Embriogénesis somática y producción de semilla...

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Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Agroalimentarias Escuela de Agronomía Embriogénesis somática y producción de semilla artificial de papaya (Carica papaya) híbrido “Pococí”. Tesis presentada para optar por el grado académico de Licenciado en Ingeniería Agronómica Paúl Solórzano Cascante Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2014

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Universidad de Costa Rica

Facultad de Ciencias Agroalimentarias

Escuela de Agronomía

Embriogénesis somática y producción de semilla artificial de

papaya (Carica papaya) híbrido “Pococí”.

Tesis presentada para optar por el grado académico de Licenciado en Ingeniería Agronómica

Paúl Solórzano Cascante

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica

2014

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Agradecimientos De manera muy especial quiero agradecer a mi director de tesis, Dr. Víctor Jiménez, por

toda su colaboración, consejos, excelente apoyo y por brindarme una excelente formación

académica.

A los miembros del comité de tesis, Dr. Eric Guevara, M.Sc. Griselda Arrieta, M.Sc. Eric

Mora, M.Sc. Jorge Wagner, mi más sincero agradecimiento por su pronta respuesta,

sugerencias y comentarios.

A Andrea Holst y María Viñas por toda su ayuda en el laboratorio y los análisis

estadísticos.

A mis padres por todo el apoyo que me han brindado durante tantos años.

A Mariana Murillo por su ayuda, apoyo y cariño.

Agradezco a todas aquellas personas que de una u otra forma me brindaron su apoyo en la

realización de este trabajo.

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Esta tesis ha sido aceptada en su presente fonna. por la Escuela de Agronomía de la Universidad de Costa Rica y aprobada por el comité consejero del estudiante como requisito parcial para optar por el grado de licenciado.

Firmantes:

Dr. Víctor Jirnénez García Director de Tesis

Dr. Eric Guevara Berger Miembro del Comité

M.Sc. Eric Mora Newcomer Miembro del Comité

MSc. Gríselda Arrieta Espinoza Miembro del Comité

M.Sc. Jorge Wagner Pineda ~--:;:,. Representante Director Escuela de Agronomi~

B.Sc. Paúl Solórzano Cascante Candidato

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Resumen El uso de la embriogénesis somática permitiría la propagación a gran escala del híbrido de

papaya “Pococí”, así como la selección y multiplicación de material hermafrodita. Para

poder utilizar esta técnica a nivel comercial es necesario contar con protocolos eficientes

para la inducción y multiplicación de embriones somáticos, así como para la germinación y

regeneración de plantas a partir de los mismos. En este trabajo se evaluó el efecto de cinco

dosis de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (2, 4, 6, 8 y 10 mg/l) sobre la inducción de

embriones somáticos. Como explantes se utilizaron embriones cigóticos desnudos, así

como semillas cortadas por la mitad. El medio de cultivo base para todos los tratamientos

contenía la mitad de la concentración de las sales minerales y todas las vitaminas del medio

de cultivo de Murashige y Skoog (MS), suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-

glutamina (400 mg/l), sacarosa (3% p/v) y Phytagel (0,28% p/v). Una vez introducidos los

explantes, estos se cultivaron en placas de Petri a la oscuridad por un periodo de 14

semanas. Durante todo el periodo de evaluación no se observó formación de callo o

embriones somáticos en ninguno de los embriones cigóticos desnudos cultivados. Por otra

parte, en las semillas cortadas por la mitad, las concentraciones de 4 y 6 mg/l de 2,4-D

indujeron mayor formación de callo a las 8 semanas de cultivo (45% y 55%,

respectivamente) en comparación con las concentraciones de 8 y 10 mg/l (15% y 0%,

respectivamente). Los explantes cultivados con 2 mg/l de 2,4-D presentaron un porcentaje

de formación de callo del 25%; sin embargo, no mostraron diferencias significativas con

respecto a los demás tratamientos. A las 14 semanas de cultivo se observó en todos los

tratamientos un porcentaje de formación de callo embriogénico de entre 25% y 33%, sin

presentar diferencias significativas entre tratamientos. A varios de estos callos

embriogénicos se les hizo un análisis histológico. La producción de embriones somáticos

por callo embriogénico osciló de entre 11 y 31 embriones somáticos y no se observó

ninguna diferencia significativa entre tratamientos. La oxidación de los explantes en todos

los tratamientos fue inferior al 5%. El análisis histológico permitió determinar la ausencia

de conexiones vasculares entre los embriones somáticos y el callo, así como la ausencia de

una estructura similar al suspensor; así como una anatomía normal por parte de los

embriones cotiledonares.

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Posteriormente, los callos embriogénicos se subcutivaron en medio sólido y líquido con

miras a propagarlos. Para establecer ambos tratamientos, se tomaron los callos

embriogénicos de todos los medios de inducción y se mezclaron en medio de cultivo

líquido. Luego, en cada unidad experimental (placas de Petri de 90 mm y Erlenmeyers de

50 ml) se colocaron 0,5 g de callo embriogénico disgregado más 25 ml de medio de cultivo.

El cultivo se realizó bajo oscuridad total por un periodo de 8 semanas y las suspensiones

embriogénicas se agitaron a 120 rpm. La propagación de los embriones somáticos fue

mayor en el medio líquido en comparación con el medio sólido (1324 y 307 nuevos

embriones somáticos por recipiente, respectivamente). En el sistema líquido el desarrollo

de los embriones somáticos fue menor que en el medio sólido, ya que el porcentaje de

embriones somáticos en etapa cotiledonar fue de 42,98% en el segundo y de 14,7% en el

primero. Los callos embriogénicos presentaron un crecimiento estadísticamente similar en

ambos sistemas de cultivo, con un peso final de 2,08 g en el sistema de cultivo sólido y

1,65 g en el cultivo en medio líquido. Por último, en ninguno de los dos sistemas de cultivo

hubo problemas de oxidación.

Con el fin de mejorar la germinación de los embriones somáticos se evaluó el efecto de

cinco dosis de 6-bencilaminopurina (BAP) (0, 0,2, 0,4, 0,6 y 0,8 mg/l) en medio de cultivo

MS suplementado con sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v). Los embriones somáticos se

cultivaron bajo un fotoperiodo de 12 horas, bajo 49 μmol/m2/s de luz fluorescente, a

temperatura promedio de 23°C y humedad relativa de 48% por 30 días. Luego de dos

semanas de cultivo se observó la brotación de los embriones somáticos en todos los

tratamientos. Al cabo de cuatro semanas de cultivo, los embriones somáticos cultivados con

0,4 y 0,6 mg/l de BAP presentaron el mayor porcentaje de brotación (40% y 27%,

respectivamente). El tratamiento sin BAP presentó un 5,5% de brotación, siendo el menor

valor observado. El porcentaje de enraizamiento osciló entre 0% y 5,5%, siendo el testigo

aquel en el cual se observó el mayor valor, seguido por el tratamiento con 0,2 mg/l de BAP

con un 1,8%. En el resto de los tratamientos establecidos no hubo enraizamiento. Además,

se observó la formación de callo en la región basal de algunos de los embriones somáticos,

con porcentajes que oscilaron entre 29% y 38%, sin presentar diferencias significativas

entre tratamientos.

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Por último, se produjeron semillas artificiales utilizando tres concentraciones de ácido

algínico (2,5%, 3,5% y 4,5%) y dos concentraciones de CaCl2 (50 mM y 100 mM). A cada

solución de ácido algínico se le agregó las sales minerales del medio de cultivo MS a la

mitad de la concentración, con excepción del calcio que no se agregó, sacarosa (3% p/v) y

BAP (0,4 mg/l). La duración de la fase de gelificación fue de 30 minutos. Además, se

evaluó el efecto de una inmersión por 20 minutos en una solución de KNO3 (200 mM)

sobre la germinación de las semillas artificiales. Las cápsulas de alginato de calcio más

duras fueron aquellas producidas con las soluciones de ácido algínico al 3,5% y 4,5% y las

soluciónes de CaCl2 a 100 mM (1,31 N•mm y 1,18 N•mm, respectivamente). Las cápsulas

producidas con las soluciones al 2,5% y 3,5% de ácido algínico y gelificadas en una

solución de CaCl2 a una concentración de 50 mM presentaron las menores fuerzas de

ruptura (0,41 N•mm y 0,28 N•mm, respectivamente). Todas las cápsulas tratadas con KNO3

(200 mM) se fisuraron luego de ser retiradas de esta solución. El coeficiente de correlación

entre la dureza de las cápsulas y la brotación de las semillas artificiales fue muy bajo

(0,0294). A las 12 semanas, los embriones somáticos sin encapsular habían brotado en un

64% mientras que el mayor porcentaje de brotación de las semillas artificiales obtenido fue

del 28% al utilizar una solución de CaCl₂ 50 mM y una solución de ácido algínico al 4,5%.

Las semillas artificiales preparadas con una solución al 2,5% de ácido algínico y otra de

CaCl2 a 100 mM presentaron la brotación más baja con un 4%.

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Índice general Agradecimientos ............................................................................................................... ii

Resumen .......................................................................................................................... iv

Índice de Figuras ............................................................................................................. ix

Introducción ...................................................................................................................... 1

Antecedentes ..................................................................................................................... 3

Conceptos generales sobre embriogénesis cigótica y somática ....................................... 3

Papel de las auxinas en el proceso de embriogénesis somática ........................................ 5

Embriogénesis somática en papaya ...................................................................................... 5

Germinación de embriones somáticos de papaya............................................................... 7

Producción de semilla artificial ............................................................................................ 7

Objetivos ......................................................................................................................... 11

Objetivo General ................................................................................................................... 11

Objetivos específicos ........................................................................................................... 11

Materiales y métodos ...................................................................................................... 12

Localidad y financiamiento ................................................................................................. 12

Experimentos realizados ...................................................................................................... 12

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos. .. 12

1.2 Análisis histológico de callos embriogénicos ...................................................... 13

2. Efecto del medio líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de papaya “Pococí” ...................................................................................................... 14

3. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”15

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas sintéticas de Papaya “Pococí” ................................................................................. 16

Programas estadísticos ......................................................................................................... 18

Resultados ....................................................................................................................... 19

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos ... 19

2. Efecto del medio líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de

papaya “Pococí” ................................................................................................................ 21

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3. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”…

23

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas

sintéticas de Papaya “Pococí”. ........................................................................................ 26

Discusión ........................................................................................................................ 30

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos ... 30

2. Efecto del medio líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de

papaya “Pococí” ................................................................................................................ 32

3. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”…

34

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas

sintéticas de Papaya “Pococí” ......................................................................................... 36

Literatura citada .............................................................................................................. 39

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Índice de Figuras

Figura 1 Procesos de intercambio catiónico durante el endurecimiento de las cápsulas de alginato de sodio y el pretratamiento de germinación con nitrato de potasio (KNO3). a) Inmersión en solución con CaCl₂ por 10 min. b) Lavado de cápsulas. c) Inmersión en solución con nitrato de potasio (200 μM) durante 60 min. d) Lavado de cápsulas. e) Ruptura de la cápsula de alginato de calcio. Modificado de Onishi et al. (1994). ............................................................................................ 9

Figura 2 A. Efecto del 2,4-D sobre la formación de callo a partir de secciones de semillas de papaya “Pococí” durante un periodo de 14 semanas. B. Producción total de embriones somáticos (ES) de papaya por callo embriogénico observado. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%.20

