Universidad de Costa Rica

Facultad de Ciencias Agroalimentarias

Escuela de Agronoma

Embriognesis somtica y produccin de semilla artificial de

papaya (Carica papaya) hbrido Pococ.

Tesis presentada para optar por el grado acadmico de Licenciado en Ingeniera Agronmica

Pal Solrzano Cascante

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica

2014

ii

Agradecimientos De manera muy especial quiero agradecer a mi director de tesis, Dr. Vctor Jimnez, por

toda su colaboracin, consejos, excelente apoyo y por brindarme una excelente formacin

acadmica.

A los miembros del comit de tesis, Dr. Eric Guevara, M.Sc. Griselda Arrieta, M.Sc. Eric

Mora, M.Sc. Jorge Wagner, mi ms sincero agradecimiento por su pronta respuesta,

sugerencias y comentarios.

A Andrea Holst y Mara Vias por toda su ayuda en el laboratorio y los anlisis

estadsticos.

A mis padres por todo el apoyo que me han brindado durante tantos aos.

A Mariana Murillo por su ayuda, apoyo y cario.

Agradezco a todas aquellas personas que de una u otra forma me brindaron su apoyo en la

realizacin de este trabajo.

Esta tesis ha sido aceptada en su presente fonna. por la Escuela de Agronoma de la Universidad de Costa Rica y aprobada por el comit consejero del estudiante como requisito parcial para optar por el grado de licenciado.

Firmantes:

Dr. Vctor Jirnnez Garca Director de Tesis

Dr. Eric Guevara Berger Miembro del Comit

M.Sc. Eric Mora Newcomer Miembro del Comit

MSc. Grselda Arrieta Espinoza Miembro del Comit

M.Sc. Jorge Wagner Pineda ~--:;:,. Representante Director Escuela de Agronomi~

B.Sc. Pal Solrzano Cascante Candidato

iv

Resumen El uso de la embriognesis somtica permitira la propagacin a gran escala del hbrido de

papaya Pococ, as como la seleccin y multiplicacin de material hermafrodita. Para

poder utilizar esta tcnica a nivel comercial es necesario contar con protocolos eficientes

para la induccin y multiplicacin de embriones somticos, as como para la germinacin y

regeneracin de plantas a partir de los mismos. En este trabajo se evalu el efecto de cinco

dosis de cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) (2, 4, 6, 8 y 10 mg/l) sobre la induccin de

embriones somticos. Como explantes se utilizaron embriones cigticos desnudos, as

como semillas cortadas por la mitad. El medio de cultivo base para todos los tratamientos

contena la mitad de la concentracin de las sales minerales y todas las vitaminas del medio

de cultivo de Murashige y Skoog (MS), suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-

glutamina (400 mg/l), sacarosa (3% p/v) y Phytagel (0,28% p/v). Una vez introducidos los

explantes, estos se cultivaron en placas de Petri a la oscuridad por un periodo de 14

semanas. Durante todo el periodo de evaluacin no se observ formacin de callo o

embriones somticos en ninguno de los embriones cigticos desnudos cultivados. Por otra

parte, en las semillas cortadas por la mitad, las concentraciones de 4 y 6 mg/l de 2,4-D

indujeron mayor formacin de callo a las 8 semanas de cultivo (45% y 55%,

respectivamente) en comparacin con las concentraciones de 8 y 10 mg/l (15% y 0%,

respectivamente). Los explantes cultivados con 2 mg/l de 2,4-D presentaron un porcentaje

de formacin de callo del 25%; sin embargo, no mostraron diferencias significativas con

respecto a los dems tratamientos. A las 14 semanas de cultivo se observ en todos los

tratamientos un porcentaje de formacin de callo embriognico de entre 25% y 33%, sin

presentar diferencias significativas entre tratamientos. A varios de estos callos

embriognicos se les hizo un anlisis histolgico. La produccin de embriones somticos

por callo embriognico oscil de entre 11 y 31 embriones somticos y no se observ

ninguna diferencia significativa entre tratamientos. La oxidacin de los explantes en todos

los tratamientos fue inferior al 5%. El anlisis histolgico permiti determinar la ausencia

de conexiones vasculares entre los embriones somticos y el callo, as como la ausencia de

una estructura similar al suspensor; as como una anatoma normal por parte de los

embriones cotiledonares.

v

Posteriormente, los callos embriognicos se subcutivaron en medio slido y lquido con

miras a propagarlos. Para establecer ambos tratamientos, se tomaron los callos

embriognicos de todos los medios de induccin y se mezclaron en medio de cultivo

lquido. Luego, en cada unidad experimental (placas de Petri de 90 mm y Erlenmeyers de

50 ml) se colocaron 0,5 g de callo embriognico disgregado ms 25 ml de medio de cultivo.

El cultivo se realiz bajo oscuridad total por un periodo de 8 semanas y las suspensiones

embriognicas se agitaron a 120 rpm. La propagacin de los embriones somticos fue

mayor en el medio lquido en comparacin con el medio slido (1324 y 307 nuevos

embriones somticos por recipiente, respectivamente). En el sistema lquido el desarrollo

de los embriones somticos fue menor que en el medio slido, ya que el porcentaje de

embriones somticos en etapa cotiledonar fue de 42,98% en el segundo y de 14,7% en el

primero. Los callos embriognicos presentaron un crecimiento estadsticamente similar en

ambos sistemas de cultivo, con un peso final de 2,08 g en el sistema de cultivo slido y

1,65 g en el cultivo en medio lquido. Por ltimo, en ninguno de los dos sistemas de cultivo

hubo problemas de oxidacin.

Con el fin de mejorar la germinacin de los embriones somticos se evalu el efecto de

cinco dosis de 6-bencilaminopurina (BAP) (0, 0,2, 0,4, 0,6 y 0,8 mg/l) en medio de cultivo

MS suplementado con sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v). Los embriones somticos se

cultivaron bajo un fotoperiodo de 12 horas, bajo 49 mol/m2/s de luz fluorescente, a

temperatura promedio de 23C y humedad relativa de 48% por 30 das. Luego de dos

semanas de cultivo se observ la brotacin de los embriones somticos en todos los

tratamientos. Al cabo de cuatro semanas de cultivo, los embriones somticos cultivados con

0,4 y 0,6 mg/l de BAP presentaron el mayor porcentaje de brotacin (40% y 27%,

respectivamente). El tratamiento sin BAP present un 5,5% de brotacin, siendo el menor

valor observado. El porcentaje de enraizamiento oscil entre 0% y 5,5%, siendo el testigo

aquel en el cual se observ el mayor valor, seguido por el tratamiento con 0,2 mg/l de BAP

con un 1,8%. En el resto de los tratamientos establecidos no hubo enraizamiento. Adems,

se observ la formacin de callo en la regin basal de algunos de los embriones somticos,

con porcentajes que oscilaron entre 29% y 38%, sin presentar diferencias significativas

entre tratamientos.

vi

Por ltimo, se produjeron semillas artificiales utilizando tres concentraciones de cido

algnico (2,5%, 3,5% y 4,5%) y dos concentraciones de CaCl2 (50 mM y 100 mM). A cada

solucin de cido algnico se le agreg las sales minerales del medio de cultivo MS a la

mitad de la concentracin, con excepcin del calcio que no se agreg, sacarosa (3% p/v) y

BAP (0,4 mg/l). La duracin de la fase de gelificacin fue de 30 minutos. Adems, se

evalu el efecto de una inmersin por 20 minutos en una solucin de KNO3 (200 mM)

sobre la germinacin de las semillas artificiales. Las cpsulas de alginato de calcio ms

duras fueron aquellas producidas con las soluciones de cido algnico al 3,5% y 4,5% y las

solucines de CaCl2 a 100 mM (1,31 Nmm y 1,18 Nmm, respectivamente). Las cpsulas

producidas con las soluciones al 2,5% y 3,5% de cido algnico y gelificadas en una

solucin de CaCl2 a una concentracin de 50 mM presentaron las menores fuerzas de

ruptura (0,41 Nmm y 0,28 Nmm, respectivamente). Todas las cpsulas tratadas con KNO3

(200 mM) se fisuraron luego de ser retiradas de esta solucin. El coeficiente de correlacin

entre la dureza de las cpsulas y la brotacin de las semillas artificiales fue muy bajo

(0,0294). A las 12 semanas, los embriones somticos sin encapsular haban brotado en un

64% mientras que el mayor porcentaje de brotacin de las semillas artificiales obtenido fue

del 28% al utilizar una solucin de CaCl 50 mM y una solucin de cido algnico al 4,5%.

Las semillas artificiales preparadas con una solucin al 2,5% de cido algnico y otra de

CaCl2 a 100 mM presentaron la brotacin ms baja con un 4%.

vii

ndice general Agradecimientos ............................................................................................................... ii

Resumen .......................................................................................................................... iv

ndice de Figuras ............................................................................................................. ix

Introduccin ...................................................................................................................... 1

Antecedentes ..................................................................................................................... 3

Conceptos generales sobre embriognesis cigtica y somtica ....................................... 3

Papel de las auxinas en el proceso de embriognesis somtica ........................................ 5

Embriognesis somtica en papaya ...................................................................................... 5

Germinacin de embriones somticos de papaya............................................................... 7

Produccin de semilla artificial ............................................................................................ 7

Objetivos ......................................................................................................................... 11

Objetivo General ................................................................................................................... 11

Objetivos especficos ........................................................................................................... 11

Materiales y mtodos ...................................................................................................... 12

Localidad y financiamiento ................................................................................................. 12

Experimentos realizados ...................................................................................................... 12

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos. .. 12

1.2 Anlisis histolgico de callos embriognicos ...................................................... 13

2. Efecto del medio lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de papaya Pococ ...................................................................................................... 14

3. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ15

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinacin de semillas sintticas de Papaya Pococ ................................................................................. 16

Programas estadsticos ......................................................................................................... 18

Resultados ....................................................................................................................... 19

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos ... 19

2. Efecto del medio lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de

papaya Pococ ................................................................................................................ 21

viii

3. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ

23

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinacin de semillas

sintticas de Papaya Pococ. ........................................................................................ 26

Discusin ........................................................................................................................ 30

