los miARNs son ARN de cadenas sencillas generados

endógenamente y con un tamaño aproximado de 19 a 25 nucleótidos (nt) de longitud.

Hasta el momento se sabe que los miARNs se unen por complementariedad parcial o

total a los ARN mensajeros (ARNm), impidiendo de esta manera su traducción a proteína

o bien generando su degradación (Bartel, 2004; Reinhart et al., 2002; Rajagopalan et al. ,

2006; Allen et al. , 2005; 2008; Chen , 2005). La determinación del papel que desempeñan

estas moléculas y su clasificación han sido posible por los avances realizados para

comprender su biogénesis, la identificación del tipo de precursor, las regiones en las que

se originan y el tipo de complementariedad que ejercen y que influyen directamente sobre

los genes blancos sobre los que ejercen su función regulatoria (Axtell , 2013) .

Para varios grupos de investigación la identificación de los miARNs y el proceso por el

cual se generan estas moléculas, ha tenido un interés particular en la identificación

funcional de estas moléculas sobre el ciclo de vida de las plantas, el papel que

desempeñan sobre la transición y desarrollo tanto en las etapas juveniles como adultas, el

proceso de germinación de las semillas y durante el desarrollo embriogénico (Chen, 2005;

Nonogaki, 2010; Curaba et al., 2012; Giraldez, 2010; Cuperus et al., 201 1). Algunos de los

miARNs reportados y caracterizados hasta el momento están involucrados en los

procesos de desarrollo vegetal con ciertas funciones conservadas entre las especies

mono y eudicotiledóneas (Bonnet et al. , 2004; Lu et al. , 2008; Rhoades, 2012; Cuperus et

al. , 2011).

Estas pequeñas moléculas se encuentran involucradas en la diferenciación y proliferación

celular así como en los mecanismos de respuestas ante extremos bióticos y abióticos

(Chen et al., 2012a; Rogers y Chen , 2013; Wang et al. , 2004). En los últimos años se han

clasificado aproximadamente 20 miARNs, conservados evolutivamente en varias especies

1

INTRODUCCIÓN

de plantas y con funciones específicas sobre el desarrollo y crecimiento vegetal (Chen et

al. , 2012b; Chen et al. , 2011 ; Chi et al. , 2011 ; Kinoshita et al. , 2012; Liu et al. , 2009; Ni et

al. , 2012; Zhang et al., 2012) . Algunos de los miARNs identificados hasta el momento son

miR160, miR168, miR172, miR390 y miR397, los cuales han sido identificados como

elementos esenciales para regular el desarrollo de nuevos órganos en las plantas

(Nonogaki, 201 O; Shen et al., 2009; Buxdorf et al. , 201 O; Reyes y Chua, 2007) . No

obstante, otros miARNs encontrados en procesos como la morfogénesis, la identidad de

órganos florales y el desarrollo embriogénico cigótico se encuentran actuando de manera

tejido-específica (Bonnet et al. , 2004; Mallan na y Rizzino, 201 O; Willmann et al. , 2011) .

El proceso de formación del embrión cigótico, que atraviesa por diversos procesos

bioquímicos y moleculares para el desarrollo de una plántula completa, se encuentra

relacionado al desarrollo embriogénico somático in vitro o embriogénesis somática (ES), y

ha sido util izado como una herramienta efectiva de propagación masiva in vitro de

especies de gran interés económico (Zimmerman, 1993; Koltunow y Grossniklaus, 2003).

La ES es un proceso notable en el que las células somáticas de las plantas desarrollan ,

bajo condiciones controladas, un embrión capaz de convertirse en una planta completa y

funcional (Zimmerman, 1993), y en el que los procesos fisiológicos y moleculares que

envuelven su desarrollo es el resultado de la correcta expresión del programa genético,

(Nassuth et al. , 1980; Hatanaka et al. , 1991 ; Yeung , 1995; Nomura y Komamine, 1995;

Kiran y Thorpe, 1995; Staritsky, 1970). Sin embargo, los estudio epigenéticos realizados

durante el desarrollo de los embriones somáticos y cigóticos han evidenciado a los

miARNs como elementos claves que pueden dirigir o alterar la expresión génica,

determinando el desarrollo o inhibición del proceso embriogénico (Heckel et al. , 1999;

Zhang et al. , 2008; Aquea y Arce-Johnson , 2008)

A partir de esta información, en mi tesis de investigación, se evaluó la expresión de

algunos de los miARNs reportados como conservados en varias especies y que ejercen

funciones importantes durante el desarrollo vegetal y la maduración de embriogénica.

También se consideraron miARNs divergentes pero relacionados al cultivo in vitro, así

como miARNs regulados por diversos factores ambientales y que por primera vez son

estudiados durante el desarrollo de la ES

2

CAPITULO 1

CAPITULO 1: ANTECEDENTES GENERALES

1.1. Los ARN pequeños no codificantes

La regulación en la expresión de genes es un proceso vital en todos los organismos vivos,

y necesario para que se lleven a cabo los procesos de diferenciación celular, la

organogénesis, el desarrollo y la apoptosis celular. Los mecanismos de regulación

genética están basados en la traducibilidad y la estabilidad del ARNm, o bien mediante la

estructuración de la cromatina (Croce y Calin , 2005) . Con la identificación de pequeñas

moléculas de interferencia (ARNi) en las plantas, afloraron otras vías de regulación que

inactivan selectivamente genes de una célula, descifrando así el funcionamiento de cada

gen y su participación en la regulación sobre los patrones expresión (Napoli et al. , 1990;

Sen y Blau, 2006).

El mecanismo de acción dirigido por los ARN interferentes (ARNi) y los ARNs pequeños

no codificantes, permite posicionarlos como elementos principales en la regulación de la

expresión génica, pues regulan aproximadamente un 40% de los genes conocidos (Xie et

al., 201 0). La regulación generada por los ARNs pequeños en el núcleo, como en el

citoplasma, se da sobre la transcripción y la traducción de genes blancos (Matzke y

Birchler, 2005); estas pequeñas moléculas pueden intervenir en todo el proceso de

desarrollo de un organismo, por lo cual ha sido necesario la identificación de su

mecanismo de regulación en células eucariotas (Zhang et al. , 2006; Rhoades et al. , 2006;

Cuperus et al. , 2011) .

Hoy en día se acepta la existencia de tres grandes familias de ARNs pequeños no

codificantes, si bien esta clasificación se encuentra sujeta a cambios con los resultados de

los análisis transcriptómicos a gran escala que se publican diariamente. La primera

clasificación de los ARNs pequeños se basó en su mecanismo de síntesis y la función de

la familia proteica Argonauta (AGO), pues estos fragmentos se asocian a esta familia . Sin

embargo, hoy en día la clasificación general comprende tres clases de pequeños ARNs:

los siARN, los miARNs y los piARNs, estos últimos han sido identificados sólo en

mamíferos (Lu et al. , 2005; Llave et al. , 2002; Kutter y Svoboda, 2008) .

3

CAPITULO 1

En la clasificación más reciente de los siARNs y los miARNs en plantas, los ARNs

pequeños se encuentran en una primera clase que detallada su origen biogénico,

determinado que las secuencias de los siARNs provienen de ARN de doble cadena

(dsARN), en tanto que los miARNs pequeños derivan de ARN de una sola cadena, con la

estructura de ARN de horquilla (hpARNs). Este origen biogénico es en principio el punto

clave que determina gran parte de su papel funcional en las plantas (Chen , 2009; Axtell ,

2013; Allen et al., 2005; Bartel , 2004) (Figura 1.1).

En los últimos años se ha establecido que los siARNs y los miARNs son capaces de

generar un cambio epigenético sobre el mantenimiento e integridad del genoma

(Skopelitis et al. , 2012; Lu et al. , 2005 ; Mallory y Vaucheret, 2006) . Por ello se ha sugerido

que el mecanismo de regulación empleado por estas moléculas se asemeja a la acción de

sustancias morfogénicas en los animales; esto condujo a predecir que estas pequeñas

moléculas de ARN podrían basarse en principios similares para generar, estabilizar e

interpretar sus gradientes de expresión. En general , la primera predicción sobre el papel

que desempeñan los miARN, a partir de las estructuras precursoras en horquilla,

requieren de la acción específica de proteínas con actividad de ARNasa tipo 111 : Drosha y

Dicer, generando miARN maduros de 22 nt, seguido de la acción de AGO, y finalmente se

unen por complementariedad , parcial o total , a los ARNm (Zhang et al. , 2006; Zhang et

al. , 2006; Rhoades, 2012).

4

1} V.ía de los siARNs

ARNds de cadena lar

"P>l RISC

1) Vfa de los miARNs

Precurso e ullo ~p. N

miiARI\I{miAIIN . • d'

to

CAPITULO 1

111) Vía de los piARNs

Figura 1.1 Clasificación de los ARN pequeños. El mecanismo de síntesis a través de la secuencias precursoras, la función de la familia proteica Argonauta (AGO) y el Complejo de Silenciamiento Asociado al ARN (RISC) determinan el tamaño y tipo de secuencias maduras .para los siARN , miARNs y los piARNs. Adaptado de Ghildiyal·y Zamore (2009) .

1.1 .2 Biogénesis de los miARNs en plantas

Hoy en día la importancia que involucra el procesamiento de los miARN y la función

estructural de tallo y horquilla como precursor del transcripto primario (pri-miARN)

demostrada, sugiere que durante la biGgénesis los miARNs maduros proceden a partir de

una cadena no lineal , -llamada MIRGene, precursora en el núcleo, seguida de la etapa

realizada en citoplasma por acción del complejo del silenciamiento asicado al ARN (RISC) y

AG01 , que llevan a cabo la degradación o represión del ARNm a través de la

complementariedad al ARNm (Figura 1.2) (Reinhart et al. , 2002; Bartel , 2004; Chen, 2005;

Westholm y Lai , 2011 ; Baumberger y Baulcombe, 2005; Lasse y Gunter, 2007).

El mecanismo general de la biogénesis y desarrollo de los miARNs en plantas da inicio en

el núcleo, a partir de MIRGEN que se transcribe individualmente pero que contiene una

organización policistrónica para la transcripción. Esta secuencia es considerada como un

promotor para la generación del precursor pri-miARNs, identificando que los extremos 3'-

5

CAPITULO 1

poli-adenilado y 5'- caperuza son reconocidos por la enzima ARN Polimerasa 11 en plantas,

siendo procesadas en el núcleo y generando un fragmento pre-miARN (70nt) y otras

estructuras secundarias (Chen et al. , 2010; Griffiths et al. , 2008; Pegtel et al. , 2010;

Cuperus et al. , 2011 ; Lasse y Gunter, 2007). Asi mismo se ha evidenciado que una

estructura estable del pre-miARNs dentro del núcleo es mantenida por enzimas con

dominio-Dawdle como FHA-nuclear y DDL, en tanto que la ARNse 111 y Dicer Like-1(DCL 1)

generan estructuras apareadas de doble cadena que finalmente y mediante la participación

de Hyponastatic (HYL 1) y C2H2_ Zinc finger Protein Serrate (SE) se estabiliza én el núcleo el

pre-miRNAs. Por lo tanto la interacción sinérgica de HYL 1, SE y DCL 1 en el núcleo (DCL 1)

son elementos esenciales y altamente reconocidos para la bio~énesis de los miARNs

(Carthew et al. , 2009; Rhoades, 2012; Cuperus et"~l. , 2011).

'CITOPLASMA

' Represión del ARNm

Degradación del ARNm

Figura 1.2. Biogénesis y mecanisrl)O de acción de los miARNs en plantas . Modificado de Eldem·et al. , (2013) .

6

CAPITULO 1

1.1.3 Participación de los miARNs en el desarrollo de las plantas

Los miARNs son uno de los componentes importantes en la regulación en todo el ciclo de

vida de las plantas. Los estudios realizados durante la última década han establecido un

papel esencial para los miARNs, sobre el control de expresión génica, las modificaciones

en el epigenoma y los patrones de respuesta contra los virus (Gao et al., 2013; Chen ,

2005; Wang et al., 2001). En el reino vegetal, los miARNs se encuentran conservados

evolutivamente, aunque también existe evidencia sobre miARNs divergentes, tanto en las

plantas como los animales (Zhang et al., 2006; Allen et al. , 2004; Rhoades, 2012; Zhang

et al. , 2006). Estudios realizados sobre los miARNs conservados muestran que esta clase

de miARNs contribuyen al crecimiento adecuado de las plantas y al proceso de la

morfogénesis (Axtell , 2008).

Las evidencia sobre la regulación ejercida por los miARNs muestran a la represión en la

traducción, como un modo de acción regulatoria de los miARNs en las plantas, la llevan a

cabo mediante la complementariedad entre las secuencias maduras de los miRNAs y sus

objetivos blanco (Brodersen et al, 2008.; Dugas y Bartel , 2008; Todesco et al. , 2010).

Otros de los puntos claves sobre el papel de los miARNs en el desarrollo de las plantas,

es la gran similitud entre miembros e isoformas de miARNs de una determinada familia

correlacionándolos funcionalmente (Meng et al., 2011 ; Rubio-Somoza y Weigel, 2011). En

otros estudios, realizados durante el desarrollo de las plantas, se ha centrado la atención

sobre la regulación sinérgica de algunos miARNs, ya que se ha determinado que una

autorregulación de miARNs permite el funcionamiento espacio-temporal de los miARNs;

no obstante, se ha hecho evidente que esta función se encuentra programada a través del

procesamiento nuclear de los pri-miARNs, pre-miARNs y la secuencia madura de los

miARNs (Wang et al. , 2001 ; Hobert, 2008).

En estudios enfocados en la autorregulación que existente entre miembros de una misma

familia o de varios miARNs, se ha identificado la relación funcional entre los miR168a/b

presentes en A. thaliana, pues estos miARNs desempeñan un papel fundamental en la

estabilización de los genes AGO, regulando de esta manera las funciones específicas de

otros miARNs. Fenotípicamente, se ha demostrado que una superposición en el balance

de estos miARNs afectan el desarrollo de la planta, produciendo efectos pleiotrópicos en

condiciones normales de crecimiento (Vaucheret et al. , 2006; Chen, 2009; Meyers et al. ,

7

CAPITULO 1

2008). Si bien la regulación ejercida por el conjunto de miARNs está relacionada

funcionalmente con los factores de transcripción y las familias de genes que presentan

dominios Cup-Shaped Cotyledon (CUC1) y NAC (NAM, ATAF1/2 y CUC2) que a su vez

se encuentran regulados por la familia miR164, son importantes para el desarrollo de la

raíz y los brotes axilares (Raman et al., 2008; Kim et al. , 2009). Así mismo, también se ha

hecho evidente que para el desarrollo correcto de la raíz y el correcto funcionamiento del

factor transcripcional SHORT ROOT (SHR) y las proteínas Scarecrow like (SCR), es

necesaria la regu lación ejercida a través de las familias MIR165 y MIR166 (Williams et al.,

2005; Zhou et al. , 2007; Yanagisawa, 2004) . En varias de las revisiones realizadas de la

función de los miARNs sobre el desarrollo de las plantas se han identificado otras familias

de miARNs, que regulan o reprimen fuertemente otros factores transcripcionales que son

necesarios para el desarrollo de las plantas.

1.1.4 miARNs y desarrollo embriogénico in vitro

La propagación masiva de especies vegetales mejoradas en la naturaleza es un proceso

largo, difícil y costoso. Una alternativa es el uso de técnicas biotecnológicas, como la

propagación in vitro, ya sea por morfogénesis o ES (Santana-Buzzy et al. , 2007, Loyola­

Vargas et al. , 2008). Cada una de ellas tiene como base la capacidad totipotente de las

células somáticas del explante (Von Arnold et al. , 2002; Karami et al. , 2009; Karami y

Saidi , 2010; Yeung, 1995).

Si bien el cultivo in vitro es una herramienta para el desarrollo y la micropropagación de

especies económicamente importante, también se puede usar como una herramienta de

estudio para comprender y caracterizar el proceso de desarrollo de las plantas, así como

para estudiar los mecanismos biológicos que permiten su desarrollo embriogénico. La

investigación actual de los miARN pequeños se lha dirigido a aquellos que se encuentran

involucrados directamente en la señalización y que participan en la regulación de los

genes que median el desarrollo de una planta completa (Yeung , 1995). En los últimos

años, durante el proceso de desarrollo embriogénico cigótico y somático, se ha

determinado que estas moléculas desempeñan funciones regulatorias esenciales para el

desarrollo de dichas estructuras embriogénicas al igual que en las hojas, tallos y raíces.

También se ha demostrado que podrían propiciar defectos pleitropicos, pues se cree que

podrían estar regulando más de un tercio de la expresión de todas las proteínas (Palatnik

8

CAPITULO 1

et al., 2003; Ng et al., 2012; Mallanna y Rizzino, 2010; Axtell, 2013; Rogers y Chen, 2013).

El papel regulador de los miARNs durante la embriogénesis somática en plantas todavía

no se entiende bien; hay pocos estudios que han evidenciado el papel de los miARNs

durante el desarrollo de la ES. Durante el proceso de desarrollo embriogénico in vitro

participa un conjunto de vías de señalización muy compleja, por lo que una inadecuada

regulación en ellas, puede dar origen a una reprogramación de la información, inhibiendo

por lo tanto el proceso de ES total o parcialmente. Por ejemplo, usando el cultivo in vitro

de Larix leptolepis como modelo experimental se demostró que una expresión diferencial

del miR171 genera una desregulación en miR172, miR159 y miR169, los cuales están

encargados de activar genes y factores de transcripción durante la diferenciación celular

(Zhang et al., 201 O). Estas observaciones sugieren que un miAR N requiere un sistema de

control de la expresión para permitir el desarrollo de la ES. Otra evidencia proviene de la

identificación de los miARNs y los genes blancos en Dimocarpus logan; en este estudio se

demostró la funcionalidad de diecisiete miARNs durante los diferentes estadios de la

inducción embriogénica, la morfogénesis, y la maduración del embrión cotiledonar (Lin y

Lai, 2013), mientras que en las especies Valencia orange, Medicago truncatula, Pinus

teada y Oryza sativa se identificaron diez miARNs conservados y sus blancos durante el

proceso embriogénico. En resumen, se han podido relacionar ciertos miARNs con los

estadios de inducción y expresión por las que atraviesa el proceso de la embriogénesis

somática (Xiao-Meng et al. , 2011; Aquea y Arce-Johnson, 2008; Eyles et al., 2013), así

como en varios eventos que llevan a la diferenciación celular (Rhoades et al., 2006;

Gutierrez et al., 2007; Willmann et al., 2011).

