CARTILLAS DE LABORATORIO - eva.fcien.udelar.edu.uy

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

CARTILLAS DE

LABORATORIO

Nombre

Licenciatura

CRONOGRAMA 2019

Clase Descripción Fechas

Introducción 1 INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

26-28/3

Purificación de lisozima de clara de huevo

2 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 2-4/4

3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

9-11/4

Semana de Turismo

4 EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN 1. Cálculo de la Actividad específica 2. Electroforesis de Proteínas

23-25/4

5 CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL 30/4; 2/5 y sab. 4/5

Ácidos nucleicos 6 ÁCIDOS NUCLEICOS 7-9/5

Taller 7 Resolución de ejercicios 14-16/5

Seminario 8 Purifique su proteína 21-23/5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA DATOS PARA APROBACIÓN DEL CURSO

Aprobación del Práctico de laboratorio (puntaje mínimo: 7 puntos).

El estudiante será evaluado a través de:

A - cuestionarios al inicio de cada práctico

B - informes que se realizarán y entregarán en cada práctico

C - su actuación en las clases prácticas.

A. Cuestionarios al inicio de cada práctico:

En los prácticos 2 a 6 habrá un cuestionario que se realizará previo al inicio de la clase. Se realizará en 5

min y constará de preguntas sencillas sobre el fundamento teórico, objetivos y protocolo del práctico de ese

día. Será corregido en clase por uno de los docentes quién registrará el resultado, será suficiente si obtiene el

50% del puntaje del mismo. El cuestionario será entregado al estudiante para que pueda realizar una

autocorrección (esto no modificará la corrección realizada por el docente). En el correr de la clase el

cuestionario deberá ser devuelto a los docentes.

Importante: Si llega a clase cuando terminó el cuestionario o falta a clase el mismo figurará como NO

APROBADO.

Aquellos estudiantes que hayan aprobado 4 o 5 cuestionarios obtendrán 1 punto que sumará en el puntaje

global del curso práctico.

Aquellos estudiantes que hayan reprobado 3 de los 5 cuestionarios deberán pasar a una instancia de

evaluación oral al final del ciclo de prácticas.

B. Informes

Los informes formarán parte de un librillo (independiente de las cartillas de laboratorios) que será

imprescindible para poder asistir a clase. Los informes se realizarán en clase y se entregarán al finalizar la

misma. El grupo se dividirá en cuatro sub-grupos que realizarán el trabajo experimental, analizarán los

resultados y redactarán el informe en conjunto. Cada estudiante debe completar su propio informe de

acuerdo a lo elaborado en su sub-grupo y entregarlo al finalizar la clase.

Los docentes corregirán uno de los informes de cada sub-grupo (elegido al azar) y controlarán el contenido

de los demás. Los informes se devolverán en la clase siguiente con el puntaje correspondiente.

Importante: en caso de entregarse un informe incompleto el puntaje será 0, se reprobará el curso práctico y

por lo tanto también el curso teórico.

Se asignará un máximo de 11 puntos a los informes.

C. Actuación en clase: se evaluará el desempeño del estudiante a lo largo del curso práctico (en particular su

participación y actitud en clase).

https://eva.udelar.edu.uy/mod/folder/view.php?id=384789

https://eva.udelar.edu.uy/mod/page/view.php?id=384784

http://eva.universidad.edu.uy/mod/page/view.php?id=253816




PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA DATOS PARA APROBACIÓN DEL CURSO

PUNTAJE GLOBAL DEL CURSO PRÁCTICO:

Descripción Puntos

Informes

Introducción al laboratorio 1

Cromatografía de intercambio iónico 1

Actividad enzimática y cuantificación de proteínas 1,5

Actividad específica y electroforesis de proteínas 1,5

Cromatografía de gel filtración 1

Acidos Nucleicos 2

Resolución y discusión de ejercicios 1

Purifique su propia proteína 2

Actuación en

clase

Cuestionarios 1

Desempeño en clase 2

TOTAL 14

MINIMO PARA APROBAR (50 %) 7

APROBACIÓN DEL CURSO PRÁCTICO

1) Para aprobar el práctico hay que obtener un puntaje igual o superior a 7 puntos (50% del total de los

puntos del curso práctico).

2) ASISTENCIA:

El estudiante deberá asistir como mínimo al 75% de las clases. El práctico consta de ocho clases

obligatorias,

La aprobación del laboratorio práctico habilita al estudiante que, habiendo aprobado los tres parciales pero

que no alcancen el puntaje necesario para la aprobación del curso, a recursar UNICAMENTE el curso

teórico en el año siguiente.

https://eva.udelar.edu.uy/mod/forum/view.php?id=384802


PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Seguridad en el laboratorio

1.1.1. Es obligatorio el uso de túnica en el laboratorio y de preferencia utilizar zapatos cerrados.

1.1.2. En algunos casos será necesario el uso de material protector como lentes o guantes.

1.1.3. Es importante leer detenidamente la práctica que se va a realizar con el fin de conocer con

qué sustancias se trabajará. Los riesgos y las precauciones que se deben tomar para la

manipulación y descarte de las sustancias figuran en su ficha de seguridad (MSDS: Material

Security Data Sheet).

1.1.4. NUNCA pipetear con la boca.

1.1.5. El mal empleo de un equipo de laboratorio conlleva riesgos para el operador, para el resto

de personas presentes en el laboratorio y para el equipo. Es necesario conocer correctamente el

funcionamiento de un equipo antes de su utilización (Manuales, tutoriales, etc.).

1.1.6. Alejar de la mesa de laboratorio aquel material que no se vaya a utilizar, como carpetas,

ropa, etc.

1.1.7. Está prohibido comer, beber, tomar mate y fumar en el laboratorio.

1.1.8. Limpiar el material antes y después de usarlo para evitar contaminaciones de reactivos y

riesgos personales al manipular material sucio.

1.1.9. Trate de minimizar los desechos, lo cual se logra reduciendo la cantidad de reactivos

utilizados en los experimentos.

1.1.10. No todos los desechos son igualmente peligrosos o se tratan de la misma manera, por lo

tanto deberá llevar los desechos a un sitio previamente determinado por el profesor o el técnico.

1.1.11. No es correcto arrojar los residuos por el desagüe a menos que se especifique de esta

manera. Cuando no es posible eliminar los residuos inmediatamente, es necesario almacenarlos

en frascos debidamente rotulados.

1.1.12. Si se contamina con algún reactivo tóxico (cara o cuerpo) el laboratorio dispone en el

corredor de ducha para ojos y cuerpo.

1.1.13. Si hubiera algún fuego, en el laboratorio se dispone de un extintor para todo tipo de

fuegos. Las instrucciones para su manejo son las siguientes1:

Sacar el pasador del seguro y abrir la botella de gas impulsor golpeando el percutor.

Dirigir el chorro de polvo a la base de la llama, accionando la pistola.

1.1.14 Ante cualquier duda CONSULTE AL DOCENTE RESPONSABLE.

1.2. Preparación de soluciones

Una solución o disolución es una mezcla homogénea compuesta por un soluto (pueden ser más

de uno) disuelto en el componente que se encuentra en exceso al que se denomina solvente o

disolvente (sustancia que disuelve).

1 Estas instrucciones se encuentran impresas en el extintor junto con el correspondiente dibujo aclaratorio.



1.2.1. Formas de expresar la concentración

Existen diferentes formas de expresar la concentración de una solución. Las que se emplean con

mayor frecuencia suponen comparar la cantidad de soluto con la cantidad total de solución, ya

sea en términos de masas, en términos de masa a volumen o incluso de volumen a volumen (si

todos los componentes son líquidos).

Porcentaje en masa (% m/m, usualmente anotado como % p/p), expresa la masa en gramos de

soluto disuelta por cada 100 gramos de solución. Su cálculo requiere considerar separadamente

la masa del soluto y la del solvente, siendo la masa de la solución la suma de la del soluto y la del

solvente.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 % (𝑚 𝑚⁄ ) =𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜(𝑔)

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛(𝑔) × 100

Porcentaje en masa/volumen (% m/v, usualmente anotado como % p/v), expresa la masa en

gramos de soluto disuelta por cada 100 mL de solución.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 % (𝑝 𝑣⁄ ) = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 (𝑔)

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝐿) × 100

Gramos por litro (g/L) indica la masa (gramos) disuelta por cada litro de solución. Tiene la

ventaja de ser una concentración expresada en unidades directamente medibles. La balanza

expresa la medida de la masa de soluto en gramos y los recipientes de uso habitual en el

laboratorio indican el volumen de líquido contenido en litros o en sus submúltiplos.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑔 𝐿) =𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 (𝑔)

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿)⁄

Molaridad (M) es la forma más frecuente de expresar la concentración de las disoluciones en

química. Indica el número de moles (n) de soluto disueltos por cada litro de solución. Una

solución 1 M contendrá un mol de soluto por litro, una 0,5 M contendrá 0,5 moles de soluto por

litro, etc.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 (𝑀) =𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿)

Recuerde que:

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 (𝑛) =𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 (𝑔)

𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟

A la masa molecular usualmente la denominamos peso molecular (PM), sus unidades son g/mol.