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos ... 30

2. Efecto del medio lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de

papaya Pococ ................................................................................................................ 32

3. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ

34

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinacin de semillas

sintticas de Papaya Pococ ......................................................................................... 36

Literatura citada .............................................................................................................. 39

ix

ndice de Figuras

Figura 1 Procesos de intercambio catinico durante el endurecimiento de las cpsulas de alginato de sodio y el pretratamiento de germinacin con nitrato de potasio (KNO3). a) Inmersin en solucin con CaCl por 10 min. b) Lavado de cpsulas. c) Inmersin en solucin con nitrato de potasio (200 M) durante 60 min. d) Lavado de cpsulas. e) Ruptura de la cpsula de alginato de calcio. Modificado de Onishi et al. (1994). ............................................................................................ 9

Figura 2 A. Efecto del 2,4-D sobre la formacin de callo a partir de secciones de semillas de papaya Pococ durante un periodo de 14 semanas. B. Produccin total de embriones somticos (ES) de papaya por callo embriognico observado. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%.20

Figura 3 Cortes histolgicos de callos embriognicos cultivados en medios de cultivo adicionados con 6 mg/l de 2,4-D (A y B) y 2 mg/l de 2,4-D (C) luego de 12 semanas de cultivo. Escala igual a 1 mm. Flechas indican un punto meristemtico (A), estructuras proembrionarias (B) y un embrin somtico (C). .................. 21

Figura 4 Efecto del sistema de cultivo sobre el nmero de embriones somticos (ES) producidos (A), el crecimiento del callo (A) y el desarrollo de los ES (B), luego de ocho semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%. ........................................................................ 22

Figura 5 Embriones somticos desarrollados a partir de secciones de semillas de papaya en medio de cultivo lquido (A) y slido (B). Barras equivalentes a 1 mm. ......... 23

Figura 6 Efecto de varias concentraciones de BAP sobre la brotacin de embriones somticos de papaya durante un periodo de cultivo de 4 semanas (letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%). ........ 24

Figura 7 Enraizamiento y brotacin de embriones somticos de papaya cultivados en un medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento (A) y otro adicionado con 4 mg/l de BAP (B). Barras equivalentes a 1 mm. ............................................... 25

Figura 8 Efecto de distintas concentraciones de BAP sobre la formacin de callo y races (A) y sobre la oxidacin (B) de los embriones somticos (ES) durante cuatro semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del 95%. ............................................................................. 26

Figura 9 Semillas artificiales de papaya Pococ elaboradas con (A) 4,5% de alginato de sodio y 100 mM de CaCl2 lista para ser cultivada; (B) tratada con 200 mM de KNO3 por 20 minutos previo a su cultivo y (C) otra brotada luego de 12 semanas de cultivo. Barras equivalentes a 3 mm. ........................................................... 27

x

Figura 10 Dureza de las cpsulas de alginato de calcio elaboradas con distintas concentraciones de alginato de sodio y gelificadas con dos concentraciones de CaCl2. ............................................................................................................... 28

Figura 11 A. Efecto del uso de distintas concentraciones de cido algnico y CaCl2 durante la encapsulacin de embriones somticos de papaya, as como de una inmersin en KNO3 (200 mM) previo al cultivo, sobre la brotacin (A) y oxidacin (B) de la semilla sinttica de papaya luego de 12 semanas de cultivo. ........................... 29

1

Introduccin La familia Caricaceae est compuesta por seis gneros, originarios, en su mayora, de

Amrica. La papaya (Carica papaya) es la nica especie dentro del gnero Carica

(Badillo 2000). Actualmente, los mayores productores de papaya son Brasil, Nigeria y

Congo. El fruto de papaya tiene un alto valor nutricional debido a que es una muy buena

fuente de cobre y magnesio, as como de vitaminas A y C (Wall 2006). Adems, el ltex

de la planta de papaya es rico en dos enzimas proteolticas: la papana y la

quimipapana, ambas usadas en la industria farmacutica (Azarkan et al. 2003).

La propagacin convencional de papaya se realiza por medio de semilla, lo cual es un

problema debido a la alta heterogeneidad del material, ya que es una especie con

polinizacin cruzada (Ellis et al. 1991; Castillo et al. 1998). A su vez, la principal

limitante que presenta la produccin de semilla de hbridos comerciales son los bajos

porcentajes de germinacin y, en algunos genotipos, la poca cantidad de semillas por

fruto (Bhattacharya y Khuspe 2001).

La papaya presenta una morfologa floral particular, ya que se pueden presentar los

siguientes tipos de flores: estaminadas, hermafroditas y pistiladas. Los frutos

provenientes de plantas hermafroditas son de forma alargada, con cscara gruesa y una

cavidad interna reducida, lo que hace que sean los frutos con mayor aceptacin a nivel

comercial (Mora y Bogantes 2005). Por otra parte, no existen variaciones en los

caracteres vegetativos entre plantas con distinto tipo de flor que permitan su

diferenciacin antes de la aparicin de las flores (de dos meses y medio a tres meses y

medio despus del transplante) (Storey 1953).

Por lo tanto, para lograr establecer plantaciones que cuenten con un porcentaje de

plantas hermafroditas de entre 92 y 94% es necesario establecer en el campo de tres a

cuatro plantas por punto de siembra, para luego, durante la floracin, seleccionar

solamente el fenotipo deseado (Mora y Bogantes 2005). Esto convierte a la papaya en

un candidato ideal para la propagacin a travs de cultivo in vitro, especficamente a

travs de embriognesis somtica, ya que de este modo se podra asegurar el

establecimiento de plantaciones 100% hermafroditas, las cuales sern altamente

productivas y con muy buena calidad de fruta, si se seleccionan genotipos adecuados.

Otra ventaja adicional del uso de la embriognesis somtica para la propagacin de

papaya es que los embriones somticos se podran encapsular para la produccin de

2

semilla artificial o sinttica (Khor y Loh 2005). Las principales ventajas del uso de

semillas artificiales son: mantener la uniformidad gentica del material, la facilidad de

transporte, la posibilidad de distribuirla directamente al campo, la clonacin rpida del

material, el establecimiento de plntulas libres de patgenos y la oportunidad de ser

producidas en cualquier poca del ao (Patel et al. 2000; Rai et al. 2009). Por otra parte,

el xito de la produccin de semillas artificiales con fines comerciales radica en contar

con sistemas de cultivo que permitan la produccin en masa de embriones somticos de

alta calidad y en encontrar una matriz de encapsulacin adecuada (Redenbaugh et al.

1986; Onishi et al. 1994).

El papel de las auxinas en la transicin de clulas somticas hacia clulas embriognicas

se ha estudiado en detalle. La auxina ms utilizada para la induccin de embriognesis

somtica ha sido el cido 2,4 diclorofenoxiactico (2,4-D) con un 50% de los casos

(Raemakers et al. 1995). Por otra parte, la adicin de este regulador de crecimiento al

medio de cultivo provoca un incremento en la concentracin de auxinas endgenas en

las clulas receptoras, as como un gradiente de auxina, el cual se postula como

necesario para que se d la divisin asimtrica de las clulas y d inicio al proceso de

embriognesis somtica (Jimnez 2005).

El alginato de sodio es el agente gelificante ms utilizado para la produccin de semillas

artificiales debido a que es soluble a temperatura ambiente (25C), no perjudica al

embrin somtico y se endurece al entrar en contacto con sales metlicas divalentes

poco txicas, como el calcio, en un proceso conocido como gelificacin ionotrpica

(Redenbaugh et al. 1986; Nieves et al. 2000). El principal factor que afecta la

germinacin de las semillas artificiales es la dureza final de la cpsula de alginato de

calcio, la cual depende de la concentracin utilizada de alginato de sodio en la solucin

gelificante, el periodo de exposicin de las gotas del conjunto embrin somtico +

solucin gelificante en la solucin con cloruro de calcio (CaCl2) y su concentracin

(Castillo et al. 1998).

3

Antecedentes

Conceptos generales sobre embriognesis cigtica y somtica

La produccin de embriones en angiospermas se da gracias al proceso de doble

fertilizacin del saco embrionario, el cual da origen al embrin cigtico y al

endosperma. Pero, tambin existen plantas en las que se da la formacin asexual de

embriones a partir del tejido materno del vulo, obviando as, la fase de recombinacin

gentica y la fertilizacin del vulo. Lo anterior pone de manifiesto dos conceptos

claves para el proceso de embriognesis somtica: 1) la seal otorgada por la

fertilizacin para que d inicio el desarrollo del embrin puede ser substituido por otro

tipo de mecanismo endgeno, y 2) que en plantas superiores otros tipos de clulas,

distintas a la clula huevo fertilizada, pueden mantener e incluso obtener la capacidad

de generar embriones (Fehr 2006).

La embriognesis somtica se ha definido como el proceso mediante el cual clulas

somticas se logran orientar hacia la formacin de estructuras similares a embriones

cigticos a travs de una serie de pasos cronolgicos sin necesidad de que ocurra la

fusin de gametos. Este proceso se divide tradicionalmente en dos etapas principales,

conocidas como: fase de induccin y fase de expresin. Durante la primera etapa, las

clulas somticas adquieren las caractersticas particulares de las clulas embriognicas

a travs de cambios fisiolgicos, metablicos y de expresin gnica. Generalmente, esta

transicin se logra exponiendo las clulas somticas a algn tipo de estmulo externo,

como el uso de algn regulador de crecimiento o el manejo del potencial osmtico del

medio, lo cual no es necesario durante la embriognesis cigtica ya que es una

caracterstica constitutiva. Por otra parte, la fase de expresin de la embriognesis

somtica se da luego de algn cambio en una o varias de las condiciones de cultivo, lo

cual permite que las clulas inducidas puedan manifestar su capacidad embriognica y

se diferencien en embriones somticos (Dodeman et al. 1997; Jimnez 2005).

Por otra parte, indistintamente del tipo de embriognesis que ocurra (ya sea

embriognesis cigtica o somtica), existen varios criterios que deben cumplirse para

que el proceso de embriognesis d inicio. Primeramente, la especie debe contar con el

potencial gentico para formar embriones a partir de clulas somticas. A su vez, una o

varias clulas de la planta deben tener la capacidad de percibir los estmulos endgenos

4

o exgenos que disparan el proceso de formacin del embrin. Y por ltimo, las clulas

que percibieron el estmulo e iniciaron el proceso de diferenciacin deben de mantener

esta condicin incluso cuando el estmulo haya desaparecido (Fehr 2006).