1.1.5 Embriogénesis somática

En las plantas superiores existen distintas vías de reproducción que conducen al

desarrollo de embriones y a la supervivencia de las especies. Uno de los mecanismos de

reproducción es la vía sexual que se lleva a cabo mediante la fecundación de un gameto

femenino por un gameto masculino, a este proceso se le conoce como embriogénesis

cigótica. Bajo ciertas condiciones, la reproducción de algunas especies vegetales puede

llevarse a cabo en ausencia de la fertilización de los gametos como en el caso de

Ka/anchoe spp. (Mogie, 1992; Koltunow y Grossniklaus, 2003). En condiciones de cultivo

in vitro, la ES es inducida para regenerar una planta completa a partir de una, o un

9

CAPITULO 1

conjunto de células con capacidad totipotente, dando origen a células embriogénicas cuyo

desarrollo asemeja, hasta cierto punto, el proceso de desarrollo de un embrión cigótico

(De Smet et al. , 201 O; Von Arnold et al. , 2002; Staritsky, 1970).

Se ha demostrado que la formación de un embrión somático, que no es el resultado de un

proceso de fertilización , el factor determinante para que la embriogénesis se realice se

encuentra contenido totalmente dentro de la célula , pudiendo funcionar en ausencia de

genes producto del medio ambiente materno o de una señal de fertilización (Nomura y

Komamine, 1995). Las células somáticas de las plantas, por lo tanto, contienen toda la

información genética necesaria para la regeneración de un organismo completo y

funcional mediante la reprogramación celular a través de las condiciones de inducción

embriogénica (Von Arnold et al. , 2002; Nomura y Komamine, 1995).

La presencia de auxinas, ya sea antes o durante el proceso de inducción , el genotipo, el

tipo de explante, la composición del medio, factores físicos como la luz y la temperatura

se han identificado como factores claves para que se lleve a cabo la ES (Karami y Saidi ,

201 O; Karami , et al. , 2009). Una visión molecular sobre los cambios que ocurren desde el

inicio de la ES, hasta la regeneración completa de una planta, han llevado a la búsqueda

de factores relacionados con los mecanismos que controlan la ES, ya que el proceso de

transición de las células somáticas a células embriogénicas, conduce a la activación del

ciclo de división celular, la reorganización fisiológica y al establecimiento de patrones de

expresión para generar células diferenciadas (Von Arnold et al. , 2002; Quiroz-Figueroa et

al., 2006b). En general, durante la ES se podrían identificar dos etapas muy importantes:

la inducción y la expresión, en la primera se adquiere la competencia embriogénica y se

da la proliferación celular, mientras que en la etapa de expresión las células despliegan su

competencia diferenciarse en estructuras somáticas (Quiroz-Figueroa et al. , 2006b).

El proceso de desarrollo de los embriones somáticos es muy semejante al proceso por el

cual se desarrolla un embrión cigótico, excepto que los embriones somáticos no

atraviesan por un periodo de dormancia y desarrollo del suspensor, como es el caso en la

embriogénesis cigótica (Zimmerman, 1993). En la ES las células continúan su

proliferación hasta la obtención de callo embriogénico capaz de diferenciarse

posteriormente en estructuras embriogénicas (Yang y Zhang , 2010) .

10

CAPITULO 1

Coazó

Torped

Plán u a

Figura 1.3 Representación del proceso de embriogénesis som.ática. A partir de explantes de una planta, las células somáticas, bajo condiciones controladas del cultivo in vitro, presentan una reprogramación celular en su epigenoma y en su genoma para dar inicio a la expresión de la totipotencialidad celular y al desarrollo de las estructuras embriogénicas (globular, corazón, torpedo y cotiledonar) (Nic-Can, 2013) .

1.1.6 El cafeto

El cafeto (Coffea spp.)_ es un género perteneciente a la familia de las Rubiaceae, cuenta

con más de 103 especies y ocupa el cuarto lugar como la familia más grande entre las

angiospermas (Davis et al., 2006; Noirot et al. , 2003) . Dos de las principales fuentes de

ingresos y divisas para los países cafeticultores son, C. arabica y C. canephora pues

producen aproximadamente el 75% y 25% de todo el café que se comercializa

mundialmente, respectivamente (Carneiro, 1997). En términos de producción de bebidas,

los consumidores de café favorecen a C. arabica por su sabor menos amargo, delicioso

aroma y menor contenido de cafeína, en comparación con la bebida proveniente de C.

canephora. Sin embargo, la comercialización del café soluble que se consume en la

mayor parte del mundo procede de C. canephora (Herrera et al., 2002).

11

CAPITULO 1

El cafeto se cultiva aproximadamente en 80 países alrededor del mundo y cerca del 70%

de la producción proviene de los pequeños agricultores (Vinod et al., 2006). México es

uno de los países productores de café orgánico, reconocido en el mundo por la calidad del

grano de café y además se ha posicionado entre los mejores a nivel internacionalmente.

El cultivo del cafeto en México, durante el año 2012, representó una de las exportaciones

más lucrativas, pues se exportaron cerca de 3,725,000 sacos con un valor de 875.9

millones de dólares, beneficiando a los pequeños agricultores y familias que dependen de

este cultivo (WWW.sagarpa .gob.mx). En la actualidad , el cafeto es uno de los productos

más valiosos en el comercio internacional. El último informe realizado por la Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO)

(http://www.fao.org/economic/est/est-commodities/es) , posiciono al cafeto junto con la

cocoa entre los tres primeros cultivares de mayor importancia en el mercado internacional

después del banano y los cítricos.

Como todo organismo vivo vegetal , el cultivo del cafeto tiene un ciclo de vida y un

potencial productivo característico. El desarrollo vegetativo y reproductivo de una

plantación joven de cafeto necesita aproximadamente de cuatro años para la obtención de

una primera cosecha (semilla - semilla) ; no obstante, estas plantas alcanzan su mayor

productividad a los seis u ocho años de edad y son consideradas comercialmente activas

hasta los 25 ó 30 años, decayendo significativamente la producción de este cultivar

después de esta edad (Arcila et al., 2007; De los Santos-Briones y Hernández-Sotomayor,

2006). Por otra parte, este cultivo puede ser afectado por diversas enfermedades y plagas

que reducen su productividad , en este sentido la especie C. arabica resulta ser más

susceptible a numerosas enfermedades y plagas como: la roya producido por el hongo

Hemielia vastatrix, enfermedades en el fruto por la presencia de Colletrotichum coffanum,

la enfermedad de la broca del café producida por Hypothenemus hampei (mejor conocido

como la broca del café) , plagas como Xylotrechus quadripes Chevr (barrenador del tallo) y

ataque por nemátodos (Meloidogyne spp. y Pratylenchus spp.), mientras que el cultivar de

C. canephora es más resistente a estas enfermedades y plagas (Lashermes et al. , 2008).

En este sentido varios cafeticultores han empleado por mucho tiempo técnicas

convencionales como las retrocruzas , con el fin de generar un genotipo de café estable y

con las características de mayor resistencia a estas enfermedades, sin embargo, el

12

CAPITULO 1

periodo de seis ciclos de auto-polinización implica más de 30 años para generar una

variedad de cafeto mejorado (Carneiro, 1997). En la actualidad se sabe que la limitante

para transferir los rasgos genéticos de resistencia presentes en C. canephora a C.

arabica, mediante técnicas convencionales se debe a que C. canephora es una especie

diploide (2n = 2x = 22) y C. arabica es una especie tetraploide (2n = 4x = 44) (Carneiro,

1999; De-Kochko et al., 201 0). En este sentido los estudios biotecnológicos sobre el

cafeto han perseguido, durante las últimas tres décadas, en laboratorios de todo el

mundo, la mejora agronómica este cultivo.

Durante los primeros estudios mediante la cruza tradicional y el análisis molecular a

través de la selección asistida por marcadores, se logró la identificación y propagación de

genotipos de cafeto deseables en el aumento de la calidad y productividad, sin embargo,

el largo periodo para los ciclos de generación, la exigencia de enormes recursos de la

tierra para los agricultores, el alto costo de las pruebas de campo y la falta de precisión en

la estrategia de esta técnica, ha limitado sustanciamente su mejora (Hendre et al., 2008;

De-Kochko et al. , 201 0) . En la última década los esfuerzos realizados mundialmente para

el mejoramiento del cafeto, han generado ligeros avances pese a las limitantes de los

factores genéticos y fisiológ icos de la misma planta, pues como sabemos, la baja

diversidad genética, el nivel de ploidía, la auto-incompatibilidad y la fácil fertilización entre

las especies robustas, limitan el progreso biotecnológico del cafeto (Carneiro, 1999; Davis

et al., 2006).

No obstante, bajo este contexto y con el uso de herramientas moleculares como la

amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPO) (Orozco-Castillo et al. , 1996), los

fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP) (Pal et al. , 2002), el polimorfismo

en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (Coulibaly et al. , 2003) y las

repeticiones de secuencias simples o microsatélites (SSR) (Yu et al. , 2011; Poncet et al. ,

2004) se ha logrado el establecimiento de algunos recursos genéticos en cafeto,

avanzado significativamente en la identificación de secuencias expresadas (EST) en

cafeto ( Mondego et al. , 2011; Bhat et al. , 2005) .

Otros de los objetivos biotecnológicos con el cafeto ha sido el mejoramiento sobre el

contenido de cafeína, debido a la sensibilidad de algunos consumidores a este alcaloide

(Silvarolla et al. , 2004). Con base en los estudios realizados por la Asociación Nacional

13

CAPITULO 1

del Café, el consumo del café descafeinado ha superado el 1 O% del café comercializado

en el mundo (http://www.ncausa.org/). Sobre esta necesidad, se ha aplicado la tecnología

del ARN de interferencia (ARNi), para la obtención de plantas transgénicas con una tasa

de síntesis de cafeína reducida (Ogita et al. , 2004; Ogita et al., 2003).

En los primeros estudios realizados sobre la biosíntesis de cafeína, a través de estas

pequeñas moléculas, se avanzó favorablemente en la inhibición en la expresión del gen

CaMXMT1, que codifica para una de las enzimas N-metiltransferasas que está

involucrada en la biosíntesis de la cafeína. El resultado, tras el uso de los ARNi en C.

canephora fue una significativa reducción en el conten ido de cafeína, del 70% al 65%, en

tanto que el uso de la misma tecnología en C. arabica la redujo hasta el 85 al 80% (Ogita

et al. , 2004; Ogita et al. , 2003) . En años recientes, se han idientificado ARNs pequeños,

como los siARNs y los miARNs, en C. canephora y C. arabica con funciones claves en la

ruta de biosíntesis de la cafeína, así como en otros procesos biológicos del cafeto,

abriendo una ruta promisoria para el control en la biosíntesis de este alcaloide.

1.1.7 El cultivo in vitro de C. canephora

Por más de cuatro décadas, el interés por el cafeto se ha convertido en el objeto de

estudio para diferentes líneas de investigación a nivel mundial. Una de ellas, aplicada

para mejorar el cafeto a través de la ingeniería genética ha sido el cultivo in vitro, un

sistema de herramientas que ha permitido estudiar diversos aspectos celulares del café,

tales como químicos (síntesis de cafeína) , fisiológicos (órganos y tejidos) , bioquímicos y

biológicos. Los primeros avances realizados en 1970, se basaron en la ES indirecta

inducida a partir de entrenudos jóvenes y tej idos blandos de C. canephora, algunos años

más tarde se obtuvo la ES en C. arabica. Se utilizó la misma vía de ES indirecta

manipulando secciones de hoja jóvenes (Staritsky, 1970; Sondahl et al. , 1979).

El primer reporte sobre la ES en C. canephora fue publicado por Startsky (1970) y en C.

arabica por Sondal y Sharp (1977). Después, se han publicado varios protocolos. Éstos

pueden ser de un paso (Dublin 1981 ; Yasuda et al. 1985) o una serie secuencial de pasos

en diferentes medios de cultivo (Sondahl y Sharp 1977; Dublin 1984; Zamarripa et al.

1991 ). La inducción de la ES se ha alcanzado usando explantes tales como yemas de

ramas plagiotrópicas y ortotrópicas (Staritsky 1970), explantes de hoja (Sondahl y Sharp

14

CAPITULO 1

1977; Quiroz-Figueroa et al. 2002) , integumentos (Lanaud 1981 ), y anteras y perispermo

(Ascanio y Arcía 1987; Sreenath et al. 1995). Sin embargo, el uso de expalntes de tejido

foliar es lo más común, debido al gran número de explantes obtenidos y la disponibilidad

de tejido a lo largo del año. Además, el tiempo requerido para la inducción de la ES a

partir de diferentes especies de cafeto toma entre ocho meses y un año.

El medio de cultivo usado para la inducción de la ES de cafeto contiene una mezcla de

auxinas y citocininas. Sin embargo, la ES puede inducirse solamente con citocininas

(Dublin 1981 ; Yasuda et al., 1985), puesto que las auxinas tienen un efecto inhibitorio

(Hatanaka et al., 1991 ). Además, Hatanaka et al. , (1995) mostraron que el uso de

inhibidores de la síntesis de etileno (Co2+, Ag+) afectan la ES en cafeto, sugiriendo una

posible función regulatoria para el etileno en la ES de esta especie. El AgN03 mejora la

producción de embriones en cinco genotipos de C. canephora, mientras que a dosis

elevadas tiene un efecto negativo (Fuentes et al. , 2000). El ácido salicílico, a bajas

concentraciones, tiene también un efecto positivo en la calidad y cantidad de los embrioes

obtenidos de C. arabica (Quiroz-Figueroa et al. , 2001 ). Otro compuesto que se ha

determinado también mejora la ES tanto de C. canephora como de C. arabica es el

triacontanol (un alcohol primario de 30 carbonos) (Giridhar et al. , 2004).

En C. canephora se ha determinado que el pre-tratamiento de las plantas cultivadas in

vitre, usadas como fuente de los explantes por 14 días en presencia de ácido

naftalenacético (ANA) y kinetina (KIN) es indispensable para la inducción de la ES.

(Quiroz-Figueroa et al., 2006a). A lo largo de las últimas cuatro décadas, el objetivo

principal de este tipo de estudio ha sido el establecimiento de protocolos eficientes para

regenerar masivamente las especies comerciales de cafeto. También se ha determinado

que factores tales como luz, y temperatura, así como el tipo de explante, el estado

fisiológico , y el pH del medio de cultivo pueden modificar la respuesta embriogénica

(Santana-Buzzy et al. , 2007) .

1.2 PREGUNTAS

1.- ¿Cuáles son los microARNs que están presentes en los diferentes estadios de

desarrollo de los embriones somáticos de C. canephora?

15

CAPITULO 1

2.- ¿Cuál es el patrón de expresión diferencial de los miARN encontrados en los

diferentes estadios del desarrollo embrionario?

1.3 HIPÓTESIS

Si los miARNs son moléculas esenciales involucradas en la morfogénesis celular,

entonces deberán acumularse diferencialmente en los diferentes estadios del proceso de

embriogénesis somática de C. canephora.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 General

);;> Evaluar la presencia de miARNs durante el proceso de embriogénesis somática en

C. canephora.

1.4.2 Especificos

);;> Identificar los miARNs presentes en cada uno de los estadios del proceso

embriogénico en C. canephora.

);;> Analizar la abundancia de miARNs especfficos en cada estadio de desarrollo

embriogénico de C. canephora .

1.5 JUSTIFICACIÓN

El proceso de desarrollo embriogénico conlleva eventos de desdiferenciación y

diferenciación celular, así como otros eventos de adaptación para que se lleve a cabo la

germinación de la semilla y el desarrollo de una planta sana y vigorosa (De Smet et al.,

201 O; Zimmerman, 1993). El desarrollo de los embriones cigóticos y somáticos ha sido

objeto de diversos estudios morfológicos, moleculares, bioquímicos y genéticos. Sin

embargo, recientemente este proceso ha sido abordado bajo el enfoque de los

mecanismos epigenéticos, tales como la metilación del ADN, las modificaciones

postraduccionales en las histonas y la participación de los pequeños ARN no codificantes,

entre los cuales se encuentran los miARNs y los siARNs (Wang et al., 2009; Trionnaire y

Twell , 201 O; Nic-Can et al. , 2013).

16

CAPITULO 1

Se ha observado que los miARNs juegan un papel importante en el desarrollo de las

plantas mediante el control de la expresión de genes blancos. Sin embargo, la función de

estas moléculas durante el proceso de desarrollo de la ES aún no se entiende, y si bien

existen algunos reportes sobre la presencia de los miARNs en la ES en especies como, L.

leptolepis, V. orange, D. /ogan y Oriza sativa, no existe ningún reporte en el que se

discutan cuáles miARN, y en qué cantidad, son expresados en los diferentes estadios

embriogénicos. Es por ello que este estudio puede fortalecer la comprensión del proceso

embriogénico.

1.6 Estrategia experimental

Hoja

•:•Análisis morfológico

,. Caracterización del cultivo in viUo

Aislamiento y colecta de Jos ES a partir del dla 56 posterior a la Inducción ------

Mp Glo Cor Tor

·:·Análisis molecular

,.Extracción de los p~:queños ARNs de bajo peso molecular

.I"Norther blot reverso I"Norther blot convencional

Mediante el marcaje radiactivo con y.:np

I"Sínlesi.s de cONA .l"qRT-PCR-Tiempo

real

Cot Clg

-:·Análisis Bioinformátlco

... Búsqueda e Identificación de miARNs candidatos

.1" Análisis en las bases de datos

.~"Diseño de sondas convencionales

17

CAPITULO 1

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28

CAPITULO 11

CAPÍTULO 11 IDENTIFICACIÓN DE miARNs CANDIDATOS EN EL

DESARROLLO EMBRIOGÉNICO DE Coffea Canephora

2.1 Introducción

El desarrollo embriogénico vegetal comprende varios procesos biológicos que permiten

establecer sistemas de señales transcripcionales y generar los patrones funcionales y

estructurales que determinan el correcto desarrollo de la estructura embriogénica

(Kapinas et al., 2013; Cangahuala-lnocente et al., 2009). La capacidad de producir un

organismo completo, a partir de células somáticas indiferenciadas, reside únicamente en

el reino vegetal (Zimmerman, 1993; Quiroz-Figueroa et al. , 2006b) . En la naturaleza, y

bajo ciertas condiciones, se puede llevar a cabo el desarrollo de embriones en ausencia

de fertilización, este proceso recibe el nombre de apomixis. En algunas especies los

embriones surgen de las hojas como propágulos vegetativos (p. ej. Ka/anchoe spp.). Los

embriones surgen directamente de una célula somática. En condiciones in vitro este

mismo tipo de células pueden dar paso al desarrollo de un embrión normal mediante el

proceso conocido como embriogénesis somática (ES) (Naumova, 1992; Yang y Zhang,

201 O; Zimmerman, 1993).

El proceso de ES atraviesa por una serie de cambios morfológicos y moleculares a través

de eventos de desdiferenciación celular, activación de la división celular, reprogramación

fisiológica y del metabolismo, así como cambios en los patrones de expresión genética.