Figura 3 Cortes histológicos de callos embriogénicos cultivados en medios de cultivo adicionados con 6 mg/l de 2,4-D (A y B) y 2 mg/l de 2,4-D (C) luego de 12 semanas de cultivo. Escala igual a 1 mm. Flechas indican un punto meristemático (A), estructuras proembrionarias (B) y un embrión somático (C). .................. 21

Figura 4 Efecto del sistema de cultivo sobre el número de embriones somáticos (ES) producidos (A), el crecimiento del callo (A) y el desarrollo de los ES (B), luego de ocho semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%. ........................................................................ 22

Figura 5 Embriones somáticos desarrollados a partir de secciones de semillas de papaya en medio de cultivo líquido (A) y sólido (B). Barras equivalentes a 1 mm. ......... 23

Figura 6 Efecto de varias concentraciones de BAP sobre la brotación de embriones somáticos de papaya durante un periodo de cultivo de 4 semanas (letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%). ........ 24

Figura 7 Enraizamiento y brotación de embriones somáticos de papaya cultivados en un medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento (A) y otro adicionado con 4 mg/l de BAP (B). Barras equivalentes a 1 mm. ............................................... 25

Figura 8 Efecto de distintas concentraciones de BAP sobre la formación de callo y raíces (A) y sobre la oxidación (B) de los embriones somáticos (ES) durante cuatro semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%. ............................................................................. 26

Figura 9 Semillas artificiales de papaya “Pococí” elaboradas con (A) 4,5% de alginato de sodio y 100 mM de CaCl2 lista para ser cultivada; (B) tratada con 200 mM de KNO3 por 20 minutos previo a su cultivo y (C) otra brotada luego de 12 semanas de cultivo. Barras equivalentes a 3 mm. ........................................................... 27

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Figura 10 Dureza de las cápsulas de alginato de calcio elaboradas con distintas concentraciones de alginato de sodio y gelificadas con dos concentraciones de CaCl2. ............................................................................................................... 28

Figura 11 A. Efecto del uso de distintas concentraciones de ácido algínico y CaCl2 durante la encapsulación de embriones somáticos de papaya, así como de una inmersión en KNO3 (200 mM) previo al cultivo, sobre la brotación (A) y oxidación (B) de la semilla sintética de papaya luego de 12 semanas de cultivo. ........................... 29

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Introducción La familia Caricaceae está compuesta por seis géneros, originarios, en su mayoría, de

América. La papaya (Carica papaya) es la única especie dentro del género Carica

(Badillo 2000). Actualmente, los mayores productores de papaya son Brasil, Nigeria y

Congo. El fruto de papaya tiene un alto valor nutricional debido a que es una muy buena

fuente de cobre y magnesio, así como de vitaminas A y C (Wall 2006). Además, el látex

de la planta de papaya es rico en dos enzimas proteolíticas: la papaína y la

quimipapaína, ambas usadas en la industria farmacéutica (Azarkan et al. 2003).

La propagación convencional de papaya se realiza por medio de semilla, lo cual es un

problema debido a la alta heterogeneidad del material, ya que es una especie con

polinización cruzada (Ellis et al. 1991; Castillo et al. 1998). A su vez, la principal

limitante que presenta la producción de semilla de híbridos comerciales son los bajos

porcentajes de germinación y, en algunos genotipos, la poca cantidad de semillas por

fruto (Bhattacharya y Khuspe 2001).

La papaya presenta una morfología floral particular, ya que se pueden presentar los

siguientes tipos de flores: estaminadas, hermafroditas y pistiladas. Los frutos

provenientes de plantas hermafroditas son de forma alargada, con cáscara gruesa y una

cavidad interna reducida, lo que hace que sean los frutos con mayor aceptación a nivel

comercial (Mora y Bogantes 2005). Por otra parte, no existen variaciones en los

caracteres vegetativos entre plantas con distinto tipo de flor que permitan su

diferenciación antes de la aparición de las flores (de dos meses y medio a tres meses y

medio después del transplante) (Storey 1953).

Por lo tanto, para lograr establecer plantaciones que cuenten con un porcentaje de

plantas hermafroditas de entre 92 y 94% es necesario establecer en el campo de tres a

cuatro plantas por punto de siembra, para luego, durante la floración, seleccionar

solamente el fenotipo deseado (Mora y Bogantes 2005). Esto convierte a la papaya en

un candidato ideal para la propagación a través de cultivo in vitro, específicamente a

través de embriogénesis somática, ya que de este modo se podría asegurar el

establecimiento de plantaciones 100% hermafroditas, las cuales serán altamente

productivas y con muy buena calidad de fruta, si se seleccionan genotipos adecuados.

Otra ventaja adicional del uso de la embriogénesis somática para la propagación de

papaya es que los embriones somáticos se podrían encapsular para la producción de

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semilla artificial o sintética (Khor y Loh 2005). Las principales ventajas del uso de

semillas artificiales son: mantener la uniformidad genética del material, la facilidad de

transporte, la posibilidad de distribuirla directamente al campo, la clonación rápida del

material, el establecimiento de plántulas libres de patógenos y la oportunidad de ser

producidas en cualquier época del año (Patel et al. 2000; Rai et al. 2009). Por otra parte,

el éxito de la producción de semillas artificiales con fines comerciales radica en contar

con sistemas de cultivo que permitan la producción en masa de embriones somáticos de

alta calidad y en encontrar una matriz de encapsulación adecuada (Redenbaugh et al.

1986; Onishi et al. 1994).

El papel de las auxinas en la transición de células somáticas hacia células embriogénicas

se ha estudiado en detalle. La auxina más utilizada para la inducción de embriogénesis

somática ha sido el ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) con un 50% de los casos

(Raemakers et al. 1995). Por otra parte, la adición de este regulador de crecimiento al

medio de cultivo provoca un incremento en la concentración de auxinas endógenas en

las células receptoras, así como un gradiente de auxina, el cual se postula como

necesario para que se dé la división asimétrica de las células y dé inicio al proceso de

embriogénesis somática (Jiménez 2005).

El alginato de sodio es el agente gelificante más utilizado para la producción de semillas

artificiales debido a que es soluble a temperatura ambiente (25°C), no perjudica al

embrión somático y se endurece al entrar en contacto con sales metálicas divalentes

poco tóxicas, como el calcio, en un proceso conocido como gelificación ionotrópica

(Redenbaugh et al. 1986; Nieves et al. 2000). El principal factor que afecta la

germinación de las semillas artificiales es la dureza final de la cápsula de alginato de

calcio, la cual depende de la concentración utilizada de alginato de sodio en la solución

gelificante, el periodo de exposición de las gotas del conjunto embrión somático +

solución gelificante en la solución con cloruro de calcio (CaCl2) y su concentración

(Castillo et al. 1998).

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Antecedentes

Conceptos generales sobre embriogénesis cigótica y somática

La producción de embriones en angiospermas se da gracias al proceso de doble

fertilización del saco embrionario, el cual da origen al embrión cigótico y al

endosperma. Pero, también existen plantas en las que se da la formación asexual de

embriones a partir del tejido materno del óvulo, obviando así, la fase de recombinación

genética y la fertilización del óvulo. Lo anterior pone de manifiesto dos conceptos

claves para el proceso de embriogénesis somática: 1) la señal otorgada por la

fertilización para que dé inicio el desarrollo del embrión puede ser substituido por otro

tipo de mecanismo endógeno, y 2) que en plantas superiores otros tipos de células,

distintas a la célula huevo fertilizada, pueden mantener e incluso obtener la capacidad

de generar embriones (Fehér 2006).

La embriogénesis somática se ha definido como el proceso mediante el cual células

somáticas se logran orientar hacia la formación de estructuras similares a embriones

cigóticos a través de una serie de pasos cronológicos sin necesidad de que ocurra la

fusión de gametos. Este proceso se divide tradicionalmente en dos etapas principales,

conocidas como: fase de inducción y fase de expresión. Durante la primera etapa, las

células somáticas adquieren las características particulares de las células embriogénicas

a través de cambios fisiológicos, metabólicos y de expresión génica. Generalmente, esta

transición se logra exponiendo las células somáticas a algún tipo de estímulo externo,

como el uso de algún regulador de crecimiento o el manejo del potencial osmótico del

medio, lo cual no es necesario durante la embriogénesis cigótica ya que es una

característica constitutiva. Por otra parte, la fase de expresión de la embriogénesis

somática se da luego de algún cambio en una o varias de las condiciones de cultivo, lo

cual permite que las células inducidas puedan manifestar su capacidad embriogénica y

se diferencien en embriones somáticos (Dodeman et al. 1997; Jiménez 2005).

Por otra parte, indistintamente del tipo de embriogénesis que ocurra (ya sea

embriogénesis cigótica o somática), existen varios criterios que deben cumplirse para

que el proceso de embriogénesis dé inicio. Primeramente, la especie debe contar con el

potencial genético para formar embriones a partir de células somáticas. A su vez, una o

varias células de la planta deben tener la capacidad de percibir los estímulos endógenos

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o exógenos que disparan el proceso de formación del embrión. Y por último, las células

que percibieron el estímulo e iniciaron el proceso de diferenciación deben de mantener

esta condición incluso cuando el estímulo haya desaparecido (Fehér 2006).

El desarrollo de los embriones somáticos es muy similar al de los embriones cigóticos.

La primera fase del desarrollo embrionario se caracteriza por la división asimétrica del

cigoto (compuesto por una sola célula), para dar origen a dos células hijas, una apical,

de la cual se desarrolla la plúmula y los cotiledones, y otra basal, de la cual se

desarrollan el hipocótilo y el suspensor. Posteriormente, ocurre la citodiferenciación del

embrión. Por último, la polaridad del embrión, así como su histodiferenciación, se

establecen a través de la tasa y posición de las divisiones celulares y su posterior

alargamiento, dando como resultado la formación de los meristemos apical y radical.

Aparte de lo anterior, un embrión somático completamente desarrollado y maduro no es

idéntico a un embrión cigótico ya que generalmente no entra en una fase de reposo ni

cuenta con endospermo ni integumentos (Dodeman et al. 1997; von Arnold et al. 2002).

El desarrollo de los embriones somáticos se puede dar a partir del tejido del explante sin

que haya una etapa de formación de callo previa; este fenómeno se conoce como

embriogénesis somática directa. Por el contrario, si los embriones se originan luego de

un evento de desdiferenciación del tejido del explante, el proceso se denomina

embriogénesis somática indirecta. Los principales factores que determinan mediante

cuál tipo de embriogénesis se formarán los embriones son el tipo y el estado fisiológico

del explante utilizado, así como el tipo y la concentración de los reguladores de

crecimiento empleados (Yang y Zhang 2010). Por último, en muchas especies

solamente ciertos tejidos de la planta cuentan con un alto potencial embriogénico.

Existe la hipótesis de la existencia de un gradiente en la respuesta a los tratamientos

inductores a través de los distintos órganos de la planta. El potencial embriogénico es

muy alto en tejidos de origen embrionario y decrece a través del hipocótilo, el peciolo,

la hoja y la raíz (Neumann 2000).

Actualmente existe gran cantidad de especies con un potencial muy alto para la

formación de embriones somáticos; sin embargo, aun quedan varias especies

recalcitrantes donde su potencial podría aumentar al mejorar las condiciones de cultivo

in vitro o la selección adecuada del explante. En ese sentido, se maneja el concepto de

que el componente genético de la planta define cuáles son las condiciones adecuadas

para que se produzcan embriones somáticos (Fehér 2006).

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Papel de las auxinas en el proceso de embriogénesis somática El papel de las auxinas en el proceso de embriogénesis cigótica es muy bien conocido.