El desarrollo de los embriones somticos es muy similar al de los embriones cigticos.

La primera fase del desarrollo embrionario se caracteriza por la divisin asimtrica del

cigoto (compuesto por una sola clula), para dar origen a dos clulas hijas, una apical,

de la cual se desarrolla la plmula y los cotiledones, y otra basal, de la cual se

desarrollan el hipoctilo y el suspensor. Posteriormente, ocurre la citodiferenciacin del

embrin. Por ltimo, la polaridad del embrin, as como su histodiferenciacin, se

establecen a travs de la tasa y posicin de las divisiones celulares y su posterior

alargamiento, dando como resultado la formacin de los meristemos apical y radical.

Aparte de lo anterior, un embrin somtico completamente desarrollado y maduro no es

idntico a un embrin cigtico ya que generalmente no entra en una fase de reposo ni

cuenta con endospermo ni integumentos (Dodeman et al. 1997; von Arnold et al. 2002).

El desarrollo de los embriones somticos se puede dar a partir del tejido del explante sin

que haya una etapa de formacin de callo previa; este fenmeno se conoce como

embriognesis somtica directa. Por el contrario, si los embriones se originan luego de

un evento de desdiferenciacin del tejido del explante, el proceso se denomina

embriognesis somtica indirecta. Los principales factores que determinan mediante

cul tipo de embriognesis se formarn los embriones son el tipo y el estado fisiolgico

del explante utilizado, as como el tipo y la concentracin de los reguladores de

crecimiento empleados (Yang y Zhang 2010). Por ltimo, en muchas especies

solamente ciertos tejidos de la planta cuentan con un alto potencial embriognico.

Existe la hiptesis de la existencia de un gradiente en la respuesta a los tratamientos

inductores a travs de los distintos rganos de la planta. El potencial embriognico es

muy alto en tejidos de origen embrionario y decrece a travs del hipoctilo, el peciolo,

la hoja y la raz (Neumann 2000).

Actualmente existe gran cantidad de especies con un potencial muy alto para la

formacin de embriones somticos; sin embargo, aun quedan varias especies

recalcitrantes donde su potencial podra aumentar al mejorar las condiciones de cultivo

in vitro o la seleccin adecuada del explante. En ese sentido, se maneja el concepto de

que el componente gentico de la planta define cules son las condiciones adecuadas

para que se produzcan embriones somticos (Fehr 2006).

5

Papel de las auxinas en el proceso de embriognesis somtica El papel de las auxinas en el proceso de embriognesis cigtica es muy bien conocido.

Se ha evidenciado el rol de auxinas endgenas, especficamente del cido indolactico

(AIA), en la formacin de embriones cigticos de zanahoria, concomitante con un

incremento en la concentracin endgena de AIA luego de la fertilizacin de vulos de

zanahoria, principalmente durante la etapa torpedo, para luego decaer a un nivel base

durante el posterior desarrollo del embrin (Ribnicky et al. 2002).

A su vez, la auxina ms utilizada, en un 50% de los casos, para la induccin de

embriognesis somtica ha sido el 2,4-D (Raemakers et al. 1995). El 2,4-D se utiliza

como agente inductor en la etapa inicial del proceso de embriognesis somtica, ya que

la adicin de este regulador de crecimiento en el medio de cultivo provoca un

incremento en la concentracin de auxinas endgenas en las clulas receptoras, as

como un gradiente de auxina, el cual se postula como necesario para que se d la

divisin asimtrica de las clulas y d inicio el proceso de embriognesis somtica

(Jimnez 2005). Por ltimo, una vez que las clulas somticas han adquirido el

potencial para producir embriones somticos es necesario disminuir la concentracin del

2,4-D en el medio de cultivo, ya que este compuesto inhibe el posterior desarrollo de los

embriones (Raghavan 2005; Yang y Zhang 2010).

Embriognesis somtica en papaya Fernando et al. (2001) obtuvieron la formacin directa de embriones somticos en

papaya Solo a partir de embriones cigticos utilizando una concentracin de 2 mg/l de

2,4-D luego de 18 das de haber introducido el material. A su vez, a travs de anlisis

histolgicos, lograron determinar que estos embriones somticos se originaron a partir

de las clulas de la protodermis del embrin cigtico. Este mismo comportamiento se

observ con embriones cigticos de la variedad Maradol rojo utilizando la misma

concentracin de 2,4-D (Posada et al. 2007).

Luego de la evaluacin de cuatro concentraciones de 2,4-D (3, 5, 10 y 15 mg/l) en el

medio de cultivo para la induccin de embriognesis somtica en papaya var. Maradol

rojo, se observ un mayor porcentaje de respuesta (embriones cigticos de los cuales

emergieron embriones somticos), as como mayor nmero de embriones somticos por

explante, en los medios de cultivo con 5 y 10 mg/l de este regulador. A su vez, se

evidenci una mayor formacin de callo a concentraciones de 10 y 15 mg/l de 2,4-D, a

6

diferencia de las concentraciones de 3 y 5 mg/l, donde se obtuvo embriognesis directa

(Posada et al. 2007).

Asimismo, embriones cigticos de las variedades de papaya Waimanalo, Sunset y

Sunrise cultivados con la mitad de la concentracin del medio de cultivo MS bajo un

gradiente de concentraciones del regulador 2,4-D han mostrado un comportamiento

similar a las variedades Solo y Maradol rojo, ya que hubo embriognesis directa a

bajas concentraciones del regulador. Sin embargo, en varias selecciones del cultivar

Kapoho, al aumentar la concentracin de 2,4-D en el medio de cultivo, aument el

porcentaje de embriones cigticos con capacidad embriognica directa, alcanzando

porcentajes de respuesta de entre 80 y 100% a 15 mg/l de 2,4-D en el medio de cultivo.

Por otra parte, cabe rescatar que en estos experimentos solamente fueron introducidos

en los respectivos medios de induccin los embrines cigticos, desechando el resto de

tejidos de cada una de las semillas, lo cual permite un mayor contacto de ambos

meristemos del embrin con el regulador de crecimiento utilizado (Fitch y Manshardt

1990).

Adems, Mishra et al. (2007) indujeron la produccin de embriones somticos a partir

de embriones cigticos desnudos en un medio de cultivo compuesto por la mitad de la

concentracin de las sales minerales del MS, las vitaminas de MS, 2,4-D a una

concentracin de 10 mg/l, sacarosa (6% p/v) y Difco bacto agar (0,8% p/v). Estos

embriones cigticos se mantuvieron en la obscuridad a una temperatura promedio de

25C. Estos autores reportan la aparicin de embriones somticos en estado globular

luego de cuatro semanas de cultivo.

La induccin de embriognesis somtica del cultivar Maradol rojo se ha logrado

tambin en trabajos posteriores utilizando un medio de cultivo MS al 50%, vitaminas

MS, 5 mg/l de 2,4-D, 400 mg/l de mio-inositol y 30 g/L de sacarosa. Posteriormente,

para la multiplicacin de los embriones somticos, se seleccionaron grupos de

aproximadamente 10-15 embriones somticos en etapa globular y se colocaron en un

medio de cultivo con la mitad de la concentracin de las sales MS, vitaminas MS, 400

mg/l de mio-inositol y 30 g/L de sacarosa bajo tres concentraciones de 2,4-D (2, 5 y 8

mg/l) (Rodrguez et al. 2009).

7

Germinacin de embriones somticos de papaya Se ha evaluado el efecto de la adicin de kinetina y BAP al medio de cultivo sobre la

germinacin de embriones somticos del cultivar Maradol rojo. Los mejores

resultados encontrados con ambos reguladores de crecimiento se dieron a una

concentracin de 4 mg/l de kinetina y de 0,22 mg/l de BAP, obteniendo porcentajes de

germinacin de 80% y 92%, respectivamente, luego de 30 das en cada medio de

germinacin. El medio base fue un MS suplementado con mio-inositol a 100 mg/l,

vitaminas MS y sacarosa al 2% (Posada et al. 2007). Asimismo, se ha utilizado BAP

(0,2 mg/l) junto con cido naftalnactico (ANA) (0,1 mg/l) en un medio de cultivo

MS suplementado con glutamina y sacarosa (3% p/v) y agar (0,8% p/v) para la

germinacin de embriones somticos de papaya (Mishra et al. 2007).

Por otra parte, se ha reportado el uso del cido giberlico (AG3) en el medio de cultivo a

una concentracin de 0,35 mg/l para la germinacin de embriones somticos maduros

(1,0 1,5 mm de longitud con una coloracin verde y libres de anormalidades) de la

variedad Maradol. Lo anterior en un medio de cultivo MS adicionado con las

vitaminas de Chen et al. (1987), 100 mg/l de glutamina, 68 mg/l de hemisulfato de

adenina y 16 g/l de sacarosa (Ascencio-Cabral et al. 2008). Adems, la germinacin de

semillas de papaya de distintas variedades se ha visto favorecida por el uso de AG3

(100-200 ppm) en tratamientos con remojo previo a la siembra in vivo de las semillas,

obteniendo porcentajes de germinacin del 50 al 60% (Bhattacharya y Khuspe 2001).

Por ltimo, para la germinacin de los embriones somticos obtenidos a partir de

embriones cigticos de los cultivares Waimanalo, Sunset, Sunrise y Kapoho se

utiliz un medio de cultivo MS desprovisto de reguladores de crecimiento bajo

iluminacin continua con fluorescentes de luz blanca y de 35 umol/m2/s de radiacin

fotosintticamente activa (PAR), a 27C (Fitch y Manshardt 1990).

Produccin de semilla artificial El uso de la tcnica de propagacin a travs de semillas artificiales es una alternativa

para la propagacin de hbridos de importancia econmica, genotipos lite, plantas

modificadas mediante ingeniera gentica y genotipos silvestres (Redenbaugh et al.