Recientemente este proceso ha empezado a ser objeto de estudio para determinar la

participación de mecanismos epigenéticos en la formación de las estructuras

embriogénicas (Lardet et al., 2009; Yang y Zhang , 201 O; Yeung, 1995; Birchler et al.,

2011 ; Mohn y Schubeler, 2009). Si bien la ES es utilizada como una herramienta

biotecnológica para la propagación masiva, la conservación in vitro del germoplasma y el

mejoramiento genético, es sin duda también una valiosa herramienta para la investigación

científica (Griga, 2000; De Smet et al. , 2010; Zimmerman, 1993; Yang y Zhang, 2010).

29

CAPITULO 11

El proceso de diferenciación celular por la que atraviesa el embrión somático durante las

transiciones de un estadio a otro se ven fuertemente influenciado por mecanismos

epigenéticos (Eckardt, 2006; Zhang et al., 2013). Entre los mecanismos epigenéticos

estudiados durante la ES están la metilación del ADN y las modificaciones

postr.aduccionales en las histonas ryvu et al. , 2010; Deal y Henikoff, 2011; Nie-Gan et al.,

2013). Sin embargo, el tercer mecanismo epigenético ejercido por los pequeños ARNs en

este proceso no ha sido estudiado al nivel que permita entender su participación durante

la ES. Los miARN, una clase de ARNs pequeños, tienen un tamaño de 17-25 nt, han sido

identificados como moléculas esenciales para la diferenciación celular y el proceso de

desarrollo y germinación del embrión . Se han encontrado algunos miARNs, con

características conservadas evolutivamente en varias especies vegetales, involucrados en

el control de procesos biológicos tales como el ciclo del desarrollo vegetal, la floración, la

morfogénesis, la organogénesis y el desarrollo de órganos florales (Rhoades et al. , 2006;

Chen et al. , 2009).

El papel que ejercen los miARNs en el proceso de maduración y desarrollo de la

embriogénesis ha sido el centro de atención de varios grupos de investigación en los

últimos años (Rhoades et al, 2011 ; Zhang et al., 2006; Reinhart et al., 2002). Si bien se ha

logrado relacionar a algunos de los miARNs conservados con el proceso de

embriogénesis, obtener ciertos patrones sobre la distribución de estos miARNs e incluso

obtener nuevos candidatos que podrían estar relacionados con el proceso de

diferenciación celular y desarrollo embriogénico, aún no se ha podido elucidar el

mecanismo de su participación en dicho proceso. En esta parte de la investigación se

realizó la búsqueda in silico de los miARNs y el análisis de expresión de algunos de ellos

que se han reportado activos durante el proceso embriogénico en plantas.

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 Cultivo in vitro de Coffea canephora

Las plántulas de C. canephora fueron mantenidas y cultivadas in vitro en medio MS

(Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 550 IJM de myo-inositol , 15 IJM de tiamina­

HCI, 206.33 IJM de L-cisteina, 16.24 IJM de ácido nicotínico, 87.67 mM de sacarosa y

30

CAPITULO 11

0.25% (p/v) de gel Rite. El pH del medio fue ajustado a 5.8. Las plántulas fueron

mantenidas bajo condiciones de fotoperiodo (16h luz /8h oscuridad), a una temperatura de

25 ± 2 ·e y sub-cultivadas a medio fresco cada 35 días.

2.2.2 Inducción de la embriogénesis somática a partir de explantes foliares de Coffea canephora

Para el proceso de inducción de la ES, las plántulas fueron pre-acondicionadas por 14

días utilizando el medio de cultivo descrito previamente, modificando la concentración del

ácido nicotínico a 8.12 1JM, y agregando ANA, (0.541JM) y KIN (2.321JM) bajo las mismas

condiciones de cultivo. La inducción de la ES, fue llevada a cabo siguiendo el protocolo

propuesto por Quiroz-Figueroa (2006b). Brevemente, a partir de los primeros pares de

hojas, se obtuvieron discos foliares con un área de aproximadamente 0.25 cm2. Un total

de cinco explantes foliares fueron colocados en matraces Erlenmeyer con 50 mL de

medio Yasuda modificado, adicionado con benciladenina (BA, 5 IJM) (Hatanaka et al.,

1991 ). Los explantes fueron incubados en condiciones de oscuridad a 25 ± 2 oc y

mantenidos en agitación a 55 rpm por 56 días.

2.2.3 Extracción de los ARNs pequeños

Los ARNs pequeños fueron extraídos a partir de 100 mg de cada uno de los siguientes

tejidos vegetales, explantes foliares colectados a los O días de inducción, masa pro­

embriogénica (Mp, colectada a los 21 días posteriores al proceso de inducción),

embriones somáticos de los estadios globular (Gio), corazón (Cor), torpedo (Tor) y

cotiledonar (Cot), aislados al dia 56 dpi. También se analizaron embriones cigóticos

colectados de plantas cultivadas en los jardines del Centro de Investigación Científica de

Yucatán.

La extracción se realizó utilizando el protocolo de cloruro de litio reportado previamente

por Rosas-Cardenas et al., (2011 ), con ciertas modificaciones para C. canephora. En

resumen, el tejido vegetal fue macerado en nitrógeno líquido con 2% de

polivinilpolipirrolidona (PVPP) (p/p) hasta la obtención de un polvo fino . El tejido

pulverizado fue homogenizado con 500 IJL del amortiguador de extracción [1 00 mM Tris­

HCI (pH 9.0), 1% dodecil sulfato de sodio (SOS), 100 mM cloruro de litio (liCI) y 1 O mM de

ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)] y 500 IJL de una solución saturada de fenol pH

31

CAPITULO 11

8.0, e incubado por 5 min a 60 oc. Posteriormente la mezcla fue centrifugada a 14,000

rpm por 1 O minutos a 4 oc y la fase superior acuosa fue transferida a un tubo nuevo.

Inmediatamente, se le adicionaron 600 IJL de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1, v/v) y la

mezcla se centrifugó a 11 ,500 rpm durante 1 O m in a 4 °C. Posteriormente, 350 IJL de la

fase superior se incubaron a 65 oc por 15 min. Finalizado el tiempo de incubación , se

adicionaron 60 IJL de NaCI 5 M y 73 IJL de polietilenglicol 8000 al 40%. La mezcla se

almacenó a -20 oc por 50 m in y después se centrifugó a 11,500 rpm durante 1 O m in a 4

°C. Seguidamente se tomaron 300 IJL de la fase superior y se le adicionaron 600 IJL de la

mezcla fenal-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1, v/v/v) , la mezcla fue centrifugada a

11 ,500 rpm durante 1 O m in a 4 °C. Finalizada la centrifugación , se tomaron 300 IJL de la

fase superior y se le adicionaron 50 IJL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y 1,700 IJL de

etanol absoluto frío. La mezcla se dejó precipitar por 15 horas a -20 oc y después fue

centrifugada a 11 ,500 rpm por 15 m in a 4 oc. El sobrenadante fue desechado y la pastilla

se dejó secar por 60 mina temperatura ambiente. Finalmente, la pastilla fue resuspendida

en 25 IJL de agua estéril libre de ARNasas y se realizó el análisis de la pureza y calidad

del ARN mediante la medición de absorbancia en los parámetros A260/A280 y

A260/A230.

2.2.4 Análisis electroforético de miARNs

El perfil electroforético de los pequeños ARNs de C. canephora se realizó utilizando geles

desnaturalizantes de urea/poliacrilamida al 12.5%. Los geles fueron preparados

mezclando 5 mL de la solución para geles al12.5% [acrilamida:bisacrilamida (19:1 Biorad)

y 8 M de urea], 25 IJL de tetrametiletilendiamina (TEMED) y 5 IJL de persulfato de amonio

(PSA) al 20%, dejando polimerizar los geles por 30 min a temperatura ambiente y

almacenados a 4 oc por 48 h. La preparación de las muestras partió de 3 IJg de ARN de

baja masa molecular añadiendo 0.3% (v/v) de amortiguador de carga (98% formamida, 10

mM EDTA, pH 8.0, 1 mg/mL xileno-cianol , 1 mg/mL de azul de bromo-fenal) más un

volumen de agua libre de ARNasas. Las muestras fueron incubadas a 65 oc durante 5

min para desnaturalizar el ARN y entonces fueron colocadas en hielo por 5 min. Los

pocillos de los geles fueron lavados introduciendo 3 mL de 0.5X de TBE (0.9 M Tris-HCI,

pH 8.0, 0.9 M ácido bórico y 2 mM EDTA) utilizando una jeringa para retirar el exceso de

PSA. La corrida electroforética se llevó a cabo por 2 h a 80 V utilizando como

amortiguador de corrida TBE 0.5X. Posteriormente, los geles fueron retirados de los

32

CAPITULO 11

cristales y teñidos con 1% de Syber-gold en 1 O mL de TBE 0.5X por 30 m in a temperatura

ambiente y realizando un lavado final con agua bidestilada por 5 min. La visualización de

las bandas fue realizada utilizando el equipo Gel Doc XR (Bio-Rad).

2.2.5 Análisis in silico de secuencias y diseño de sondas para los microARNs de Coffea canephora

Los miARNs que se consideraron analizar en este trabajo fueron a partir de una búsqueda

exhaustiva en artículos de investigación publicados hasta el momento en procesos como

la ES, EC y la respuesta a estrés in vitro. Posteriormente, las secuencias maduras de los

miARNs candidatos fueron buscadas en la base de datos miRBase

(http://www.mirbase.org), seleccionando las secuencias de los miARN maduros de las

e~pecies Vitis vinífera, Solanum lycopersicum, G/ycina· max, Popu/os trichocarpa, M.

truncatu/a, A. thalíana y O. sativa. Posteriormente, se realizó un alineamiento de

secuencias utilizando la plataforma de datos psRNATarget: A Plant Small RNA Target

Analysis Server (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/). A partir de este análisis, las

secuencias que presentaron mayor similitud fueron seleccionadas para el estudio en C .

. canephora. Las sondas seleccionadas. para nuestro estudio se enviaron a sintetizar y se

enlistan en el Cuadro 2.1.

Cuadro 2.1. Lista de sondas sintetizadas correspondientes a secuencias maduras de miARNs

m1ARNs Secuencta 5 '~3 ' moARNs Secuencia 5'-3 '

SnU6 5 "AGGGGCCATGCTAATCTTCTC3" miR397 S"TCATCAACGCTGCACTCAAT3'

5 '85 5'ACGTCTGCCTGGGTGTCACAA3' m iR5158 5' ATTCATCCTCATCCCAGTGGCTCA3"

miR1524 s· GGAGTTCCTTCCTCGGACTCG3" miR393 s· ATCAATGCGATCCCTTTGGAA 3'

miR157a S" GTGCTCTCTATCTTCTGTCAA3' miR400 5' TGACTTATAATACTCTCATA 3'

miR165a 5'GGGGGATGAAGCCTGGTCGGA3' miR778 5' TGTACATAAACCAAGCCA 3'

miR2119 5' TTCCCCTACAACTCCCTTTGA3' m iRB24 S'TTCTCACAAATGGTCTA 3'

miR3623a 5'TGGTGCTTGGATGAACTTGTGA3' miR399 S' GCAAATCTCCTTTGGCA 3'

miR3623b 5'ATGCAAATTCGTCCAAGCACCA3' m iRB27t 5' AATCTACTGGTAGTTGTTT 3'

miR3629b 5'TCCTACATTTTCTCAGCAGCC3' m iR827c 5' AATCTACTGGTAGTTGTTTG 3'

miR3635b 5'CAGGCATGTGTGGGACATAAT3' miRB19 5' AAAGTCTTATAACCTGA 3'

miR3636b 5'CTCCGACTTGCTTCTCCGACAGAC3' miR472 S'GGATGGGTGGAGTAGGGAAAA3'

m iR390 5'GGCGCTATCCCTCCTGAGCTT3' m iR2199 5' ACTATGTGAT CGTGCCTAGTC3'

m iR395 5'GGAGTTCCCCCAAACACTTCAG3' miR1862 S' TCCCAAAATAAACCAACCTCGT3'

m iR398 5'AAGGGGTGACCTGAGAACACA3' miR449 S'CCAGCTAACATACACTGCCA3'

miR482 5'TAGGAATGGGTGGAATTGGAAA3' m1R164 5T GCACGTGCCCTGCTTCTCCA3'

miR535 5'GCGTGCTCTCTCTCGTTGTCA3' miR154 5'CGAAGGGCAACACGGATAACCTA3'

miR822 5'CATGTGCAAATGCTTCCCGCA3' miR166 5'GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA3'

m iR169 5'CCGGCAAGTCATCCTTGGCTG3' miR319 5'AGGAGCTCCCTTCAGTCCAAA3'

miR171 5'GATATTGGCACGGCTCAATCA3' miR156 5'GTGCTCTCTATCTTCTGTCAA3'

miR159 5'TAGAGCTCCCTTCAATCCAAA3' miR170 S'GATATTGACACGGCTCAATCA3'

m iR160 5'TGGCATACAGGGAGCCAGGCA3' miR172 S' ATGCAGCATCATCAAGATTCT3'

m iR168 5'TTCCCGACCTGCACCAA GCGA3' miR158 5'TGCTTTGTCTACATTTGGGA3'

m iR167 5'TAGATCATGCTGGCAGCTTCA3' miR430 S'TTACCCCAACATGTAGCACTTA3'

m iR163 5'ATCGAAGTTCCAAGTCCTCTTCAA3' miR427 S'GCCCAAAACAGAAAGCACTTT3'

m iR396 s'CAGTTCAAGAAAGCTGTGGAA3' miR309 S'CAAAACCGAACAAGGTTTGTCG3'

33

CAPITULO 11

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Inducción, desarrollo morfológico y rendimiento de la ES en Coffea canephora

Para realizar el análisis de los miARNs durante el proceso de formación y desarrollo de

los embriones somáticos en C. canephora, como modelo de estudio, a partir de explantes

foliares sometidos al proceso inducción fue preciso hacer el seguimiento de la respuesta

al proceso embriogénico.

El proceso de la ES en C. canephora fue monitoreado durante 56 días (Figura 2.1 ).

Durante los primeros 14 días posteriores a la inducción, los explantes mostraron las

señales de cicatrización y engrosamiento en las heridas que son típicas de este proceso.

También se pudieron observar pequeñas estructuras dispersas, que indicaron el

comienzo de la diferenciación celular, como se muestra en la figura 2.1 D. Posteriormente,

en los días 21 y 28 dpi, se observó un aumento en la proliferación celular, como resultado

de una serie de divisiones celulares que caracterizan la diferenciación celular durante la

embriogénesis, al mismo tiempo que también se forma una masa Mp. Cuando han

transcurrido siete semanas de la inducción de la ES, se puede apreciar la formación de

embriones en el estadio globular. A partir de este momento se da una formación contínua

de los diferentes estadios embriogénicos, corazón, torpedo y cotiledonar. Durante los días

42 y 49 dpi se puede observar una mezcla de todos los estadios embriogénicos.

Finalmente, en el día 56 dpi, el explante se encuentra cubierto de estructuras

embriogénicas.

34

CAPITULO 11

Figura 2.1. Proceso de ES en Coffea canephora. (A) Preacondicionamiento de plántulas por catorce días en medio MS + ANA y KIN. (8) hojas primordiales. (C) explantes foliares para la inducción de ES y (D) Seguimiento del proceso embriogénico cada 7 días después de la inducción de la ES (dpi) hasta el día 56 dpi.

El análisis, aislamiento y cuantificación de los embriones somáticos en el explante

después de 56 dpi permitió determinar que se producen alrededor de 100 embriones

somáticos por explante, divididos de la siguiente manera, 20, 38, 2.5 y 15 para los estadios

Glo, Cor, Tor y Cot, respectivamente (Figura 2.28). Los embriones en estadio cotiledonar

fueron puestos a germinar, con el fin de determinar su viabilidad. Todos los embriones

germinaron y produjeron plantas sanas (Figura 2.2A).

35

CAPITULO 11

40

0 Estadios embriogénicos

Figura 2.2. Aislamiento y cuantificación de los embriones somáticos en C. anephora. (A) Los embriones somáticos aislados a los 56 dpi. Los embriones somáticos del estadio cotiledonar fueron colocados en medio MS para su conversión a plántulas. (B) Cuantificación de los embriones somáticos por explante 56 dpi. Las barras representan la cuantificación de tres réplicas biológicas. Las letras sobre las barras representan la diferencia significativa con una P>0.05 utilizando la prueba de Tukey.

2.3.2 Aislamiento de los ARN pequeños y miARNs en el proceso embriogénico de C. canephora

Para abordar molecularmente el presente estudio se aislaron los ARNs pequeños. Se

tomaron 100 mg de cada una de las muestras mencionadas en materiales y métodos para

la realización de la extracción de los ARNs pequeños. En la figura 2.3 se enlistan los·

tejidos analizados en este estudio, así como la cantidad de individuos por tejido para la

extracción de ARNs pequeños. Por ejemplo, si se parte de hoja solo se utilizan tres

explantes para obtener la cantidad requerida pero si se parte de embriones globulares, se

requieren de 690 embriones para realizar una extracción , por lo que para realizar una

extracción de ARNs pequeños del estadio globular se requieren de 35 explantes en

promedio.

Aunque existen protocolos estandarizados para la extracción de ARN total , para la

extracción de los pequeños ARN se requirió estandarizar una metodología para un

enriqueciendo de los ARNs con tamaños de 17-30 nt. El análisis de eficiencia del

36

CAPITULO 11

protocolo utilizado en las muestras de C. canephora se determinó mediante el patrón de

bandeo en las corridas electroforéticas de dos diferentes marcadores moleculares; uno de

330 a 10 pb (M1; Figura 2.3) , que sirve para distinguir a los ARN pequeños totales y el

otro de 17-25 nt (M2; Figura 2.3) que es útil para ubicar a los miAR N que se encuentren

en ese rango de tamaño. Se observó un patrón de bandeo de 17-25 nt en las muestras

correspondientes a Cor, Tor y Cot, las cuales tuvieron una mayor abundancia en las

bandas, en comparación a las muestras de hoja, Mp, Glo y EC (Figura 2.3). Esto sugiere

que los ARNs pequeños de esas muestras están más íntegros que las de hoja, Mp, Glo y

EC.