La masa molecular de una proteína generalmente se expresa en Daltons2 (Da) o kilo Daltons3

(kDa).

2 1 Da = 1 g/mol 3 1 kDa = 1000 Da



Molalidad (m) indica el número de moles de soluto disuelto en cada kilogramo de solvente.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑙 (𝑚) =𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑘𝑔)

Tenga en cuenta en el momento de preparar las disoluciones, si las sales o compuestos que debe

pesar se encuentran hidratadas/os o no, esto cambiará la masa del compuesto a utilizar. En el

frasco del reactivo o en la ficha técnica encontrará esta información (grado de hidratación, masa

molecular).

En el Anexo 2 se muestran algunos ejemplos de preparación de soluciones.

1.2.2. Cómo preparar diluciones

Diluir significa agregar disolvente. En todos los casos, partiremos de una solución de mayor

concentración (solución stock o madre) y obtendremos una solución de menor concentración o

diluida. La cantidad total de soluto tomada de la solución concentrada es igual a la cantidad total

de soluto puesto en la solución diluida; sin embargo, la concentración de soluto es menor en la

solución diluida que en la solución concentrada, ya que en la primera el volumen total de solución

es mayor. De esta forma se cumple que:

𝐶𝑖 × 𝑣𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑣𝑓

Conociendo la concentración de la solución stock (𝐶𝑖) es posible calcular el volumen de solución

stock (𝑣𝑖) que es necesario utilizar para preparar la solución diluida de concentración (𝐶𝑓) y

volumen (𝑣𝑓) deseados. El volumen de solvente que será necesario agregar será igual a la

diferencia entre el volumen de solución diluida y el volumen de solución stock (𝑣𝑓 − 𝑣𝑖).

La dilución realizada se puede calcular como:

𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =𝐶𝑓

𝐶𝑖=

𝑣𝑖

𝑣𝑓

El factor de dilución (FD) es cuantas veces mayor es la concentración de la solución stock respecto

a la solución diluida (inversa de la dilución) y se puede calcular como:

𝐹𝐷 =𝐶𝑖

𝐶𝑓=

𝑣𝑓

𝑣𝑖

Soluciones concentradas, madre o stock. Un solución 5x, indica que todos sus componentes se

encuentran a una concentración 5 veces mayor que la presente en la solución de trabajo o 1x.

Para transformar una solución 5x en 1x, debemos diluirla al quinto (1/5), es decir tomar 1 volumen

de la 5x y agregarle 4 volúmenes del diluyente.

En el Anexo 2 se muestran algunos ejemplos de diluciones.



1.3. Espectrofotometría

La espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible (UV-visible) es una herramienta utilizada

en bioquímica principalmente para determinar la concentración de un soluto en solución o

identificar compuestos desconocidos. Muchas biomoléculas pueden absorber luz en el rango UV-

visible del espectro electromagnético (Tabla 1). Dependiendo de su estructura atómica y del

medio en el que se encuentran podrán absorber luz de diferente longitud de onda (λ) y con

diferente eficiencia. La cantidad de luz, de una determinada λ, que puede ser absorbida por una

especie absorbente o cromóforo se denomina absorbancia (A). El gráfico de A en función de λ

de una sustancia se denomina espectro de absorción y puede utilizarse para determinar la o las

longitudes de onda a las que el cromóforo presenta máxima absorción (λMax).

La concentración de un cromóforo se determina cuantificando la absorbancia a una longitud de

onda conocida y generalmente se utiliza la λMax para tener mayor sensibilidad.

Tabla 1. Regiones del espectro electromagnético

Región Longitud de onda (nm)

Rayos X 0,01-15

UV lejano 15-200

UV cercano 200-400

Visible 400-800

Infrarrojo 800-2500

1.3.1 Absorbancia y concentración

Cuando un rayo de luz atraviesa un medio homogéneo de espesor b, en el cual hay especies

absorbentes que están en una concentración c, parte de la luz es absorbida y parte transmitida.

Para una determinada longitud de onda la relación entre la luz incidente (𝐼𝑜) y la luz transmitida

(I) está dado por la Ley de Lambert-Beer:

𝑇𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑇) =𝐼

𝐼𝑜= 10−𝜀𝑏𝑐

Se define Absorbancia (A) como:

𝐴 = log1

𝑇= log

𝐼𝑜

𝐼= 𝜀𝑏𝑐

𝑨 = 𝜺𝒃𝒄 Ley de Lambert-Beer

ε es el coeficiente de extinción molar (o absortividad molar) tiene como unidades M-1 cm-1. Es

una característica intrínseca de cada sustancia pura que nos dice cuánta luz absorbe a una longitud

de onda dada.

b representa el camino óptico de la solución (o ancho de la cubeta) en cm.

c indica la concentración de la sustancia expresada en M.



1.3.2 Absorción UV de las proteínas

Las proteínas contienen ciertos enlaces o aminoácidos cuyos grupos funcionales absorben luz en

el UV y por lo tanto pueden ser utilizados para cuantificar la concentración de proteína por

espectrofotometría.

Absorbancia a λ=280 nm

En la Figura 1 se muestran los espectros de absorción en el ultravioleta de los aminoácidos

aromáticos triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y fenilalanina (Phe). En esa figura podemos ver que

estos aminoácidos principalmente Trp y Tyr absorben luz UV de λ280 nm. También la Cistina (Cys-

Cys), no representada en esta figura, absorbe luz UV en esa región del espectro. Debido a esto, la

absorción de luz de λ280nm de una proteína depende de la presencia de tales aminoácidos en su

secuencia.

Figura 1. Espectro de absorción de Trp, Tyr y Phe.

La mayoría de las proteínas, en mayor o menor proporción, contienen alguno de estos

aminoácidos, lo que nos permite detectar su presencia y estimar su concentración midiendo la

A280nm.

Para una muestra de proteína pura si se conoce el valor de ε se puede calcular su concentración

molar (M) aplicando:

𝑐 =𝐴280𝑛𝑚

𝜀 × 𝑏

Existen programas disponibles libremente a través de la web que predicen el valor teórico de 280

nm para una proteína en solución acuosa, como por ejemplo en ExPASy: SIB Bioinformatics

Resource Portal (http://www.expasy.org). Para la determinación de ε se puede ir directamente a:

http://web.expasy.org/protparam/.

http://www.expasy.org/

http://web.expasy.org/protparam/



Ejemplo:

Cálculo de concentración de BSA pura a partir del valor de A280nm.

Ingresar a http://web.expasy.org/protparam/

Usar el accession number: P02769 que corresponde a la seroalbúmina bovina (Bos taurus).

Seleccionar: compute parameters.

Seleccionar: CHAIN 25-607, para que tenga en cuenta solo los residuos que van desde el 25 al

607, que son los que realmente están en la lisozima madura.

De esta manera, obtendremos diferentes parámetros fisicoquímicos de esta proteína. Entre otros,

podremos ver que ε280nm = 42925 M-1 cm-1

.

Supongamos que ahora tenemos una solución de BSA pura cuya A280nm medida en una celda de

1 cm es 0,878. Podemos calcular la concentración:

Concentración= 0,878 / 42925 M-1 cm-1

x 1 cm = 2,04 x10-5 M

Este valor se puede expresar más cómodamente en μM

[BSA] = 20,4 μM

Absorbancia a λ=205 nm

La medida de la A205nm, longitud de onda cercana al máximo de absorbancia del enlace peptídico

(λ=190 nm) es especialmente útil para medir concentraciones de proteínas o péptidos que no

contienen Trp, Tyr o Cys-Cys. Sin embargo, este método tiene el inconveniente de que muchos

compuestos que frecuentemente están presentes en las preparaciones de proteínas, o que usamos

como componentes de los buffers, absorben luz a esta longitud de onda. Se utiliza mucho para

seguir cromatografías de purificaciones de péptidos en soluciones que no contienen estas

sustancias interferentes.