1988; Rai et al. 2009). Adems, una de las aplicaciones ms importantes para la

tecnologa de produccin de semilla artificial es la posibilidad de ser usada para la

8

conservacin a largo plazo de especies con semilla sexual recalcitrante dentro de bancos

de germoplasma (Nyende et al. 2005; Ozden-Tokatli et al. 2008).

El trmino de semilla artificial se refiere a la encapsulacin artificial de un embrin

somtico, yema vegetativa, agregado celular o algn otro tejido meristemtico, el cual

posea la capacidad de regenerar una planta, ya sea bajo condiciones in vitro o ex vitro, y

que adems sea capaz de mantener esta cualidad luego de periodos de almacenamiento

(Nyende et al. 2005; Rai et al. 2009). Por otra parte, la formacin de semillas artificiales

a partir de embriones somticos es ms ventajosa que de los otros tejidos mencionados

anteriormente, debido a que el primero cuenta con un meristemo apical y otro radical, lo

que le permite regenerarse en una planta completa. Por ltimo, el uso de embriones

somticos para la produccin comercial de semilla sinttica radica en encontrar una

matriz de encapsulacin adecuada y la utilizacin de embriones somticos de alta

calidad (entindase por lo anterior un embrin somtico similar a uno cigtico en cuanto

a morfologa, fisiologa y bioqumica). Es decir, el embrin somtico debe tener la

capacidad de germinar, as como contar con un meristema apical y otro radical, los

cuales le permitan desarrollarse en una planta completa vigorosa (Redenbaugh et al.

1986; Saiprasad 2001; Khor y Loh 2005).

El procedimiento general para la fabricacin de semilla artificial involucra depositar los

propgulos en la matriz gelificante, la cual contiene alginato de sodio a una determinada

concentracin. Posteriormente, se toma una gota de la matriz gelificante, que contenga

uno de los propgulos, y se deja caer en la solucin con CaCl2 o Ca(NO3)2 (solucin

solidificante) por aproximadamente 40 min para que las gotas se gelifiquen. Luego, se

decanta la solucin con CaCl2 y las cpsulas ya solidificadas se enjuagan con agua

destilada y se encuentran listas para almacenarse o ser sembradas. En forma general, se

reporta que la concentracin mnima de CaCl2 requerida para que se d un

endurecimiento adecuado de las cpsulas es de 50 uM con un tiempo de exposicin de

30 min. Cabe mencionar, que durante esta fase de solidificacin la sal divalente (CaCl2)

se acompleja con el polmero de alginato para formar un gel de alginato de calcio

(Redenbaugh et al. 1986).

La dureza de la cpsula de alginato de calcio est determinada por la concentracin de

alginato de sodio, la concentracin de CaCl2 y el tiempo de inmersin en esta ltima

solucin (Rai et al. 2009). Al correlacionar la dureza de la cpsula de alginato de calcio

con la germinacin de embriones somticos de zanahoria, se encontr que, en la medida

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en que aumentaba la dureza de la cpsula, el porcentaje de germinacin disminua

debido a las dificultades mecnicas del embrin para romper la matriz del gel. A su vez,

Shigeta et al. (1990) reportan una menor germinacin en aquellas semillas artificiales de

zanahoria con una dureza superior a 1,5 kg/cm2. A su vez, se ha determinado que la

dureza de una cpsula de alginato de calcio debe oscilar de 0,5 a 2,0 kg/cm2 para que

esta pueda ser manipulada sin problemas y el embrin sea capaz de germinar

(Redenbaugh et al. 1986).

Por otra parte, con el fin de mejorar el proceso de hidratacin de las semillas artificiales

para facilitar la germinacin, se ha implementado la inmersin de las cpsulas dentro de

una solucin con algn in monovalente, como por ejemplo una solucin de KNO3 (200

uM), durante un determinado periodo de tiempo (Kumar et al. 2005). Durante el

periodo de inmersin de la cpsula en esta solucin catinica se sustituyen los iones

calcio de la matriz de alginato de calcio por los iones potasio, lo que provoca una

prdida de solidez, facilitando as la germinacin del embrin somtico (Onishi et al.

1994) (Ver Figura 1).

Figura 1. Procesos de intercambio catinico durante el endurecimiento de las cpsulas

de alginato de sodio y el pretratamiento de germinacin con nitrato de

potasio. a) Inmersin en solucin con CaCl por 10 min. b) Lavado de

cpsulas. c) Inmersin en solucin con nitrato de potasio (200 M) durante 60

min. d) Lavado de cpsulas. e) Ruptura de la cpsula de alginato de calcio.

Modificado de Onishi et al. (1994).

Castillo et al. (1998) obtuvieron un 80% de germinacin de semillas sintticas de

papaya con una concentracin de 2,5% de alginato de sodio y un tiempo de exposicin

de 10 minutos en una solucin de CaCl2 (50 uM). Por otra parte, para la encapsulacin

de embriones somticos de Mangifera indica L. cv. Amprali, se utiliz alginato de sodio

al 2% en la solucin gelificante, y una concentracin de 100 mM de CaCl2. A su vez, el

10

tiempo de inmersin de la gota de la matriz gelificante con el embrin fue de 40 a 45

minutos (Ara et al. 1999).

Para el caso de la encapsulacin de embriones somticos de Citrus reticulata Blanco,

cv. Mandarino Tardivo di Ciaculli, se utiliz una solucin gelificante al 2,5% de

alginato de sodio enriquecida con la mitad de las sales del medio MS, extracto de malta

(0,25 g/l), cido ascrbico (0,25 g/l), cido giberlico (1,0 mg/l), ANA (0,02 mg/l) y

sacarosa (6,8 g/l). Adems, los embriones somticos se sumergieron en una solucin de

CaCl2 (99,12 M) durante 30 minutos. Por ltimo, las semillas artificiales se lavaron

con agua destilada varias veces con el fin de eliminar el exceso de iones calcio

(Germana et al. 2007).

Para la fabricacin de semilla sinttica de Quercus robur se encapsularon embriones

somticos de aproximadamente 4 a 8 mm de longitud, en una matriz gelificante al 4%

de alginato de sodio disuelta en el medio lquido P con sacarosa al 3%. Por otra parte,

para el proceso de endurecimiento a travs del intercambio de iones sodio por iones

calcio, se tom una alcuota de 0,10 a 0,15 ml de la matriz gelificante junto con el

embrin somtico y se depositaron en la solucin con CaCl2 50 M. Posteriormente, las

cpsulas en formacin se colocaron en una centrfuga a 75 rpm por 20 min con el fin de

favorecer el intercambio inico. Por ltimo, las cpsulas se enjuagaron con agua

destilada tres veces (Prewein y Wilhelm 2003).

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Objetivos

Objetivo General Evaluar la utilizacin de semilla sinttica para la propagacin clonal de papaya

Pococ.

Objetivos especficos Inducir la formacin de embriones somticos a partir de embriones cigticos de

papaya Pococ.

Evaluar la multiplicacin de embriones somticos de papaya Pococ en medio

de cultivo lquido y slido.

Evaluar el efecto de distintos tratamientos sobre la germinacin de embriones

somticos de papaya Pococ.

Encapsular embriones somticos de Papaya Pococ bajo distintas matrices de

alginato de calcio y evaluar su germinacin.

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Materiales y mtodos

Localidad y financiamiento Los experimentos fueron financiados en el marco del proyecto de investigacin 734-B3-

107, y se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnologa del Centro para

Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), ubicado en la Facultad de Ciencias

Agroalimentarias, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, San

Pedro.

Experimentos realizados

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos

En el presente experimento se evaluaron las siguientes concentraciones de la auxina

sinttica 2,4-D: 2, 4, 6, 8 y 10 mg/l como agente inductor del proceso de embriognesis

somtica sobre embriones cigticos de papaya Pococ, basndose en los trabajos

realizados por Fitch y Manshardt (1990) y Posada et al. (2007). El medio de cultivo

base para todos los tratamientos contena la mitad de la concentracin de las sales

minerales y todas las vitaminas del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962)

suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-glutamina (400 mg/l), sacarosa (3% p/v) y

Phytagel (0,28% p/v) segn Clarindo et al. (2008). El pH del medio se ajust a 5,8 y

posteriormente se esteriliz a 121C y 1,05 kg/cm2 durante 30 minutos.

El tipo de explante utilizado en este experimento fueron embriones cigticos desnudos y

semillas cortadas por la mitad. Para esto fue necesario extraer aspticamente semillas

del hbrido de papaya Pococ de varios frutos en su punto de madurez fisiolgica

(fruto verde con una mancha amarilla). Los frutos se cosecharon de plantas cultivadas

en la Estacin Experimental Fabio Baudrit, en el mes de octubre del ao 2011. La

desinfeccin de los frutos se realiz flameando la superficie externa de los frutos

cerrados dentro de la cmara de flujo laminar. Luego, con un cuchillo de cocina estril

se cortaron rebanadas de los frutos y se extrajeron las semillas. Estas se colocaron en

soportes de malla metlicos estriles donde se extendi la semilla y se dej secar por 5

das dentro de la cmara de flujo laminar. Para la extraccin de los embriones cigticos,

a cada semilla se le realizaron dos cortes longitudinales cerca de su eje central,

utilizando un bistur nmero 22, con lo cual se obtuvo un disco compuesto por un anillo

13

de la sarcotesta, dentro del cual se encontraban secciones del endospermo y el embrin

cigtico. Luego, con la ayuda de un bistur nmero 11, se rompi la sarcotesta, se

removieron los restos del endospermo y se extrajo el embrin cigtico. Este

procedimiento se llev a cabo en condiciones aspticas dentro de la cmara de flujo

laminar. Los explantes introducidos se mantuvieron a la oscuridad y a una temperatura

de 25C.

El diseo experimental utilizado fue un irrestricto al azar. Se consider cada placa de

Petri de 90 mm, en la cual se colocaron cuatro embriones cigticos o secciones de

semilla, como unidad experimental. Cada tratamiento estuvo compuesto por cinco

repeticiones. El experimento se evalu por un perodo de 14 semanas. Las variables

porcentaje de formacin de callo y porcentaje de oxidacin fueron analizadas

estadsticamente mediante la prueba de Chi Cuadrado con un 95% de confianza. La

variable nmero de embriones somticos se analiz mediante un anlisis de varianza

(ANDEVA) con 95% de confianza.

