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ESTUDIO DE LAS ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PLANTAINTERACCIONES PLANTA--HONGOS PATOGHONGOS PATOGÉÉNICOSNICOS

Clase I Clase I -- conceptosconceptos

Marciel J. Stadnik

UFS

CVCC UFS

CVCCLABFITOP

stadnik@cca.ufsc.br

PreguntasPreguntas? > ? > RespuestasRespuestas

Cual Cual óórgano y tejido es infectado por el hongo?rgano y tejido es infectado por el hongo?Como ocurre la infecciComo ocurre la infeccióón? directa o indirecta?n? directa o indirecta?Cuales cCuales céélulas del hululas del huéésped son colonizadas? sped son colonizadas? (epidermis, (epidermis, mesmesóófilofilo, etc.), etc.)CuCuááles son los mecanismos involucrados con les son los mecanismos involucrados con la defensa de la planta contra el hongo?la defensa de la planta contra el hongo?

ClasificaciClasificacióón de hongos:n de hongos:

Cuanto a la relaciCuanto a la relacióón parasitaria:n parasitaria:

ParParáásitos obligadossitos obligados: Ciclo de vida ocurre : Ciclo de vida ocurre exclusivamente en el tejido vivo del huexclusivamente en el tejido vivo del huééspedsped

ParParáásitos no obligadossitos no obligadosSaprSapróófitosfitos facultativosfacultativosPatPatóógenos facultativosgenos facultativos

ClasificaciClasificacióón de hongosn de hongos

Cuanto a las relaciones nutricionales (Cuanto a las relaciones nutricionales (LuttrellLuttrell,1974):,1974):

NecrotrNecrotróóficofico ((PertotroficoPertotrofico):): patpatóógeno mata geno mata las clas céélulas do hululas do huéésped antes de colonizarlassped antes de colonizarlas

AlternariaAlternaria spp.spp.

HemibiotrHemibiotróóficofico:: patpatóógeno forma inicialmente una asociacigeno forma inicialmente una asociacióón n con ccon céélulas vivas del hululas vivas del huéésped, y mas tarde se vuelve sped, y mas tarde se vuelve necrotrnecrotróóficofico

Ex: Ex: ColletotrichumColletotrichum spp.spp.

BiotrBiotróóficofico:: patpatóógeno se nutre de tejido vivogeno se nutre de tejido vivoOOíídiosdios, Rojas, Rojas

CaracterCaracteríísticas sticas organismos organismos biotrbiotróóficosficos

estructuras de infecciestructuras de infeccióón altamente n altamente desarrolladasdesarrolladasbaja actividad de enzimas lbaja actividad de enzimas lííticasticascamadas interfaciales que separan las camadas interfaciales que separan las membranas plasmmembranas plasmááticas del hongo y planta ticas del hongo y planta mecanismos de supresimecanismos de supresióón de defensa del n de defensa del huhuééspedspedhausthaustóóriosrios

((MendgenMendgen & & HahnHahn, 2002). , 2002).

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Modo de infecciModo de infeccióón y n y colonizacicolonizacióónn

Rojas Rojas ((basidiomycotabasidiomycota))

OOíídiosdios ((ascomycotaascomycota) )

ColletotrichumColletotrichum lindemuthianumlindemuthianum y y ColletotrichumColletotrichum gloeosporioidesgloeosporioides

= presentan diferentes tipos y grados de = presentan diferentes tipos y grados de desarrollo desarrollo biotrbiotróóficofico. .

Rojas Rojas ((biotrbiotróóficosficos deldel mesmesóófilo)filo)

UromycesUromyces appendiculatusappendiculatus FormaciFormacióón de n de apresapresóóriorio en en respuesta a caracterrespuesta a caracteríísticas sticas topogrtopográáficasficas

Allen et al. (1991)

Roja de la sojaRoja de la soja((PhakopsoraPhakopsora pachyrhizipachyrhizi))

Penetración directa !Koch et al. (1983)

MicroscopMicroscopííaa de luzde luz

TestsTests in in vitrovitro sobre papel sobre papel celofcelofáánn

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PadrPadróón de expresin de expresióón de n de ARD1ARD1-- ArabitolArabitol DesidrogenaseDesidrogenase

((AA)) RepresentaciRepresentacióón de las n de las estructrurasestructruras de infeccide infeccióón de la n de la roja: roja: 1, 1, ureduredóósporosporo (SP); 2, tubo (SP); 2, tubo germinativo (GT) 4 h despugerminativo (GT) 4 h despuéés de s de la germinacila germinacióón; 3n; 3––6, estructuras de 6, estructuras de infecciinfeccióón n in in vitrovitro en en estadestadííosossiguientes: 3, siguientes: 3, apresapresóóriorio (AP) (6 h); (AP) (6 h); 4, ves4, vesíícula cula subestomatalsubestomatal (SV) (12 (SV) (12 h); 5, hifa de infeccih); 5, hifa de infeccióón (IH) (18 h); n (IH) (18 h); 6, c6, céélulalula--madre madre haustorialhaustorial (HM) (HM) estadestadííoo (21 h); 7, (21 h); 7, hausthaustóóriorio (HA); (HA); 8, hojas infectadas; 9, no 8, hojas infectadas; 9, no infectadas (estructuras 2infectadas (estructuras 2––6 6 obtidasobtidasin in vitrovitro).; NB, gola do ).; NB, gola do pescopescoççoo; ; EM, matriz EM, matriz extrahaustorialextrahaustorial. .