2. OBJETIVOS

2.1. Conocer las precauciones generales de trabajo en el laboratorio y familiarizarse con el

equipamiento a utilizar a lo largo del práctico.

2.2. Adquirir destreza en las técnicas de pipeteo y preparación de soluciones diluidas.

2.3. Medir el espectro de absorción UV de una proteína.

2.4. Estimar el coeficiente de extinción molar de una molécula.

3. REACTIVOS

Solución estándar de BSA 10 mg/mL (solución A).

4. EQUIPOS Y MATERIALES

- Material volumétrico: propipetas/pipetas de vidrio/plástico o automáticas.

- Material de vidrio

- Agua ultrapurificada (MilliQ)

- Espectrofotómetro

http://web.expasy.org/protparam/



- Balanza analítica

5. PROCEDIMIENTO

5.1 Seguridad en el laboratorio

5.1.1 Analice el frasco del reactivo a utilizar: BSA, la ficha técnica y de seguridad (MSDS)

impresa de dicho compuesto.

5.1.2 Observe y diferencie lo que es una ficha técnica, una ficha de seguridad y un certificado de

calidad de un reactivo. Si en algún caso no cuenta con dicha información, sabiendo el código del

reactivo, en sitio web del vendedor, puede obtener la ficha técnica y de seguridad del reactivo y

con el número de lote el certificado del análisis de calidad del mismo.

5.1.3 Consulte los manuales de los equipos que se encuentran en el laboratorio.

5.2. Reconocimiento de material volumétrico y equipos del laboratorio

5.2.1 Se dispondrá de diferentes tipos de material volumétrico (pipetas, micropipetas, matraces

aforados, probetas, etc)

5.3. Espectro de absorción UV de BSA

El docente le entregará una solución de BSA de concentración desconocida.

Mida su espectro de absorción UV entre λ=230 nm y λ= 320 nm (En el Anexo 3

encontrará una guía de uso del espectrofotómetro).

Grafique los valores de A en función de la longitud de onda.

Determine la longitud de onda a la que la BSA presenta mayor absorbancia (λMax).

BIOQUIMÍCA-PRÁCTICO

Introducción al trabajo en el Laboratorio

5.4. Determinación del coeficiente de extinción molar de BSA

El docente le entregará una solución estándar de BSA 10 mg/mL (solución A).

A partir de la solución A prepare la solución B y a partir de ésta las soluciones C a H

POR DUPLICADO de acuerdo al siguiente esquema:

Mida la absorbancia a λ= 280 nm de las muestras A, B, C, D, E, F, G utilizando el

espectrofotómetro indicado por el docente.

Grafique los valores de A280 nm promedio en función de la concentración molar de BSA.

Aplique la Ley de Lambert-Beer y determine el coeficiente de extinción molar de la BSA.

6. BIBLIOGRAFÍA

Normas para el manejo de reactivos y soluciones

(Extraído de http://docencia.udea.edu.co/cen/tecnicaslabquimico/03anexos/anexo02.htm)

Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. ExPASy: the

proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-

3788(2003).

http://docencia.udea.edu.co/cen/tecnicaslabquimico/03anexos/anexo02.htm



ANEXO 1

Ejemplos de pictogramas de Riesgo y Peligrosidad de productos químicos

ANEXO 2

Ejemplos de preparación de soluciones

2.1 Concentración expresada como porcentaje en masa. Calculemos la concentración en

porcentaje de masa (m/m) de una solución preparada mezclando 5,00 g de cloruro de hidrógeno

(HCI) con 35,00 g de agua.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 % (𝑚 𝑚) =𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝑙 (𝑔)

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝑙 (𝑔) + 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎(𝑔) × 100 =

5,00 𝑔

5,00 𝑔 + 35,00 𝑔× 100 = 12,5 %⁄

2.2 Concentración expresada como porcentaje en masa/volumen. Calculemos la

concentración, expresada como porcentaje de masa/volumen (m/v), de una solución preparada

disolviendo 2,00 g de extracto de levadura en agua y llevando a un volumen final de 200,00 mL.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 % (𝑚 𝑣) =2,00 𝑔

200 𝑚𝐿⁄ × 100 = 1 %



2.3 Concentración expresada en gramos/L. Calculemos los gramos/litro de la solución

preparada en el punto 2.1.

Primero, utilizando el valor de densidad del HCl a 20ºC (1,060 g/mL) calculamos la masa de un

litro de solución.

𝑚𝑎𝑠𝑎 (𝑔) = 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝑔 𝑚𝐿⁄ ) × 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝐿) = 1,060(𝑔 𝑚𝐿⁄ ) × 1000 𝑚𝐿 = 1060 𝑔

Ahora considerando el valor de % (m/m) calculado arriba (12,5%) se determina la masa en gramos

del soluto contenida en la solución:

12,5 𝑔 … … … … … 100 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑥 … … … . … . . .1060 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

La cantidad resultante representa la concentración en gramos de soluto (HCI) por litro de solución,

es decir 132,5 g/L.

2.4 Concentración molar. Calculemos la Molaridad de la solución preparada en el punto 2.3.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑀) =132,5 𝑔

1𝐿 × 36,47 𝑔 𝑚𝑜𝑙⁄= 3,63 𝑀

Donde 36,47 g/mol es la masa molecular del HCI.

2.5 Concentración molal. Calculemos la Molalidad de la solución descrita en el punto 2.1.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚) =5,00 𝑔

36,47 𝑔 𝑚𝑜𝑙 × 0,035 𝑘𝑔⁄= 3,92 𝑚

2.6 Preparación de una solución diluida a partir de un stock. Calculemos como se procedería

para preparar 20 mL de una solución 50 mM a partir de un stock 0,5 M.

𝐶𝑖 = 0,5 𝑀 = 500 𝑚𝑀

𝐶𝑓 = 50 𝑚𝑀

𝑣𝑓 = 20 𝑚𝐿

Entonces:

𝑣𝑖 =20 𝑚𝐿 × 50 𝑚𝑀

500 𝑚𝑀= 2 𝑚𝐿

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 = 20 𝑚𝐿 − 2 𝑚𝐿 = 18 𝑚𝐿

Se toman 2 mL del stock y se agregan 18 mL de solvente con lo que se obtienen 20 mL de solución

50 mM.



La dilución realizada se puede calcular como:

𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =50 𝑚𝑀

500 𝑚𝑀=

2 𝑚𝐿

20 𝑚𝐿=

1

10

El factor de dilución (FD) se puede calcular como:

𝐹𝐷 =500 𝑚𝑀

50 𝑚𝑀=

20 𝑚𝐿

2 𝑚𝐿= 10

ANEXO 3

Guía general de manejo del Espectrofotómetro

Encender el equipo y esperar que la lámpara se estabilice (UV o visible).

Seleccionar la longitud de onda “WAVELENGTH” deseada (Ej.: λ= 405 nm).

Colocar la/las cubeta/s (llamadas también celdas) o la placa en el caso de un lector de

placas, en el equipo.

Medir el blanco o si el equipo lo permite llevar a cero el equipo (es decir realizar

AUTOCERO)

Sacar la anterior cubeta (dependiendo del equipo) y colocar la celda con la muestra

problema

Medir la muestra problema (no olvide restar el blanco a todas las lecturas, esto no es

necesario si el equipo le permite realizar el autocero con el blanco de reacción).

Retire las celdas, verifique que todo esté limpio.

Apagar el equipo.

Notas

Cuando se va a poner la celda de medición se debe limpiar por fuera para eliminar las

gotas de solución que pudieran haberse derramado cuando se cargó, observando que

queden burbujas ni partículas. Esto no solo dará lecturas equivocadas sino que provocará

el deterioro del aparato.

Para que un dato de absorbancia pueda ser utilizado en el cálculo de concentración debe

estar dentro de la zona en la cual la curva es lineal, esto es, en el rango de concentraciones

en el que se cumple la ley de Lambert-Beer (A = ε b c). El rango lineal dependerá de la

sensibilidad del equipo utilizado para las medidas, generalmente el máximo es una lectura

de absorbancia de 1), por lo cual en caso que la lectura supere el valor de 1 será necesario

diluir la muestra.