2. Anlisis histolgico de callos embriognicos

Luego de 12 semanas de cultivo, se realiz un estudio histolgico de callos

embriognicos provenientes de explantes cultivados en 2 y 6 mg/l de 2,4-D, para ello

las muestras se procesaron de acuerdo con la metodologa descrita a continuacin. La

fijacin de los tejidos se realiz colocando las secciones de tejido en una solucin de

formalina (37%), etanol (95%) y cido actico (37%) (FAA) en una proporcin 1-18-1

por aproximadamente 72 horas. Posteriormente, se removi el FAA de los tejidos,

sumergiendo los callos en agua destilada por dos horas. Luego, para la deshidratacin,

se colocaron las secciones de callo en soluciones de alcohol etlico al 50% por 2 horas,

al 70% por 16 horas, al 80% por 2 horas, al 90% por 1 hora, al 95% por 1 hora, al 100%

adicionado con Eritrosina (2,0 mg/l) por 16 horas, en etanol absoluto por 3 horas (cada

hora se renov la solucin de etanol absoluto) y por ltimo, en una solucin de etanol

absoluto y xilol (1:1) por 2 horas.

Para infiltrar la parafina en los tejidos, estos se sumergieron en una mezcla de xilol y

parafina lquida (1:1) por 70 minutos, luego se transfirieron a una mezcla de xilol y

parafina slida (1:1) por una hora en un estufa a 65C, seguido de la mezcla de parafina

slida y parafina lquida (1:1) por 16 horas a 65C. Luego, los callos se sumergieron en

parafina slida por un periodo de 48 horas, renovando la parafina slida a las 8, 16 y 24

14

horas a 65C. Una vez infiltrada la parafina, se extrajeron las secciones de callo

embriognico y se colocaron sobre una placa de Petri plstica (50 mm) llena hasta la

mitad de su volumen con parafina semislida y luego se agreg parafina derretida hasta

el tope de la placa de Petri. Una vez que la parafina se solidific se formaron bloques de

parafina, donde cada uno contena una porcin de callo y de parafina.

Se cortaron los bloques de parafina con los segmentos de callo en secciones de 8-10 m

de grosor con un micrtomo de rotacin (American Optical 820, Buffalo, USA). Los

cortes se dejaron reposar por 5-10 segundos sobre agua tibia (27-28C) con el fin de

expandir la lmina de parafina; luego los cortes se colocaron sobre un portaobjetos.

Posteriormente se removi la parafina de los tejidos y se realiz la tincin de los cortes.

Para esto se sumergieron en xilol por 10 minutos dos veces, luego en una solucin de

etanol al 95% por 5 minutos, etanol al 70% por 5 minutos, en etanol al 50% por 5

minutos, en solucin de safranina (0,5%) y etanol (0,35%) por 5 minutos, en agua

destilada por 5 minutos, en etanol al 50% por 5 minutos, en etanol al 70% por 5

minutos, en etanol al 95% por 5 minutos, en una solucin de verde rpido (1%) por 1

minuto, en etanol al 100% por 5 minutos, y en xilol, dos veces, por tres minutos. Una

vez teidos los cortes, se observaron con un microscopio invertido Vert A1 (Zeiss,

Goettingen, Alemania) para evaluar el grado de desarrollo de los embriones somticos

en los distintos callos embriognicos. Adems, se tomaron fotografas de los cortes ms

representativos con una cmara digital Moticam Pro (Motic, Xiamen, China) y estas

se procesaron con la ayuda del software Motic Images Plus 2.0 (Motic, Xiamen,

China).

3. Efecto del cultivo en medios lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de papaya Pococ

En este experimento se evalu el efecto de dos sistemas in vitro: el cultivo sobre medio

semislido y el cultivo en medio lquido. En ambos casos el medio de cultivo utilizado

fue el mismo medio de cultivo base utilizado en el experimento anterior, adicionado con

2 mg/l de 2,4-D. El medio de cultivo slido se endureci con Phytagel (0,28% p/v). El

pH de los medios de cultivo se ajust a 5,8 y se esteriliz a 121C y 1,05 kg/cm2

durante 30 minutos. Las condiciones de cultivo fueron las mismas establecidas para el

experimento anterior. Por ltimo, el cultivo en medio lquido se mantuvo en agitacin a

120 rpm en un agitador orbital horizontal (Hotech , San Chung, Taiwn).

15

En este experimento se estableci como unidad experimental una placa de Petri (90

mm) para el cultivo en medio slido y un frasco Erlenmeyer (50 ml) para el cultivo en

medio lquido y se establecieron cinco repeticiones por tratamiento. Debido al poco

material vegetal disponible para cada uno de los tratamientos de induccin de callos

embriognicos, para establecer este ensayo de propagacin se tomaron los callos

embriognicos cultivados bajo las distintas concentraciones de 2,4-D y se mezclaron en

un beaker (250 ml) con el mismo medio de cultivo base adicionado con 2 mg/l de 2,4-

D. Luego, en cada unidad experimental, se colocaron 0,5 g de callo embriognico ms

25 ml de medio de cultivo. Luego de un mes de cultivo los callos embriognicos en

medio slido se subcultivaron al mismo medio, mientras que a las suspensiones

embriognicas se les renov el medio de cultivo cada 15 das.

El diseo experimental de este ensayo fue un irrestricto al azar. Las evaluaciones se

realizaron por un periodo de ocho semanas, en las cuales se determin el nmero de

embriones somticos producidos por unidad experimental, la ganancia en peso y el

porcentaje de embriones cotiledonares y globulares. El anlisis estadstico de las

variables mencionadas se realiz mediante un ANDEVA y la prueba de Tukey con una

confiabilidad del 95%. Todos los tratamientos se transformaron con logaritmo base

diez.

4. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ

Para la realizacin de este experimento se seleccionaron embriones somticos de los

callos embriognicos inducidos a partir de secciones de semillas de papaya Pococ en

todos los medios de induccin de embriognesis somtica con 2,4-D, los cuales haban

sido homogenizados dentro de un Erlenmeyer (250 ml) con 100 ml de agua destilada

estril (ver seccin 3 de Materiales y Mtodos) y subcultivados por un periodo de dos

meses en el mismo medio de cultivo slido utilizado en el experimento anterior. Los

embriones somticos se seleccionaron con la ayuda de un estereoscopio SZ2-ILST

(Olympus, Tokyo, Japn) y se colocaron en los distintos tratamientos. El medio de

cultivo base para todos los tratamientos contena las sales minerales y vitaminas de MS,

suplementados con sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v). El pH del medio se ajust a 5,8

y el medio se esteriliz a 121C y 1,05 kg/cm2 durante 30 minutos. Para esta prueba los

embriones somticos seleccionados se encontraban en etapa cotiledonar y tenan una

longitud de 0,5 - 1,0 mm. Adems, se evalu el efecto de concentraciones crecientes de

16

BAP (0, 0,2, 0,4, 0,6 y 0,8 mg/l) en el medio de cultivo, segn trabajos realizados por

Posada et al. (2007). Las condiciones en las que se cultivaron los embriones somticos

durante esta fase de germinacin fueron: 49 mol/m2/s de luz fluorescente, con un

fotoperiodo de 12 horas, temperatura promedio de 23C y humedad relativa de 48%.

Los callos embriognicos sobrantes se cultivaron en el medio de cultivo slido utilizado

en el experimento de multiplicacin.

El diseo experimental utilizado fue un irrestricto al azar. A su vez, como unidad

experimental se consider una placa de Petri (90 mm), en la cual se colocaron cuatro

embriones somticos. Adems, por cada tratamiento se establecieron cinco repeticiones.

Por ltimo, se determin el porcentaje de germinacin por un periodo de 30 das. El

anlisis estadstico de los datos se realiz utilizando la prueba de Chi cuadrado con un

nivel de significancia superior al 95%.

5. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinacin de semillas sintticas de papaya Pococ

Los embriones somticos utilizados provenan del tratamiento de multiplicacin de

embriones somticos, cuyo medio de cultivo estaba compuesto por la mitad de la

concentracin de las sales minerales y la dosis normal de vitaminas del medio de cultivo

MS suplementado con mio inositol (99 mg/l), L-glutamina (400 mg/l), sacarosa (3%

p/v), adicionado con 2 mg/l de 2,4-D y solidificado con PhytagelTM (0,28%). El

procedimiento de encapsulacin utilizado se bas en el protocolo propuesto por Castillo

et al. (1998). La encapsulacin de los embriones somticos se realiz de manera

individual, por lo que fue necesario seleccionar y separar cada embrin somtico (0,5-

1,0 mm de longitud) del conglomerado en el que se encontraban utilizando pinzas de

punta fina y un estereoscopio SZ2-ILST (Olympus, Tokyo, Japn). Cada embrin

somtico se sumergi en una solucin de cido algnico. Luego, con ayuda de una

pipeta de vidrio con 2,5 mm de dimetro interno, se succionaron aproximadamente 200

l de la solucin de cido algnico ms el embrin somtico y se depositaron en una

solucin de CaCl2 por 30 minutos. Por ltimo, se decant la solucin de CaCl2 y las

cpsulas as formadas se enjuagaron tres veces con agua destilada estril. Todo el

proceso se llev a cabo dentro de la cmara de flujo laminar.

Durante este experimento se evalu el efecto de tres concentraciones de cido algnico

(2,5, 3,5 y 4,5% p/v) y dos concentraciones de CaCl2 (50 y 100 mM) sobre la dureza de

las cpsulas de alginato de calcio y la germinacin de las semillas artificiales de papaya

17

Pococ. A cada solucin de cido algnico se le agregaron las sales minerales del

medio de cultivo MS a la mitad de la concentracin, con excepcin del calcio que no se

agreg, sacarosa (3% p/v) y BAP (0,4 mg/l). El pH de todas las soluciones y los medios

de cultivo se ajust a 5,8 y estos se esterilizaron a 121C y 1,05 kg/cm2 durante 30

minutos. Previo a la esterilizacin, fue necesario calentar levemente las soluciones de

cido algnico para disolverlas.