((BB)) GeleGele de agarosa de agarosa

((CC)) Northern Northern blotblot de de gelesgelesdescritos en (descritos en (BB). ).

Link et al. (2005)

AnAnáálisislisis inmunocitolinmunocitolóógicasgicas y gelesy geles

OOíídiosdios((biotrbiotróóficosficos de de lala epidermisepidermis))

Blumeria graminis

Proceso de infecciProceso de infeccióón de n de BlumeriaBlumeria graminisgraminis

MICROSCOPÍA DE FLUORENCIA

COMPUESTOS FENÓLICOS

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE

VARREDURA

SUPERFICIE

Microscopia de Microscopia de fluorescenciafluorescencia (MF)(MF)

Luz incidente 100 a 400nmLuz incidente 100 a 400nmFiltro antes de Filtro antes de lala lente objetiva permite apenas lente objetiva permite apenas elel pasajepasaje de luz excitadade luz excitadaComponentes Componentes autofluorescentesautofluorescentes (ex. (ex. compuestoscompuestos fenfenóólicos)licos)FluorocromosFluorocromos como sondascomo sondasEnEn materialesmateriales fijadosfijados y no y no fijadosfijadosProteProteíínas fluorescentes (nas fluorescentes (expresadasexpresadas o o microinyectadasmicroinyectadas) ) enen ccéélulas vivas.lulas vivas.

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TTéécnicas microsccnicas microscóópicas para picas para lalaevaluacievaluacióónn de de anastomosisanastomosis conidialconidial

Live‐cell imaging

Scanning

Electron microscopy

Staining TransmissionLabelling

GFP

Calcofluor White

DAPI

DiCO6Carboxy‐DFDA

ElectronElectron microscopymicroscopy

SporesSpores collectedcollected bybytouchingtouching a 15a 15--dayday oldoldcultureculture withwith nylon nylon hybridisationhybridisation membranemembrane, , oror fixedfixed andand mountedmounteddirectlydirectly fromfrom de de beanbeanpodpod..

MicroscMicroscóópio pio óóptico & ptico & GUS e GFPGUS e GFPExpresiExpresióónn ggéénicanica a a nivelnivel celular mediante celular mediante elel uso de uso de genes repgenes repóórteres visualmente rteres visualmente detectablesdetectablesGUS (GUS (ββ--DD--glucoronidasaglucoronidasa))Marcadores histoquMarcadores histoquíímicos y genes repmicos y genes repóórteresrteresSonSon introducidosintroducidos em em elel hongohongo de de interinterééss. . AmuestrasAmuestrassonson colectadascolectadas y colocadas para y colocadas para reaccionarreaccionar concon elelsubstrato de GUS(5substrato de GUS(5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolylindolyl--ββ--DD--glucorglucoróónidonido ((XX--GlcAGlcA) ) →→ precipitado azulprecipitado azul

http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p40/fulltext.pdf0/fulltext.pdf

LiveLive--cellcell imagingimaging11-- StainingStaining

-- ConidiaConidia collectedcollected fromfrom 77--16 16 oldold culturescultures andandsuspendedsuspended in in waterwater (1x10(1x106 6 conidiaconidia/mL)/mL)→→inoculateinoculate PDB in slide PDB in slide cultureculture chamberchamber..

-- IncubatedIncubated for 24h,48 for 24h,48 andand 72h.72h.

-- CalcofluorCalcofluor White(0,12 M)White(0,12 M)→→ for for cellcell wallwall-- DAPIDAPI→→ for for nucleinuclei-- DiCODiCO66 →→ for for mitochondriamitochondria-- CarboxyCarboxy--DFDADFDA →→ for for vacuolesvacuoles

-- InvertedInverted microscopemicroscope equippedequipped withwith bluebluediodediode andand argonargon ionion laserslasers

22-- LabellingLabelling withwith GFPGFP

-- ProtoplastProtoplast obtainedobtained fromfrom youngyoung myceliamycelia in in NaClNaCl as as osmoticosmoticstabilizerstabilizer

-- IncubationIncubation ofof protoplastsprotoplasts for 3h for 3h withwith LyzingLyzing EnzymesEnzymes..