Je~lantes

25 explantes

~690 emb one:s

-4 4 embriones

.. 110 embriones

~68 embrlon s

- 70 embriones

Figura 2.3. Perfil de bandeo de las extracciones de los ARNs pequeños. (A) Tejido necesario para obtener 100 mg de tejido de hoja (hoja), masa pro-embriogénica (Mp) , embrión globular (Gio), corazón (Cor), torpedo (Tor), cotiledonar (Cot), embrión cigótico (Cig) . (B) Corrida electroforética en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al12.5% de las muestras de hoja, Mp, Glo, Cor, Tor, Cot y Cig. M1 y M2 h son los marcadores moleculares de 330 a 10 pb y de 17 a 25 nt, respectivamente.

2.2.3 Búsqueda in silico de los miARNs presentes durante el proceso embriogénico de C. canephora

Para determinar los posibles miARNs candidatos que pudieran estar participando en la ES

de C. canephora se utilizaron las bases de datos miRBase (http://www.mirbase.org) y

Plant Small RNA Target Analysis Server (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/). Se

37

CAPITULO 11

obtuvieron 47 secuencias de miARNs que pudieran estar involucradas en el proceso de la

ES. En esta búsqueda se identificaron secuencias conservadas para C. canephora , de los

miR156, miR158, miR159, miR164, miR166, miR167, miR168, miR171 , miR390, miR397,

miR398. Asi también se identificaron otras secuencias en C. canephora, que han sido

estudiadas en funciones biológicas como la desdiferenciación y diferenciación celular, el

desarrollo vegetativo y el estrés in vítro, los cuales hasta el momento no habían sido

evaluados en el proceso de la ES (Cuadros 2.2; 2.3 y 2.4).

2.3 DISCUSIÓN

La ES es una valiosa herramienta para estudiar los procesos celulares, bioquímicos,

epigenéticos y moleculares que ocurren durante la _inducción , la transición entre estadios

de desarrollo y el desarrollo de embriones somáticos (Kiran y Thorpe, 1995b; De Smet et

al. , 2010; Yang y Zhang , 2010; Zimmerman , 1993).

Durante mucho tiempo el género Coffea ha sido objeto de diversos estudios para la

obtención de protocolos eficientes y reproducibles de multiplicación a gran escala. Los

estudios realizados para determinar el mejor tipo de explante (García y Menéndez, 1987) ,

las condiciones y medio de cultivo (Samson et al. , 2006) y los análisis durante el

desarrollo de estructuras embriogénicas (Nassuth et al. , 1980; Quiroz-Figueroa et al. ,

2002), han permitido optimizar la eficiencia y el desarrollo embriogénico de Coffea, así

como también , se ha logrado determinar algunos de los factores que intervienen en la

capacidad de diferenciación celular y el papel clave de ciertos reguladores del crecimiento

que adicionados en la etapa de pre-tratamiento mejoran y optimizan el proceso de

inducción , así como la ES (Carneiro , 1997; Ayii-Gutiérrez et al. , 2013; Hatanaka et al. ,

1991 ; Quiroz-Figueroa et al. , 2001 ). En este trabajo se comprobó la eficiencia

embriogénica que presentan los explantes de C. canephora (Figuras 2.1 y 2.2). También

se analizó el posible papel que podrían estar ejerciendo los ARNs pequeños, como

mecanismo epigenético, durante el proceso embriogénico.

Se sabe que la regulación transitoria ejercida por los ARNs pequeños es un paso clave en

los mecanismos epigenéticos que regulan procesos como la gametogénesis, la

fertilización y el desarrollo de embriones (Chuck et al., 2009) . Estas pequeñas moléculas

no solo han sido relacionadas con el mantenimiento de la integridad genómica cigótica, en

38

CAPITULO 11

estudios recientes se determinó que existe una correlación entre su funcionamiento y el

origen biogénico de los ARNs pequeños que determinan su modus operandi entre

diversos grupos taxonómicos; inclusive, se ha propuesto que, debido a determinados

modos de acción, podrían regular la herencia de las marcas en las histonas contribuyendo

directamente en la herencia epigenética en las plantas superiores (Schwach et al. , 2009;

Xie et al., 2004; Zhang et al. , 2013; Llave et al., 2002a) . En conjunto, la importancia sobre

el conocimiento de estos mecanismo epigenéticos, durante el proceso de la ES, radica en

que permite relacionar la regulación en la actividad transcripcional de ciertos genes,

debido a estados conformacionales específicos de la cromatina, que restringen o permiten

la expresión genética, con la metilación del ADN.

Por otro lado, las moléculas pequeñas de ARN, entre las que destacan los ARNs

pequeños de interferencia (siARN) y los microARNs (miARNs), son elementos

moduladores del mecanismo epigenético, pues la metilación de las histonas y la

metilación del ADN y en consecuencia la remodelación de la cromatina, podrían estar

regulados a través de estos ARNs pequeños (Zhang et al., 2013; Tariq y Paszkowski,

2004). Recientemente, utilizando herramientas de la genómica comparativa se ha

determinado la presencia de miARNs pequeños nuevos conservados en C. canephora.

Utilizando la base de datos para EST de Solanaceae Genome Netwoks se identificaron un

total de 42 genes blanco potenciales. La mayoría de esos genes codifican para factores

de transcripción que parecen participar en el crecimiento, desarrollo y en las respuestas al

estrés (Nellikunnuma y Chandrashekar, 2012). Utilizando un acercamiento similar Akter et

al. , (2014) identificaron varios miARNs potenciales en C. arabica y también determinaron

seis posibles genes blanco en A. thaliana para estos miARNs. Un caso aparte lo forman

los miARNs provenientes del ARN de los intrones. En C. canephora, recientemente se ha

descubierto uno de estos miARNs que regula la expresión de los genes que codifican

para la N-metiltransferasa, una enzima que participa en la biosíntesis de la cafeína. El

miARNs pequeño proviene de un intrón del gen que codifica para la teobromina sintasa

(Mohanan et al. , 2013).

Así mismo, en el presente trabajo se encontró la presencia de ARNs pequeños con

tamaños entre 17 a 25 nt de longitud durante todo el proceso de inducción y desarrollo de

la ES en C. canephora (Figura 2.3). Ha tomado más de 20 años de investigación para

39

CAPITULO 11

elucidar la función de los ARNs pequeños no codificantes en el proceso del desarrollo y

maduración de embriones cigóticos y somáticos en diferentes especies vegetales.

Estudios en A. thaliana (Schwarz et al. , 2008; Willmann et al. , 2011 ), M. truncatu/a (Eyles

et al. , 2013), V. orange (Xiao-Meng et al. , 2011), L. /eptolepis (Zhang et al. , 2012) y D.

logan (Lin y Lai , 2013) , han mostrado la función los miARNs involucrados en el desarrollo

de las estructuras embriogénicas, así como la importancia de los otros componentes,

tales como Dicer, Argonauta y HASTY, que participan en la biogénesis de las diferentes

clases de ARNs pequeños en las plantas, pues determinan en gran parte la funcionalidad

de estas moléculas (Wilbert y Yeo, 2011 ; Chen, 2005; Nonogaki, 201 O) .

El análisis del proceso de los miARNs ha ampliado el panorama sobre el papel en la

regulación que tienen estas moléculas en diferentes procesos biológicos (Cuadro 2.2, 2.3

y 2.4). Los microARNs: miR156, miR159, miR164, miR166, miR167, miR168, miR171 ,

miR390, miR397, miR398 y miR169 que val idamos experimentalmente en esta

investigación, se les ha relacionado con el proceso de la ES en C. orange, L. /eptolisis y

M. truncatula , lo que sugiere que se necesita cierta regulación por estos miARNs para que

se lleven a cabo los eventos biológicos implicados en la inducción y diferenciación celular

de la ES; asimismo, también se ha demostrado que al perderse la regulación

proporcionada por los miARNs, miR164/166/397, se puede inhibir parcial o totalmente el

desarrollo embriogénico (Xiao-Meng et al. , 2011; Zhang et al., 2012; Zhou et al., 2008;

Eyles et al. , 2013).

Por otra parte, con la utilización de diversas herramientas, provenientes de la genómica

comparativa, se ha avanzado en las predicciones de nuevos miARNs en diferentes

especies. Los estudios computacionales realizados en C. canephora y C. arabica han

identificado miARN conservados relacionados a 12 familias de miARNs en especies como

S. /ycopersicum, V. vinífera, A. tha/iana, G. max, P. trichocarpa y O. sativa (Nellikunnuma

y Chandrashekar, 2012; Akter et al. , 2014) . Por ello, para la síntesis de las sondas de los

miARNs analizados en esta investigación , se usaron las secuencias reportadas en estas

especies. Si bien , la mayoría de los miARNs se encuentran relacionados con factores de

transcripción que regulan el crecimiento y la respuesta a extremos ambientales, también

existen otros miARNs, como miR309, miR400, miR427, miR430 y miR2119, que se están

estudiando en este trabajo , debido a que se sabe que participan en el desarrollo

40

CAPITULO 11

embrionario en los mamíferos y en alg~nos vertebrados, y han sido analizados durante el

desarrollo de las plat:ltas, y deseamos determinar si estos miARNs podrían estar

involucrados en el desarrollo embrionario de las plantas (Sunkar y Zhu, 2004; Zhu et al.,

2008; Sunkar y Zhu, 2004).

Cuadro 2.2. miARNs conservados e involucrados en el desarrollo de las plantas y su papel

durante el proceso de ES.

miARNs Función Proteína codificada

Referencias por el gen diana

Transición de la fase juvenil a la Squamosa prometer- (Jiao et al. , 2010; Wu y fase adulta, desarrollo de raíz, miR156

maduración de EC ~ inducción de binding protein Poethig, 2006; Zhang

la ES. (SBP) et al., 2012)

Desarrollo de órganos florales,

miR159 germinación de semillas y MYB protein

(Achard et al. , 2004; formación de embriones en estadio Reyes y Chua, 2007) globular. Desarrollo de brotes, formación de NAC Domain (Kim et al. , 2009;

miR164 meristemos apicales y regulación containing proteins, Raman et al., 2008; en la transición de estadios CUC y GBOF-1- Sanan-Mishra et al., embriogénicos LIKE 2013) Formación de meristemos

miR166 apicales, desarrollo vascular, HD-ZIP transcription (Zhou et al., 2007; polaridad de hojas y el desarrollo factor Williams et al. , 2005) en la ES

Desarrollo de órganos Auxin response (Kinoshita et al. , 2012a; miR167 reproductivos, fertilización y factor (ARF's) Wu et al. , 2006)

desarrollo de los estadios en la EC

miR168 Modula la biogénesis de miARNs, Argonaute (AG01)

(Vaucheret et al. , 2006; el desarrollo de la ES Lin y Lai , 2013)

Desarrollo de flores, diferenciación GRAS domain or (Zhang et al. , 201 O; miR171 celular, regulación en el patrón del SCARECROW- like

sistema radicular proteins (SCL) Llave et al., 2002b)

Estrés in vitro, regula el ciclo de (Shen et al. , 2009;

miR390 desarrollo de raíces laterales y TAS3 and (ARFs) Marin et al. , 201 O; modula la formación del estadio

globular en la ES Yoon et al., 2010)

Regula la respuesta ante los

miR397 extremos por sequía, salinidad y Laceases and beta-6 (Sunkar y Zhu, 2004)

ácido abscísico (ABA) y la tubulin diferenciación celular Tolerancia a estrés oxidativo y ,POr Copper superoxide

miR398 deficiencia de nutrientes y modula dismutases (Sunkar et al. , 2006) el proceso de diferenciación celular (cds1,cds2, ccs1, y transición embriogénica cox5b-1)

41

CAPITULO 11

Cuadro 2.3. miARNs divergentes en el desarrollo de las plantas y su papel durante el proceso embriogénico.

Proteína miARNs Función codificada por el Referencias

gen blanco

Desarrollo de la morfogénesis en (Rhoades et al. , 2002;

miR157 hojas, semillas, regula los

Sbp-box Gandikota et al. , 2007; tiempos de floración y las fases Wang et al ., 2001 ; Kim et de transición vegetativa al. , 2012)

Regula la iniciación de raíces ARF10, ARF16;

(Mallory et al. , 2005; miR160 laterales, desarrollo de semilla y Nonogaki, 201 O; Qiao et

biosíntesis de las auxinas ARF17

al. , 2012)

Desarrollo y morfología de hoja, HD-Zip 111 gene, (Mallory et al. , 2005; Zhou

miR165 et al. , 2007; Williams et al. , el meristemo y las semillas phb, phv

2005) Desarrollo de la floración , regula

miR169 la respuesta ante estres por ABA ABRE,NF-YA (Un ver et al. , 201 O) y la proliferación celular Patrones de floración, regula la

APETALA-2, (Zhang et al. , 201 O; Zhu et miR172

diferenciación celular y el cambio RAP2.6,toe1, toe2, al. , 2009; Glazinska et al.,

de estadios vegetativos de las toe3,ids1, gloy15 2009)

plantas

Desarrollo de la semilla y (Ori et al. , 2007; Schommer et al. , 2008;

miR319 morfología de las hojas, regula la Tcp4, lanceolate,

Addo-Quaye et al. , 2009; respuesta ante los extremos de FamilyTFs

Li et al. , 2011 ; Ori et al. , salinidad y sequía 2007)

Desarrollo de hojas, raíces y (Chen et al. , 2011 ; Si-

TAAR, tir1 , afb2 y Ammour et al. , 2011 ; miR393 brotes apicales, modula la

afb3 Robert-Seilaniantz et al. , biosíntesis de auxinas 2011)

miR396 Regula el desarrollo y morfología Gfr, WRKY,

(Xia et al. , 2012b; de las hojas Giacomelli et al. , 2012) Regula la diferenciación celular y (Gar et al. , 2011 ; Li et al. ,

miR535 el estrés in vitro de cultivos NF-YA (HAP2) 2009)

micropropagados

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CAPITULO 11

Cuadro 2.4. miARNs divergentes involucrados en el desarrollo de las plantas y extremos

ambientales.

Proteína miARNs Función codificada por el Referencias

gen diana

miR158 Regula el desarrollo de la ------ ( Rhoades , 2012; Reinhart et al. , planta 2002; Rhoades et al. , 2002)

miR309 Modula la programación (Bushati et al. , 2008) celular -------

Regula la respuesta ante miR395 los estreses de salinidad, ------- (Lu et al. , 2008)

sequía, y sul~atos

Regula el patrón de (Sunkar y Zhu, 2004; Zhu et al. , miR400 desarrollo y maduración de ------- 2008; Sunkar y Zhu, 2004)

embriones cigóticos

Regula la programación miR427 celular y desarrollo df1a, cxcr7, TDRD7 (Bushati et al. , 2008)

embriogénico

Regula la maduración del miR430 EC y el desarrollo del ------- (Eyles et al., 2013)

embrión cotiledonar

Regula la floración,

miR482 expansión de pétalos y Sp/2, MYB, NAC, (Li et al. , 201 O) respuesta a infecciones NAM virales

Interfiere sobre el estado

miR827 de compactación de la ------- (Lu et al. , 2008) cromatina, y biosíntesis del (GA)

miR1524 Modula el de·sarrollo del

GAMYB (Subramanian et al. , 2008) sistema radicular

Regula la maduración del (Eyles et al. , 2013; Naqvi et al., miR2199 EC y el desarrollo del ------- 2010)

embrión cotiledonar

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CAPITULO 11

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CAPITULO 111

CAPÍTULO 111 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE miARNs

DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE C. Canephora

3.1 Introducción

Los miARNs son moléculas pequeñas, no codificantes, que realizan un papel muy

importante en la regulación del desarrollo de las plantas. Con la creciente innovación

tecnológica como la secuenciación masiva y el desarrollo de herramientas

bióinformáticas, ahora se puede predecir la presencia de miARNs nuevos; utilizando este

acercamiento se ha dado un gran avance en el número de miARNs y su presencia en

varias especies de plantas (Thakur et al., 2011; Adai et al. , 2005; Wang et al., 2004;

Rhoades et al., 2002). Si bien biológicamente se ha llegado a comprender la biogénesis y

el mecanismos de acción de estas moléculas, el reto biológico que aun persiste gira

alrededor de la identificación y validación de las funciones que desempeñan estas

moléculas (Tretter et al., 2008; Rogers y Chen, 2013; Chen, 2005; Allen et al. , 2005) .

Entre los procesos que sabemos que regulan los miARNs se encuentran el desarrollo de

los órganos florales, la morfogénesis de hojas, la respuesta generada ante diversos

extremos ambientales y el desarrollo de los embriones (Mallory y Vaucheret, 2006; Pei et

al., 2013; Wang et al., 2001; Palatnik et al., 2003; Khraiwesh et al., 2012; Mallanna y

Rizzino, 201 0). Se ha evaluado ampliamente la expresión de estas moléculas y se ha

hecho evidente que existe una distribución espacio-temporal de sus patrones de

expresión lo que a su vez controla la activación y la represión del programa de desarrollo

de las plantas, creando así una base sustentable para una serie de predicciones sobre la

función de los miARNs y sus genes blancos (Llave et al. , 2002; Wang et al., 2005; Bonnet

et al. , 2004; Cuperus et al., 2011).

Durante los procesos de embriogénesis cigótica y somática ocurren eventos biológicos

que requieren de una adecuada programación en la expresión génica (Yang y Zhang ,

2010; Xu y Huang, 2014; Aquea y Arce-Johnson, 2008; Karami et al. , 2009). La

53

CAPITULO 111

importancia de la función de los miARNs durante el desarrollo y la maduración de los

embriones se describió inicialmente en embriones cigóticos de A. thaliana, en particular

de la enzima responsable de la biogénesis de los miARNs, Dicer-like1 (DCL-1). Se

descubrió que la sincronización del programa de maduración de los embriones se lleva a

cabo a través de la regulación por miARNs, controlando la represión de los reguladores

LEAFY COTYLEDON-2 (LEC2) y FUSCA-3, así como de los factores transcripcionales

ARABIDOPSIS 68-INTERACTING PROTEIN1-LIKE1 (ASIL 1) 1 ASIL2 y a la deacetilasa

de la histona HDA6/SIL 1 los cuales participan en los estadios tempranos de la

embriogénesis en Arabidopsis (Willmann et al., 2011 ).