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Principio de la cromatografía de intercambio iónico

Durante una cromatografía de intercambio iónico, la propiedad de las moléculas que se utiliza

para facilitar su separación es la carga neta superficial que presentan a un pH determinado. La

separación se basa en la adsorción reversible de los analitos con carga (iones) a grupos iónicos de

carga opuesta presentes en la fase estacionaria (gel intercambiador). En este caso, el analito

adsorbido se une al intercambiador mediante fuerzas electrostáticas. El término “adsorción” hace

referencia a que las moléculas quedan atrapadas o retenidas en una superficie.

En la Figura 1 vemos como los analitos con carga negativa interaccionan con la fase estacionaria

-que tiene grupos inmóviles de carga positiva- y por lo tanto, las moléculas de esos analitos son

retenidas por fuerzas electrostáticas. A su vez, la repulsión de cargas entre las moléculas de los

analitos con carga positiva y los de la fase estacionaria (también positiva), hacen que estos analitos

positivamente cargados no sean retenidos y fluyan libremente.

Figura 1. Esquema representando la interacción electrostática entre los analitos de carga negativa y el gel

intercambiador de carga positiva (intercambio iónico aniónico).

Siguiendo con el ejemplo planteado en la figura, para eluir (des-adsorber) los analitos cargados

negativamente (retenidos en el intercambiador de carga positiva), se puede proceder de dos

maneras:

CAMBIO DE pH – teniendo en cuenta que la carga del analito depende del pH, la idea es

cambiar la carga del mismo de forma tal que no sea más adsorbido (o retenido) por la matriz

cromatográfica. Cuando trabajamos con analitos que se comportan como ácido/base débiles (que

son los casos más frecuentes de los que trataremos en este curso), la elución de los mismos la

podemos realizar pasando por la columna un solvente con: a) un pH que coincida con el punto

isoeléctrico del analito (es decir, un pH al cual la carga neta del analito es 0); o b) un solvente

cuyo pH provoque la inversión de la carga del analito (de negativa a positiva, en el ejemplo

planteado más arriba).

AUMENTO DE LA FUERZA IONICA – la idea es agregar a la columna de intercambio iónico

un solvente conteniendo una molécula que por competencia desplace al analito unido en forma

electrostática a la matriz cromatográfica. En otras palabras, se puede pasar una solución que

contenga una concentración de aniones lo suficientemente alta para desplazar por competencia al

analito (cargado negativamente) que está unido a la fase estacionaria.

Para que las moléculas se separen en una cromatografía de intercambio iónico es necesario que

tengan cargas eléctricas diferentes en las condiciones del experimento. Esta técnica se puede

aplicar a diferentes moléculas (proteínas, ácidos nucleicos, otras moléculas orgánicas o iones

inorgánicos). La separación dependerá de que los analitos posean una diferencia de carga neta


superficial tal que puedan establecer diferentes grados de interacción con la fase estacionaria.

Estas interacciones pueden controlarse variando las condiciones de pH o de fuerza iónica.

1.2 Intercambiadores iónicos

En la cromatografía por intercambio iónico, la fase estacionaria consisten en una matriz porosa

insoluble a la cual están unidos en forma covalente grupos químicos con carga eléctrica. Estos

grupos cargados interaccionan en forma electrostática con sus contraiones móviles (ver Figura 2).

Éstos pueden intercambiarse en forma reversible con otros iones de igual carga, sin alterar la

estructura de la fase estacionaria.

Los intercambiadores cuyos grupos inmovilizados tienen carga positiva tienen contraiones

negativos (aniones) disponibles para ser intercambiados, por lo cual se denominan

intercambiadores aniónicos. Por otro lado, las matrices intercambiadoras con carga negativa

tienen contraiones positivos (cationes) disponibles para intercambiar y por lo tanto se conocen

como intercambiadores catiónicos (ver Figura 2).

Figura 2. Intercambiador catiónico. La matriz tiene grupos sulfónicos (-SO3-) unidos covalentemente, que

unen analitos con carga positivos por interacción electrostática. El analito puede eluirse por competencia

con otros iones de carga positiva, como ser el Na+

En la Tabla 1 se muestra una lista de intercambiadores, incluyendo información sobre los grupos

químicos cargados covalentemente y unidos a la matriz, el tipo de intercambiador que es, y la

fuerza del mismo. El término fuerte y débil no se refiere a la fuerza de la unión, se refiere al

grado de ionización de los grupos inmovilizados en la matriz, a un pH. Los intercambiadores

fuertes se mantienen completamente ionizados en un amplio rango de pH; mientras que los

intercambiadores débiles presentan un grado de ionización que varía mucho con el pH.

Tabla 1. Lista de intercambiadores iónicos y algunas de sus características

Otra característica de los intercambiadores a tener en cuenta es el número total de grupos cargados


que tiene la matriz, lo cual determina la capacidad del intercambiador. La capacidad puede

expresarse como el número de grupos cargados por gramo de intercambiador seco (meq de iones

intercambiables/g de matriz seca) o por mL de intercambiador hidratado. La aplicación de una

cantidad excesiva de muestra en una columna cromatográfica puede llevar a una sobrecarga de la

misma (superar la capacidad de la columna), lo cual resultaría en un proceso de purificación no

exitoso.

1.3 Cromatografía en batch o en columna

Los procedimientos de intercambio iónico pueden llevarse a cabo en columna o en lote (“batch”).

EN COLUMNA: el intercambiador se empaqueta en una columna, donde la muestra se aplica en

la parte superior de la misma, y se va agregando el solvente adecuado (fase móvil) (Figura 3 del

repartido de Generalidades de la Cromatografía). Los analitos que interaccionan con el

intercambiador quedan adsorbidos y los que no interaccionan salen de la columna (a esta última

fracción le llamamos percolado).

EN LOTE (“BATCH”): el intercambiador y la muestra se colocan en un recipiente y se agitan

durante un determinado tiempo para permitir que se establezca el equilibrio (absorción de los

analitos a la matriz cromatográfica). Posteriormente, se deja sedimentar el intercambiador donde

se encuentran los analitos que han quedado absorbidos o retenidos. En la fase líquida (que

llamaremos sobrenadante) se encontrará los analitos no retenidos.

1.4 Regeneración del intercambiador

La matriz o intercambiador se pueden reutilizar, pero antes es necesario regenerarla. La

regeneración consiste en lavar la fase estacionaria buscando eliminar todos aquellos analitos que

no eluyeron durante su uso, lo que permite reutilizar el intercambiador para ensayar otras

condiciones o analizar nuevas muestras.

1.5 ¿Por qué los aminoácidos y las proteínas pueden purificarse por intercambio iónico?

Los aminoácidos tienen grupos funcionales ionizables. Cualquier aminoácido puede comportarse

como ácido y como base (decimos que son anfóteros). Consideremos el comportamiento ácido-

base de la glicina, el aminoácido más sencillo. La misma presenta dos grupos ionizables, el grupo

carboxílico y el grupo amino.

Si la glicina se disuelve en una solución muy ácida (por ej. pH = 1,0) tanto el grupo amino como

el grupo carboxilo se encuentran en su mayoría protonados; la carga neta de la molécula es +1. Si

se aumenta el pH mediante el agregado de un álcali, la disociación de protones tendrá lugar como

se muestra en la Figura 3.

En este ejemplo, en la zona cercana al pH 5.97, la mayor parte de la glicina se encuentra en la

forma: H3N+—CH2—COO-, con una carga neta igual a cero. Un anfolito que se encuentre en este

estado, con igual número de cargas positivas y negativas, es decir carga neta cero, se denomina

zwitterion. El pH en el cual una sustancia ionizable tiene carga neta cero se denomina punto

isoeléctrico (pI).


Figura 3. Curva de titulación de glicina.

Se puede calcular el valor de pH en el cual una molécula se encuentra en el punto isoélectrico

aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbalch a cada uno de los grupos ionizables:

𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log[𝐴−]

[𝐻𝐴]

Primero, procedemos a plantear las ecuaciones para ambos equilibrios:

Para el primer equilibrio:

𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝐶𝑜𝑜𝐻 + log[𝐻3𝑁+𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂−]

[𝐻3𝑁+𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻]

Para el segundo equilibrio:

𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑁𝐻3+ + log

[𝐻2𝑁𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂−]

[𝐻3𝑁+𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂−]

Si sumamos miembro a miembro ambas ecuaciones:

2𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑝𝐾𝑁𝐻3+ + log

[𝐻2𝑁𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂−]

[𝐻3𝑁+𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻]

Ahora, si aplicamos la definición de pI, es decir, el pH al cual la carga neta es cero, entonces en

ese punto se cumple que:

[𝐻2𝑁𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂−] = [𝐻3𝑁+𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻]

En tales condiciones, en la ecuación anterior, el cociente dentro del logaritmo es 1, y el logaritmo

de éste es cero.