-- TranformationTranformation ofof protoplastsprotoplasts withwith thethe plasmidplasmid pMF357 pMF357 whichwhichcarriedcarried hH1hH1--sgfpsgfp gene gene andand hphhph gene for gene for hygromycinhygromycinresistanceresistance

-- MixtureMixture transferedtransfered to to regenerationregeneration agaragar andand hygromycinhygromycin B B

-- ConidiaConidia obtainedobtained fromfrom transformantstransformants werewere spread spread ontoonto PDA PDA containingcontaining hygromycinhygromycin..

-- SingleSingle conidiaconidia expressingexpressing hH1hH1--sFGPsFGP werewere selectedselected usingusing a a fluorescencefluorescence stereostereo microscopemicroscope withwith GFP GFP filterfilter setset

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Propidium iodide(nuclei)

DAPI (nuclei) Carboxy‐DFDA (vacuoles)

Calcofluor White (cell walls) hH1 ‐GPF

MetodologMetodologííaa bbáásicasica

DISCOS FOLIARES

SOLUCIÓN PARA CLAREAMENTOSOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN

MetodologiaMetodologia1) Colecta de discos de tejido foliar después de la inoculación

1) Solución I: (etanol/ácido acético glacial; 3:1, v/v) para fijación y clareamento de los tejidos.

- 24 -48 h/ cambios de soluciones

2) Solución II: lactoglicerol (ác. lático, glicerol y agua)para continuar el clareamento y conservación.

4) Visualización al microscopio óptico (hasta 3 meses)

Puntos importantes:- Conducción con máximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos

suavemente en las hojas. - Las estructuras del hongo son teñidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie

blue o tripan blue. - El porcentaje de germinación, la formación de apresórios y la penetración son evaluados

sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco.

Stadnik e Buchenauer (2000):

Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006

CrecimientoCrecimiento deldel hongohongo in in plantaplanta

Incubación con solución de coloración (azul  de  tripan2,5 mg/mL em lactofenol + 2 volúmenes de  etanol)  a 100°C por 1 min.

Resfriar  elmaterial por 1 h a temperatura ambiente.

Remover  la soluciónde  coloración y adicionar  cloral hidratado (2,5 g/mL).

Incubar  por  12  h  y substituir  la soluciónde  clareamento  por glicerol 70%.

Incubar  por  6  h  y substituir  la soluciónde  clareamento  por una nueva.

Weigel e Glazebrook (2002)

Incubar  en soluciónde diaminobenzidina(1 mg/mL) por 8 h

Decoloración enetanol 100% por 3h.

Solución de conservación(glicerol 70%)

DetecciDeteccióónn de de lala reaccireaccióónn de de hipersensibilidadhipersensibilidad enenArabidopsisArabidopsis Weigel e Glazebrook (2002)

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Conservación enácido láctico: glicerol: agua (1:1:1, v/v/v)

Solución de diaminobenzidina

(1mg/mL)

Decoloración en ácido tricloroacético 0,15% 

p/v; en etanol: clorofórmio (4:1)

DetecciDeteccióónn de de lala reaccireaccióónn de de hipersensibilidadhipersensibilidad enen porotoporotoHϋckelhoven (1999)

Fotos: Fotos: CrecimientoCrecimiento deldel hongohongoin plantain planta

Plantas inoculadas Plantas inoculadas concon una gota de 10uL de una una gota de 10uL de una suspensisuspensióónn de esporas de de esporas de A. A. brassicicolabrassicicola (10(1066

conconíídios/mL)dios/mL)

EvaluaciEvaluacióónn realizada a realizada a loslos 4 dias 4 dias despudespuééss de de lalainoculaciinoculacióónn

Foto: Foto: ReacciReaccióónn de de hipersensibilidadhipersensibilidad MetodologMetodologííaa bbáásicasica

DISCOS FOLIARES

SOLUCIÓN PARA CLAREAMIENTOSOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN

Desarrollo Desarrollo biotrbiotróóficofico de de los olos oíídiosdios

A

TTéécnicas cnicas histoquhistoquíímicasmicas

JohansenJohansen (Cap(Capíítulo IX)tulo IX)ClareamientoClareamiento y y tincitincióónn de de loslos tejidostejidos

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Tipos de haustTipos de haustóóriosrios

OOíídiodio deldel Pepino Pepino PodosphaeraPodosphaera xanthiixanthii HemibiotrHemibiotróóficosficos

(dos (dos ““facesfaces”” de de unun patpatóógenogeno))

HemibiotrHemibiotróóficosficos((ColletotrichumColletotrichum lindemuthianumlindemuthianum))

Antracnose Antracnose deldel frijolfrijol

ColletotrichumColletotrichum lindemuthianumlindemuthianum

8

Colletotrichum lindemuthianum (24 hai)

Colletotrichum gloeosporioides (48 hai)

ColletotrichumColletotrichum gloeosporioidesgloeosporioidesManzanoManzano

?