En los últimos tres años, diferentes reportes sobre el papel de los miARNs durante el

proceso de EC en A. thaliana (Willmann et al. , 2011 ), P. teada (Oh et al., 2008) y L.

/eptolepis (Zhang et al., 2013) y durante la ES en M. truncatula (Eyles et al., 2013), L.

/eptolepis (Zhang et al., 2012), D. Logan (Lin y Lai, 2013), O. Sativa (Zhou et al., 201 O) y

V. orange (Xiao-Meng et al., 2011), muestran que existen un claro patrón de expresión de

los miARNs durante las etapas que comprenden el desarrollo embriogénico (Jenik et al.,

2007). Por ejemplo, se ha descubierto que durante la primera etapa de la ES en C.

sinensis, miR156 actúa sobre ocho genes blancos putativos, todos ellos codifican para

Squamosa promoter-binding proteins (SBP). Siete de esos genes son Squamosa

Promoter-Binding-like (SPL) e incluyen a los genes SPL2 (uno), SPL4 (uno), SPL 13 (uno),

SPL5 (dos) y SPL9 (dos) (Xiao-Meng et al., 2011). Hoy en día se sabe que una correcta

programación durante la etapa temprana del estadio de corazón resulta crucial para el

modelado del eje embrionario y del meristemo (Jenik et al. , 2007) . No obstante, el papel

que desempeñan los miARNs en la segunda etapa de la ES, es decir, durante la

transición de los estadios embriogénicos tempranos hasta la conversión completa al

estadio cotiledonar, no está clara.

En los últimos años, varios autores han estudiado el papel de miR156, miR159, miR164,

miR166, miR167, miR168, miR171, miR390, miR397 y miR398, clasificados como

miARNs conservados evolutivamente en diferentes especies, y su relación en la

modulación de genes blanco a través de su expresión diferencial en varios procesos del

desarrollo vegetativo (Rhoades, 2012). Algunos de estos miARNs regulan factores como

SEPALA TA (SPL), Argonauta (AG01) y Scarecrow-like (SCL) (Zhang et al., 201 0). Por

54

CAPITULO 111

otro lado miR159, miR162, miR164, miR390 y miR397 participan modulando la expresión

de NAC, MYB-protein, TAS3 y LACCASES (Zhang et al., 2012; Xiao-Meng et al., 2011).

Los miARNs miR160, miR166, miR167 y miR398 también participan en la regulación de

los estadios tardíos de la ES y actúan sobre los factores Auxin Response Factor (ARF's),

PHABULOSA (PHB) y LACCASES (Oh et al., 2008; Zhang et al., 2012). Finalmente, con

base en el estudio bioinformático realizado en C. canephora, en el que se determinaron

18 miARNs pertenecientes a 12 familias y 42 blancos potenciales (Nellikunnuma y

Chandrashekar, 2012) y utilizando el proceso embriogénico establecido en C. canephora

en esta investigación se estudiaron 47 miARNs como posibles candidatos de la regulación

del proceso embriogénico de esta especie.

3.2 Materiales y métodos

3.2.1 Recuperación y purificación de fragmentos pequeños (17 -25 nt) de ARN

La purificación de los fragmentos de ARN pequeños se realizó a partir de una corrida

electroforética con 25 ¡Jg del ARN de cada una de las muestras (Hj, Mp, Glo, Cor, Tor, Cot

y Cig). Posteriormente, las bandas de 17 - 25 nt fueron cortadas y colocadas en tubos

Eppendorf, triturando el gel con una varilla de vidrio en 200 !JL de agua bidestilada, hasta

obtener una mezcla homogénea. El volumen total de la mezcla fue incubada a 70 OC por

10 min, seguida de una centrifugación a 3,000 rpm por 2 min a 4 °C. Se tomó la fase

acuosa y el volumen final se llevó a 500 IJL con agua libre de ARNsas, se le adicionaron 8

!JL de glucógeno (5 mg/ml), 35 !JL de NaOAc 3 M (pH 5.2) y 900 !JL de etanol absoluto

frío. La mezcla se incubó por 1 ha -80 OC y se centrifugó a 7,000 rpm por 10 mina 4 °C.

El sobrenadante se descartó y la pastilla se dejó secar por 30 m in y se resuspendió en 1 O

¡JL de agua libre de ARNsas y almacenada a -20 OC hasta su uso.

3.2.2 Desfosforilación a partir de los fragmentos purificados de C. canephora

La reacción de desfosforilación de las muestras (Hj, Mp, Glo, Cor, Tor, Cot y Cig) se

realizó en los ARNs purificados, preparando reacciones con un volumen total de 30 IJL.

Cada mezcla se realizó a partir de 900 ng de los ARNs purificados, 1 O U/¡JL de la enzima

fosfatasa antártica (New England Biolabs, M0289S), 4 IJL del amortiguador 1 OX (Bis-tris­

propano HCI, 50 mM; i+MgCI2, 1 mM; ZnCI2, 0.1 mM; pH 6) y el volumen necesario de

55

CAPITULO 111

agua libre de ARNasas para alcanzar 30 ~L. La reacción se incubó por 60 min a 37 oc, y

se terminó inactivando la enzima a 65 oc por 5 min y finalmente almacenada a -20 oc.

3.2.3 Preparación de membranas para el Northern Blot Reveerso (NBR)

En una membrana de Nylon-N+ (GE, RPN119B) de 12 cm x 9 cm se colocaron 30 pmoles

por sonda de miARNs por cuadricula, dejándola secar a 22 ·e por 40 min . Para efectuar la

inmovilización de las sondas, las membranas fueron colocados en cuatro papeles filtros

Whatman 3 mm, humedecidas con la solución entrecruzante de acuerdo a lo descrito por

Pall y Hamilton (2008) . Se prepararon 24 mL de la solución entrecruzante por membrana

mezclando agua didestilada estéril, 500 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

(DEPC) y 245 ~L de metilimidazol12.5 M (pH 8.0). El proceso de inmovilización se realizó

agregando 12 mL de la solución entrecruzante, e iincubando 30 mina 60 oc en un horno

de hibridación. Posteriormente se añadieron 12 mL adicionales de esta solución ,

incubando 1 h a 60 oc. Finalmente, se realizaron dos lavados con agua didestilada por 60

seg cada uno, dejando secar la membrana a 20 ·e por 40 min y almacenándola a -20 ·c.

3.2.4 Análisis por NBR: marcaje radiactivo e hibridación

Una vez que las membranas fueron fijadas e inmovilizadas con la solución entrecruzante,

se procedió a la realización de la prehibridación adicionando 15 mL del amortiguador

comercial UL TRAhyb® (AM8669, Ambion) e incubándolas a 37 oc por 1.5 h. En este

tiempo se realizó la reacción para el marcaje radiactivo, mezclando 20 ~L de agua estéril,

8 ~L del amortiguador 10X T4 Poli-nucleótido Kinasa (PNK), 10 U/~L T4 PNK, 10 ~L de

ARN defosforilado y 1.5 ~L 32P-y-ATP, >7000 Ci/ mmole (-150 ~Ci/~L), incubando a 37

oc por 1 h, seguido de la in activación de la enzima T 4 PNK a 65 oc por 5 m in y 5 m in en

hielo. Una vez que se realizó el proceso de prehibridación y marcaje en la membrana, se

agregaron las muestras marcadas radiactivamente y 5 mL de amortiguador de

prehibridación UL TRAhyb® para iniciar la hibridación a 42 oc por 30 h. Después de

realizar el proceso de hibridación se desechó el amortiguador de hibridación y se

realizaron dos lavados, uno de 3 y otro de 5 min a 42 oc con 15 mL de la solución 5X

SSC/SDS [citrato de sodio/ NaCI (SSC)/0.1% dodecil-sulfato de sodio (SOS)].

Posteriormente, cada membrana fue cubierta con una película plástica (Kieen pack) y se

colocaron en un casete de exposición con dos Hyperfilm ECL (28-9068-35 GE) del

56

CAPITULO 111

tamaño de la membrana en un cuarto oscuro. La exposición se llevó a cabo por 15 días a

-80 oc, para su posterior revelado.

3.2.5 Preparación de las muestras para el análisis del Northern Blot Convencional (NBC)

El análisis mediante NBC es ligeramente diferente al descrito para el NBR. En el caso del

NBR, después de la corrida electroforética, los ARNs pequeños son cortados del gel y

purificados. Por el otro lado, para el análisis del NBC, los ARNs pequeños son

transferidos del gel a una membrana Hybond-N+.

3.2.6 Preparación de las membranas para el NBC

El proceso de electrotransferencia de los ARNs pequeños a las membranas, se realizó

primeramente equilibrando las membranas, las almohadillas Whatman de 0.25 mm y el

gel de la corrida electroforética en el amortiguador de transferencia TBE 1X por 30 min.

Dicho proceso se realizó mediante un ensamblaje en el siguiente orden, apilando las

almohadillas Whatman de 0.25 mm, la membrana Hybond-N+, el gel y almohadillas

Whatman de 0.25 mm en el equipo Simuir transblot (Biorad). Una vez que se retiró el

exceso de amortiguador de transferencia, se selló el apilamiento con una placa metálica y

se realizó la electrotransferencia por 1 h a 1 O V constantes. Una vez terminada la

electrotransferencia la membrana se dejó secar por 40 min a 22 oc. Una vez transcurrido

este tiempo, las membranas fueron fijadas con 12 mL de la solución entrecruzante como

se describió en el protocolo para NBR.

3.2.7 Marcaje radiactivo y proceso de hibridación

Las condiciones para el análisis de las membranas para el NBC son similares a la

realizada para el NBR, lo cual involucra la prehibridación , el marcaje radiactivo y la

hibridación. Las membranas fueron colocadas en los recipientes para realizar la

prehibridación adicionando 1 O mL del amortiguador UL TRAhyb® e incubando durante 1.5

h a 37 oc. Durante este tiempo se efectúo la reacción de marcaje radiactivo mezclando 12

!JL de agua bidestilada estéril , 4 !JL de amortiguador para la enzima 1 OX T4 PNK, 1 !JL de

la enzima T4 PNK, 1 !JL de la sonda del miARN (20 mM) y 1 !JL de la marca 32P-y-ATP,

>7000 Ci/mmole (-100 ¡.JCi/!JL). La mezcla se incubó a 37 oc por 1 h, 5 mina 85 oc y 5

57

CAPITULO 111

min en hielo. A continuación se realizó la prehibridación a 42 oc agregando el volumen

total de la alícuota marcada radiactivamente a la membrana en agitación por 30 h a 60 oc. Los lavados de las membranas se realizaron como se describe para las membranas del

NBR.

3.2.8 Revelado de las películas del NBR y NBC

El revelado de las películas fotográficas se realizó en el cuarto oscuro, retirando las

películas del casete y exponiéndolas a una solución reveladora (Kodak-Sigma-Aidrich

revelador 50/50% agua [v/v]) durante 5 min. A continuación las películas se lavaron con

abundante agua y se transfirieron a la solución fijadora (Kodak-Sigma-Aidrich fijador­

aclarador 50/50% agua [v/v]) por 5 min. Seguidamente, las películas se lavaron con

abundante agua y se dejaron secar por 40 min a temperatura ambiente. Posteriormente,

la película fue digitalizada con el equipo Gel Doc XR (Bio-Rad) usando una placa

intensificadora para su posterior análisis digital.

3.2.9. Análisis de la expresión relativa de los miARNs durante la ES

3.2.9.1 Síntesis del ADN complementario (ADNc) y reacción de

poliadenilación

A partir del ARN extraído (tema 2.2.3), los ARNs pequeños fueron purificados mediante

columnas NucleoSpin® miRNA. Las concentraciones fueron verificadas con un Nanodrop

(Thermo Fisher Scientific) y analizadas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al

12.5%. Posteriormente se realizó la síntesis del ADNc a partir de los miARNs utilizando el

kit Ncode® miRNA first strand cONA synthesis (lnvitrogen) , siguiendo las instrucciones del

fabricante. La poliadenilación del ARN purificado se realizó mezclando 2.5 ~g del ARNs, 5

~L de amortiguador de reacción 5X miARNs, 2.5 1..1L de MnCI2 (25mM), 1 ~L de dATP 10

mM, 1 ~L de Poly A polimerasa y agua HyPure grado biología molecular hasta un

volumen final de 25 ~L. La reacción se incubó a 37 oc por 15 m in. Para la síntesis del

ADNc se mezclaron 4 ~L del ARN poliadenilado, 1 ~L del amortiguador de alineamiento y

3 ~L de la secuencia universal RT miRNAs (25 mM); la mezcla de reacción se incubó por

5 m in a 65 oc. A continuación se adicionaron 1 O ¡.~L de 2X first-strand reaction mix y 2 ~L

de la enzima Super-Script 111 RT/ARNsa out, y se incubó por 1 h a 50 oc; la reacción se

58

CAPITULO 111

terminó incubando la mezcla a 85 oc por 5 min y las muestras se almacenaron a -20 oc.

3.2.9.2 Análisis de la expresión de los miARNs por PCR tiempo real (qPCR)

El análisis de expresión por qPCR se realizó utilizando el equipo qPCR cycler (Applied

Biosystems) y el kit Ncode<TM) qRT-PCR (lnvitrogen). Se siguieron las instrucciones

descritas por el fabricante, el ADNc sintetizado fue diluido 1:1 O con agua DEPC. Las

reacciones fueron preparadas a un volumen final de 20 IJL, mezclando 1 O IJL de syber

green qPCR mix, 0.4 IJL de los miARNs de interés (1 O mM), 0.4 IJL del sebador universal

qPCR miRNAs, 0.4 IJL de Passive reference (ROX) y 2 IJL del ADNc (1 :1 O) y 7.2 IJL de

agua tratada con DEPC. Las cond iciones de amplificación para los miARNs fueron 50 oc durante 2 m in, 95 oc durante 1 O m in y 40 ciclos a 95 oc durante 15 seg y 60 oc durante

60 seg.

3.2.9.3 Determinación de los niveles de expresión de los miARNs

El análisis para la determinación de los niveles de expresión relativa de los miARNs se

realizó estableciendo primero la eficiencia de cada miARN y de las curvas de calibración

con las secuencias snU6 y la región 5.8'S. Para determinar la cantidad adecuada de cada

miARN que se usará en el RT-qPCR, se prepararon reacciones con diferentes

concentraciones de ADNc 0.01, 0.1 , 1, 1 O y 1 00 ng en cada una de las muestras (Hj , Mp,

Glo, Cor, Tor, Cot y Cig) y se usaron como testigos de carga al 5.8'S y el snU6. La

determinación de la eficiencia se realizó utilizando la media de los datos obtenidos como

Ct (ciclo umbral) de las reacciones en la curva estándar del testigo endógeno 5.8'S y de

cada miARNs, sustituyendo dichos valores en la ecuación E = 10/\ [-1/valor de la

pendiente]. Posteriormente, para determinar las unidades relativas de expresión se aplicó

la sustitución de datos obtenidos en la ecuación R = [(EmiRNA) ñCt.miRNA] 1 [(E 5.8s) -

ñCt5.8s], en la que ~CT = Ct calibrador - Ct de la muestra ES (en la que para el Ct del

calibrador se utilizó el Ct de snU6 en las muestras de café y 5.8'S se utilizó como testigo

endógeno normalizador).

3.2.1 O Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el software Origin 8.0. Los datos para

determinar la cantidad necesaria para el RT-qPCR de cada miARN fueron obtenidos de la

59

CAPITULO 111

media de dos replicas experimentares y el análisis de expresión relativa de las muestras

problemas fue realizado por triplicado. Los valores fueron evaluados utilizando un análisis

de varianza (ANOVA), donde el grado de significancia entre el valor de las medias se

realizó con la prueba de Tukey con un 95% de confianza.

3.3 RESULTADOS

3.3.1 Análisis del patrón de expresión de los miARNs candidatos por

Northern blot reverso (NBR)

Para responder a la pregunta biológica ¿Cuál es la abundancia de los miARN en las

diferentes etapas del desarrollo embriogénico en C. canephora?, primeramente se realizó

una revisión minuciosa y exhaustiva en las bases datos y las publicaciones hasta el año

2012. Se seleccionaron 47 miARNs con características tanto conservadas como

divergentes en distintas especies vegetales, incluyendo en primera instancia los once

miARNs reportados como conservados en el proceso de la ES.

Los miARNs candidatos durante este trabajo fueron analizados a través de tres técnicas

moleculares, en el primer acercamiento se determinaron patrones de expresión y/o

represión en las muestras del proceso embriogénico de C. canephora, Hj, Mp, Glo, Cor,

Tor, Cot y Cig mediante la técnica del Northern blot reverso (NBR), a partir de estos

resultados se realizó una nueva selección de miARNs, y se determinó cuantitativamente

el patrón de expresión mediante análisis de qPCR-tiempo real. Finalmente, por medio de

la técnica del Northern blot convencional (NBC) se analizaron los patrones particulares de

expresión genética de cinco miARNs, seleccionados entre los miARNs evaluados por

qPCR-tiempo real y NBR.

El patrón de expresiónde los miARNs analizados por NBR se ilustra en el cuadro 3.1 y

muestra los patrones diferenciales de expresión obtenidos para cada miARNs durante las

dos etapas que comprende el proceso de desarrollo embriogénico en C. canephora. En

primer lugar cabe mencionar que por lo menos siete de los miARNs analizados en este

proceso (miR808, miR847t/c, miR1862, miR3623b, miR3629, miR3636 y miR5158) no

fueron detectados mediante esta técnica. Eso puede deberse a que no están presentes o

60

CAPITULO 111

que su expresión está por debajo de los límites de detección de la técnica utilizada. En

segundo lugar se determinó la presencia de una serie de miARNs de una forma

dependiente del tejido y del estadio de desarrollo. En la muestra del explante foliar, día

cero de la inducción de la ES, se detectaron los siguientes miARNs: miR154, miR156,

miR158, miR164, miR165, miR169, miR170, miR172, miR309, miR319, miR390, miR395,

miR397, miR430, miR449, miR535, miR778, miR824, miR827c, miR866 y miR2199.

Después de 21dpi, que corresponde al aislamiento de la Mp, se identificaron a los

miARNs: miR156, miR157, miR160, miR164, miR165, miR170, miR398, miR427, miR449,

miR535, miR778, miR822, miR824, miR2119 y miR3623a. Durante el inicio de la

diferenciación celular y comienzo del desarrollo de las estructuras embriogénicas (estadio

globular) se identificaron los miARNs: miR158, miR163, miR164, miR168, miR170,

miR172, miR395, miR396, miR430, miR535, miR824, miR1524, miR2119, miR2199 y

miR3623a.