Adems, se estudi el efecto de una inmersin por 30 minutos de las semillas

artificiales en una solucin de KNO3 (200 mM) sobre la germinacin de las mismas.

Este tratamiento se realiz dentro de la cmara de flujo laminar utilizando beakers (20

ml) estriles. Luego de la inmersin en KNO3, las semillas artificiales se enjuagaron tres

veces con agua destilada estril. Las semillas artificiales se sembraron en un medio de

cultivo MS adicionado con BAP (0,4 mg/l), sacarosa (3% p/v) y agar (0,9% p/v) en

placas de Petri (90 mm de dimetro). Las condiciones en las que se cultivaron las

semillas artificiales durante esta fase de germinacin fueron: 49 mol/m2/s de luz

fluorescente, con un fotoperiodo de 12 horas, temperatura promedio de 23C y humedad

relativa de 48%. Las placas se colocaron en el piso inferior de uno de los estantes de

crecimiento ya que esto evita la deshidratacin del medio y la condensacin de agua en

la parte superior de la placa de Petri.

El diseo experimental utilizado fue irrestricto al azar. Se estableci cada placa de Petri

como unidad experimental, la cual contena cinco semillas artificiales. Para cada

tratamiento se establecieron cinco repeticiones. Se evalu el porcentaje de brotacin y

de oxidacin de los embriones somticos por un periodo de 12 semanas. Tambin se

evalu la dureza de las semillas artificiales, para lo cual se produjeron cpsulas de

alginato de calcio de cada tratamiento de encapsulacin de acuerdo con la metodologa

descrita anteriormente, pero sin incluir los embriones somticos dentro de las cpsulas.

La determinacin de la dureza de las cpsulas se realiz con un texturmetro digital

(TA-TX Plus Texture Analyzer, Stable Micro Systems LTD., Godalming, Reino Unido)

equipado con una punta cilndrica (3 mm de dimetro) que penetr una distancia de 2,5

mm de profundidad sobre la cpsula, a una velocidad de 1,5 mm/s. La fuerza de ruptura

se determin mediante el clculo del rea bajo la curva desde el inicio de la penetracin

hasta alcanzar el pico mximo de ruptura y se expres en Nmm-1.

La variable fuerza de ruptura, el porcentaje de brotacin y el porcentaje de oxidacin se

analizaron mediante un ANDEVA factorial con el fin de determinar el efecto ejercido

18

por cada factor, y luego se aplic una prueba Tukey para la comparacin de medias.

Debido a problemas con la normalidad de los porcentajes fue necesario transformar

ambas variables con la raz de y. Con el fin de evaluar si existan diferencias

significativas entre el testigo absoluto y los distintos tratamientos de encapsulacin se

realiz una prueba de Chi cuadrado entre ambos grupos.

6. Programas estadsticos Todos los anlisis de varianza se realizaron con el programa estadstico Statistica 8.0

(StatSoft Inc., Tulsa, EUA). Por otra parte, los anlisis de Chi cuadrado se realizaron

con el programa estadstico Infostat versin 2008 (Grupo InfoStat FCA, Universidad

Nacional de Crdoba, Crdoba, Argentina).

19

Resultados

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos

En ninguno de los tratamientos de induccin se dio la formacin de callo o de

embriones somticos al utilizar embriones cigticos desnudos, as como tampoco se

observ la oxidacin de los mismos, durante todo el periodo de evaluacin. En las

secciones de semilla la formacin de callo fue evidente luego de 8 semanas de cultivo

en los tratamientos con 2, 4, 6 y 8 mg/l de 2,4-D. Se observ que los callos

embriognicos obtenidos a partir de secciones de semilla se originaron en la regin del

meristemo apical de los embriones cigticos. En cuanto a la oxidacin de los explantes

introducidos, en todos los tratamientos se observaron porcentajes inferiores al 5%.

Como se observa en la Figura 2.A, las concentraciones de 4 y 6 mg/l de 2,4-D indujeron

mayor formacin de callo a las 8 semanas de cultivo (45% y 55% respectivamente) en

comparacin con las concentraciones de 8 y 10 mg/l (15% y 0% respectivamente). En

esta misma fecha de evaluacin, al utilizar una concentracin de 2 mg/l de 2,4-D se

obtuvo un porcentaje de formacin de callo del 25%; sin embargo, la respuesta entre

repeticiones fue muy variable por lo que no mostr diferencias significativas con

respecto a los dems tratamientos.

Al avanzar el periodo de evaluacin, los explantes cultivados con las concentraciones de

4 y 6 mg/l no mostraron diferencias significativas en cuanto a la formacin de callo en

comparacin con el resto de las dosis utilizadas. Adems, a las 14 semanas de cultivo se

evalu la formacin de callos embriognicos y se observ en todos los tratamientos un

porcentaje de formacin de callos embriognicos del 25% al 33%, sin presentar

diferencias significativas entre tratamientos (datos no presentados). El mbito en la

produccin de embriones somticos entre los distintos tratamientos fue de 11 a 31

embriones somticos cotiledonares por callo embriognico y no se observ ninguna

diferencia significativa sobre esta variable al utilizar distintas concentraciones de 2,4-D

(Figura 2.B).

20

Figura 2. A. Efecto del 2,4-D sobre la formacin de callo a partir de secciones de

semillas de papaya Pococ durante un periodo de 14 semanas. B.

Produccin total de embriones somticos (ES) de papaya por callo

embriognico observado. Letras distintas muestran diferencias significativas

con un nivel de confianza del 95%.

La formacin de embriones somticos en los distintos tratamientos se dio de manera

desincronizada, ya que luego de 12 semanas de cultivo algunos de los callos solo

presentaron conglomerados de clulas menos vacuoladas y con citoplasmas densos

(Figura 3.A), mientras que en otros se observaron estructuras proembrionarias, las

cuales no tenan una conexin vascular con el resto del callo (Figura 3.B). O bien, como

se observa en la Figura 3.C, en otros callos los embriones somticos se encontraban en

un estado cotiledonar con una anatoma normal, es decir contaban con una radcula,

hipoctilo y cotiledones. Adems, en los estados iniciales del desarrollo de los

embriones somticos de papaya no se apreci de forma clara la presencia de un

suspensor (Figura 3.A).

a a

a

a

a

0

5

10

15

20

25

30

35

2 mg/l 4 mg/l 6 mg/l 8 mg/l 10 mg/l

N

me

ro d

e E

S /

callo

Concentracin de 2,4-D

ab

abc

a a

a

a

a

a aa

a

bc

bca

c

c

a a

0

10

20

30

40

50

60

70

6 8 10 12 14

Form

aci

n d

e c

allo

(%

)

Semanas de evaluacin

2 mg/l

4 mg/l

6 mg/l

8 mg/l

10 mg/l

A

B

21

Figura 3. Cortes histolgicos de callos embriognicos cultivados en medios de cultivo

adicionados con 6 mg/l de 2,4-D (A y B) y 2 mg/l de 2,4-D (C) luego de 12

semanas de cultivo. Escala igual a 1 mm. Flechas indican un punto

meristemtico (A), estructuras proembrionarias (B) y un embrin somtico

(C).

2. Efecto del cultivo en medios lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de papaya Pococ

Como se observa en la Figura 4.A., luego de un periodo de ocho semanas, la

propagacin de embriones somticos en medio lquido fue mayor que al cultivarlos en

medio slido. El nmero de nuevos embriones somticos en el sistema de cultivo slido

fue de 307 y en el sistema de cultivo lquido la media fue de 1326 por unidad

experimental. En ambos sistemas de cultivo el porcentaje de embriones somticos en

etapa globular-torpedo fue significativamente mayor en comparacin con el porcentaje

A B

C

22

de embriones en etapas cotiledonares, con valores de 85,30% y 14,70% en suspensiones

embriognicas y cultivo en medio slido, respectivamente (Ver Figura 4.B).

Figura 4. Efecto del sistema de cultivo sobre el nmero de embriones somticos (ES)

producidos (A), el crecimiento del callo (A) y el desarrollo de los ES (B),

luego de ocho semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias

significativas con un nivel de confianza del 95%.

Transcurrido el periodo de cultivo, los callos embriognicos presentaron un crecimiento

estadsticamente similar en ambos sistemas de cultivo, donde el peso final obtenido en

el sistema de cultivo slido y lquido fue de 2,08 g y 1,65 g, respectivamente.

Por otro lado, el porcentaje de formacin de embriones somticos entre las etapas

globular y torpedo en medio lquido fue significativamente mayor (85,3%) al obtenido

en medio slido (57,0%) (ver Figura 4B y 5). En ninguno de los dos sistemas de cultivo

se presentaron problemas de oxidacin.

b

a

a

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Slido Lquido

Cre

cim

ien

to d

el c

allo

em

bri

og

nic

o (

g)

Pro

du

cci

n d

e E

S (u

nid

ade

s)

Medio de cultivo

Conteo ES Peso (g)

A

b

a

c

d

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Slido Lquido

Form

aci

n d

e E

S (%

)

Medio de cultivo

ES globulares

ES cotiledonares

B

23

Figura 5. Embriones somticos desarrollados a partir de secciones de semillas de

papaya en medio de cultivo lquido (A) y slido (B). Barras equivalentes a 1

mm.

3. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ

El crecimiento del meristemo apical de los embriones somticos se dio luego de dos

semanas de cultivo en todos los tratamientos con BAP, donde se observaron porcentajes

de brotacin de los embriones somticos del 23%, 19%, 14%, 7,8% y 3,3% en los

medios de cultivo aadidos con 0,4 mg/l, 0,6 mg/l, 0,2 mg/l, 0,8 mg/l y 0 mg/l (testigo)

de BAP, respectivamente. El anlisis estadstico indic que no existen diferencias

significativas entre los tratamientos adicionados con BAP en ese momento. Sin

A

B

24

embargo, s existi una diferencia significativa entre este mismo grupo de tratamientos

y el testigo (Figura 6).

Figura 6. Efecto de varias concentraciones de BAP sobre la brotacin de embriones

somticos de papaya durante un periodo de cultivo de cuatro semanas (letras

distintas muestran diferencias significativas con un nivel de confianza del

95%).