Así, para el valor de pH que llamamos punto isoeléctrico se cumple que:

2 𝑃𝐼 = 𝑝𝐾𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑝𝐾𝑁𝐻3+ → 𝑃𝐼 = 1 2 (𝑝𝐾𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑝𝐾𝑁𝐻3

+)⁄


En el caso particular de la Gly:

𝑃𝐼 = 1 2 (𝑝𝐾1 + 𝑝𝐾2)⁄

Un ejemplo más complejo

Veamos ahora un ejemplo más complejo. En los aminoácidos que tienen grupos ionizables en sus

cadenas laterales, las curvas de titulación son más complejas. Sin embargo, se puede proceder de

manera análoga para calcular el pI. Sólo hay que tener la precaución de utilizar los equilibrios que

llevan a la forma con carga neta cero de la molécula. Veamos el ácido glutámico (Glu).

En este caso, los equilibrios que llevan a la forma con carga neta cero son los que están regidos

por pK1 y pKR. Por tanto, para el Glu (y también el Asp):

𝑃𝐼 = 1 2 (𝑝𝐾1 + 𝑝𝐾𝑅)⁄

También se puede razonar de esta manera para determinar el pI de los aminoácidos básicos (Arg,

Lys, His). Se verá que en esos casos, se cumple:

𝑃𝐼 = 1 2 (𝑝𝐾2 + 𝑝𝐾𝑅)⁄

Las moléculas grandes, como las proteínas, pueden tener muchos grupos ionizables, ácidos o

básicos, debido a que pueden contener muchos residuos con cadenas laterales ionizables (además

de los extremos amino y carboxilo de la cadena polipeptídica). Estas moléculas se denominan

polianfolitos. Cuando tenemos más de dos grupos ionizables, el cálculo de pI es más complejo.

El pI de una proteína puede calcularse de forma aproximada por métodos de cálculo numérico (si

conocemos la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica), pero en muchos casos es

imprescindible determinarlo experimentalmente, mediante la determinación del pH al cual la

proteína —cuando es sometida a un campo eléctrico— tiene movilidad nula.

La carga neta de una proteína está determinada por su pI y el pH del buffer en el que se encuentra.

Si el pH es mayor que el pI, la proteína tendrá carga neta negativa. Si el pH es menor que el pI,

tendrá carga neta positiva.

Suele ser útil plantearse el siguiente esquema:

Las proteínas, en su punto isoeléctrico, tienen carga neta cero y no se unen ni a un intercambiador


aniónico ni a uno catiónico.

Recuerde:

- Si el pH del medio es mayor que el pI de una determinada proteína, ésta tendrá carga negativa,

y podrá unirse entonces a un intercambiador aniónico (pero no se unirá a uno catiónico).

- Si el pH de la solución es menor que el pI de una proteína, ésta tendrá carga positiva, y se unirá

a un intercambiador catiónico (pero no se unirá a uno aniónico).

- El pH del buffer determinará la carga neta de las proteínas durante el experimento. Basados en

este principio, se decidirá si es adecuado usar un intercambiador aniónico o uno catiónico para el

experimento.

- El buffer seleccionado tiene que ser tal que la sustancia a ser unida al intercambiador se

encuentre cargada.

- Como regla práctica, el pH del buffer tiene que ser al menos una unidad mayor que el pI de la

proteína si se va a utilizar un intercambiador aniónico (la proteína queda con carga neta negativa)

o al menos una unidad menor que el pI si se va a utilizar un intercambiador catiónico (la proteína

queda con carga neta positiva).

- Otro aspecto a tener en cuenta es que el buffer donde está la muestra proteica tenga la misma

fuerza iónica que el buffer en el que se encuentra el intercambiador, para que los iones del buffer

no compitan por los sitios de intercambio.

- Muchas proteínas presentan solubilidad mínima en su pI. Por tanto, se deben tomar precauciones

para que no ocurra precipitación en la columna si el pH es el pI de alguno de los componentes de

la mezcla. La solubilidad de los componentes de la muestra en el pH y fuerza iónica que se usarán

en la separación deben ser ensayadas antes de hacer el experimento.


1.6 Lisozima

La lisozima es una enzima con actividad glicosidasa. Esta enzima es capaz de hidrolizar el enlace

glicosídico que mantiene la estructura de las paredes celulares en bacterias [hidrólisis entre el C-

1 del NAM (N-acetilmuramato) y el C-4 del NAG (N-acetilglucosamina) presentes en la pared

celular]. Por lo tanto, la lisozima provoca la muerte de una bacteria al romper su pared celular

(soporte rígido de la bacteria).

Figura 4. Diagrama en cintas de la estructura de la Lisozima (PDB 2lyz).

La lisozima se encuentra también presente en secreciones como lágrimas, mocos, saliva, leche.

Por otra parte, es muy abundante en la clara de huevo, lo cual constituye la fuente de obtención

de lisozima para su uso industrial. Presenta una masa molecular de 14300 Da y un punto

isoeléctrico pI = 11. Este pI es muy elevado en comparación con los pI de las otras proteínas

presentes en la clara de huevo. A valores de pH relativamente altos (por ejemplo, pH 10), la mayor

parte de las proteínas que componen la clara de huevo se encuentran con carga negativa, en tanto

que la lisozima se mantiene con carga positiva. Tal propiedad facilita su purificación por

cromatografía de intercambio iónico en un solo paso.

Dado que puede obtenerse en forma abundante a partir de un producto comestible (clara de

huevo), esta enzima presenta buenas cualidades para su uso en alimentos. Por ejemplo, reduce el

número de microorganismos en productos cárnicos o lácteos


2. OBJETIVO

2.1 Purificación de lisozima de clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1. Un huevo de gallina.

3.2. Gasa.

3.3. Gel de intercambio catiónico CM-Sephadex hidratado con agua por los docentes, y

equilibrado con buffer de equilibrio por los estudiantes del grupo anterior. (4 mL de gel)

3.4. Preparación de soluciones

3.4.1. Solución de equilibrio: (Buffer Gly-NaOH 0,1 M, pH 10,0)

7,51 g de Glicina

4,0 g de NaOH

H2O destilada, cantidad suficiente para (csp) 1L (Antes de llevar a volumen final,

ajustar pH con HCl concentrado.)

3.4.2. Solución de elución: (Buffer Gly-NaOH 0.1 M, pH 10,0 + NaCl 0,5 M)

2,34 g de NaCl

Disolver en buffer preparado según 3.4.1 hasta llegar a 100mL.

3.4.3. Solución de regeneración: (Buffer Gly-NaOH 0,1 M, pH 10,0 + NaCl 1,0 M)

5,84 g de NaCl

Disolver en buffer preparado según 3.4.1, csp 100mL

3.5. Agua destilada o agua “MilliQ”

4. EQUIPOS Y OTROS MATERIALES

4.1. Columnas de plástico vacías

4.2. Espectrofotómetro UV-Visible

4.3. Cubetas de cuarzo de 1 mL para medir absorbancia en UV.

4.4. Material volumétrico (tubos, pipetas).

4.5. Soporte y pinzas para columnas.

4.6. Jeringas.

5. PRECAUCIONES

No existen en esta práctica precauciones especiales, sólo las generales aplicadas a las buenas

prácticas en el laboratorio.


6. PROCEDIMIENTO

6.1. Protocolo de intercambio iónico


7. BIBLIOGRAFÍA

RCSB PDB: Homepage. (n.d.). Retrieved March 20, 2019, from https://www.rcsb.org/

Handbooks - GE Healthcare Life Sciences. (n.d.). Retrieved March 20, 2019, from

https://www.gelifesciences.com/en/ar/support/Documents-and-Downloads/Handbooks

-Ion Exchange Chromatography, 3rd ed., Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden.

Jollés, P., Charlamagne, D., Petit, J.F., Maire, A.C. and Jollés, J. (1965) Biochimie Comparée

des lysozymes. Bull. Soc. Chem. Biol., 47 (12): 2241-2259.

Worthington, T.M. (1979). Enzymes and Related Biochemicals. Millipore corp. Bedford, Ma,

USA.P210.