Durante la etapa de desarrollo y transición de las estructuras embriogénicas, la dinámica

de expresión de los miARNs expresados fue la siguiente: durante el estadio corazón los

miARNs presentes fueron : miR154, miR156, miR157, miR158, miR159, miR160, miR163,

miR164, miR166, miR167, miR168, miR169, miR170, miR171, miR390, miR393, miR396,

miR397, miR398, miR399, miR449, miR472, miR482, miR535, miR822, miR824, miR827t,

miR866, miR1524, miR2119, miR3623a. Para la transición al estadio torpedo se

expresaron los miARNs: miR154, miR156, miR157, miR158, miR159, miR160, miR164,

miR166, miR167, miR168, miR169, miR170, miR171 , miR309, miR319, miR390, miR393,

miR396, miR395, miR397, miR398, miR399, miR472, miR482, miR535, miR827t, miR866,

miR1524, miR2119, miR3623a. Para el estadio cotiledonar se detectó la expresión de los

miARNs: miR156, miR157, miR158, miR159, miR160, miR164, miR166, miR167, miR168,

miR170, miR171 , miR172, miR309, miR319, miR390, miR393, miR397, miR398, miR396,

miR472, miR482, miR535, miR778, miR822, miR827t, miR1524, miR2119. Finalmente, en

los embriones cigóticos se detectó la expresión de los miARNs: miR154, miR156, miR157,

miR158, miR164, miR165, miR166, miR167, miR169, miR390, miR398, miR399, miR427,

miR472, miR535, miR778, miR2119, y miR3623a.

La evaluación de las dos etapas del proceso embriogénico en C. canephora permitió

determinar la dinámica de la expresión de los miARNs. En el explante foliar usado para la

61

CAPITULO 111

inducción de la ES se expresan 21 miARNs; 21 dpi se detectaron 16 miARNs y al inicio de

la diferenciación celular y establecimiento de los primeros embriones globulares se

detectó la expresión de 15 miARNs. En los estadios Cor, Tor y Cot, se determinó la

expresión de entre 27 y 30 miARNs. También se pudo determinar que hay diferencias

entre los embriones cotiledonares cigóticos y somatícos, pues en los primeros se detectó

la expresión de 18 miARNs, en lugar de los 30 detectados en los somáticos. Estos datos

sugieren la presencia de una dinámica en la expresión de los miARNs durante el proceso

de embriogénesis y permite resaltar las diferencias en los niveles de expresión entre los

dos procesos, el somático y el cigótico.

Los miARNs identificados durante su expresión en la ES fueron agrupados en tres clases,

respecto a los criterios considerados en la etapa de selección, en el primer grupo miARNs

conservados evolutivamente y con funciones regulatorias en la ES de las especies M.

truncatula , L. leptolepis, D. Logan, O. Sativa y V. orange, en tanto que en la segunda

clase se agruparon a los miARNs reportados en los últimos años como miARNs que

participan en la regulación del estrés in vitro, sistemas de micropropagación vegetal y

maduración del embrión cigótico. En la tercera clase se agruparon a los miARNs que

regulan diferentes extremos ambientales en an imales y que por primera vez fueron

analizados durante el proceso de la ES en esta investigación (Cuadro 3.2)

62

CAPITULO 111

Cuadro 3.1 Resultados de expresión cualitaivos por Northern blot reverso. Presencia (+) ausencia (-) de expresión en los miARNs evaluados durante el proceso embriogénico en C. canephora. miARNs conservados (azul) , miARNs implicados en la maduración del embrión cotiledonar y en el estrés in vitro (verde), miARNs candidatos para el proceso de ES (naranja). Masa pro-embriogénica (Mp), embrión globular (Gio) , embrión corazón (Cor), embrión torpedo (Tor) , embrión cotiledonar (Cot) y embrión cigótico (Cig).

miARN Hoja Mp Glo Cor Tor Cot Cig m1 R156 + + - + + + + miR159 - - - + + + -miR160 1 - + - + + + -miR164 1 + + + + + + + miR165 + + - - - - + miR166 - - - + + + + miR167 1 - - - + + + + miR168 1 - - + + + + -miR169 + - - + + - + miR171 - - - + + + -miR172 1 + - + - - + -miR319 1 + - - - + + -miR390 1 + - - + + + + miR393 - - - + + + -miR397 + - - + + + -miR398 1 - + - + + + + miR824 + + + + - - -miR157 - + - + + + + miR396 1 - - + + + + -miR309

1 + - - - + + -

miR427 1 - + - - - - + miR430 1 + - + - - - -miR482 1 - - - + + + -miR535 1 + + + + + + + miR154 - + + + + + -miR158 1 + - + + + + + miR163 - - + + - - -miR170 + + + + + + -miR395 1 + - + - + - -miR399 1 - - - + + - + miR449 1 + + - + - - -miR472 1 - - - + + + + miR778 1 + + - - - + + miR822 1 - + - + - + -miR827t 1 + - - + + + -miR866 1 + - - + + - -miR1524 1 + - - + + - + miR2119 1 - + + + + + + miR2199 + - + - - - -

miR3623a - + + + + - +

63

CAPITULO 111

Cuadro 3.2. Clasificación general de los miARNs presentes durante el proceso embriogénico en C. canephora y analizados por NBR.

Clasificación de los miARNs en C. canephora Hoja Mp Glo Cor Tor Cot

Conservados evolutivamente y reguladores de la ES 8 5 3 13 14 14

Regulan el estrés in vitro y maduración embriogénica 4 4 4 5 5 5

Modulan la respuesta a diferentes extremos ambientales y no han sido reportados en la 9 7 8 13 11 8 e m briogénesis

Total 21 16 15 31 30 27

3.3.2 Determinación de los patrones de expresión por RT-qPCR de 16

miARNs en tejidos embriogénicos de C. canephora

Cig

8

3

7

18

Del análisis de los reportes realizados hasta el momento y del acercamiento experimental

descrito en esta investigación, es clara la participación de los miARNs durante la

inducción y el desarrollo de la ES. Además, con el fin de profundizar y ampliar este

conocimiento durante las fases de inducción y la formación del embrión cotiledonar, se

realizó un análisis más detallado de la presencia de los miARN para determinar su

panorama global durante estos procesos, con base en la primera aproximación obtenida

por NBR.

Con base en los patrones de expresión de los miARN durante estos procesos biológicos,

se realizó la selección de 16 miARNs para la determinación de los patrones de expresión

por RT-qPCR. El grupo de miARNs analizados durante esta etapa incluyó inicialmente a

miR156, miR159, miR164, miR166, miR167, miR168, miR171 , miR390, miR393, miR397

y miR398 que se han reportado como miARN conservados y ejerciendo funciones tejido­

específico en la ES de V. orange, también intervienen en la regulación de la maduración

de los embriones cigóticos. Subsecuentemente, se agregaron tres miARNs a esta lista,

los miR157, miR482 y miR535, ya que miR157 se expresa desde Mp, hasta el Cot;

miR482 se expresa en los estadios Cor, Tor y Cot, en tanto que miR535 se expresa en

todo el proceso embriogénico, así como en el embrión cigótico de C. canephora. Es

interesante mencionar que la expresión de estos miARNs también ha sido reportada en

64

CAPITULO 111

procesos de micropropagación masiva y estrés in vitre . Finalmente los miR1524 y

miR2119, analizados previamente por NBR, también fueron considerados ya que se

expresan en la mayor parte del proceso embriogénico y este es el primer trabajo en el

cual, a estos miARN se les ha evaluado como reguladores de la expresión genética

durante la ES, pues particularmente solo se les ha relacionado con el desarrollo radicular.

Para la determinación por RT-qPCR de los 16 miARNs seleccionados, en el orden

anteriormente descrito, se realizó la calibración descrita en materiales y métodos

empleando como testigos internos la expresión de los genes 5.8'S y snU6. También se

determinó la eficiencia del ensayo, mediante el análisis sobre rango dinámico y la

precisión del ensayo realizado para cada miARNs (Anexo 1 ). Los valores obtenidos para

la eficiencia fueron del 86 y 98%, respectivamente.

El análisis de los patrones de expresión de los miARNs conservados: miR156, miR159,

miR164, miR166, miR167, miR168, miR171 , miR390, miR397 y miR398, durante la ES de

C. canephora mostró cierto comportamiento tejido-específico. Durante el análisis en la

etapa inicial del proceso embriogénico se evaluó la expresión de los miARN en explante

foliar, considerado como el día O de la inducción embriogénica. Claramente hay una

diferencia en la expresión de los miR164, miR390 y miR397 (Figuras 3.1 y 3.2). La

expresión más abundante en la de miR390 (2.5 URE) y las expresiones más bajas para

miR164 (0.5 URE) y miR397 (0.2 URE). En la Mp, aislada del explante en el día 28 del

proceso embriogénico, sólo se encuentra presente m iR 164 (1 .0 URE); este miAR N se

expresa más abundantemente en la Mp que en el tejido foliar. Durante la fase de embrión

globular miR164 aumentó (1.75 URE), en tanto que miR168 (0.6 URE) se expresa en

niveles muy bajos (Figuras 3.1, 3.2).

Durante el estadio de Cor se determinó que hay una abundante expresión de miR397 (2.5

URE), miR390 (2.35 URE), miR166 (2.0 URE), miR171 (2 .0 URE). La expresión de

miR168 (1.4 URE), miR393 (1.6 URE) fue intermedia, y para los siguientes miARNs fue

mínima: miR164 (1.0 URE), miR159 (1.0 URE), miR167 (0.9 URE) y miR156 (0.2 URE).

Para el estadio Tor se observó la expresión abundante de miR390 (2.75 URE), miR398

(2 .25 URE), miR159 (2.0 URE) y miR171 (2.0 URE); expresiones intermedias para

miR393 (1.7 URE), miR166 (1 .5 URE), miR167 (1 .0 URE) y miR168 (1 .0 URE) y una

expresión mínima para miR397 (0.4 URE), miR156 (0.5 URE) y miR164 (0.75 URE). Para

65

CAPITULO 111

la transición Tor-Cot se identificaron expresiones abundantes de miR171 (2. 75 URE) y

miR390 (2.5 URE), expresiones intermedias para miR393 (1.8 URE), miR398 (1 .75 URE),

miR167 (1.4 URE) y miR166 (1.25 URE) y expresiones menores para miR164 (1 .0 URE),

miR159 (1.0 URE), miR168 (0.9 URE), miR156 (0.4 URE) y miR397 (0.4 URE). En el caso

del embrión cigótico se determinó que la expresión fue abundante para miR390 (2.35

URE) y miR164 (2.0 URE), intermedia para miR167 (1.1 URE) y menor para miR156 (0.2

URE) (Figuras 3.1 y 3.2) .

El análisis de los patrones de expresión de los miARNs miR157, miR482, miR535,

miR1524 y miR2119 durante el desarrollo de la ES, mostró niveles marcadamente

diferenciados (Figura 3.3) . Durante el explante correspondiente al día cero, se observaron

expresiones abundantes en miR535 (2.20 URE) y miR1524 (2.35 URE}, en tanto que en

el día 28 dpi correspondiente a la Mp, se observarán expresiones intermedias en miR157

(1.18URE) y miR2119 (1 .30 URE}, y minima para miR535 (0.9 URE). Para el desarrollo

del primer estadio embriogénico (Gio) , miR535 (2.20 URE) fue abundante respecto a

miR2119 (1.0 URE) con una expresión intermedia, necesarios para la diferenciación de

este estadio. No obstante, para la transición de los estadios embriogénicos Cor, Tor y Cot

la dinámica entre estos miARNs mostrarán que durante el estadio Cor, miR1524 (2.1

URE) se expresa en mayor abundancia respecto a miR535 (0.25 URE), miR482 (0.8

URE), miR157 (1.0 URE) y miR2119 (1 .9 URE). Durante la transición para el estado Tor,

miR1524 mantuvo su expresión , en tanto que miR482 (2.0 URE}, miR157 (1.20 URE) y

miR535 (0.5 URE) aumentaron su abundancia, en tanto que para miR2119 (1 .1 URE)

disminuyo. Finalmente durante el estadio Cot, la mayor abundancia se presento en

miR157 (2.0 URE), miR535 fue constante y miR482 (0.75 URE), miR1524 (1.75 URE) y

miR2119 (0.3 URE) disminuyendo significativamente. Sin embargo, durante el estadio

cotiledonar cigótico (Cig) se observó la expresión de miR1524 (2.25 URE), miR535 (2.0

URE}, miR157 (1.25 URE) y miR2119 (1 .2 URE).

De acuerdo con los patrones de expresión obtenidos en los siete tejidos analizados en el

proceso embriogénico de C. canephora , los miARNs analizados fueron agrupados

finalmente en tres clases: los miARNs que intervinieron en la primera etapa de inducción

embriogénica (Hj , Mp, Glo) (miR164, miR168, miR390, miR397, miR157, miR535, miR154

y miR2119), los miARNs que ejercieron cierta regulación durante el proceso de transición

66

CAPITULO 111

embriogénica (Cor, Tor, Cot) (miR156, miR159, miR164, miR166, miR167, miR168,

miR171 , miR390, miR397, miR398, miR397, miR157, miR482, miR535, miR1524 y

miR2119) y finalmente los que encontraron durante el estadio Cig (miR164, miR390,

miR156, miR167, miR157, miR535, miR154 y miR2119} , presentando expresiones

minimas, intermedias, abundantes o ausentes en el curso temporal de la ES en C.

canephora (Cuadro 3.3) .

Cuadro 3.3 Patrones de expresión cuantitativa (qPCR-tiempo real) minimas (+), intermedias(++), abundantes (+++) y ausentes (ND) durante el proceso embriogénico de Coffea canephora.

miARNs Hoja Masa pro-

Globular Corazón Torpedo Cotiledonar Cigótico embrigénica

miR156 ND ND ND + + + +

miR159 ND ND ND + +++ ++ ND

miR164 + + ;H + + ++ +++

miR166 ND ND ND +++ ++ ++ ND

miR167 ND ND ND + ++ ++ ++

miR168 ND ND + ++ ++ + ND

miR171 ND ND ND +++ +++ +++ ND

miR390 +++ ND ND +++ +++ +++ +++

miR393 ND ND ND ++ ++ ++ ND

miR397 + ND ND +++ + + ND

miR398 ND ND ND ++ +++ ++ ND

miR157 ND ++ ND ++ ++ +++ ++

miR482 ND ND ND + +++ + ND

miR535 +++ + +++ + + + +++

miR1524 +++ ND ND +++ +++ ++ +++

miR2119 ND ++ ++ ++ ++ + ++ Valores cuant1tat1vos de la Unidades Relat1vas de Expresión (URE): (+) 0.01 - 0.99 URE, (++) 1.0 - 1.99 URE, (+++) 2.0 - 3.0 URE

67

CAPITULO 111

miR156 ..

o.urrollo embtlog6nle0 <10 c . canepltOr•

a.s miR164

•

"' ::0

Desarrollo mb11Q06nleo ele c . canephora

miR167 2,0 ,.. ••• ·~ t.2

&! 1,0

::011,8

1).<1

~

u o

Hj" Hj Mp Glo COt TOf COl Clg

o. .. I'I'OIIo •mbl1ogjnlco <10 C. c•IH>phora

2 ,S

2 ,0

1.1

... "' ::0

1 .0

o,s

o.o

1,0

1,$

"' "' ::0

0,5

O, O

1,11

1,-• . ... 1,2

1,0 111

"' 0,1 ::0

O,t

o 0,2

o,o

m iR159

•

Hj' Hj Mp Olo Cor Tor Cot Clg

OHarroJio embrlogtnleo de c. canaphor•

miR166 *

miR168

l,.,

DH•rrollo embrlogtnlco <10 C. can phora

Figura 3.1. Niveles relativos de expresión de los miARNs conservados en el sistema embriogénico de C. canephora. La expresión relativa (URE) se calculó con base en la .relación [(E miRNA) ACt. miRNA] 1 [(E5.8S) ACt.5.8S]. Para la cual se usaron los valores obtenidos en el análisis de eficiencia de PCR (E), ciclo de la PCR en el que se detecta el producto (Ct) y el gen de referencia (5.8'S). El nivel de expresión snU6 en hoja (Hj*) fue utilizado como normalizador para los miR156, miR159, miR164, miR166, miR167 y miR168. Los asteriscos indican la diferencia significativa de cada miARNs respecto a las muestras analizadas, mediante el análisis estadístico de ANOVA y prueba de Tukey >0.05 error.

68

CAPITULO 111

miR171 miR39 0

miR 393 m R3 97

m iR398

Figura 3.2. Niveles relativos de expresión de miARNs conservados en el sistema embriogénico de C. canephora. La expresión relativa (URE) se tomaron con base en la relación = [(E miRNA) .óCt miRNA] 1 [(E5.8S) .óCt.5.8S]. Para la cual se necesitaron los valores obtenidos en el análisis de eficiencia de PCR (E), ciclo de la PCR en el que se detecta el producto (Ct) y el gen de referencia (5.8'S). El nivel de expresión de snU6 en hoja (Hj*) fue utilizado como normalizador para los miR171 , miR390, miR393, miR397 y miR398. Los asteriscos indican la diferencia significativa de cada miARNs respecto a las muestras analizadas, mediante el análisis estadístico de ANOVA y prueba de Tukey >0.05 error.

69

CAPITULO 111

2.5

U.l 1.5 a:: '::)

o.s

miR157

.Hj" Hj Mp Glo Cor Tor Cot Clg DHarrollo embriogénico de C. canephora

miR535

Hj• Hj: Mp Gto Cor Tor Cot Cig Desarrollo ombrlog6nlco do C. canophora

2 ,1)

1·1·

1,1 1,4

~ u ::::) 1,1>

m iR482

·*

Hj• Hj Mp Glo Cor Tor Cot Cig Desarrollo embriogénico de C. canephora

mi R1524

Hj• Hj Mp Glo Cor Tor Cot. Cig Oe&arrollo embrlogénl<:o ele c. eaMphor<~

miR21 19

Hj* Hj: Mp Glo Cor Tor Cot Cig Desarrollo embriogénico de C; canephora

Figura 3.3. Niveles relativos de expresión de miARNs divergentes en el sistema embriogénico de C. canephora. La expresión relativa (URE) se tomaron con base en la ·relación = [(E miRNA) t.Ct .miRNA] 1 [(E5.8S) t.Ct.5.8S]. Para la cual se necesitaron los valores obtenidos en el análisis de eficiencia de PCR (E), ciclo de la PCR en el que se detecta el producto (Ct) y el gen de referencia (5.8'S). El nivel de expresión snU6 en hoja (Hj*) fue utilizado como normalizador para los miARNs relacionados al estrés in vitro y maduración embriogénica miR157, miR482, miR535 y los miARNs reguladores de estreses ambientales ex vitro miR1524 y miR2119. Los asteriscos indican la diferencia significativa de cada miARNs respecto a las muestras analizadas, mediante el análisis estadístico de ANOVA y prueba de Tukey >0.05 error.