Se ha evidenciado el rol de auxinas endógenas, específicamente del ácido indolacético

(AIA), en la formación de embriones cigóticos de zanahoria, concomitante con un

incremento en la concentración endógena de AIA luego de la fertilización de óvulos de

zanahoria, principalmente durante la etapa torpedo, para luego decaer a un nivel base

durante el posterior desarrollo del embrión (Ribnicky et al. 2002).

A su vez, la auxina más utilizada, en un 50% de los casos, para la inducción de

embriogénesis somática ha sido el 2,4-D (Raemakers et al. 1995). El 2,4-D se utiliza

como agente inductor en la etapa inicial del proceso de embriogénesis somática, ya que

la adición de este regulador de crecimiento en el medio de cultivo provoca un

incremento en la concentración de auxinas endógenas en las células receptoras, así

como un gradiente de auxina, el cual se postula como necesario para que se dé la

división asimétrica de las células y dé inicio el proceso de embriogénesis somática

(Jiménez 2005). Por último, una vez que las células somáticas han adquirido el

potencial para producir embriones somáticos es necesario disminuir la concentración del

2,4-D en el medio de cultivo, ya que este compuesto inhibe el posterior desarrollo de los

embriones (Raghavan 2005; Yang y Zhang 2010).

Embriogénesis somática en papaya Fernando et al. (2001) obtuvieron la formación directa de embriones somáticos en

papaya “Solo” a partir de embriones cigóticos utilizando una concentración de 2 mg/l de

2,4-D luego de 18 días de haber introducido el material. A su vez, a través de análisis

histológicos, lograron determinar que estos embriones somáticos se originaron a partir

de las células de la protodermis del embrión cigótico. Este mismo comportamiento se

observó con embriones cigóticos de la variedad “Maradol rojo” utilizando la misma

concentración de 2,4-D (Posada et al. 2007).

Luego de la evaluación de cuatro concentraciones de 2,4-D (3, 5, 10 y 15 mg/l) en el

medio de cultivo para la inducción de embriogénesis somática en papaya var. “Maradol

rojo”, se observó un mayor porcentaje de respuesta (embriones cigóticos de los cuales

emergieron embriones somáticos), así como mayor número de embriones somáticos por

explante, en los medios de cultivo con 5 y 10 mg/l de este regulador. A su vez, se

evidenció una mayor formación de callo a concentraciones de 10 y 15 mg/l de 2,4-D, a

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diferencia de las concentraciones de 3 y 5 mg/l, donde se obtuvo embriogénesis directa

(Posada et al. 2007).

Asimismo, embriones cigóticos de las variedades de papaya “Waimanalo”, “Sunset” y

“Sunrise” cultivados con la mitad de la concentración del medio de cultivo MS bajo un

gradiente de concentraciones del regulador 2,4-D han mostrado un comportamiento

similar a las variedades “Solo” y “Maradol rojo”, ya que hubo embriogénesis directa a

bajas concentraciones del regulador. Sin embargo, en varias selecciones del cultivar

“Kapoho”, al aumentar la concentración de 2,4-D en el medio de cultivo, aumentó el

porcentaje de embriones cigóticos con capacidad embriogénica directa, alcanzando

porcentajes de respuesta de entre 80 y 100% a 15 mg/l de 2,4-D en el medio de cultivo.

Por otra parte, cabe rescatar que en estos experimentos solamente fueron introducidos

en los respectivos medios de inducción los embriónes cigóticos, desechando el resto de

tejidos de cada una de las semillas, lo cual permite un mayor contacto de ambos

meristemos del embrión con el regulador de crecimiento utilizado (Fitch y Manshardt

1990).

Además, Mishra et al. (2007) indujeron la producción de embriones somáticos a partir

de embriones cigóticos desnudos en un medio de cultivo compuesto por la mitad de la

concentración de las sales minerales del MS, las vitaminas de MS, 2,4-D a una

concentración de 10 mg/l, sacarosa (6% p/v) y Difco bacto agar (0,8% p/v). Estos

embriones cigóticos se mantuvieron en la obscuridad a una temperatura promedio de

25°C. Estos autores reportan la aparición de embriones somáticos en estado globular

luego de cuatro semanas de cultivo.

La inducción de embriogénesis somática del cultivar “Maradol rojo” se ha logrado

también en trabajos posteriores utilizando un medio de cultivo MS al 50%, vitaminas

MS, 5 mg/l de 2,4-D, 400 mg/l de mio-inositol y 30 g/L de sacarosa. Posteriormente,

para la multiplicación de los embriones somáticos, se seleccionaron grupos de

aproximadamente 10-15 embriones somáticos en etapa globular y se colocaron en un

medio de cultivo con la mitad de la concentración de las sales MS, vitaminas MS, 400

mg/l de mio-inositol y 30 g/L de sacarosa bajo tres concentraciones de 2,4-D (2, 5 y 8

mg/l) (Rodríguez et al. 2009).

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Germinación de embriones somáticos de papaya Se ha evaluado el efecto de la adición de kinetina y BAP al medio de cultivo sobre la

germinación de embriones somáticos del cultivar “Maradol rojo”. Los mejores

resultados encontrados con ambos reguladores de crecimiento se dieron a una

concentración de 4 mg/l de kinetina y de 0,22 mg/l de BAP, obteniendo porcentajes de

germinación de 80% y 92%, respectivamente, luego de 30 días en cada medio de

germinación. El medio base fue un MS suplementado con mio-inositol a 100 mg/l,

vitaminas MS y sacarosa al 2% (Posada et al. 2007). Asimismo, se ha utilizado BAP

(0,2 mg/l) junto con ácido naftalénacético (ANA) (0,1 mg/l) en un medio de cultivo ½

MS suplementado con glutamina y sacarosa (3% p/v) y agar (0,8% p/v) para la

germinación de embriones somáticos de papaya (Mishra et al. 2007).

Por otra parte, se ha reportado el uso del ácido giberélico (AG3) en el medio de cultivo a

una concentración de 0,35 mg/l para la germinación de embriones somáticos maduros

(1,0 – 1,5 mm de longitud con una coloración verde y libres de anormalidades) de la

variedad “Maradol”. Lo anterior en un medio de cultivo MS adicionado con las

vitaminas de Chen et al. (1987), 100 mg/l de glutamina, 68 mg/l de hemisulfato de

adenina y 16 g/l de sacarosa (Ascencio-Cabral et al. 2008). Además, la germinación de

semillas de papaya de distintas variedades se ha visto favorecida por el uso de AG3

(100-200 ppm) en tratamientos con remojo previo a la siembra in vivo de las semillas,

obteniendo porcentajes de germinación del 50 al 60% (Bhattacharya y Khuspe 2001).

Por último, para la germinación de los embriones somáticos obtenidos a partir de

embriones cigóticos de los cultivares “Waimanalo”, “Sunset”, “Sunrise y “Kapoho” se

utilizó un medio de cultivo MS desprovisto de reguladores de crecimiento bajo

iluminación continua con fluorescentes de luz blanca y de 35 umol/m2/s de radiación

fotosintéticamente activa (PAR), a 27°C (Fitch y Manshardt 1990).

Producción de semilla artificial El uso de la técnica de propagación a través de semillas artificiales es una alternativa

para la propagación de híbridos de importancia económica, genotipos élite, plantas

modificadas mediante ingeniería genética y genotipos silvestres (Redenbaugh et al.

1988; Rai et al. 2009). Además, una de las aplicaciones más importantes para la

tecnología de producción de semilla artificial es la posibilidad de ser usada para la

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conservación a largo plazo de especies con semilla sexual recalcitrante dentro de bancos

de germoplasma (Nyende et al. 2005; Ozden-Tokatli et al. 2008).

El término de semilla artificial se refiere a la encapsulación artificial de un embrión

somático, yema vegetativa, agregado celular o algún otro tejido meristemático, el cual

posea la capacidad de regenerar una planta, ya sea bajo condiciones in vitro o ex vitro, y

que además sea capaz de mantener esta cualidad luego de periodos de almacenamiento

(Nyende et al. 2005; Rai et al. 2009). Por otra parte, la formación de semillas artificiales

a partir de embriones somáticos es más ventajosa que de los otros tejidos mencionados

anteriormente, debido a que el primero cuenta con un meristemo apical y otro radical, lo

que le permite regenerarse en una planta completa. Por último, el uso de embriones

somáticos para la producción comercial de semilla sintética radica en encontrar una

matriz de encapsulación adecuada y la utilización de embriones somáticos de alta

calidad (entiéndase por lo anterior un embrión somático similar a uno cigótico en cuanto

a morfología, fisiología y bioquímica). Es decir, el embrión somático debe tener la

capacidad de germinar, así como contar con un meristema apical y otro radical, los

cuales le permitan desarrollarse en una planta completa vigorosa (Redenbaugh et al.

1986; Saiprasad 2001; Khor y Loh 2005).

El procedimiento general para la fabricación de semilla artificial involucra depositar los

propágulos en la matriz gelificante, la cual contiene alginato de sodio a una determinada

concentración. Posteriormente, se toma una gota de la matriz gelificante, que contenga

uno de los propágulos, y se deja caer en la solución con CaCl2 o Ca(NO3)2 (solución

solidificante) por aproximadamente 40 min para que las gotas se gelifiquen. Luego, se

decanta la solución con CaCl2 y las cápsulas ya solidificadas se enjuagan con agua

destilada y se encuentran listas para almacenarse o ser sembradas. En forma general, se

reporta que la concentración mínima de CaCl2 requerida para que se dé un

endurecimiento adecuado de las cápsulas es de 50 uM con un tiempo de exposición de

30 min. Cabe mencionar, que durante esta fase de solidificación la sal divalente (CaCl2)

se acompleja con el polímero de alginato para formar un gel de alginato de calcio

(Redenbaugh et al. 1986).

La dureza de la cápsula de alginato de calcio está determinada por la concentración de

alginato de sodio, la concentración de CaCl2 y el tiempo de inmersión en esta última

solución (Rai et al. 2009). Al correlacionar la dureza de la cápsula de alginato de calcio

con la germinación de embriones somáticos de zanahoria, se encontró que, en la medida

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en que aumentaba la dureza de la cápsula, el porcentaje de germinación disminuía

debido a las dificultades mecánicas del embrión para romper la matriz del gel. A su vez,

Shigeta et al. (1990) reportan una menor germinación en aquellas semillas artificiales de

zanahoria con una dureza superior a 1,5 kg/cm2. A su vez, se ha determinado que la

dureza de una cápsula de alginato de calcio debe oscilar de 0,5 a 2,0 kg/cm2 para que

esta pueda ser manipulada sin problemas y el embrión sea capaz de germinar

(Redenbaugh et al. 1986).

Por otra parte, con el fin de mejorar el proceso de hidratación de las semillas artificiales

para facilitar la germinación, se ha implementado la inmersión de las cápsulas dentro de

una solución con algún ión monovalente, como por ejemplo una solución de KNO3 (200

uM), durante un determinado periodo de tiempo (Kumar et al. 2005). Durante el

periodo de inmersión de la cápsula en esta solución catiónica se sustituyen los iones

calcio de la matriz de alginato de calcio por los iones potasio, lo que provoca una

pérdida de solidez, facilitando así la germinación del embrión somático (Onishi et al.

1994) (Ver Figura 1).

Figura 1. Procesos de intercambio catiónico durante el endurecimiento de las cápsulas

de alginato de sodio y el pretratamiento de germinación con nitrato de

potasio. a) Inmersión en solución con CaCl₂ por 10 min. b) Lavado de

cápsulas. c) Inmersión en solución con nitrato de potasio (200 μM) durante 60

min. d) Lavado de cápsulas. e) Ruptura de la cápsula de alginato de calcio.