Para la tercera semana de cultivo se observ un porcentaje de brotacin del 34% y 24%

en los tratamientos adicionados con 0,4 mg/l y 0,6 mg/l de BAP, sin diferencias

estadsticamente significativas entre ambos tratamientos. La adicin de 0,2 mg/l de BAP

al medio de cultivo no mejor significativamente la brotacin de los embriones

somticos, ya que este tratamiento no present diferencias significativas con respecto al

testigo. Adems, a partir de esta fecha fue posible observar que la concentracin de 0,8

mg/l de BAP ejerci un efecto detrimental sobre la brotacin de los embriones

somticos, ya que la brotacin de los embriones somticos en este tratamiento fue

significativamente menor a la obtenida en los tratamiento con 0,6 y 0,4 mg/l. En la

ltima semana de evaluacin, los tratamientos con 0,4 mg/l y 0,6 mg/l de BAP

presentaron los porcentajes de brotacin ms altos, con 40% y 27% de brotacin,

respectivamente. Con respecto a los tratamientos con 0,2 mg/l, 0,8 mg/l de BAP y el

testigo se observ la misma tendencia de la fecha anterior (Figura 6).

ab c d

abc bc

a

a

a

a

abab

a c cd

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4

Bro

taci

n

de

ES

(%)

Semanas

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

25

En la Figura 7.A se muestra la formacin de una raz en un embrin somtico cultivado

en el tratamiento sin BAP. El porcentaje de enraizamiento oscil entre 0% y 5,5%, sin

presentar diferencias significativas entre tratamientos (Figura .A).

Figura 7. Enraizamiento y brotacin de embriones somticos de papaya cultivados en

un medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento (A) y otro adicionado

con 4 mg/l de BAP (B). Barras equivalentes a 1 mm. Flecha indica formacin

de callo en la base de los embriones somticos.

Adems, se observ la formacin de callo en la regin basal de los embriones

somticos, por lo que se evalu el efecto de las distintas concentraciones de BAP sobre

este parmetro (Figura 7.B). En el testigo, el 20% de los explantes introducidos

formaron callo. En los tratamientos con 0,2 mg/l, 0,4 mg/l, 0,6 y 0,8 mg/l de BAP se

observ un porcentaje de formacin de callo del 28%, 33%, 46% y 38%,

respectivamente, siendo los dos ltimos tratamientos estadsticamente distintos del

testigo (Figura .A). Por otra parte, el 45% de los embriones somticos cultivados en el

medio de cultivo adicionado con 0,8 mg/l de BAP se oxidaron, valor estadsticamente

distinto de aquellos obtenidos para el resto de los tratamientos (Figura .B). La oxidacin

para el resto de los tratamientos oscil entre el 13% y 23%, sin diferencias significativas

entre ellos.

A B

26

Figura 8. Efecto de distintas concentraciones de BAP sobre la formacin de callo y

races (A) y sobre la oxidacin (B) de los embriones somticos (ES) durante

cuatro semanas de cultivo. Letras distintas muestran diferencias significativas

con un nivel de confianza del 95%.

4. Efecto de la dureza de la matriz de alginato de calcio sobre la germinacin de semillas sintticas de Papaya Pococ

En forma paralela a la formacin de semillas artificiales de papaya Pococ (Figura

9.A) y su colocacin en los distintos medios de germinacin, se determin la fuerza de

ruptura de las cpsulas con las distintas concentraciones de alginato de sodio y CaCl2

(sin embrin en su interior).

b

ab

ab

a

a

a

a

a a a-1

1

3

5

7

9

11

13

15

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

Riz

og

ne

sis

de

ES

(%)

Cal

log

ne

sis

en

ES

(%)

Concentracin de BAP

Callo Raiz

b

bb

b

a

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0,0 mg/l 0,2 mg/l 0,4 mg/l 0,6 mg/l 0,8 mg/l

Oxi

dac

in

de

ES

(%)

Concentracin de BAPB

A

27

Figura 9. Semillas artificiales de papaya Pococ elaboradas con (A) 4,5% de alginato

de sodio y 100 mM de CaCl2 lista para ser cultivada; (B) tratada con 200 mM

de KNO3 por 20 minutos previo a su cultivo y (C) otra brotada luego de 12

semanas de cultivo. Barras equivalentes a 3 mm. Flecha indica el lugar de la

fisura de la semilla sinttica.

Como se observa en la Figura 10, las cpsulas ms duras fueron aquellas producidas con

las soluciones de cido algnico al 3,5% y 4,5%, y las soluciones de CaCl2 a 100 mM

(1,31 Nmm y 1,18 Nmm, respectivamente). Las cpsulas fabricadas con las soluciones

al 2,5% y 3,5% de cido algnico y gelificadas en una solucin de CaCl2 a una

concentracin de 50 mM presentaron fuerzas de ruptura de 0,41 Nmm y 0,28 Nmm,

respectivamente, las cuales fueron significativamente menores que el resto de los

tratamientos.

Al elaborar cpsulas con cido algnico al 4,5% y CaCl2 a 50 mM se produjeron

cpsulas con una fuerza de ruptura de 0,79 Nmm, las cuales no presentaron diferencias

significativas con respecto a las cpsulas elaboradas con una solucin de cido algnico

al 2,5% y gelificadas en una solucin de CaCl2 a 100 mM (0,94 Nmm). Por ltimo,

todas las cpsulas tratadas con KNO3 (200 mM) se fisuraron al momento en que la

aguja del texturmetro comenz a ejercer presin sobre ellas, por lo que no fue posible

determinar su fuerza de ruptura (ver Figura 9.B). A pesar de lo anterior, el KNO3 no

present una interaccin significativa con el alginato de sodio (p: 0,1388), el CaCl2 (p:

0,6425) o con ambos factores (p: 0,9604) sobre la brotacin de las semillas artificiales.

A B C

28

Figura 10. Dureza de las cpsulas de alginato de calcio elaboradas con distintas

concentraciones de alginato de sodio y gelificadas con dos concentraciones

de CaCl2.

En cuanto al comportamiento de las semillas sintticas luego de 4 semanas de cultivo,

los embriones somticos sin encapsular mostraron 30% de brotacin; sin embargo, en

los distintos tratamientos de encapsulacin el porcentaje de brotacin fue inferior al

10% (datos no mostrados). El experimento se continu evaluando hasta alcanzar un

periodo de cultivo de 12 semanas, momento en el cual 64% de los embriones sin

encapsular haban brotado (datos no presentados), valor significativamente mayor a los

obtenidos en todos los tratamientos de encapsulacin (Figura 11.A), que oscil entre 4%

(100 mM de CaCl2 con 2,5 y 3,5% de cido algnico) y 28% (50 mM de CaCl2 y 4,5%

de cido algnico). Segn el anlisis estadstico, para esta variable no hubo diferencias

significativas entre los distintos tratamientos de encapsulacin. En la Figura 9.C se

muestra la brotacin de una semilla artificial de papaya Pococ. Por ltimo, el

coeficiente de correlacin entre la dureza de las cpsulas y el porcentaje de brotacin

fue de 0,0294.

Con respecto a la oxidacin de los embriones somticos encapsulados, el anlisis

estadstico indica que existi una interaccin entre la concentracin de CaCl2 y el

tratamiento de las cpsulas con KNO3. Sin embargo, segn el anlisis estadstico,

solamente el porcentaje de oxidacin de las cpsulas gelificadas con 100 mM de CaCl2

sin tratar con KNO3 fue significativamente distinto de los dems tratamientos (Figura

11.B). Por ltimo, la oxidacin de los embriones somticos sin encapsular (27%) fue

estadsticamente igual al observado en todas las semillas sintticas (p: 0,5709).

cc

bb

a a

0.00.20.40.60.81.01.21.4

2.50% 3.50% 4.50% 2.50% 3.50% 4.50%

cido Algnico cido Algnico

50 mM CaCl 100 mM CaClRe

sist

en

cia

me

cn

ica

(N*

mm

)

Tratamientos

29

Figura 11. A. Efecto del uso de distintas concentraciones de cido algnico y CaCl2

durante la encapsulacin de embriones somticos de papaya, as como de

una inmersin en KNO3 (200 mM) previo al cultivo, sobre la brotacin (A)

y oxidacin (B) de la semilla sinttica de papaya luego de 12 semanas de

cultivo.

A

b

b

a

b

0

10

20

30

40

50

60

70

(-) KNO (+) KNO (-) KNO (+) KNO

50 mM CaCl 100 mM CaCl

Oxi

dac

in

de

ES

(%)

TratamientosB

a

a

a

a

a

a

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

2,50% 3,50% 4,50% 2,50% 3,50% 4,50%

cido Algnico cido Algnico

50 mM CaCl 100 mM CaCl

Bro

taci

n

de

ES

(%)

Tratamientos de encapsulacin

30

Discusin

1. Efecto de la concentracin de 2,4-D sobre la induccin de embriones somticos

La induccin de embriones somticos a partir de embriones cigticos desnudos se ha

reportado en varios cultivares de papaya (Co7, Solo, Maradol y Maradol Rojo

y otros cultivares hawaianos) (Fitch y Manshardt 1990; Castillo et al. 1998; Posada et

al. 2007; Ascencio-Cabral et al. 2008; Anandan et al. 2012). Sin embargo en este

trabajo, los embriones cigticos desnudos de papaya Pococ no respondieron al

cultivarse en un medio adicionado con 2,4-D, lo cual podra estar relacionado con el

grado de madurez (aproximadamente 130-150 das despus de la antesis) en el que estos

se encontraban al momento de ser extrados de la semilla. Al respecto, Anandan et al.

(2012) observaron que los embriones cigticos extrados de semillas maduras y negras

(140-150 das despus de la antesis) del cultivar Co7 no respondieron ante el estmulo

con 2,4-D, a diferencia de aquellos embriones cigticos extrados de semillas inmaduras

(110-120 das despus de la antesis), las cuales se caracterizaban por presentar una

coloracin blanca.