8 ANEXOS

Proteínas de la clara de huevo

*Familia de genes de ovoalbúmina: 3 Genes: ovoalbúmina, Y, X. La relación de máxima expresión de los genes es:

Ovoalbumina:Y:X 100:10:1

Extraído de C. Guerin-Dubiard , M. Pasco , A. Hietanen, A. Quiros del Bosque,F. Nau, T. Croguennec. Hen egg white fractionation by ion-exchange chromatography. Journal of Chromatography A, 1090 (2005) 58–67

No.

aa

PM

(KDa) PI Observaciones

Abundancia

(%)

Lisozima 129 14,4 10,7 No glicosilada Monómero 3,5

Ovotransferrina 686 78-80 6 glicoproteína Glicano (manosa y N-

acetilglucosamina) 12

Ovoalbúmina* 385 45 4,5 fosfoglicoproteína

54 ovoalbumina gen

Y 388 53

5,5; 5,4;

5,3 glicosilada No fosforilada

ovoalbumina gen

X 496 55,9 6,47

Ovomucina Dímero

2-4 -Ovomucina 2087 230,9 glicoproteína

-Ovomucina 400-720 glicoproteína

Ovoflavoproteina 219 29,2 4 fosfoglicoproteína Un sitio con alta afinidad para

riboflavina 0,8

Avidina 14,3 10,5 glicoproteína Homotetramero 0,05

https://www.rcsb.org/

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Determinación de la actividad enzimática

La cantidad de una enzima pura puede ser expresada en moles o en unidades de masa, como las

de cualquier otro compuesto químico. Pero también puede ser cuantificada en términos de

actividad enzimática. No son maneras totalmente equivalentes: en el primer caso, se contabiliza

la cantidad total de la proteína, en tanto que en el segundo caso, se determina qué nivel de proteína

activa está presente en la muestra, el cual no necesariamente constituye el total de las moléculas

de proteína presentes en la muestra. La actividad enzimática de una cantidad de enzima definida

se puede calcular determinando por algún método la cantidad de sustrato que se convierte en

producto por unidad de tiempo (Figura 2). Generalmente la actividad enzimática se expresa en

unidades de enzima (U) y usualmente representa la cantidad de enzima que cataliza la conversión

de 1 micromol de sustrato en producto en 1 minuto.

Figura 1. Curva de avance de una reacción catalizada por una enzima. P es la concentración de producto

formado a medida que avanza la reacción. La velocidad inicial de la reacción (vo) es la pendiente de la parte

inicial de la curva. S1, S2, S3, S4, corresponde a las curvas obtenidas utilizando concentraciones crecientes

de sustrato y una misma concentración de enzima.

En la práctica, para el seguimiento de la actividad de una enzima, en algunos casos se detecta la

formación de producto y en otros el consumo de sustrato. Esto dependerá de las características

del sustrato y/o producto formado para la enzima en estudio, así como de la disponibilidad de los

sustratos. Existen diferentes métodos para lograr este cometido, los cuales se detallan a

continuación

1.1.1 Métodos continuos de determinación de la actividad enzimática

Estos métodos siguen de forma continua el progreso de la reacción enzimática. Existen dos tipos:

Método continuo-directo: se utiliza cuando la actividad de la enzima se puede seguir midiendo

cambios en la absorbancia, turbidez, fluorescencia, viscosidad, pH u otros posibles parámetros

físicos en función del tiempo. Para este tipo de método se utilizan por ejemplo sustratos artificiales

que generan productos coloreados o fluorescentes luego de la acción de la enzima en estudio.

Método continuo-acoplado: se utiliza en los casos donde la enzima a estudiar no genera ningún

cambio en los parámetros físicos medibles directamente. En estos casos se utiliza un método

continuo acoplado en el cual el producto generado por la enzima en estudio es utilizado como

sustrato por otra enzima cuyo producto sí puede ser detectado por parámetros físicos medibles.

Un ejemplo de método continuo-directo: la determinación de la actividad lisozima



El mismo utiliza una suspensión de bacterias Micrococcus lysodeikticus como sustrato. Estas

células son sustrato de la lisozima pues contienen peptidoglicano en su pared celular el cuál puede

ser hidrolizado por acción de dicha enzima. La suspensión de bacterias presenta una turbidez

inicial que depende de la densidad celular de la misma. La turbidez inicial o densidad óptica (DO)

de este sustrato particular se puede medir utilizando un espectrofotómetro, a una longitud de onda

visible, generalmente entre 450-600 nm. Debemos tener en cuenta que la DO no representa una

medida de absorbancia en un sentido estricto, ya que dicho valor no refleja la luz absorbida por la

muestra, sino que representa la luz dispersada por esta. Al incubar esta suspensión celular con una

muestra que contenga actividad lisozima, la fracción glucídica del peptidoglicano que compone la

pared celular de dichas células se hidroliza y las células se irán lisando a medida que transcurre el

tiempo de incubación, dando lugar a una reducción de la turbidez inicial. Así la disminución de la

turbidez se podrá registrar a λ=450 nm y será proporcional a la actividad lisozima presente en la

muestra. Note que en este caso se determina la actividad de la lisozima mediante la desaparición

del sustrato y no mediante la formación de producto. Es así que para este método particular:

1 U se define como la cantidad de enzima que produce una disminución en la turbidez a λ

450 nm de 0,001 unidades en 1 minuto, en las condiciones definidas del ensayo.

Las U pueden expresarse en unidades de enzima por unidad de volumen de la muestra evaluada

(U/mL).

1.1.2. Método a punto final de determinación de la actividad enzimática

El método de punto final consiste determinar la cantidad de producto que ha sido generado luego

de transcurrido un tiempo fijo de reacción. Para detener la reacción se utiliza por ejemplo: agentes

que desnaturalizan la enzima (detergentes, ácidos fuertes, calor, etc) o inhibidores irreversibles

específicos para la enzima en estudio (por ejemplo iones de metales pesados). Para utilizar este

método es necesario verificar previamente que una vez trascurrido este tiempo fijo de reacción

nos encontramos en condiciones de velocidad inicial, en las condiciones del ensayo utilizadas.

1.1.3. Otras consideraciones importantes

Los ensayos para determinar actividad enzimática se hacen a un determinado pH y temperatura,

que se suele escoger para obtener una actividad enzimática óptima, o para aproximarse a las

condiciones fisiológicas. Recuerde que la actividad de una enzima depende de diversos factores

que afectan la catálisis, no sólo la concentración de enzima y de sustrato, sino también del pH, la

temperatura, la fuerza iónica, la presencia de cofactores o de inhibidores, las modificaciones

postraduccionales que puedan modular la actividad de dicha enzima, etc. Por lo tanto, si las

condiciones del ensayo cambian, también podrá cambiar la actividad.

La actividad de la enzima podrá expresarse en μmoles de producto formado por minuto si es

posible obtener la cantidad de producto formado en función del tiempo, para una concentración

de enzima determinada. Para esto es necesario conocer el coeficiente de extinción molar del

producto detectado. Luego, aplicando la ley de Lambert-Beer es posible calcular la concentración

de producto formado por unidad de tiempo.

Es decir, si recordamos que:

A=εbc y vo= ΔA/Δt

Entonces: ΔA/Δt= εbΔc/Δt

A = absorbancia

c = concentración

t = tiempo

b = camino óptico

ε = coeficiente de extinción molar



(ΔA/Δt)/εb= Δc/Δt

(En el caso que se detecte formación de P, Δc/Δt corresponde a ΔP/Δt tal como se muestra en la Figura 1)

1.2. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

La estimación o cuantificación de la cantidad de proteína que hay presente un una muestra puede

determinarse utilizando diferentes métodos. Estos métodos pueden dividirse en dos categorías:

directos e indirectos.

1.2.1 Métodos Directos

Son métodos que utilizan la absorción intrínseca de ciertos grupos componentes de las proteínas,

a una longitud de onda particular.

Absorción en el ultravioleta

El enlace peptídico y los aminoácidos aromáticos (Tirosina, Triptófano y Fenilalanina) de las

proteínas absorben luz en la región del ultravioleta y por lo tanto pueden ser utilizados para

determinar la concentración proteica por espectrofotometría.

El método se basa en la ley de Lambert y Beer, donde: Abs = ε.c.b. “ε” es el coeficiente de

extinción de la proteína (una propiedad específica de cada proteína), “c” es la concentración molar

(M) y “b” es la distancia recorrida por el haz de luz. Conociendo la secuencia de la proteína

podemos determinar el valor teórico de dicho coeficiente en (http://www.expasy.org/protparam)

Cuando se trata de una mezcla no pura, como puede ser la mezcla de varias proteínas, no podemos

calcular la concentración exacta de proteína pues cada proteína tendrá un ε particular y algunas

de estas proteínas puede que no sepamos de que proteína se trate. Por lo tanto en este caso

podremos sólo estimar la concentración de proteína de la muestra.