Modificado de Onishi et al. (1994).

Castillo et al. (1998) obtuvieron un 80% de germinación de semillas sintéticas de

papaya con una concentración de 2,5% de alginato de sodio y un tiempo de exposición

de 10 minutos en una solución de CaCl2 (50 uM). Por otra parte, para la encapsulación

de embriones somáticos de Mangifera indica L. cv. Amprali, se utilizó alginato de sodio

al 2% en la solución gelificante, y una concentración de 100 mM de CaCl2. A su vez, el

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tiempo de inmersión de la gota de la matriz gelificante con el embrión fue de 40 a 45

minutos (Ara et al. 1999).

Para el caso de la encapsulación de embriones somáticos de Citrus reticulata Blanco,

cv. Mandarino Tardivo di Ciaculli, se utilizó una solución gelificante al 2,5% de

alginato de sodio enriquecida con la mitad de las sales del medio MS, extracto de malta

(0,25 g/l), ácido ascórbico (0,25 g/l), ácido giberélico (1,0 mg/l), ANA (0,02 mg/l) y

sacarosa (6,8 g/l). Además, los embriones somáticos se sumergieron en una solución de

CaCl2 (99,12 μM) durante 30 minutos. Por último, las semillas artificiales se lavaron

con agua destilada varias veces con el fin de eliminar el exceso de iones calcio

(Germana et al. 2007).

Para la fabricación de semilla sintética de Quercus robur se encapsularon embriones

somáticos de aproximadamente 4 a 8 mm de longitud, en una matriz gelificante al 4%

de alginato de sodio disuelta en el medio líquido P₂₄ con sacarosa al 3%. Por otra parte,

para el proceso de endurecimiento a través del intercambio de iones sodio por iones

calcio, se tomó una alícuota de 0,10 a 0,15 ml de la matriz gelificante junto con el

embrión somático y se depositaron en la solución con CaCl2 50 μM. Posteriormente, las

cápsulas en formación se colocaron en una centrífuga a 75 rpm por 20 min con el fin de

favorecer el intercambio iónico. Por último, las cápsulas se enjuagaron con agua

destilada tres veces (Prewein y Wilhelm 2003).

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Objetivos

Objetivo General Evaluar la utilización de semilla sintética para la propagación clonal de papaya

“Pococí”.

Objetivos específicos Inducir la formación de embriones somáticos a partir de embriones cigóticos de

papaya “Pococí”.

Evaluar la multiplicación de embriones somáticos de papaya “Pococí” en medio

de cultivo líquido y sólido.

Evaluar el efecto de distintos tratamientos sobre la germinación de embriones

somáticos de papaya “Pococí”.

Encapsular embriones somáticos de Papaya “Pococí” bajo distintas matrices de

alginato de calcio y evaluar su germinación.

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Materiales y métodos

Localidad y financiamiento Los experimentos fueron financiados en el marco del proyecto de investigación 734-B3-

107, y se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Centro para

Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), ubicado en la Facultad de Ciencias

Agroalimentarias, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, San

Pedro.

Experimentos realizados

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos

En el presente experimento se evaluaron las siguientes concentraciones de la auxina

sintética 2,4-D: 2, 4, 6, 8 y 10 mg/l como agente inductor del proceso de embriogénesis

somática sobre embriones cigóticos de papaya “Pococí”, basándose en los trabajos

realizados por Fitch y Manshardt (1990) y Posada et al. (2007). El medio de cultivo

base para todos los tratamientos contenía la mitad de la concentración de las sales

minerales y todas las vitaminas del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962)

suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-glutamina (400 mg/l), sacarosa (3% p/v) y

Phytagel (0,28% p/v) según Clarindo et al. (2008). El pH del medio se ajustó a 5,8 y

posteriormente se esterilizó a 121°C y 1,05 kg/cm2 durante 30 minutos.

El tipo de explante utilizado en este experimento fueron embriones cigóticos desnudos y

semillas cortadas por la mitad. Para esto fue necesario extraer asépticamente semillas

del híbrido de papaya “Pococí” de varios frutos en su punto de madurez fisiológica

(fruto verde con una mancha amarilla). Los frutos se cosecharon de plantas cultivadas

en la Estación Experimental Fabio Baudrit, en el mes de octubre del año 2011. La

desinfección de los frutos se realizó flameando la superficie externa de los frutos

cerrados dentro de la cámara de flujo laminar. Luego, con un cuchillo de cocina estéril

se cortaron rebanadas de los frutos y se extrajeron las semillas. Estas se colocaron en

soportes de malla metálicos estériles donde se extendió la semilla y se dejó secar por 5

días dentro de la cámara de flujo laminar. Para la extracción de los embriones cigóticos,

a cada semilla se le realizaron dos cortes longitudinales cerca de su eje central,

utilizando un bisturí número 22, con lo cual se obtuvo un disco compuesto por un anillo

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de la sarcotesta, dentro del cual se encontraban secciones del endospermo y el embrión

cigótico. Luego, con la ayuda de un bisturí número 11, se rompió la sarcotesta, se

removieron los restos del endospermo y se extrajo el embrión cigótico. Este

procedimiento se llevó a cabo en condiciones asépticas dentro de la cámara de flujo

laminar. Los explantes introducidos se mantuvieron a la oscuridad y a una temperatura

de 25°C.

El diseño experimental utilizado fue un irrestricto al azar. Se consideró cada placa de

Petri de 90 mm, en la cual se colocaron cuatro embriones cigóticos o secciones de

semilla, como unidad experimental. Cada tratamiento estuvo compuesto por cinco

repeticiones. El experimento se evaluó por un período de 14 semanas. Las variables

porcentaje de formación de callo y porcentaje de oxidación fueron analizadas

estadísticamente mediante la prueba de Chi Cuadrado con un 95% de confianza. La

variable número de embriones somáticos se analizó mediante un análisis de varianza

(ANDEVA) con 95% de confianza.

2. Análisis histológico de callos embriogénicos

Luego de 12 semanas de cultivo, se realizó un estudio histológico de callos

embriogénicos provenientes de explantes cultivados en 2 y 6 mg/l de 2,4-D, para ello

las muestras se procesaron de acuerdo con la metodología descrita a continuación. La

fijación de los tejidos se realizó colocando las secciones de tejido en una solución de

formalina (37%), etanol (95%) y ácido acético (37%) (FAA) en una proporción 1-18-1

por aproximadamente 72 horas. Posteriormente, se removió el FAA de los tejidos,

sumergiendo los callos en agua destilada por dos horas. Luego, para la deshidratación,

se colocaron las secciones de callo en soluciones de alcohol etílico al 50% por 2 horas,

al 70% por 16 horas, al 80% por 2 horas, al 90% por 1 hora, al 95% por 1 hora, al 100%

adicionado con Eritrosina (2,0 mg/l) por 16 horas, en etanol absoluto por 3 horas (cada

hora se renovó la solución de etanol absoluto) y por último, en una solución de etanol

absoluto y xilol (1:1) por 2 horas.

Para infiltrar la parafina en los tejidos, estos se sumergieron en una mezcla de xilol y

parafina líquida (1:1) por 70 minutos, luego se transfirieron a una mezcla de xilol y

parafina sólida (1:1) por una hora en un estufa a 65°C, seguido de la mezcla de parafina

sólida y parafina líquida (1:1) por 16 horas a 65°C. Luego, los callos se sumergieron en

parafina sólida por un periodo de 48 horas, renovando la parafina sólida a las 8, 16 y 24

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horas a 65°C. Una vez infiltrada la parafina, se extrajeron las secciones de callo

embriogénico y se colocaron sobre una placa de Petri plástica (50 mm) llena hasta la

mitad de su volumen con parafina semisólida y luego se agregó parafina derretida hasta

el tope de la placa de Petri. Una vez que la parafina se solidificó se formaron bloques de

parafina, donde cada uno contenía una porción de callo y de parafina.

Se cortaron los bloques de parafina con los segmentos de callo en secciones de 8-10 µm

de grosor con un micrótomo de rotación (American Optical 820, Buffalo, USA). Los

cortes se dejaron reposar por 5-10 segundos sobre agua tibia (27-28°C) con el fin de

expandir la lámina de parafina; luego los cortes se colocaron sobre un portaobjetos.

Posteriormente se removió la parafina de los tejidos y se realizó la tinción de los cortes.

Para esto se sumergieron en xilol por 10 minutos dos veces, luego en una solución de

etanol al 95% por 5 minutos, etanol al 70% por 5 minutos, en etanol al 50% por 5

minutos, en solución de safranina (0,5%) y etanol (0,35%) por 5 minutos, en agua

destilada por 5 minutos, en etanol al 50% por 5 minutos, en etanol al 70% por 5

minutos, en etanol al 95% por 5 minutos, en una solución de verde “rápido” (1%) por 1

minuto, en etanol al 100% por 5 minutos, y en xilol, dos veces, por tres minutos. Una

vez teñidos los cortes, se observaron con un microscopio invertido Vert A1 (Zeiss,

Goettingen, Alemania) para evaluar el grado de desarrollo de los embriones somáticos

en los distintos callos embriogénicos. Además, se tomaron fotografías de los cortes más

representativos con una cámara digital Moticam Pro (Motic®, Xiamen, China) y estas

se procesaron con la ayuda del software Motic Images Plus 2.0 (Motic®, Xiamen,

China).

3. Efecto del cultivo en medios líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

En este experimento se evaluó el efecto de dos sistemas in vitro: el cultivo sobre medio

semisólido y el cultivo en medio líquido. En ambos casos el medio de cultivo utilizado

fue el mismo medio de cultivo base utilizado en el experimento anterior, adicionado con

2 mg/l de 2,4-D. El medio de cultivo sólido se endureció con Phytagel (0,28% p/v). El

pH de los medios de cultivo se ajustó a 5,8 y se esterilizó a 121°C y 1,05 kg/cm2

durante 30 minutos. Las condiciones de cultivo fueron las mismas establecidas para el

experimento anterior. Por último, el cultivo en medio líquido se mantuvo en agitación a

120 rpm en un agitador orbital horizontal (Hotech ®, San Chung, Taiwán).

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En este experimento se estableció como unidad experimental una placa de Petri (90

mm) para el cultivo en medio sólido y un frasco Erlenmeyer (50 ml) para el cultivo en

medio líquido y se establecieron cinco repeticiones por tratamiento. Debido al poco

material vegetal disponible para cada uno de los tratamientos de inducción de callos

embriogénicos, para establecer este ensayo de propagación se tomaron los callos

embriogénicos cultivados bajo las distintas concentraciones de 2,4-D y se mezclaron en

un beaker (250 ml) con el mismo medio de cultivo base adicionado con 2 mg/l de 2,4-

D. Luego, en cada unidad experimental, se colocaron 0,5 g de callo embriogénico más

25 ml de medio de cultivo. Luego de un mes de cultivo los callos embriogénicos en

medio sólido se subcultivaron al mismo medio, mientras que a las suspensiones

embriogénicas se les renovó el medio de cultivo cada 15 días.

El diseño experimental de este ensayo fue un irrestricto al azar. Las evaluaciones se

realizaron por un periodo de ocho semanas, en las cuales se determinó el número de

embriones somáticos producidos por unidad experimental, la ganancia en peso y el

porcentaje de embriones cotiledonares y globulares. El análisis estadístico de las

variables mencionadas se realizó mediante un ANDEVA y la prueba de Tukey con una

confiabilidad del 95%. Todos los tratamientos se transformaron con logaritmo base

diez.

4. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

Para la realización de este experimento se seleccionaron embriones somáticos de los

callos embriogénicos inducidos a partir de secciones de semillas de papaya “Pococí” en

todos los medios de inducción de embriogénesis somática con 2,4-D, los cuales habían

sido homogenizados dentro de un Erlenmeyer (250 ml) con 100 ml de agua destilada

estéril (ver sección 3 de Materiales y Métodos) y subcultivados por un periodo de dos

meses en el mismo medio de cultivo sólido utilizado en el experimento anterior. Los

embriones somáticos se seleccionaron con la ayuda de un estereoscopio SZ2-ILST

(Olympus, Tokyo, Japón) y se colocaron en los distintos tratamientos. El medio de

cultivo base para todos los tratamientos contenía las sales minerales y vitaminas de MS,

suplementados con sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v). El pH del medio se ajustó a 5,8

y el medio se esterilizó a 121°C y 1,05 kg/cm2 durante 30 minutos. Para esta prueba los

embriones somáticos seleccionados se encontraban en etapa cotiledonar y tenían una

longitud de 0,5 - 1,0 mm. Además, se evaluó el efecto de concentraciones crecientes de

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BAP (0, 0,2, 0,4, 0,6 y 0,8 mg/l) en el medio de cultivo, según trabajos realizados por

Posada et al. (2007). Las condiciones en las que se cultivaron los embriones somáticos

durante esta fase de germinación fueron: 49 μmol/m2/s de luz fluorescente, con un

fotoperiodo de 12 horas, temperatura promedio de 23°C y humedad relativa de 48%.

Los callos embriogénicos sobrantes se cultivaron en el medio de cultivo sólido utilizado

en el experimento de multiplicación.

El diseño experimental utilizado fue un irrestricto al azar. A su vez, como unidad

experimental se consideró una placa de Petri (90 mm), en la cual se colocaron cuatro

embriones somáticos. Además, por cada tratamiento se establecieron cinco repeticiones.

Por último, se determinó el porcentaje de germinación por un periodo de 30 días. El

análisis estadístico de los datos se realizó utilizando la prueba de Chi cuadrado con un

nivel de significancia superior al 95%.

5. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas sintéticas de papaya “Pococí”

Los embriones somáticos utilizados provenían del tratamiento de multiplicación de

embriones somáticos, cuyo medio de cultivo estaba compuesto por la mitad de la

concentración de las sales minerales y la dosis normal de vitaminas del medio de cultivo

MS suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-glutamina (400 mg/l), sacarosa (3%

p/v), adicionado con 2 mg/l de 2,4-D y solidificado con PhytagelTM (0,28%). El

procedimiento de encapsulación utilizado se basó en el protocolo propuesto por Castillo

et al. (1998). La encapsulación de los embriones somáticos se realizó de manera

individual, por lo que fue necesario seleccionar y separar cada embrión somático (0,5-

1,0 mm de longitud) del conglomerado en el que se encontraban utilizando pinzas de

punta fina y un estereoscopio SZ2-ILST (Olympus, Tokyo, Japón). Cada embrión

somático se sumergió en una solución de ácido algínico. Luego, con ayuda de una

pipeta de vidrio con 2,5 mm de diámetro interno, se succionaron aproximadamente 200

µl de la solución de ácido algínico más el embrión somático y se depositaron en una

solución de CaCl2 por 30 minutos. Por último, se decantó la solución de CaCl2 y las

cápsulas así formadas se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Todo el

proceso se llevó a cabo dentro de la cámara de flujo laminar.

Durante este experimento se evaluó el efecto de tres concentraciones de ácido algínico

(2,5, 3,5 y 4,5% p/v) y dos concentraciones de CaCl2 (50 y 100 mM) sobre la dureza de

las cápsulas de alginato de calcio y la germinación de las semillas artificiales de papaya

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17

“Pococí”. A cada solución de ácido algínico se le agregaron las sales minerales del

medio de cultivo MS a la mitad de la concentración, con excepción del calcio que no se

agregó, sacarosa (3% p/v) y BAP (0,4 mg/l). El pH de todas las soluciones y los medios

de cultivo se ajustó a 5,8 y estos se esterilizaron a 121°C y 1,05 kg/cm2 durante 30

minutos. Previo a la esterilización, fue necesario calentar levemente las soluciones de

ácido algínico para disolverlas.

Además, se estudió el efecto de una inmersión por 30 minutos de las semillas

artificiales en una solución de KNO3 (200 mM) sobre la germinación de las mismas.

Este tratamiento se realizó dentro de la cámara de flujo laminar utilizando beakers (20

ml) estériles. Luego de la inmersión en KNO3, las semillas artificiales se enjuagaron tres

veces con agua destilada estéril. Las semillas artificiales se sembraron en un medio de

cultivo MS adicionado con BAP (0,4 mg/l), sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v) en

placas de Petri (90 mm de diámetro). Las condiciones en las que se cultivaron las

semillas artificiales durante esta fase de germinación fueron: 49 μmol/m2/s de luz

fluorescente, con un fotoperiodo de 12 horas, temperatura promedio de 23°C y humedad

relativa de 48%. Las placas se colocaron en el piso inferior de uno de los estantes de

crecimiento ya que esto evita la deshidratación del medio y la condensación de agua en

la parte superior de la placa de Petri.

El diseño experimental utilizado fue irrestricto al azar. Se estableció cada placa de Petri

como unidad experimental, la cual contenía cinco semillas artificiales. Para cada

tratamiento se establecieron cinco repeticiones. Se evaluó el porcentaje de brotación y

de oxidación de los embriones somáticos por un periodo de 12 semanas. También se

evaluó la dureza de las semillas artificiales, para lo cual se produjeron cápsulas de

alginato de calcio de cada tratamiento de encapsulación de acuerdo con la metodología

descrita anteriormente, pero sin incluir los embriones somáticos dentro de las cápsulas.

La determinación de la dureza de las cápsulas se realizó con un texturómetro digital

(TA-TX Plus Texture Analyzer, Stable Micro Systems LTD., Godalming, Reino Unido)

equipado con una punta cilíndrica (3 mm de diámetro) que penetró una distancia de 2,5

mm de profundidad sobre la cápsula, a una velocidad de 1,5 mm/s. La fuerza de ruptura

se determinó mediante el cálculo del área bajo la curva desde el inicio de la penetración

hasta alcanzar el pico máximo de ruptura y se expresó en N•mm-1.

La variable fuerza de ruptura, el porcentaje de brotación y el porcentaje de oxidación se

analizaron mediante un ANDEVA factorial con el fin de determinar el efecto ejercido

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por cada factor, y luego se aplicó una prueba Tukey para la comparación de medias.

Debido a problemas con la normalidad de los porcentajes fue necesario transformar

ambas variables con la raíz de y. Con el fin de evaluar si existían diferencias

significativas entre el testigo absoluto y los distintos tratamientos de encapsulación se

realizó una prueba de Chi cuadrado entre ambos grupos.

6. Programas estadísticos Todos los análisis de varianza se realizaron con el programa estadístico Statistica 8.0

(StatSoft Inc., Tulsa, EUA). Por otra parte, los análisis de Chi cuadrado se realizaron

con el programa estadístico Infostat versión 2008 (Grupo InfoStat FCA, Universidad

Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina).

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19

Resultados

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos

En ninguno de los tratamientos de inducción se dio la formación de callo o de

embriones somáticos al utilizar embriones cigóticos desnudos, así como tampoco se

observó la oxidación de los mismos, durante todo el periodo de evaluación. En las

secciones de semilla la formación de callo fue evidente luego de 8 semanas de cultivo

en los tratamientos con 2, 4, 6 y 8 mg/l de 2,4-D. Se observó que los callos

embriogénicos obtenidos a partir de secciones de semilla se originaron en la región del

meristemo apical de los embriones cigóticos. En cuanto a la oxidación de los explantes

introducidos, en todos los tratamientos se observaron porcentajes inferiores al 5%.

Como se observa en la Figura 2.A, las concentraciones de 4 y 6 mg/l de 2,4-D indujeron

mayor formación de callo a las 8 semanas de cultivo (45% y 55% respectivamente) en

comparación con las concentraciones de 8 y 10 mg/l (15% y 0% respectivamente). En

esta misma fecha de evaluación, al utilizar una concentración de 2 mg/l de 2,4-D se

obtuvo un porcentaje de formación de callo del 25%; sin embargo, la respuesta entre

repeticiones fue muy variable por lo que no mostró diferencias significativas con

respecto a los demás tratamientos.

Al avanzar el periodo de evaluación, los explantes cultivados con las concentraciones de

4 y 6 mg/l no mostraron diferencias significativas en cuanto a la formación de callo en

comparación con el resto de las dosis utilizadas. Además, a las 14 semanas de cultivo se

evaluó la formación de callos embriogénicos y se observó en todos los tratamientos un

porcentaje de formación de callos embriogénicos del 25% al 33%, sin presentar

diferencias significativas entre tratamientos (datos no presentados). El ámbito en la

producción de embriones somáticos entre los distintos tratamientos fue de 11 a 31

embriones somáticos cotiledonares por callo embriogénico y no se observó ninguna

diferencia significativa sobre esta variable al utilizar distintas concentraciones de 2,4-D

(Figura 2.B).

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Figura 2. A. Efecto del 2,4-D sobre la formación de callo a partir de secciones de

semillas de papaya “Pococí” durante un periodo de 14 semanas. B.

Producción total de embriones somáticos (ES) de papaya por callo

embriogénico observado. Letras distintas muestran diferencias significativas

con un nivel de confianza del 95%.

La formación de embriones somáticos en los distintos tratamientos se dio de manera

desincronizada, ya que luego de 12 semanas de cultivo algunos de los callos solo

presentaron conglomerados de células menos vacuoladas y con citoplasmas densos

(Figura 3.A), mientras que en otros se observaron estructuras proembrionarias, las

cuales no tenían una conexión vascular con el resto del callo (Figura 3.B). O bien, como

se observa en la Figura 3.C, en otros callos los embriones somáticos se encontraban en

un estado cotiledonar con una anatomía normal, es decir contaban con una radícula,

hipocótilo y cotiledones. Además, en los estados iniciales del desarrollo de los

embriones somáticos de papaya no se apreció de forma clara la presencia de un

suspensor (Figura 3.A).

a a

a

a

a

0

5

10

15

20

25

30

35

2 mg/l 4 mg/l 6 mg/l 8 mg/l 10 mg/l

me

ro d

e E

S /

callo

Concentración de 2,4-D

ab

abc

a a

a

a

a

a aa

a

bc

bca

c

c

a a

0

10

20

30

40

50

60

70

6 8 10 12 14

Form

ació

n d

e c

allo

(%

)

Semanas de evaluación

2 mg/l

4 mg/l

6 mg/l

8 mg/l

10 mg/l

A

B

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Figura 3. Cortes histológicos de callos embriogénicos cultivados en medios de cultivo

adicionados con 6 mg/l de 2,4-D (A y B) y 2 mg/l de 2,4-D (C) luego de 12

semanas de cultivo. Escala igual a 1 mm. Flechas indican un punto

meristemático (A), estructuras proembrionarias (B) y un embrión somático

(C).