70

CAPITULO 111

3.3.3 Análisis de patrones de expresión semi-cuantitativos por Northern Blot

Convencional (NBC)

A través de la obtención de los datos experimentales sobre los patrones de expresión

parcial por NBR y las expresiones cuantitativas analizadas por RT-qPCR hemos

identificado el papel de los miARNs durante el proceso embriogénico, sin embargo, para

obtener el análisis completo de los miARNs, fue necesario el análisis semi-cuantitativo

mediante NBC. Es decir, a partir de los patrones de expresión identificados por NBR y el

análisis cuantitativos mediante RT-qPCR en los cuales se utilizaron las mismas sondas,

se realizó la selección individual de los miARNs: miR157, miR164, miR166, miR535 y

miR2119 para la validación experimental mediante la hibridación por Northern blot

convencional, con la secuencias de las sondas antisentido marcadas radiactivamente con

[32P] ATP, proporcionando de esta manera el análisis detallados en por lo menos los cinco

miARNs evaluados por las tres técnicas durante el proceso embriogénico de C.

canephora .

Los resultados obtenidos mediante esta técnica mostraron que los niveles de expresión

de miR157 durante el desarrollo embriogénico de C. canephora son abundantes en los

estadios torpedo (Tor) , cotiledonar (Cot) y en el embrión cigótico (Cig) muestran una baja

expresión en la masa pro-embriogénica (Mp) y el estadio de corazón (Cor). También se

determinó que este miARNs no se expresa en el estadio globular (Gio) y el explante foliar

que representa el día cero de la inducción embriogénica (Hj) . Al mismo tiempo miR164 se

expresó durante todo el proceso de la ES; sin embargo, se expresó preferencialmente en

la Mp y en el estadio de Cor, y presenta una expresión constante en los estadios

embriogénicos Glo, Tor, Cot y en el embrión Cig . El miR166 solo se expresa en los

estadios Cor, Tor y Cot y no lo hace en el resto de los tejidos analizados. Por su parte

miR535 se expresó mayormente en Hj y el estadio Glo, en tanto que se expresó en

niveles muy bajos en los estadios Tor y Cot y mientras que su expresión fue constante en

los estadios Mp, Cor y en el embrión Cig. miR2119 se expresó en la Mp, y su mayor

expresión fue en el estadio de Cor, en tanto que su minina expresión se dio en los

estadios Glo y en el embrión Cig, su expresión fue constante en la Mp y en los estadios

Tor y Cot (Figura 3.4) .

Finalmente mediante la comparación de los patrones de expresión de los miARN

71

CAPITULO 111

analizados semi-cuantitativamente, pudimos corroborar el patrón de expresión obtenido

por RT-qPCR de los miR157, miR164, miR166 , miR535 y miR2119 (Figuras 3.1, 3.2 y

3.3), puntualizando que las expresiones analizadas semi-cuantitativas fueron comparadas

con el testigo de carga del ARN nuclear U6 (snU6).

miARNs Gl.o Cor Tor Cot

miR157

miR164

mi-R166

miR535

miH2119

snU6

Figura 3.4. Detección de los miARNs utilizando el análisis Northern blot convencional durante la ES de C. canephora. El análisis de las muestra se realizó por hibridación con sondas correspondientes a miR157, miR164, miR166, miR535, miR2119 marcadas radiactivamente con fosforo [32P] A TP y una exposición de 20 dí as a -80°C. Los tej idos analizados corresponden a hoja (Hj) , masa pro-embriogén ica (Mp), estadios globular (Gio) , corazón (Cor), torpedo (Tor) y cotiledonar somático (Cot) asf como embrión cigótico cotiledonar (Cig), comparados con control de carga snU6.

3.4 Discusión

Hasta la fecha , se han identificado numerosos precursores y secuencias maduras de

miARNs en diversas especies de plantas (www.miRBase.com) . La comprensión sobre la

funcionalidad de los genes, a través de la regulación de los miARNs, depende hoy en día

de la disponibilidad de estrategias innovadoras y del enfoque biológico de la investigación ,

(Jin et al. , 201 0). Actualmente, se han desarrollado diversas metodologías con el objeto

72

CAPITULO 111

de establecer una vía sensible y específica para la detección en el genoma de todos los

miRNAs presentes en las plantas. Los métodos más utilizados para la identificación y la

validación de los miARNs, implican la clonación directa de secuencias maduras de los

miARNs, RT-qPCR cuantitativo, secuenciación masiva y los métodos basados en la

hibridación de sondas por Northern blot, hibridación in situ y microhileras (Eidem et al.,

2013; Jin et al., 201 O).

En conjunto, estas metodologías han generado evidencias sobre la abundancia de los

miARNs durante procesos bilógicos como el ciclo celular, el desarrollo vegetativo y la

respuesta de la plantas ante diversos extremos ambientales; además, estos métodos han

conducido en gran parte a la identificación de los miARN y el destino funcional que estos

ejercen en el nivel de expresión del ARNm, representando así una valiosa información

sobre las funciones de los miARN reportados hasta el momento (Eidem et al. , 2013;

Zhang et al., 2005). En este trabajo, considerando las ventajas e inconvenientes de las

metodologías para la identificación y validación de miARNs, se emplearon las

metodologías basadas en la hibridación de sondas por Northern blot reverso y Northern

blot convencional, así como el análisis cuantitativo por RT-qPCR, con las cuales se

obtuvo una aproximación sobre los patrones de expresión de los miARNs durante la ES

de C. canephora,

En este estudio se identificarán 40 miARNs en los siete tejidos estudiados de C.

canephora. Los patrones de expresión indicán una importante dinámica durante las dos

etapas que conlleva el proceso de la ES (Cuadro 3.1 ). Los patrones de expresión

observados durante el inicio de la inducción, la diferenciación celular y la transición

embriogénica utilizando NBR permitieron observar los patrones de expresión de miARNs

conservados y divergentes (Rhoades, 2012; Zhang et al., 2006a), analizados por primera

vez durante este proceso embriogénico (Cuadro 3.2). Este primer acercamiento permitió

realizar una analogía respecto a los miARNs que han sido reportados en la ES a partir de

callo embriogénico de V. orange (Xiao-Meng et al., 2011) , L. leptolepis (Zhang et al.,

2010; Zhang et al., 2012), D. logan (Lin y Lai, 2013), así como de los embriones de P.

teada aislados durante la embriogénesis somática directa de esta especie (Oh et al.,

2008).

Entre los miARNs analizados hay ciertos miARNs que se expresaron notablemente

73

CAPITULO 111

durante los estadios que comprende la ES y el embrión Cig, en particular miR164 y

miR535. miR164 ha sido ampliamente estudiado en el desarrollo de brotes, meristemos

apicales, plasticidad celular y senescencia de las hojas (Raman et al., 2008; Rubio­

Somoza y Weigel, 2011), en tanto que miR535 ha sido estudiado durante el estrés in vitro,

el desarrollo de cultivos de la manera convencional y la micropropagación (Li et al., 2009;

Mica et al., 2009). Otros miARNs, como miR1524 y miR2119, sólo habían sido reportados

durante el desarrollo del sistema radicular (Lelandais-Briére et al., 2009; Subramanian et

al., 2008). Durante este estudio, estos miARNs se expresaron en las fases de transición

embriogénica, diferenciación celular e inducción de la ES, lo que sugiere que

posiblemente estos miARNs tienen otra función biológica. Otros de los miARNs

ampliamente estudiados en varias especies vegetales han sido miR168 y miR396, al

primero se le ha relacionado en el proceso de maduración de los embriones (Mica et al. ,

2009), y miR396 con la proliferación celular (Rodríguez et al., 201 O). En este trabajo se

demostró que estos miARNs se expresan durante el desarrollo de las estructuras

embriogénicas Glo, Cor, Tor y Cot.

Hasta el momento, la expresión de los miARNs analizados en la ES en L. /eptolepis y V.

orange, ha mostrado la expresión de un grupo de 11 miARNs durante el proceso de la ES

indirecta (Zhang et al., 2012; Xiao-Meng et al. , 2011 ). En C. canephora se determinó la

expresión de miR156, miR159, miR166, miR167, miR171, miR390, miR397 y miR398

durante el desarrollo y transición de las estructuras de Cor, Tor y Cot. La expresión de

miR157, miR160, miR393 y miR482 durante estas mismos estadios de la ES sugiere la

participación de miARNs divergentes, a los que se les ha relacionado recientemente con

estreses in vitro (Nonogaki, 201 O; Si-Ammour et al., 2011; Li et al. , 201 O; Rhoades, 2012) .

La expresión de miR309 se ha relacionado con la programación celular (Bushati et al. ,

2008) y la expresión de miR319 con el desarrollo de semillas, hojas, así como a los

extremos de sequia y salinidad (Schommer et al. , 2008; Ori et al., 2007) .

Sin duda, es un panorama muy interesante y ciertamente muy complejo, sin embargo, con

la cuantificación de los miARNs: miR154, miR156, miR157, miR159, miR164, miR166,

miR167, miR168, miR171, miR390, miR393, miR397, miR398, miR482, miR535, miR1524

y miR2119, se expuso un panorama más detallado de la interacción entre los miARNs que

intervinieron en la regulación de la ES tanto de los conservados, como de los divergentes

74

CAPITULO 111

(Figura 3.1), estos últimos poco relacionados con el proceso de ES (Figuras 3.2 y 3.3) ,

pero esenciales para el desarrollo correcto de la ES en C. canephora.

El análisis cuantitativo de estos miARNs, durante los diferentes estadios del proceso

embriogénico, puso en evidencia la presencia de los patrones de expresión de miARNs

necesarios para el desarrollo y regulación de la respuesta de los explantes sometidos al

proceso de inducción embriogénica. Este análisis mostró que hay una baja expresión de

miR164 y miR397, y expresiones abundantes para miR390, miR535 y miR1524.

Indudablemente cada nivel de expresión desempeña un papel clave en la inducción de la

ES; por ejemplo, la expresión de miR164 en A. thaliana regula las concentraciones de

auxinas en la planta, así como la respuesta a etileno y por lo tanto, probablemente, se

encuentra regulando la respuesta al daño mecánico a través de la regulación

transcripcional de NAC1 y ORE1 los que a su vez regulan el proceso de senescencia

foliar (Kim et al. , 2009). miR397, el cual se expresa en bajos niveles, dirige las primeras

repuestas del explante a través de modulación de Lacease (Meng et al., 2012; Axtell y

Bartel, 2005), en tanto que miR390, que regula post-transcripcionalmente la biogénesis de

los elementos actuando en trans, siARNs TAS3, interrumpiendo y degradando el ARNm

que proviene de los genes que codifican para enzimas de la síntesis de auxinas, está

relacionado con miR164 como posible ca-regulador en la concentración de las auxinas

presentes en el tejido foliar (Zhang et al. , 2006b).

Los eventos involucrados en la diferenciación celular de la Mp a Glo, muestran la

dinámica en los niveles de expresión para regular el desarrollo y la competencia celular, a

través de una baja expresión de miR164 y miR535 y una expresión elevada de miR157 y

miR2119 en el desarrollo de la Mp. Durante la formación de la forma esférica y textura lisa

que caracteriza al estadio Glo, los niveles de expresión de miR164 y miR535 aumentaron,

al mismo tiempo que se reprime la expresión de miR157 y mantiene los niveles de

expresión de miR168 y miR2119 a un mínimo. Esta dinámica de regulación y

desregulación entre los miARNs se puede relacionar con las funciones regulatorias

reportadas para los factores CUC1 mediante una baja expresión de miR164. De esta

manera se regula la plasticidad y la diferenciación celular (Rubio-Somoza y Weigel, 2011).

Por su parte, miR157 que ejerce un papel clave sobre la Mp, ha sido funcionalmente

caracterizado en la vía de señalización para inducir el desarrollo embriogénico, mientras

75

CAPITULO 111

que miR168, el cual interviene en la regulación de los factores de respuesta a auxinas

(ARF's) (Kou et al., 2012; Qiao et al. , 2012) , se expresa en niveles altos en C. canephora.

No cabe duda que la regulación ejercida por estos miARNs marcan un papel fundamental

durante el proceso de la diferenciación celular, sin embargo, nuestros resultados no

coinciden en su totalidad con lo reportado durante la ES de V. orange (Xiao-Meng et al.,

2011), L. lepto/epis (Zhang et al., 2012) y O. sativa (Chen et al., 2011) , en particular la

participación de miR156, miR168 y miR171 en la inducción del callo embriogénico, así

como la expresión de miR166, miR167 y miR398 durante la formación del estadio Glo.

Alagunas de estas diferencias podrían estar determinadas por el tipo de explante y la vía

embriogénica utilizada, pues se ha reportado que el tipo de embriogénesis, las

características fenotípicas y el origen del explante influyen en los patrones de expresión

durante la diferenciación celular y el desarrollo de las estructuras embriogénicas (López­

Gómez et al. , 201 O; Nassuth et al. , 1980).

Durante el desarrollo de la segunda etapa de la ES, la expresión cuantitativa de los

miARNs: miR156, miR157, miR159, miR164, miR166, miR167, miR168, miR171 , miR390,

miR393, miR397, miR398, miR482, miR535, m iR 1524 y miR2119 mostraron patrones de

expresión diferentes a partir del desarrollo del embrión Glo y el proceso de transición a los

estadios Cor, Tor y Cot. La regulación ejercida por los miARNs durante esta transición ha

sido estudiada en las especies V. orange, D. logan, L. leptolepis, P. teada y O. sativa, en

los cuales se determinó que existe una regulación diferencial de los miARNs involucrados

en la transición embriogénica del estadio Glo al estadio Cot (Xiao-Meng et al. , 2011 ; Lin y

Lai , 2013; Zhang et al. , 2012; Oh et al. , 2008; Zhou et al. , 2010) . En C. canephora esta

dinámica comprendió principalmente niveles de expresión relativamente abundantes para

los miR390 y miR171 , así como niveles mínimos de expresión para miR156 y miR535.

Este patrón de regulación fue similar al reportado previamente para V. orange y P. teada

en los cuales se observaron una expresión abundante de miR390 y miR171 y bajos

niveles de expresión para m iR 156 durante el proceso de transición y desarrollo del

embrión cotiledonar, permitiendo de esta manera una detallada programación para

degradar dinámicamente el ARNm que codifican a los receptores tipo cinanas (RLK) y

TAS3 mediante la acción de miR390, SCL a través de miR171 y SBPy SPL regulados por

m iR 156 (Xiao-Meng et al. , 2011 ; Oh et al., 2008).

76

CAPITULO 111

Un segundo tipo de relación, es la que muestran los miARN, miR166, miR393, miR398 y

m iR 1524, los que se expresan mayormente durante el desarrollo de los primordios

cotiledonares que caracteriza al estadio Cor y una expresión baja durante la transición y el

desarrollo del estadio Cot. Estos resultados son similares a los reportados para miR166,

miR393 y miR398 en D. Logan y L. Jeptolepis, y conforme se van desarrollando los

embriones estos miARNs ejercen una amplia regulación sobre los factores

transcripcionales y genes como APL2 y HD-Zip 111, particularmente por miR166, en tanto

que la expresión de F-box, NF-YC11 y TIR1 es regulada por miR393 y la de la Cu/Zn

superoxide dismutase es regulada por miR398, esto garantiza la transición del estadio Cor

al Cot (Un y Lai , 2013; Zhang et al. , 2012) , Por el contrario, esta relación en la expresión

de los miARNs, durante la transición embriogénica en V. orange es distinta, ya que

durante el desarrollo del estadio globular la expresión de los miARNs se encuentra en

mínimo y alcanzan un máximo durante el desarrollo del embrión cotiledonar (Xiao-Meng et

al. , 2011).

Un tercer tipo de patrón de expresión detectada durante la transición embriogénica fue la

mostrada por los mi ARNs, miR164, miR159 y miR482. La expresión de estos miARNs es

mayor durante el estadio Tor y bajo durnate los estadios de Cor y Cot. Los miANRs,

miR397, miR168 y miR2119 se expresan en mayor abundancia en el estadio de corazón y

la disminuyen durante el desarrollo del embrión Cot, por el contrario los miARNs, miR167

y miR157, se expresan abundantemente en el este estadio. Esta dinámica en la expresión

de los miARNs en C. canephora también se ha determinado en V. orange, P. teada y L.

leptolepis para los miARNs, miR157, miR159, miR164, miR167, miR168 y miR397 (Xiao­

Meng et al. , 2011 ; Oh et al. , 2008; Zhang et al. , 2010 ; Zhang et al., 2012).

Los miARNs, miR482, miR535, m iR 1524 y miR2119, analizados por primera vez en este

proceso embriogénico, y que previamente se les ha relacionado con los sistemas de

propagación vegetativo (U et al. , 2009) y el desarrollo del sistema radicular (Subramanian

et al., 2008; Lelandais-Briére et al. , 2009) , se les puede relacionar con la regulación de

algunos de los estadios embriogénicos.

Considerando la dinámica diferencial en la expresión de los miARNs, miR156, miR157,

miR164, miR167, miR390, miR535, miR1524 y miR2119, evaluados cuantitativamente

durante la ES de C. canephora y dada la estrecha semejanza que se presenta entre el

77

CAPITULO 111

desarrollo del embrión somático y la del embrión cigótico, podemos especular que hemos

ampliado nuestra visión sobre la regulación de los miARNs involucrados en la ES y la

regulación del desarrollo del embrión cigótico.

Se ha reportado que en el embrión Cig miR164 regula el desarrollo de los meristemos a

través del control de NACS; también se ha sugerido activa la participación de las auxinas

en el desarrollo vegetativo (Rubio-Somoza y Weigel, 2011 ; Raman et al. , 2008). Por su

parte, miR390 y miR167 son reguladores del desarrollo cotiledonar cigótico, y esta función

se ha relacionado con funciones regulatorias en la división celular mediante la modulación

de los receptores tipo cinasas (RLK) y AUX/AIA (Marin et al. , 2010; Sunkar et al. , 2005).