1.2.2. Métodos Indirectos

Estos métodos están basados en la absorción de luz resultante de la interacción de las proteínass

con reactivos específicos. En estos existen condiciones definidas para las cuales la cantidad de

complejo formado y detectado espectrofotométricamente es proporcional a la cantidad de proteína

de la muestra. Los métodos indirectos más usados son el de Biuret, Lowry, Bradford y del ácido

bicinconínico (o BCA). Cada uno aplica reactivos específicos, difieren en el grado de sensibilidad

de detección y en las posibles interferencias que pueden presentar (ver Anexo).

Para determinar la concentración de una muestra problema, estos métodos indirectos utilizan una

proteína de concentración conocida (generalmente seroalbúmina bovina, BSA) como estándar o

referencia. A diferentes diluciones de la proteína estándar se le aplica el método seleccionado.

Con los valores de absorbancia obtenidos se realiza un gráfico de Absorbancia vs la concentración

de la proteína de referencia, denominado curva de calibración del estándar (ver Figura 1). El valor

de absorbancia de la muestra problema, obtenido por el mismo método que la proteína estándar,

es interpolado en el gráfico de la curva de calibración, obteniéndose así la concentración de

proteína de dicha muestra en estudio.

Un ejemplo de método indirecto: el método de Bradford

El ensayo de Bradford se basa en la unión no covalente del Azul de Coomassie a las proteínas.

Este compuesto presenta diferentes espectros de absorción según el estado de protonación en el

que se encuentra: la forma catiónica es de color rojo amarronado (máximo de absorbancia a 470



nm), la neutra es verde (máximo a 650 nm) y la aniónica es azul (máximo a 595nm). La presencia

de proteínas favorece el desplazamiento del equilibrio hacia la forma aniónica debido a la

interacción de los grupos sulfónicos del Coomassie con los grupos catiónicos de las cadenas

laterales de algunos residuos aminoacídicos de las proteínas (principalmente Arg y Lys). Esto

genera la coloración azul del reactivo, que puede medirse a 595 nm. La intensidad del color azul

aumentará al aumentar la concentración de proteína

Figura 2. Ejemplo de curva de calibración estándar.

Las principales ventajas de este ensayo son su alta sensibilidad (detecta entre 1-10 µg por mL) y

sencillez (se mezcla el reactivo con la solución de proteína, se incuba un corto tiempo y se mide

la A595nm).

Sin embargo hay que tener en cuenta que es un método con una dependencia más fuertemente de

la composición de aminoácidos de la proteína que se mide en comparación con otros métodos.

Así, proteínas ricas en aminoácidos catiónicos como la lisina, como las histonas, darán valores de

concentración sobrestimados si se utiliza el método de Bradford para su dosificación. Debe

tenerse en cuenta también la posible interferencia de detergentes tales como el Triton X100 o el

Dodecilsulfato de sodio (SDS).

2. OBJETIVOS:

2.1. Cuantificar la actividad Lisozima en las muestras obtenidas en el práctico anterior (Fo, F1

y EA)

2.2. Determinar la concentración proteica en las muestras obtenidas en el práctico anterior (Fo,

F1 y EA) aplicando un método indirecto y calcular la actividad específica de dichas

fracciones.

3. REACTIVOS

3.1. PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD LISOZIMA

● Buffer de actividad de lisozima: fosfato de potasio 0,5 M pH 6,2 a temperatura

ambiente.

● Suspensión bacteriana de Micrococcus lysodeikticus (Sigma-Aldrich), 0,2 mg de células

por mL de buffer de actividad.



3.2. PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

● Reactivo de Bradford: 100 mg de Azul de Coomasie G, 50 mL de Etanol, 100 mL de

ácido fosfórico 85% (p/v), H2O destilada, csp 1L

● Solución estándar de proteína, albúmina bovina (BSA) a 1 mg/mL

● Agua Milli-Q

● Muestras problema de concentración proteica desconocida: Fo, F1, E


● Computadora con programa de gráficos tipo Excel.

● Espectrofotómetro

● Placas de 96 pocillos de fondo plano y lector de placas

● Material volumétrico (tubos, pipetas, puntas)

5. PRECAUCIONES

Atención: el reactivo de Bradford es sensible a la luz y contiene ácido fosfórico 85% (p/v) por

lo cual es necesario utilizar guantes y si es posible lentes, evitando salpicar al descargar el

reactivo en la placa.

6. PROCEDIMIENTO

6.1. PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD LISOZIMA

2. Añadir 20 µL de la muestra correspondiente como se indica en

el esquema. Para el control negativo (C-) sustituir la muestra por

buffer y para el control positivo (C+) se agregará una solución de

lisozima comercial proporcionado por el Docente.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A F0 F0 F0

B F1 F1 F1

C EA EA EA

D C+ C+ C+

E C- C- C-

F

G

H



6.2. PARA LA DOSIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. A partir de la solución estándar de proteínas de

1mg/mL, hacer diluciones apropiadas, en el rango de 0,1 a

1mg/mL*, con los cuales obtener los datos para el trazado

de una curva de calibración.

Tome las diluciones preparadas y guardada en dicha

práctica y continúe el procedimiento en el paso siguiente

* Las soluciones diluídas son las preparadas en el Práctico 1.



Nota: Atención - leer absorbancia a 595 nm luego de 10 minutos y no más de 1 h

después de que comenzó la reacción.

4. Adicionar a cada pocillo 330µL del reactivo de

Bradford

330



7. ANEXO

7.1. Dosificación de proteínas

Los métodos de dosificación de proteínas son utilizados para determinar o estimar la

concentración de proteína en solución. Veremos aquí algunos de los métodos más usuales, en los

que se utiliza la espectrofotometría como herramienta para la cuantificación. Éstos pueden

dividirse en dos categorías: directos o indirectos.

Métodos directos: basados en la absorción propia de las proteínas:

- absorción de luz ultravioleta

- absorción de luz debida a grupos prostéticos de las proteínas (si los hay)

Métodos indirectos: basados en la absorción de luz que resulta de la interacción de las proteínas

con reactivos específicos:

- con el reactivo de Biuret

- con el reactivo de Lowry

- con el ácido bicinconínico (BCA)

- con el reactivo de Bradford

7.1.1. Métodos directos

Absorción en el ultravioleta

Las proteínas contienen ciertos enlaces o aminoácidos cuyos grupos funcionales absorben luz en

el ultravioleta (UV) y por lo tanto pueden ser utilizados para cuantificar la concentración de

proteína por espectrofotometría. (Ver fundamentos de estos métodos en sección: “1. Introducción

al trabajo en el laboratorio”)

Ventajas de los métodos directos:

-- Rápidos y sensibles (50-100 μg/ml) (mucho más sensible que el método indirecto Biuret,

por ejemplo).

-- No destructivos, es decir que la muestra de proteína no es sometida a ninguna reacción

química y se puede recuperar intacta.

-- En el caso de A280nm, muchas sales y otras sustancias que se usan para preparar los buffers

usualmente no interfieren en la medida.

Desventajas de los métodos directos:

-- Los ácidos nucleicos también absorben en la región de λ=280nm.

-- El contenido de aminoácidos aromáticos puede diferir considerablemente entre las

proteínas.

-- La solución debe ser clara y sin turbidez, de lo contrario de pueden producir resultados

erráticos.

-- Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este método.

Existe una fórmula empírica desarrollada por Warburg y Christian (1941) que permite estimar la

concentración de proteínas aun en presencia de ácidos nucleicos. Para aplicar la fórmula es

necesario medir la absorbancia a dos longitudes de onda, A280 y A260. (λ=260 nm es donde la

absorbancia de los ácidos nucleicos es máxima en esa región del espectro)

Concentración de proteínas (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260

En algunos casos, cuando hay componentes del buffer que absorben a λ 280 nm, pero se



encuentran en bajas concentraciones, el problema puede subsanarse incluyendo esas mismas

sustancias en el blanco del ensayo (es necesario conocer la concentración de los componentes del

buffer).

7.1.2. Métodos indirectos

Los métodos indirectos están basados en la absorción de luz de los complejos que se forman

cuando las proteínas reaccionan con reactivos específicos. En todos los métodos indirectos

existirán condiciones definidas para las cuales la cantidad de complejo formado y detectado

espectrofotométricamente es proporcional a la cantidad de proteína de la muestra.