2. Efecto del cultivo en medios líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

Como se observa en la Figura 4.A., luego de un periodo de ocho semanas, la

propagación de embriones somáticos en medio líquido fue mayor que al cultivarlos en

medio sólido. El número de nuevos embriones somáticos en el sistema de cultivo sólido

fue de 307 y en el sistema de cultivo líquido la media fue de 1326 por unidad

experimental. En ambos sistemas de cultivo el porcentaje de embriones somáticos en

etapa globular-torpedo fue significativamente mayor en comparación con el porcentaje

A B

C

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de embriones en etapas cotiledonares, con valores de 85,30% y 14,70% en suspensiones

embriogénicas y cultivo en medio sólido, respectivamente (Ver Figura 4.B).

Figura 4. Efecto del sistema de cultivo sobre el número de embriones somáticos (ES)

producidos (A), el crecimiento del callo (A) y el desarrollo de los ES (B),

luego de ocho semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias

significativas con un nivel de confianza del 95%.

Transcurrido el periodo de cultivo, los callos embriogénicos presentaron un crecimiento

estadísticamente similar en ambos sistemas de cultivo, donde el peso final obtenido en

el sistema de cultivo sólido y líquido fue de 2,08 g y 1,65 g, respectivamente.

Por otro lado, el porcentaje de formación de embriones somáticos entre las etapas

globular y torpedo en medio líquido fue significativamente mayor (85,3%) al obtenido

en medio sólido (57,0%) (ver Figura 4B y 5). En ninguno de los dos sistemas de cultivo

se presentaron problemas de oxidación.

b

a

a

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Sólido Líquido

Cre

cim

ien

to d

el c

allo

em

bri

ogé

nic

o (

g)

Pro

du

cció

n d

e E

S (u

nid

ade

s)

Medio de cultivo

Conteo ES Peso (g)

A

b

a

c

d

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Sólido Líquido

Form

ació

n d

e E

S (%

)

Medio de cultivo

ES globulares

ES cotiledonares

B

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Figura 5. Embriones somáticos desarrollados a partir de secciones de semillas de

papaya en medio de cultivo líquido (A) y sólido (B). Barras equivalentes a 1

mm.

3. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

El crecimiento del meristemo apical de los embriones somáticos se dio luego de dos

semanas de cultivo en todos los tratamientos con BAP, donde se observaron porcentajes

de brotación de los embriones somáticos del 23%, 19%, 14%, 7,8% y 3,3% en los

medios de cultivo añadidos con 0,4 mg/l, 0,6 mg/l, 0,2 mg/l, 0,8 mg/l y 0 mg/l (testigo)

de BAP, respectivamente. El análisis estadístico indicó que no existen diferencias

significativas entre los tratamientos adicionados con BAP en ese momento. Sin

A

B

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embargo, sí existió una diferencia significativa entre este mismo grupo de tratamientos

y el testigo (Figura 6).

Figura 6. Efecto de varias concentraciones de BAP sobre la brotación de embriones

somáticos de papaya durante un periodo de cultivo de cuatro semanas (letras

distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del

95%).

Para la tercera semana de cultivo se observó un porcentaje de brotación del 34% y 24%

en los tratamientos adicionados con 0,4 mg/l y 0,6 mg/l de BAP, sin diferencias

estadísticamente significativas entre ambos tratamientos. La adición de 0,2 mg/l de BAP

al medio de cultivo no mejoró significativamente la brotación de los embriones

somáticos, ya que este tratamiento no presentó diferencias significativas con respecto al

testigo. Además, a partir de esta fecha fue posible observar que la concentración de 0,8

mg/l de BAP ejerció un efecto detrimental sobre la brotación de los embriones

somáticos, ya que la brotación de los embriones somáticos en este tratamiento fue

significativamente menor a la obtenida en los tratamiento con 0,6 y 0,4 mg/l. En la

última semana de evaluación, los tratamientos con 0,4 mg/l y 0,6 mg/l de BAP

presentaron los porcentajes de brotación más altos, con 40% y 27% de brotación,

respectivamente. Con respecto a los tratamientos con 0,2 mg/l, 0,8 mg/l de BAP y el

testigo se observó la misma tendencia de la fecha anterior (Figura 6).

ab c d

abc bc

a

a

a

a

abab

a c cd

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4

Bro

taci

ón

de

ES

(%)

Semanas

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

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En la Figura 7.A se muestra la formación de una raíz en un embrión somático cultivado

en el tratamiento sin BAP. El porcentaje de enraizamiento osciló entre 0% y 5,5%, sin

presentar diferencias significativas entre tratamientos (Figura .A).

Figura 7. Enraizamiento y brotación de embriones somáticos de papaya cultivados en

un medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento (A) y otro adicionado

con 4 mg/l de BAP (B). Barras equivalentes a 1 mm. Flecha indica formación

de callo en la base de los embriones somáticos.

Además, se observó la formación de callo en la región basal de los embriones

somáticos, por lo que se evaluó el efecto de las distintas concentraciones de BAP sobre

este parámetro (Figura 7.B). En el testigo, el 20% de los explantes introducidos

formaron callo. En los tratamientos con 0,2 mg/l, 0,4 mg/l, 0,6 y 0,8 mg/l de BAP se

observó un porcentaje de formación de callo del 28%, 33%, 46% y 38%,

respectivamente, siendo los dos últimos tratamientos estadísticamente distintos del

testigo (Figura .A). Por otra parte, el 45% de los embriones somáticos cultivados en el

medio de cultivo adicionado con 0,8 mg/l de BAP se oxidaron, valor estadísticamente

distinto de aquellos obtenidos para el resto de los tratamientos (Figura .B). La oxidación

para el resto de los tratamientos osciló entre el 13% y 23%, sin diferencias significativas

entre ellos.

A B

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Figura 8. Efecto de distintas concentraciones de BAP sobre la formación de callo y

raíces (A) y sobre la oxidación (B) de los embriones somáticos (ES) durante

cuatro semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas

con un nivel de confianza del 95%.

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas sintéticas de Papaya “Pococí”

En forma paralela a la formación de semillas artificiales de papaya “Pococí” (Figura

9.A) y su colocación en los distintos medios de germinación, se determinó la fuerza de

ruptura de las cápsulas con las distintas concentraciones de alginato de sodio y CaCl2

(sin embrión en su interior).

b

ab

ab

a

a

a

a

a a a-1

1

3

5

7

9

11

13

15

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

Riz

ogé

ne

sis

de

ES

(%)

Cal

logé

ne

sis

en

ES

(%)

Concentración de BAP

Callo Raiz

b

bb

b

a

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

Oxi

dac

ión

de

ES

(%)

Concentración de BAPB

A

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Figura 9. Semillas artificiales de papaya “Pococí” elaboradas con (A) 4,5% de alginato

de sodio y 100 mM de CaCl2 lista para ser cultivada; (B) tratada con 200 mM

de KNO3 por 20 minutos previo a su cultivo y (C) otra brotada luego de 12

semanas de cultivo. Barras equivalentes a 3 mm. Flecha indica el lugar de la

fisura de la semilla sintética.

Como se observa en la Figura 10, las cápsulas más duras fueron aquellas producidas con

las soluciones de ácido algínico al 3,5% y 4,5%, y las soluciones de CaCl2 a 100 mM

(1,31 N•mm y 1,18 N•mm, respectivamente). Las cápsulas fabricadas con las soluciones

al 2,5% y 3,5% de ácido algínico y gelificadas en una solución de CaCl2 a una

concentración de 50 mM presentaron fuerzas de ruptura de 0,41 N•mm y 0,28 N•mm,

respectivamente, las cuales fueron significativamente menores que el resto de los

tratamientos.

Al elaborar cápsulas con ácido algínico al 4,5% y CaCl2 a 50 mM se produjeron

cápsulas con una fuerza de ruptura de 0,79 N•mm, las cuales no presentaron diferencias

significativas con respecto a las cápsulas elaboradas con una solución de ácido algínico

al 2,5% y gelificadas en una solución de CaCl2 a 100 mM (0,94 N•mm). Por último,

todas las cápsulas tratadas con KNO3 (200 mM) se fisuraron al momento en que la

aguja del texturómetro comenzó a ejercer presión sobre ellas, por lo que no fue posible

determinar su fuerza de ruptura (ver Figura 9.B). A pesar de lo anterior, el KNO3 no

presentó una interacción significativa con el alginato de sodio (p: 0,1388), el CaCl2 (p:

0,6425) o con ambos factores (p: 0,9604) sobre la brotación de las semillas artificiales.

A B C

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Figura 10. Dureza de las cápsulas de alginato de calcio elaboradas con distintas

concentraciones de alginato de sodio y gelificadas con dos concentraciones

de CaCl2.

En cuanto al comportamiento de las semillas sintéticas luego de 4 semanas de cultivo,

los embriones somáticos sin encapsular mostraron 30% de brotación; sin embargo, en

los distintos tratamientos de encapsulación el porcentaje de brotación fue inferior al

10% (datos no mostrados). El experimento se continuó evaluando hasta alcanzar un

periodo de cultivo de 12 semanas, momento en el cual 64% de los embriones sin

encapsular habían brotado (datos no presentados), valor significativamente mayor a los

obtenidos en todos los tratamientos de encapsulación (Figura 11.A), que osciló entre 4%

(100 mM de CaCl2 con 2,5 y 3,5% de ácido algínico) y 28% (50 mM de CaCl2 y 4,5%

de ácido algínico). Según el análisis estadístico, para esta variable no hubo diferencias

significativas entre los distintos tratamientos de encapsulación. En la Figura 9.C se

muestra la brotación de una semilla artificial de papaya “Pococí”. Por último, el

coeficiente de correlación entre la dureza de las cápsulas y el porcentaje de brotación

fue de 0,0294.

Con respecto a la oxidación de los embriones somáticos encapsulados, el análisis

estadístico indica que existió una interacción entre la concentración de CaCl2 y el

tratamiento de las cápsulas con KNO3. Sin embargo, según el análisis estadístico,

solamente el porcentaje de oxidación de las cápsulas gelificadas con 100 mM de CaCl2

sin tratar con KNO3 fue significativamente distinto de los demás tratamientos (Figura

11.B). Por último, la oxidación de los embriones somáticos sin encapsular (27%) fue

estadísticamente igual al observado en todas las semillas sintéticas (p: 0,5709).

cc

bb

a a

0.00.20.40.60.81.01.21.4

2.50% 3.50% 4.50% 2.50% 3.50% 4.50%

Ácido Algínico Ácido Algínico

50 mM CaCl₂ 100 mM CaCl₂Re

sist

en

cia

me

cán

ica

(N*

mm

)

Tratamientos

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Figura 11. A. Efecto del uso de distintas concentraciones de ácido algínico y CaCl2

durante la encapsulación de embriones somáticos de papaya, así como de

una inmersión en KNO3 (200 mM) previo al cultivo, sobre la brotación (A)

y oxidación (B) de la semilla sintética de papaya luego de 12 semanas de

cultivo.