Si bien se observ visualmente que los callos obtenidos de las secciones de semilla de

papaya Pococ se generaron a partir del embrin cigtico, los cuales se elongaron un

poco, es necesario realizar un anlisis histolgico en el momento en que se inicia la

formacin de callo, para descartar que se genere a partir de tejido materno. Asi lo

describieron Vila et al. (2003), quienes realizaron estudios histolgicos luego de tres

das de iniciado el cultivo de embriones cigticos (con y sin nucela) y de ovarios de

Melia azedarach para determinar el tejido del cual se originan los embriones somticos

durante su induccin. Por otra parte, la formacin de embriones somticos de papaya

Pococ a partir de algn tejido materno podra no ser muy alta. Ya que, se ha

observado, en otras especies, que el porcentaje de formacin de embriones somticos a

partir de tejidos maternos es muy bajo, como en el cultivar Ataulfo de Mangifera

indica, donde la formacin de embriones somticos a partir de estos mismos tejidos se

dio en solo el 10 % de los explantes (Rivera-Domnguez et al. 2004).

A las ocho semanas de cultivo, los explantes de papaya Pococ cultivados en un

gradiente de 2,4-D presentaron un comportamiento similar al que observaron Anandan

et al. (2012). Estos autores obtuvieron los mayores porcentajes de formacin de callo al

31

utilizar concentraciones entre los 2 y 6 mg/l de 2,4-D, observando un pico de respuesta

de 87% de formacin de callo con la primera concentracin, siendo el 75% de estos

embriognicos. Adems, los mismos autores observaron que al utilizar concentraciones

mayores a 2 mg/l disminuy significativamente la formacin de callo, lo cual indica un

efecto inhibitorio del proceso de induccin de callo por parte del regulador de

crecimiento a partir de cierto umbral (Anandan et al. 2012). Lo anterior podra explicar

los menores porcentajes de formacin de callo en los explantes de papaya Pococ

cultivados bajo concentraciones de 2,4-D superiores a los 6 mg/l, indicando un menor

grado de susceptibilidad de este genotipo a las altas concentraciones de este mismo

regulador de crecimiento.

Luego de 14 semanas de cultivo, 65% de los explantes de papaya Pococ cultivados

en una concentracin de 4 mg/l de 2,4-D formaron callo, porcentaje que no fue

significativamente distinto del observado con las otras concentraciones del regulador.

Adems, el porcentaje de formacin de callo embriognico y el nmero de embriones

somticos obtenidos tampoco vari significativamente entre tratamientos, lo cual indica

que concentraciones mayores de 2 mg/l de 2,4-D no promovieron la transicin de un

mayor nmero de clulas somticas hacia un estado embriognico. Fitch y Manshardt

(1990) observaron un comportamiento similar en la variedad de papaya Kapoho al

cultivar embriones cigticos desnudos (cosechados 104 das despus de la floracin), ya

que dichos explantes presentaron un porcentaje de formacin de callo similar, sin

importar la concentracin de 2,4-D utilizada.

El desarrollo no sincronizado de los embriones somticos y la alta variabilidad de

respuesta obtenida en cada tratamiento es un fenmeno que se ha observado al cultivar

embriones cigticos de otras variedades de papaya (Sunrise, Sunset, Waimanalo

y Kapoho), as como en Vitis vinifera y Quercus robur, y es atribuido a que no todas

las clulas somticas de los explantes cultivados cuentan con el mismo potencial

gentico para llevar a cabo el proceso de embriognesis somtica (Fitch y Manshardt

1990; Jayasankar et al. 2003; San-Jos et al. 2010). Lo anterior puede estar relacionado

con la capacidad de las clulas de los explantes de papaya de modificar sus patrones de

metilacin de la cromatina y por ende sus patrones de expresin gnica, durante su

cultivo con 2,4-D (Verdeil et al. 2007). El efecto del 2,4-D durante la induccin

embriognica posiblemente se relaciona con un incremento en la metilacin total del

tejido, tal como en el caso de la induccin de embriones somticos de la accesin 85 de

32

Acca sellowiana a partir de embriones cigticos tratados con un breve estmulo de 2,4-

D (200 mM), el cual indujo la formacin de embriones somticos, as como un aumento

de la tasa de metilacin total de los explantes. Por otra parte, al tratar los embriones

cigticos con un estmulo del agente hipometilante 5-azacitidina (100 M) y su

posterior cultivo en un medio de cultivo adicionado con 50 M de este compuesto, no se

observ la formacin de embriones somticos y la metilacin total de los explantes

disminuy conforme avanz el periodo de cultivo (30 das) (Fraga et al. 2012).

Las estructuras observadas en la figura 3.B, son probablemente estructuras nodulares

embriognicas o embriones somticos en etapa globular, las cuales se caracterizan por

la carencia de una estructura similar a un suspensor, y fueron semejantes a los

generados a partir de segmentos nodales de Quercus robur, los cuales cuentan con

puntos meristemticos que dieron origen a embriones somticos normales (San-Jos et

al. 2010). Es comn observar la formacin del suspensor en etapas muy tempranas del

desarrollo embrionario y hasta la etapa globular, ya que luego de desarrollarse por

completo y en las etapas finales del desarrollo, el suspensor atraviesa un proceso de

senescencia, como en el caso de las especies Acca sellowiana y Sorbus pohuashanensis

(Jayasankar et al. 2003; Yang et al. 2012).

2. Efecto del medio lquido y slido sobre la propagacin de embriones somticos de papaya Pococ

El mayor nmero de embriones somticos de papaya obtenido al subcultivar los callos

embriognicos en medio de cultivo lquido puede estar relacionado con las ventajas que

ofrece este sistema de cultivo. La disociacin de los conglomerados de embriones, una

mayor exposicin de los tejidos al medio y sus componentes, una buena aireacin,

provocada por la agitacin leve de los Erlenmeyers, son varias de estas ventajas y se

considera que son las que mayor influencia ejercen sobre la formacin de nuevos

embriones somticos (Jimnez et al. 2011; Remakanthan et al. 2013). Un resultado

similar se ha obtenido al cultivar callos embriognicos de los cultivares Deglet Nour,

Bousthami noir y Jihel de la especie Phoenix dactylifera, obteniendo en algunos

casos incrementos del 20% en cuanto al nmero de embriones somticos producidos al

comparar el sistema de cultivo en medio lquido con el slido (Fki et al. 2003; Al-

Khayri 2012). Litz y Conover (1983) lograron establecer suspensiones embriognicas

de papaya en un medio de cultivo MS adicionado con 1-2 mg/l de 2,4-D, en las cuales

se observ la proliferacin de embriones somticos luego de 1-2 meses de cultivo,

33

resultado muy similar al observado en las suspensiones embriognicas de papaya

Pococ. Adems, las suspensiones embriognicas de papaya establecidas por estos

ltimos autores se subcultivaron regularmente por un periodo de un ao sin aparente

prdida de la capacidad regenerativa. Si las suspensiones embriognicas de papaya

Pococ presentaran un comportamiento similar se facilitara la propagacin a mayor

escala de este genotipo ya que no sera necesario realizar la induccin de nuevos callos

embriognicos con mucha frecuencia.

Por ltimo, en ambos sistemas, los callos embriognicos presentaron el mismo

crecimiento; sin embargo, el mayor nmero de embriones somticos as como el menor

desarrollo de los embriones se dio en el sistema lquido, lo cual indica un efecto del

sistema de cultivo sobre el desarrollo de los embriones somticos recin formados. En

otras especies se han observado situaciones similares. Tal es el caso de los embriones

somticos de Phoenix dactylifera L. cv. Deglet Nour cultivados en medio slido, los

cuales presentaron un crecimiento ms lento, as como menor nmero de embriones

somticos, al compararlos con el sistema lquido (Fki et al. 2003). Se considera que la

diferenciacin de embriones globulares hacia etapas posteriores del desarrollo

embrionario es inhibida por el cultivo continuo del material en presencia de auxinas,

debido a la sntesis de ARNm y protenas que detienen el desarrollo embrionario

(Jimnez 2001). Esta regulacin tambin se puede dar a nivel de la cromatina, ya que se

ha observado que el uso de 5-azacitidina (10 M), como agente hipometilante, en

conjunto con 2,4-D (200 mM) para la induccin de embriones somticos de Acca

sewolliana, detiene el desarrollo de los mismos, los cuales se mantienen en etapas de

desarrollo previas a la fase acorazonada (Fraga et al. 2012). Lo anterior indica que el

cultivo en medio lquido de callos embriognicos de papaya Pococ posiblemente

modifica los patrones de metilacin y expresin gnica de los mismos, ocasionando un

aumento en la produccin de nuevos embriones somticos, as como un retraso en su

desarrollo.

34

3. Efecto del BAP sobre la germinacin de embriones somticos de papaya Pococ

La poca germinacin de los embriones somticos de papaya Pococ en este trabajo,

as como lo observado por otros autores, en otros genotipos, al ser cultivados en un

medio desprovisto de reguladores de crecimiento, indica la necesidad de algn estmulo

adicional para favorecer este proceso (Fitch y Manshardt 1990; Anandan et al. 2012). El

BAP se ha utilizado en muchas especies durante distintas etapas del proceso de

embriognesis somtica, ya sea durante su induccin o bien durante la diferenciacin y

germinacin de los embriones somticos (Raemakers et al. 1995; Fehr 2006;

HaeYoung y ChangHoo 2009). Segn este trabajo, el rango de concentracin adecuado

de BAP para la brotacin de los embriones somticos de papaya Pococ es de 0,4-0,6

mg/l de BAP. Este resultado coincide con aquellos obtenidos por Posada et al. (2007),

quienes evaluaron el efecto de varias concentraciones de BAP sobre la germinacin de

embriones somticos de la variedad de papaya Maradol rojo y el mejor resultado se

obtuvo al utilizar una concentracin de 0,22 mg/l de BAP, alcanzando un porcentaje de

germinacin del 92%, luego de 30 das en el medio de germinacin.

Los embriones somticos de papaya Pococ cultivados en todos los medios de cultivo

presentaron un enraizamiento muy bajo. Un resultado similar fue obtenido por Clarindo

et al. (2008) al cultivar embriones somticos de papaya Golden en un medio de

cultivo MS desprovisto de reguladores de crecimiento. Una posible explicacin para

este comportamiento es que los embriones somticos de papaya Pococ no culminaron

el proceso de maduracin. Al respecto, Pullman et al. (2003) indican que embriones

cigticos cotiledonares maduros