Por otra parte, m iR 156 y m iR 157 son reguladores de la cascada de señalización en el

desarrollo embriogénico, como lo son SPL y la Squamosa Promoter binding Protein

(SBP), los cuales están implicados en la transición embriogénica y en el desarrollo de

hojas. Los miARNs, miR535, miR1524 y miR2119, que son reportados por primera en

esta investigación se expresan diferencialmente en la mayor parte del proceso

embriogénico estudiado. Finalmente, el estudio de los miARNs, miR157, miR164, miR166,

miR535 y miR2119 en el proceso de ES (Figura 3.4), mostró que participan en la

regulación del proceso embriogénico.

En suma, se ha generado una base sólida para la comprensión funcional y el papel que

juegan en la regulación estos miARNs durante el proceso embriogénico de C. canephora.

Pues aunque esta técnica es ampliamente utilizada para la caracterización de los

miARNs, mayormente se ha utilizado para comprobar funciones específicas de miARN

relacionados con extremos de salinidad y sequia (Zhao et al., 2009; Tran, 2009; Pall y

Hamilton, 2008). En esta investigación se probó que la expresión ·de miR166 en los

estadios Cot y Cig de P. teada (Oh et al. , 2008), muestra exactamente el mismo patrón

que en C. canephora. También podemos concluir que las diferencias en la expresión

temporal de algunos miARNs, como miR164 y miR535, juegan un papel importante en la

inducción de la ES, m iR 157 y miR2119 son esenciales para el proceso de

desdiferenciación y diferenciación celular, en tanto que la expresión de miR166 es

necesaria para el desarrollo temprano y transición entre los estadios de Cor, Tor y Cot.

78

CAPITULO 111

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83

CAPITULO IV

CAPITULO IV: DISCUSIÓN GENERAL, CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

4.1 DISCUSIÓN GENERAL

Las plantas son organismos sésiles que presentan continuo crecimiento en todo su ciclo

de vida, son capaces de generar respuestas rápidas para adaptarse ante diversos

extremos ambientales mediante la plasticidad celular, única de las células vegetales

(Zimmerman, 1993; Yang y Zhang , 201 O). Bajo condiciones controladas el cultivo in vitro

es una herramienta biotecnológica utilizada para la regeneración de plantas, la

conservación del germoplasma y la obtención de plantas genéticamente mejoradas en

diferentes especies agronómicamente importantes (Sachs, 1991 ; Yeung, 1995). Entre las

técnicas in vitro más utilizadas para estos fines está la organogénesis y la embriogénesis,

en donde la plasticidad celular y la capacidad totipotente durante el proceso embriogénico

han sido estudiadas desde los aspectos bioquímicos, moleculares y genéticos. Sin

embargo, en la última década la regulación mediante los mecanismos epigenéticos y

específicamente la regulación ejercida a través de los pequeños ARNs, ha empezado a

ganar terreno para comprender su importancia en los procesos biológicos, por ejemplo, el

desarrollo de la embriogénesis somática (ES).

Los estudios realizados con miARNs durante la embriogénesis han demostrado el papel

clave que estas pequeñas moléculas desempeñan durante este proceso. Por ejemplo,

actualmente se han identificado miARNs en diferentes especies vegetales involucrados en

la inducción embriogénica, la morfogénesis y la maduración del embrión cigótico y

somático (Xiao-Meng et al., 2011; Aquea y Arce-Johnson , 2008; Eyles et al. , 2013) . En la

presente tesis fue posible evaluar 11 miARNs conservados y 29 miARNs divergentes

(Cuadro 3.1.) , los cuales fueron considerados a partir de los miARNs reportados en las

especies S. lycopersicum (Zhang et al. , 2008; Pilcher et al., 2007), G. max (Li et al. , 2011 ;

Chen et al., 2009) , P. trichocarpa (Barakat et al. , 2007; Chen et al., 2011 ; Lu et al., 2005),

V. vinífera (Lu et al. , 2008; Tillett et al. , 2011), M. truncatula (Zhou et al., 2008; lmin et al. ,

2008), V. orange (Xiao-Meng et al., 2011), A. thaliana (Tretter et al. , 2008; Todesco et al.,

85

CAPITULO IV

201 0), así como C. canephora y C. arabica (Nellikunnuma y Chandrashekar 2012).

En general , los resultados obtenidos de la expresión cuantitativa de 11 miARNs

conservados (Figura 3.1, 3.2) y cinco miARNs seleccionados (Figura 3.3), de los 29

miARNs divergentes relacionados por primera vez al proceso de inducción, el desarrollo y

la maduración embriogénica, mostraron ciertos patrones de expresión que sugieren su

participación en el proceso embriogénico de C. canephora. Por ejemplo, la expresión

abundante de miR164, encontrada en el embrión globular y su abundancia mínima

durante todo el proceso de la ES (Figura 3.1 ), podría relacionarse con la regulación de los

genes NAC durante el desarrollo del embrión globular y la maduración del embrión

cigótico como ha sido reportado en A. thaliana (Kim, et al. , 2009; Raman et al. , 2008). Por

lo cual se podría inferir que este miARN se encuentra relacionado al proceso del

desarrollo globular cigótico y somático, así también, podría considerarse como un miARNs

esencial durante el proceso embriogénico en C. canephora.

Otros miARNs conservados y evaluados en este estudio fueron los miARNs; miR156,

miR166, miR167, miR168, miR171 y miR398, reportados hasta el momento como

miARNs involucrados en la ES indirecta y en la regulación de los genes SCARECROW­

LIKE-3 (SCL), SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) y

ARGONAUTA-1 (AG01) , importantes durante la inducción y el mantenimiento del callo

embriogénico (Lin y Lai , 2013; Zhang et al. , 2012 ; Xiao-Meng et al. , 2011) . El análisis

encontrado en la primera etapa en la ES (explante foliar y Mp) en C. canephora (Cuadro

3.1) mostró que estos miARNs estuvieron ausentes, lo cual sugiere que los genes SCL,

SPL y AG01 podrían estar expresados en estos tejidos. Además, se ha reportado que

estos genes están involucrados en la diferenciación celular para la generación de la masa

pro-embriogénica (Lin y Lai , 2013). Por otro lado, los resultados obtenidos de miR168

(Figura 3.1) durante la transición embriogénica Glo, Cor, Tor, y Cot de C. canephora,

podría estar relacionada a la regulación de AG01 y RNA-INDUCED TRANSCRIPTIONAL

SILENCING COMPLEX PROTEIN-3 (TAS3) como ha sido reportado en D. logan y L.

leptolepis en donde este miARN ejerce una regulación durante el desarrollo y la transición

de las estructuras embriogénicas deCora Cot (Vaucheret et al. , 2006; Zhang et al. , 2010;

Zhang et al. , 2012, Lin y Lai , 2013).

Algunos de los miARN nuevos analizados en C. canephora como los miR157, miR390 ,

86

CAPITULO IV

miR535, m iR 1524 y miR2119 evaluados durante el proceso embriogénico presentaron

expresiones diferenciales durante la ES (Cuadro 3.3). Por ejemplo, el miR157 y el miR390

se encontraron con expresiones abundantes en los estadios Cor, Tor y Coten la ES de C.

canephora (Cuadro 3.3) . Hasta el momento el miR157 ha sido reportado como un

elemento clave para el desarrollo morfogénico y la transición de fases vegetativas

(Gandikota et al., 2007; Rhoades et al., 2002), mientras que el miR390 ha sido

considerado un regulador clave para el desarrollo cotiledonar, cigótico y el proceso de la

división celular a través de la regulación de los receptores tipo cinasas (RLK) y

AUXIN/INDOLE-3-ACETIC AGIO (AUX/AIA) (Marin et al. , 2010; Sunkar et al. , 2005).

Estos dos miARNs han sido recientemente relacionados con miR535, como posibles

reguladores de los extremos in vitro en especies micropropagados como Strawberry spp

(Li et al. , 2009). Ante estas evidencias y con base a los resultados obtenidos en la ES de

C. canephora (Cuadro 3.3) , se podría sugerir que estos miARNs se encuentran ejerciendo

funciones similares y tal vez podrían estar estableciendo un sistema de autorregulación in

vitro en los factores transcripcionales y genes involucrados en la ES, que dirigen el

desarrollo y transición de los embriones somáticos (Figuras 3.2 y 3.3).

La información generada en este trabajo y la aplicación de las técnicas moleculares

utilizadas han permitido realizar un primer acercamiento sólido para la comprensión

funcional de 16 miARNs durante el proceso embriogénico de C. canephora (Cuadro 3.3) .

Los resultados generados pueden ser considerados el punto de partida de otras

investigaciones que busquen esclarecer el funcionamiento biológico de genes blancos

regulados por estos miARNs y dar respuesta a algunas de las interrogantes sobre el

proceso embriogénico somático y cigótico, así como propuestas biotecnológicas que den

soluciones a algunas de las problemáticas que implican algunos sistemas in vitro

vegetales como la recalcitrancia. Con los resultados obtenidos en este trabajo y la

información disponible en la literatura se puede proponer finalmente un modelo

epigenético sobre el posible mecanismo de acción de los miARNs durante el proceso de

la ES de C. canephora (Figura 4.1 ).

87

CAPITULO IV

AG01

NAC

miR172 ~ APL2

miR4Q~AUX/AII MYB APL ~. ~? ~

familias miR159/miR169/miR171

A miR156 miR1 71

...... miR166

miR2119?

miR535 ?

miR154?

miR168 r AG09 ......-- m::::::::=- B miR16~ HO-ZIPIII

miR15~ MYB33

miR156~ SPL

? siARNs

,-------i ARF17 miR160/miR167 IAUXINASJ

4~&13

miR160/mÍR390 4 ARF2/ARF3/ARF4

Familia miR396

r--1 Represión

-:;;::- Balance para dos miARNs Abundancia elevada

miR396a 4 CDS

miR397 Y LACCASE ~ miR24 ?

TIR ? miR393 --=----' SCL/SCR

Transcripción .A. Auto-regulación

Balance entre varios miARNs ? Blancos de acción desconocidos

Figura 4.1 . Modulación epigenética de los miARNs en la embriogénesis somática de Coffea canephora. Durante el inicio del proceso embriogénico, las células somáticas presentes en el explante foliar experimentan una reprogramación en su epigenoma a través de una regulación ejercida por miARNs conservados y divergentes. En el presente modelo se sugiere la regulación dinámica de 16 miARNs evaluados durante el explante foliar, la masa pro-embriogénica (Mp) y el desarrollo de las estructuras embriogénicas (Gio, Cor, Tor, Cot). (A) Indica la regulación de los

88

CAPITULO IV

miARNs miR154, miR164, miR168 miR390, miR482 y miR535, evaluados por primera vez, durante el proceso de la ES y la posible regulación sobre HEME ACTIVATOR PROTE/N-2 (HAP2), ARGONAUTA1 (AG01) y NAM, ATAF y CUC (NAC). (8) Indica la dinámica ejercida de los miARNs conservados, miR156, miR159, miR160, miR166, miR168, miR171 , miR390, miR393 miR397 y miR398, en la ES de C. canephora sobre el desarrollo y la transición embriogénica a través de la posible regulación de los genes SQUAMOSA PROMOTER 8/ND/NG PROTEIN (SPL), CLASS 111 HOMEODOMAIN-LEUC/NE ZIPPER (HD-Z/P/11), ARGONAUTA (AGO), AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF}, SCARECROW-LIKE PROTEIN (SCUSCR}, COPPER SUPEROXIDASE DISMUTASES (CDS), LACCASE, MYB, y TIR como ha sido encontrado en las especies Larix leptolepis, Valencia orange y Dimocarpus /ogan .

4.2 CONCLUSIÓN GENERAL

El principal objetivo de este trabajo fue la identificación de los miARNs presentes durante

el proceso de ES en C. canephora, así como, la determinación de sus patrones de

expresión a lo largo del proceso embriogénico. Los resultados obtenidos sugieren que el

mecanismo epigenético regulado por los miARNs, en el proceso embriogénico de C.

canephora, podría estar altamente regulado por estas pequeñas moléculas desde la

inducción de la ES, hasta el desarrollo y transición entre los diferentes estadios

embriogénicos. Las conclusiones generales de este trabajo son:

~ Se determinó que la transición de las células somáticas, presentes en el explante

foliar, a células con capacidad embriogénica es dirigida por los miRNAs: miR156,

miR164, miR165, miR169, miR172, miR309, miR319, miR390, miR397, miR430,

miR535 y miR824.

~ Se determinó que los miARNs: miR156, miR157, miR160, miR164, miR165,

miR171 , miR398, miR427, miR535 y miR824 regulan el desarrollo de la Mp.

~ Se demostró que para el desarrollo morfogénico y la transición entre los diferentes

estadios embriogénicos es necesaria la participación temprana de los miR164,

miR168, miR172 , miR396, miR430, miR535 y miR824, (estadio globular) , seguida

de la activación de 22 miARNs para la regulación de la transición entre los

estadios corazón , torpedo y cotiledonar. En el embrión cigótico se idéntico la

presencia de niveles bajos de expresión de once miARNs.

~ Se identificaron cuantitativamente los patrones de expresión de 16 miARNs

durante los diferentes estadios del proceso embriogénico de C. canephora. Se

89

CAPITULO IV

determinó la expresión de miR157, miR164, miR168, miR390, miR397, miR535 y

miR1524, durante la inducción y la formación de la masa pro-embriogénica, en

tanto que durante el desarrollo y transición entre los diferentes estadios

embriogénicos se determinó la expresión de miR156, miR157, miR159, miR164,

miR166, miR167, miR168, miR171 , miR390, miR393, miR397, miR398, miR482,

miR535 y miR2119.

>-- La expresión de miR157, miR164, miR166, miR535 y miR2119 se demostró a

través de tres metodologías, lo que permitió establecer los patrones de expresión

de estos miARNs de una forma tejido-especifico.

4.3 PERSPECTIVAS DEL TRABAJO

90

>-- En trabajos futuros será necesario continuar el análisis de los patrones de

expresión relativa durante el proceso de ES en C. canephora con el fin de

identificar nuevos miARNs que puedan estar participando en la regulación del

proceso de ES.

>-- En estudios posteriores será necesario identificar los genes blanco de la acción de

los miARNs durante el proceso de ES en C. canephora .

>-- Será necesario la elaboración de una base de datos para todos los miARNs

relacionados con el proceso de ES.

>-- También será necesario la elucidación de los precursores biológicos de estos

miARNs e identificación de las isoformas que los miARNs pueden presentar.

CAPITULO IV

4.4 REFERENCIAS

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93

CAPÍTULO V

CAPITULO V ANEXO: CURVAS DE CALIBRACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DEL QPCR TIEMPO REAL

miARN SnU6 38 miAR N 5.8'S 38

Pendiente -3.105 Pendiente -3.1 05

36 R' 0.979 36 R' 0.979 Eficiencia 2.098 Eficiencia 2.098

34 34

32 32

tS 30 tS

30

28 28

28 26

24 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

ADNc diluciones ng/~L AONc diluciones ngii!L

38 miARN miR156 38 miARN miR157 Pendiente -3.259 Pendiente -3.305

36 R' 0.994 38

R' 0.998 Eficiencia 2.126 Eficiencia 2,00670292

34 34

32 32

i3 i3 30 30

2S 2S

26

28

24

24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

AONc diluciones ng/¡ll AONc diluciones ng/j!L

38 38 miARN miR164 miARN miR159 Pendiente -3.181 .. Pendiente -3.t27

38 36 . R' R' 0.996 0.989

Eficiencia 2.062 34 Eficiencia 2.101 34

32 32

tS ü 30 30

28 28

28 28

24 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

AONc diluciones ng/1.1L ADNc diluciones ng/~L

Figura 5.1 . Curvas de calibración y determinación de la eficiencia del qPCR del testigo endógeno 5.8's, el ARN nuclear normalizador snU6 y los miARNs: miR156, miR157, miR159 y miR164 miARNs Ct: valor de ciclo umbral (media± DE, n = 2); E: eficiencia qPCR, E= 10 [-1/pendiente].

95

CAPÍTULO V

:l8 38 miARN miR166 miARN miR167

J6 Pendiente -3.157 38 Pendiente -3.305 R' 0.998 R' 0.997

34 Eficiencia 2.073 34 Eficiencia 2.006

32 32

o so ü 30

28 28

26 26

"' 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

ADNc diluciones ng/¡!L AONc diluciones ng/¡.tl

38 miAR N miR168 38 miAR N miR171 Pendiente -3.301 Pendiente -3.030

38 ~ 0.994 38 R' 0.999 Eficiencia 2.009 Eficiencia 2.134

34 34

32 32 ü

30 ! ü 30

28 28

26 26

24 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100 AONc diluciones ng/¡.¡L AONc diluciones ng/¡.tl

38 38 miARN miR390 miARN miR393

38 Pendiente -3.035 38 Pendiente -3.067

R' 0.973 R' 0.998

34 Eficiencia 2.321 34 Eficiencia 2.118

32 32

JO ü 30 ü

28 28

26 26

24 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

ADNc diluciones ng/¡.tl AONc diluciones ng/¡.tl

Figura 5.2. Determinación de la eficiencia del qPCR de los miARNs: miR166, miR167 miR168, miR171 , miR390 y miR393. Ct: valor de ciclo umbral (media ± DE, n = 2); E: eficiencia qPCR, E = 10 [-1/pendiente].

96

CAPÍTULO V

"" miARN miR398 miARN miR397 "" Pendiente -3.122 Pendiente -3.098

R' 36 R' 0.994

36 0.997 Eficiencia 2.053 Eficiencia 2.091

34 34

32 32

ü ü

"" JO

28 28

26 26 ..

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100 ADNc diluciones ng/IJ.L ADNc diluciones ng/IJ.L

38 miARN miR482 38

Pendiente -3.051 miARN miR535

R' 0.976 38 Pendiente -3.135

38 R'

Eficiencia 2.126 0.986

34 34 Eficiencia 2.1 84

32 32

ü JO ü JO

28 28

26 26

24

24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

ADNc diluciones ng/IJ.L ADNc diluciones ng/IJ.L

38 miARN miR1524

Pendiente 38 miARN miR2119 .-3.235

Pendiente -3.451 38 R2 0.9745 36 R' 0.975

34 Eficiencia 2.084 Eficiencia 1.998 34

32 32

ü )1) ü 30

28 28

26 26

24 24

0.01 0.1 10 100 0.01 0.1 10 100

ADNc diluciones ng/IJ.L ADNc diluciones ng/¡J.L

Figura 5.3. Determinación de la eficiencia del qPCR del los miARNs: miR397, miR398, miR482, miR535, miR1524y miR2119 Ct: valor de ciclo umbral (media ± DE, n = 2); E: eficiencia qPCR, E = 10 [-1/pendiente]

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