A

b

b

a

b

0

10

20

30

40

50

60

70

(-) KNO₃ (+) KNO₃ (-) KNO₃ (+) KNO₃

50 mM CaCl₂ 100 mM CaCl₂

Oxi

dac

ión

de

ES

(%)

TratamientosB

a

a

a

a

a

a

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

2,50% 3,50% 4,50% 2,50% 3,50% 4,50%

Ácido Algínico Ácido Algínico

50 mM CaCl₂ 100 mM CaCl₂

Bro

taci

ón

de

ES

(%)

Tratamientos de encapsulación

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30

Discusión

1. Efecto de la concentración de 2,4-D sobre la inducción de embriones somáticos

La inducción de embriones somáticos a partir de embriones cigóticos desnudos se ha

reportado en varios cultivares de papaya (“Co7”, “Solo”, “Maradol” y “Maradol Rojo”

y otros cultivares hawaianos) (Fitch y Manshardt 1990; Castillo et al. 1998; Posada et

al. 2007; Ascencio-Cabral et al. 2008; Anandan et al. 2012). Sin embargo en este

trabajo, los embriones cigóticos desnudos de papaya “Pococí” no respondieron al

cultivarse en un medio adicionado con 2,4-D, lo cual podría estar relacionado con el

grado de madurez (aproximadamente 130-150 días después de la antesis) en el que estos

se encontraban al momento de ser extraídos de la semilla. Al respecto, Anandan et al.

(2012) observaron que los embriones cigóticos extraídos de semillas maduras y negras

(140-150 días después de la antesis) del cultivar “Co7” no respondieron ante el estímulo

con 2,4-D, a diferencia de aquellos embriones cigóticos extraídos de semillas inmaduras

(110-120 días después de la antesis), las cuales se caracterizaban por presentar una

coloración blanca.

Si bien se observó visualmente que los callos obtenidos de las secciones de semilla de

papaya “Pococí” se generaron a partir del embrión cigótico, los cuales se elongaron un

poco, es necesario realizar un análisis histológico en el momento en que se inicia la

formación de callo, para descartar que se genere a partir de tejido materno. Asi lo

describieron Vila et al. (2003), quienes realizaron estudios histológicos luego de tres

días de iniciado el cultivo de embriones cigóticos (con y sin nucela) y de ovarios de

Melia azedarach para determinar el tejido del cual se originan los embriones somáticos

durante su inducción. Por otra parte, la formación de embriones somáticos de papaya

“Pococí” a partir de algún tejido materno podría no ser muy alta. Ya que, se ha

observado, en otras especies, que el porcentaje de formación de embriones somáticos a

partir de tejidos maternos es muy bajo, como en el cultivar “Ataulfo” de Mangifera

indica, donde la formación de embriones somáticos a partir de estos mismos tejidos se

dio en solo el 10 % de los explantes (Rivera-Domínguez et al. 2004).

A las ocho semanas de cultivo, los explantes de papaya “Pococí” cultivados en un

gradiente de 2,4-D presentaron un comportamiento similar al que observaron Anandan

et al. (2012). Estos autores obtuvieron los mayores porcentajes de formación de callo al

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31

utilizar concentraciones entre los 2 y 6 mg/l de 2,4-D, observando un pico de respuesta

de 87% de formación de callo con la primera concentración, siendo el 75% de estos

embriogénicos. Además, los mismos autores observaron que al utilizar concentraciones

mayores a 2 mg/l disminuyó significativamente la formación de callo, lo cual indica un

efecto inhibitorio del proceso de inducción de callo por parte del regulador de

crecimiento a partir de cierto umbral (Anandan et al. 2012). Lo anterior podría explicar

los menores porcentajes de formación de callo en los explantes de papaya “Pococí”

cultivados bajo concentraciones de 2,4-D superiores a los 6 mg/l, indicando un menor

grado de susceptibilidad de este genotipo a las altas concentraciones de este mismo

regulador de crecimiento.

Luego de 14 semanas de cultivo, 65% de los explantes de papaya “Pococí” cultivados

en una concentración de 4 mg/l de 2,4-D formaron callo, porcentaje que no fue

significativamente distinto del observado con las otras concentraciones del regulador.

Además, el porcentaje de formación de callo embriogénico y el número de embriones

somáticos obtenidos tampoco varió significativamente entre tratamientos, lo cual indica

que concentraciones mayores de 2 mg/l de 2,4-D no promovieron la transición de un

mayor número de células somáticas hacia un estado embriogénico. Fitch y Manshardt

(1990) observaron un comportamiento similar en la variedad de papaya “Kapoho” al

cultivar embriones cigóticos desnudos (cosechados 104 días después de la floración), ya

que dichos explantes presentaron un porcentaje de formación de callo similar, sin

importar la concentración de 2,4-D utilizada.

El desarrollo no sincronizado de los embriones somáticos y la alta variabilidad de

respuesta obtenida en cada tratamiento es un fenómeno que se ha observado al cultivar

embriones cigóticos de otras variedades de papaya (“Sunrise”, “Sunset”, “Waimanalo”

y “Kapoho”), así como en Vitis vinifera y Quercus robur, y es atribuido a que no todas

las células somáticas de los explantes cultivados cuentan con el mismo potencial

genético para llevar a cabo el proceso de embriogénesis somática (Fitch y Manshardt

1990; Jayasankar et al. 2003; San-José et al. 2010). Lo anterior puede estar relacionado

con la capacidad de las células de los explantes de papaya de modificar sus patrones de

metilación de la cromatina y por ende sus patrones de expresión génica, durante su

cultivo con 2,4-D (Verdeil et al. 2007). El efecto del 2,4-D durante la inducción

embriogénica posiblemente se relaciona con un incremento en la metilación total del

tejido, tal como en el caso de la inducción de embriones somáticos de la accesión 85 de

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Acca sellowiana a partir de embriones cigóticos tratados con un breve estímulo de 2,4-

D (200 mM), el cual indujo la formación de embriones somáticos, así como un aumento

de la tasa de metilación total de los explantes. Por otra parte, al tratar los embriones

cigóticos con un estímulo del agente hipometilante 5-azacitidina (100 μM) y su

posterior cultivo en un medio de cultivo adicionado con 50 μM de este compuesto, no se

observó la formación de embriones somáticos y la metilación total de los explantes

disminuyó conforme avanzó el periodo de cultivo (30 días) (Fraga et al. 2012).

Las estructuras observadas en la figura 3.B, son probablemente estructuras nodulares

embriogénicas o embriones somáticos en etapa globular, las cuales se caracterizan por

la carencia de una estructura similar a un suspensor, y fueron semejantes a los

generados a partir de segmentos nodales de Quercus robur, los cuales cuentan con

puntos meristemáticos que dieron origen a embriones somáticos normales (San-José et

al. 2010). Es común observar la formación del suspensor en etapas muy tempranas del

desarrollo embrionario y hasta la etapa globular, ya que luego de desarrollarse por

completo y en las etapas finales del desarrollo, el suspensor atraviesa un proceso de

senescencia, como en el caso de las especies Acca sellowiana y Sorbus pohuashanensis

(Jayasankar et al. 2003; Yang et al. 2012).

2. Efecto del medio líquido y sólido sobre la propagación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

El mayor número de embriones somáticos de papaya obtenido al subcultivar los callos

embriogénicos en medio de cultivo líquido puede estar relacionado con las ventajas que

ofrece este sistema de cultivo. La disociación de los conglomerados de embriones, una

mayor exposición de los tejidos al medio y sus componentes, una buena aireación,

provocada por la agitación leve de los Erlenmeyers, son varias de estas ventajas y se

considera que son las que mayor influencia ejercen sobre la formación de nuevos

embriones somáticos (Jiménez et al. 2011; Remakanthan et al. 2013). Un resultado

similar se ha obtenido al cultivar callos embriogénicos de los cultivares “Deglet Nour”,

“Bousthami noir” y “Jihel” de la especie Phoenix dactylifera, obteniendo en algunos

casos incrementos del 20% en cuanto al número de embriones somáticos producidos al

comparar el sistema de cultivo en medio líquido con el sólido (Fki et al. 2003; Al-

Khayri 2012). Litz y Conover (1983) lograron establecer suspensiones embriogénicas

de papaya en un medio de cultivo MS adicionado con 1-2 mg/l de 2,4-D, en las cuales

se observó la proliferación de embriones somáticos luego de 1-2 meses de cultivo,

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resultado muy similar al observado en las suspensiones embriogénicas de papaya

“Pococí”. Además, las suspensiones embriogénicas de papaya establecidas por estos

últimos autores se subcultivaron regularmente por un periodo de un año sin aparente

pérdida de la capacidad regenerativa. Si las suspensiones embriogénicas de papaya

“Pococí” presentaran un comportamiento similar se facilitaría la propagación a mayor

escala de este genotipo ya que no sería necesario realizar la inducción de nuevos callos

embriogénicos con mucha frecuencia.

Por último, en ambos sistemas, los callos embriogénicos presentaron el mismo

crecimiento; sin embargo, el mayor número de embriones somáticos así como el menor

desarrollo de los embriones se dio en el sistema líquido, lo cual indica un efecto del

sistema de cultivo sobre el desarrollo de los embriones somáticos recién formados. En

otras especies se han observado situaciones similares. Tal es el caso de los embriones

somáticos de Phoenix dactylifera L. cv. “Deglet Nour” cultivados en medio sólido, los

cuales presentaron un crecimiento más lento, así como menor número de embriones

somáticos, al compararlos con el sistema líquido (Fki et al. 2003). Se considera que la

diferenciación de embriones globulares hacia etapas posteriores del desarrollo

embrionario es inhibida por el cultivo continuo del material en presencia de auxinas,

debido a la síntesis de ARNm y proteínas que detienen el desarrollo embrionario

(Jiménez 2001). Esta regulación también se puede dar a nivel de la cromatina, ya que se

ha observado que el uso de 5-azacitidina (10 μM), como agente hipometilante, en

conjunto con 2,4-D (200 mM) para la inducción de embriones somáticos de Acca

sewolliana, detiene el desarrollo de los mismos, los cuales se mantienen en etapas de

desarrollo previas a la fase acorazonada (Fraga et al. 2012). Lo anterior indica que el

cultivo en medio líquido de callos embriogénicos de papaya “Pococí” posiblemente

modifica los patrones de metilación y expresión génica de los mismos, ocasionando un

aumento en la producción de nuevos embriones somáticos, así como un retraso en su

desarrollo.

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3. Efecto del BAP sobre la germinación de embriones somáticos de papaya “Pococí”

La poca germinación de los embriones somáticos de papaya “Pococí” en este trabajo,

así como lo observado por otros autores, en otros genotipos, al ser cultivados en un

medio desprovisto de reguladores de crecimiento, indica la necesidad de algún estímulo

adicional para favorecer este proceso (Fitch y Manshardt 1990; Anandan et al. 2012). El

BAP se ha utilizado en muchas especies durante distintas etapas del proceso de

embriogénesis somática, ya sea durante su inducción o bien durante la diferenciación y

germinación de los embriones somáticos (Raemakers et al. 1995; Fehér 2006;

HaeYoung y ChangHoo 2009). Según este trabajo, el rango de concentración adecuado

de BAP para la brotación de los embriones somáticos de papaya “Pococí” es de 0,4-0,6

mg/l de BAP. Este resultado coincide con aquellos obtenidos por Posada et al. (2007),

quienes evaluaron el efecto de varias concentraciones de BAP sobre la germinación de

embriones somáticos de la variedad de papaya “Maradol rojo” y el mejor resultado se

obtuvo al utilizar una concentración de 0,22 mg/l de BAP, alcanzando un porcentaje de

germinación del 92%, luego de 30 días en el medio de germinación.

Los embriones somáticos de papaya “Pococí” cultivados en todos los medios de cultivo

presentaron un enraizamiento muy bajo. Un resultado similar fue obtenido por Clarindo

et al. (2008) al cultivar embriones somáticos de papaya “Golden” en un medio de

cultivo MS desprovisto de reguladores de crecimiento. Una posible explicación para

este comportamiento es que los embriones somáticos de papaya “Pococí” no culminaron

el proceso de maduración. Al respecto, Pullman et al. (2003) indican que embriones

cigóticos cotiledonares maduros de Pinus taeda presentaron una germinación adecuada,

donde germinó primero la radícula y posteriormente el hipocótilo, mientras que, por el

contrario, embriones cotiledonares en una fase temprana desarrollaron primero el

hipocótilo y la formación de raíces fue muy escasa. Con el fin de mejorar el

enraizamiento de los embriones somáticos de papaya “Pococí” se podría evaluar el

efecto de la adición de BAP junto con ANA al medio de cultivo, ya que se ha

determinado que ambos reguladores de crecimiento aplicados en conjunto tienen un

efecto sinérgico sobre el desarrollo y la germinación de estos (Wong et al. 2013). Esta

estrategia se ha evaluado con embriones somáticos de los variedades de papaya

“Eksotika” y “CO7”, obteniendo porcentajes de germinación del 62% y 100%,

respectivamente, al cultivarlos en medios adicionados con BAP (0,2 y 0,4 mg/l,

respectivamente) y de ANA (0,2 -0,02 mg/l, respectivamente) (Mishra et al. 2007;

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Anandan et al. 2008; Anandan et al. 2012; Bukhori 2013). Luego de un periodo de

cultivo de 35 a 45 días, los embriones somáticos germinados de la variedad “CO7” se

convirtieron en plántulas completas (Anandan et al. 2012). Sin embargo, los embriones

somáticos de la variedad “Eksotika”, luego de tres meses de cultivo en las condiciones

descritas anteriormente, no presentaron formación de raíces por lo que fue necesario

subcultivarlos por un periodo de ocho semanas en un medio MS adicionado con 2,0

mg/l de ácido indolbutírico (AIB) (Bukhori 2013).

Lo anterior constituye una alternativa para la posible regeneración de plantas de papaya

“Pococí”, que se ha realizado con cultivares de papaya hawaianos, en los cuales se

indujo la formación de raíces en brotes con 3-6 hojas trilobuladas provenientes de

embriones somáticos utilizando AIB (5 μM) (Fitch 1993). Otra alternativa para la

germinación de los embriones somáticos de papaya “Pococí” podría ser el uso de otros

compuestos como el AG3 y la floridzina. Sin embargo, el cultivo de embriones

somáticos de papaya “Maradol” y de Jarilla heterophylla en medios de cultivo

adicionados con 0,35 mg/l de AG3 y 3 g/l de floridzina, resultó en porcentajes de

germinación del 29% y 17,5%, respectivamente, siendo valores muy similares a los

obtenidos en este trabajo y significativamente menores a los reportados en otras

variedades de papaya y especies relacionadas utilizando BAP (Ascencio-Cabral et al.

2008; Nuño-Ayala et al. 2012).

En cuanto a la formación de callo en la base de los embriones somáticos de papaya

“Pococí”, no se observó un efecto significativo de la adición de BAP al medio de

cultivo sobre este fenómeno. Fitch y Manshardt (1990) reportan resultados similares al

cultivar los embriones somáticos de varios cultivares de papaya hawaiana en medio

desprovisto de reguladores de crecimiento y en un medio de cultivo adicionado con 5

mg/l de kinetina, otra citoquinina, siendo la formación de raíces muy escasa, y en la

mayoría de los casos observaron la formación de callos con una consistencia muy

acuosa en la radícula del embrión. Por otra parte, Litz y Conover (1982) reportaron la

formación de callo en la base de los embriones somáticos de C. papaya x C. cauliflora

al utilizar concentraciones de ANA mayores a 2,0 mg/l en un medio de cultivo

adicionado con 0,2 mg/l de BAP, lo cual podría indicar un posible efecto del subcultivo

de los embriones somáticos en medio de cultivo adicionado con 2,4-D sobre el balance

endógeno de citoquininas y auxinas en la radícula de los embriones somáticos.

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4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinación de semillas sintéticas de papaya “Pococí”

La información provista por el análisis de la fuerza de ruptura de las cápsulas de

alginato de calcio permite determinar varias características: 1) la protección mecánica

que le ofrece la cápsula al embrión somático que se encuentra dentro de ella, 2) la

resistencia con que deberá lidiar este mismo embrión para poder romper la cápsula, y 3)

la capacidad de difusión de la matriz de alginato de calcio (ya que en la medida en que

aumenta la dureza de la cápsula es menor la pérdida de nutrientes a partir de la matriz

debido a la disminución de la porosidad del complejo) (Timbert et al. 1995; Nieves et

al. 2000). Según los resultados obtenidos en este trabajo, existe una interacción entre la

concentración de alginato de sodio y de CaCl2, sobre la dureza de las cápsulas de

alginato de calcio, ya que la fuerza de ruptura aumentó al incrementar la concentración

de ácido algínico (2,5%-4,5%) y de CaCl2 (50-100 mM), lo cual concuerda con los

resultados obtenidos por Timbert et al. (1995), quienes utilizaron varias concentraciones

(0,75% a 2,5%) de alginato de sodio de baja, media y alta viscosidad y de CaCl2 (25-

100 mM) para la elaboración de semillas artificiales de Daucus carota L.

Según los resultados obtenidos en este trabajo, la dureza de la cápsula de alginato de

calcio no ejerció un efecto directo sobre la brotación de los embriones somáticos de

papaya “Pococí”, ya que incluso las semillas artificiales que se trataron con KNO3, que

ocasionó que estas se agrietaran, no presentaron un mayor porcentaje de germinación

que aquellas sin tratar. Al respecto, Timbert et al. (1995) reportaron frecuencias de

germinación de semillas sintéticas de Daucus carota L. cercanas al 100% en semillas

sintéticas con una fuerza de compresión de 2 N•mm al utilizar una concentración de

alginato de sodio (con una viscosidad de 250 mPa•s) del 2,5% y una solución de cloruro

de calcio a 100 mM. Ello sugiere que la poca germinación de las semillas artificiales de

papaya producidas en este trabajo no se debió a la dureza de la cápsula de alginato de

calcio, cuyo valor más alto fue de 1,31 N•mm. Por otra parte, Castillo et al. (1998)

reportaron 80% de germinación de semillas sintéticas de papaya producidas con una

concentración de 2,5% de alginato de sodio en una solución de CaCl2 de 50 μM, pero

con un tiempo de exposición de la gota de alginato de sodio en la solución de CaCl2 de

10 minutos, mucho menor a los 30 minutos usados en este trabajo, lo cual se podría

reflejar en cápsulas un poco más blandas que las de este trabajo. Cabe indicar, que los

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autores anteriormente citados no determinaron la dureza de las cápsulas de alginato de

calcio que elaboraron.

Los valores de resistencia mecánica obtenidos en este trabajo con las distintas matrices

de encapsulación son mucho menores a aquellos reportados por Timbert et al. (1995)

con matrices de encapsulación similares, lo cual podría estar relacionado con el efecto

detrimental que ejerce el autoclavado de las soluciones de alginato de sodio sobre su

capacidad de acomplejamiento en la solución de CaCl2, ya que, Timbert et al. (1995) no

reportaron haber autoclavado las soluciones utilizadas para la encapsulación. Por

último, se ha reportado que la concentración de ácido algínico y la duración del

autoclavado son factores que influyen sobre la dureza de las cápsulas de alginato de

calcio (Larkin et al. 1988).

Las semillas sintéticas de papaya “Pococí” presentaron una menor brotación con

respecto a los embriones somáticos sin encapsular. Singh y Chand (2010) observaron un

comportamiento similar en la especie Dalbergia sissoo, donde solo el 43,3% de las

semillas sintéticas producidas, con una solución de alginato de sodio al 2,5% y de CaCl2

a 75 mM, germinaron, mientras que los embriones somáticos desnudos respondieron en

72,3%. West et al. (2006) sugieren que la matriz de encapsulación, además de ser una

barrera física, también modifica el potencial hídrico del embrión somático, debido al

aumento en la concentración de iones sodio, afectando la disponibilidad de agua para el

mismo. Lo anterior permitiría explicar el efecto negativo ejercido por la encapsulación,

sin importar la concentración de alginato de sodio o de CaCl2, de los embriones

somáticos de papaya “Pococí”, sobre la brotación de los mismos.

Por otra parte, se ha determinado una disminución en la tasa de respiración celular de

los embriones somáticos encapsulados, y por ende de su germinación, al aumentar la

concentración de alginato de sodio (Kersulec et al. 1993); lo cual se puede relacionar

con los porcentajes de oxidación de 20% a 60% observados en las cápsulas producidas,

ya sea con 50 o 100 mM de CaCl2 y los bajos porcentajes de brotación de las semillas

artificiales. Además, como se mencionó anteriormente, se ha sugerido que existe una

relación directa entre la dureza de la cápsula y la capacidad de difusión de solutos a

través de la misma, lo cual podría explicar el aumento en la oxidación de las semillas

sintéticas producidas, en este trabajo, con 50 mM de CaCl2 con respecto a aquellas

hechas con 100 mM. El efecto del tratamiento de KNO3 sobre la oxidación de las

semillas artificiales producidas con 100 mM podría ser ocasionado por una mayor

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aireación y difusión de solutos hacia el embrión luego de la ruptura de la cápsula. Sin

embargo, el efecto del tratamiento con KNO3 de las semillas artificiales sobre la

oxidación de las mismas no es claro ya que en las semillas sintéticas producidas con 50

mM de CaCl2 no se observó una respuesta similar ante el tratamiento con KNO3.

Una alternativa para aumentar la brotación de las semillas artificiales de papaya

“Pococí” podría ser encapsular los embriones somáticos en cápsulas con centro blando,

de acuerdo con la metodología propuesta por Nyende et al. (2003). Esta consiste en

realizar una doble encapsulación del explante, siendo el núcleo de la cápsula un poco

más blando que su capa exterior. Estos últimos autores utilizaron este sistema para la

encapsulación de yemas de Solanum tuberosum de las cultivares “Désirée”, “Genet”,

“Tigoni” y “Tomensa” obteniendo porcentajes de regeneración del 100% en todos ellos.

En resumen, este trabajo permitió determinar que la inducción de embriones somáticos

de papaya “Pococí”, a partir de embriones cigóticos provenientes de frutas en estado de

madurez fisiológica, se puede realizar al utilizar semillas cortadas por la mitad como

explante. Además, que el periodo de formación de callo fue de 8 a 10 semanas en todos

los tratamientos y las concentraciones de 2,4-D que produjeron una mayor respuesta

fueron las de 2, 4 y 6 mg/l. Los embriones somáticos producidos en este trabajo se

caracterizaron por no presentar una conexión vascular con el callo del cual provenían y

presentaron una anatomía normal. Por otra parte, el subcultivo de los callos

embriogénicos en medio de cultivo líquido permitió una mayor propagación de los

embriones somáticos que con el medio sólido. Pero, en el sistema líquido los embriones

somáticos no se desarrollaron tanto como en el medio sólido. En cuanto a la

germinación de los embriones somáticos inducidos en este estudio, se observó un efecto

positivo de la adición de BAP, a concentraciones entre 0,4 y 0,6 mg/l, sobre la brotación

de los mismos. Sin embargo, en la mayoría de los embriones somáticos cultivados no se

observó el desarrollo de la parte radical, siendo el porcentaje de enraizamiento en todos

los tratamientos inferior al observado en el testigo. Por último, al producir semillas

artificiales utilizando distintas matrices de encapsulación se observó una disminución

considerable en la brotación de los embriones somáticos. La correlación entre la dureza

de las cápsulas de alginato de calcio y la germinación de las semillas artificiales fue

muy baja.

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