7.1.2.1. Método del Biuret

El reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y sulfato de cobre (solución alcalina

fuerte). Los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con los

iones del cobre Cu2+ del reactivo dando el color azul-púrpura. Cada átomo de Cu2+ reacciona con

dos átomos de N y se establece una resonancia de electrones con otros dos N de grupos imino

vecinos (Figura 4). Este complejo azul-púrpura absorbe luz en la región visible del espectro

(λ=540 nm, luz amarilla) y la intensidad del color producido es proporcional al número de enlaces

peptídicos, y por lo tanto a la cantidad de proteína de la muestra.

Figura 4. Complejo proteína-Cu2+.

El método del Biuret tiene la ventaja de que no depende del tipo de aminoácidos presente en las

proteínas de la muestra, ya que en la reacción interviene el enlace peptídico y no las cadenas

laterales de los mismos. Sin embargo, comparado con otros métodos disponibles el método del

Biuret resulta poco sensible, ya que cada ensayo requiere una concentración de proteína superior

a 100 microgramos/mL. Además, son numerosos los compuestos que interfieren con la reacción

(sacarosa, Tris, glicerol, EDTA, etc.).

7.1.2.2. Método de Lowry

En 1927, Folin y Ciocalteu inventaron un reactivo que lleva sus nombres, compuesto por

fosfotungstato y fosfomolibdato (usado originalmente para la dosificación de grupos fenólicos).

Este reactivo, combinado con la reacción del biuret descrita en 1.1.2.1, es la base del método

propuesto por Lowry en 1951. En este ensayo tienen lugar una serie de reacciones de

oxidación/reducción que transcurren en por lo menos dos pasos (Figura 5):



(1) los iones Cu2+ se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno

de los enlaces peptídicos (lo mismo que el método del biuret). Además, provocan el

desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo los residuos de

Tyr y Trp que van a participar en la segunda etapa de la reacción. En las condiciones de

este ensayo, el Cu2+ se reduce a Cu1+.

(2) el Cu1+ y los radicales Tyr, Trp, asi como también Cys, provocan la reducción del

reactivo de Folin-Ciocalteu (de color amarillo), dando lugar a un complejo de color azul

intenso que puede ser detectado por absorción de luz de λ=750 nm (luz de color rojo).

El ensayo de Lowry es mucho más sensible que la simple formación del complejo del biuret. Se

pueden detectar concentraciones de proteína del orden de unos pocos microgramos/mL. Sin

embargo, la susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una de las

desventajas del método. Además, algunos agentes reductores frecuentemente utilizados en

preparaciones de proteínas (beta-mercaptoetanol, ditiotreitol) y quelantes de metales (EDTA),

interfieren el ensayo.

Figura 5. Reacciones del Método de Lowry.

7.1.2.3. Método del ácido bicinconínico (BCA)

El principio de este ensayo es similar al del método de Lowry, ya que depende de la reducción de

Cu2+ a Cu1+ que se ve facilitada luego de formarse el complejo descrito en las figuras 4 y 5. El

Cu1+ forma un complejo de color púrpura con el ácido bicinconínico (BCA, Figura 6). Este

complejo presenta un máximo de absorbancia a 562 nm.

Figura 6 Complejo BCA con el cobre Cu1+.



Una de las mayores ventajas de este ensayo es que es compatible con varios detergentes, iónicos

y no iónicos, que se usan para solubilizar proteínas, así como su alta sensibilidad (0,5 – 1 μg/mL).

7.3. Cuadro comparativo de métodos de dosificación de proteínas

Método λ (nm) Sensibilidad

(μg/mL)

¿Depende de la

composición

aminoacídica?

Interferencias

Directo:

Absorción

luz UV

205 10 No Muchas

280 50 Sí Detergentes

Ác. nucleicos

Lowry 750 10 Sí EDTA,

reductores

Bicinconínico.

(BCA) 562 0,5 No

(NH4)2SO4

Lípidos

Biuret 540 100 No

Sacarosa,

Tris,

glicerol,

EDTA

Bradford 595 1 Sí Detergentes

7.4. Aplicaciones de la dosificación de proteínas (algunos ejemplos)

- Investigación básica: la determinación de la concentración de proteínas en una muestra es un

ensayo realizado muy frecuentemente en el laboratorio de investigación bioquímica. Durante el

proceso de purificación de una proteína, generalmente se determina la concentración de proteínas

en cada paso, ya que esto es necesario para poder seguir el proceso de purificación, como veremos

más adelante. Conocer este valor suele ser necesario para poder continuar el análisis de la muestra,

ya sea a través de ensayos de actividad enzimática o de análisis por electroforesis, como veremos

en las prácticas siguientes.

- En la industria de los alimentos: como las proteínas son nutrientes básicos de nuestro

organismo, su concentración está asociada con parámetros de calidad de los alimentos, ya sea

porque pueden tener influencia en los procesos industriales (gelificación), en el color o aroma de

alimentos (productos horneados de panificación, tostado de café) o en el precio de los cereales

(porcentaje de proteínas vegetales).

- En el laboratorio clínico: la determinación de proteínas séricas en orina (proteinuria) es un

análisis de rutina en el laboratorio de análisis clínico. La proteinuria, primera manifestación de

las enfermedades renales, se produce por daño de los filtros que tienen los riñones (glomérulos).

Normalmente las proteínas no pueden atravesar dichos filtros. Si estos se encuentran alterados,

los orificios son más grandes dejando pasar proteínas. Los glomérulos pueden estar alterados por

enfermedades propias de los riñones (glomerulonefritis) o por el daño producido por

enfermedades de otros órganos como por ejemplo la diabetes o el lupus eritematoso sistémico.



7.5. Abundancia de aminoácidos en las proteínas

La tabla muestra la ocurrencia promedio (expresada en porcentaje) de los distintos aminoácidos a partir de

datos de más de 1,150 proteínas. (Tomado de Lehninger, Principios de Bioquímica, 4ta edición).

8. BIBLIOGRAFÍA

Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye biding. Analytical Biochemistry 72:24-254

Delobette H., Friry A., Plewniak F., Egly J-M. (1991) Le dosage des protéines. Le Technoscope

de Biofutur 41: 3-12.

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951) Protein measurement with

the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275

Pace, CN, Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G & Gray, T. (1995) How to measure and predict the

molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 4: 2411-24


EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN

1. Cálculo de la Actividad específica

2. Electroforesis de Proteínas

1. INTRODUCCIÓN

1.1 CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA Y EVALUACIÓN DE LA

PURIFICACIÓN

La actividad específica (AE) de una enzima se refiere a la actividad de dicha enzima por unidad

de masa de proteína presente en la muestra, y se suele expresar en U/mg de proteína. La actividad

específica nos permite tener una idea de la pureza de la enzima en estudio cuando esta es

determinada en las diferentes muestras que se obtienen a lo largo de una purificación. Esto se

debe a que para una muestra en particular, nos informará cuanta enzima está activa por cada mg

de proteína total. Si con los pasos de purificación se van eliminando proteínas contaminantes,

quedando la muestra cada vez más enriquecida en la enzima, la relación de unidades de

enzima/mg de proteína debe aumentar. De esta forma, la AE permite evaluar el éxito de un

proceso de purificación de una enzima, ya que a través de dicho proceso lo que buscamos es tener

la mayor cantidad de enzima con respecto a las demás proteínas (“impurezas”). El procedimiento

de purificación “más exitoso” será aquel con el que se logre alcanzar la más alta AE.

Por lo tanto, para calcular la AE (ecuación 1) es necesario determinar: por un lado la actividad/mL

(U/mL) de muestra (“concentración de enzima activa”) a partir de los resultados de un ensayo de

actividad enzimática y por otro lado la concentración de proteínas (mg de proteína/mL de

muestra) a partir de un ensayo de cuantificación de proteínas.

Controlando cómo aumenta la AE a lo largo del protocolo de purificación respecto a la muestra

de partida se evalúa el éxito del protocolo de purificación. Para simplificar la evaluación, se

acostumbra incluir el factor de purificación (FP, ecuación 2) que es la relación de la AE de un

paso determinado sobre la AE inicial. De ésta forma se calcula cuántas veces aumenta la AE

respecto al valor inicial.

Ecuación 1: Actividad Específica

𝐴𝐸 = (

𝑈

𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)

(𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠

𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)

=𝑈

𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎.

𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎=

𝑈

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠

Ecuación 2: Factor de Purificación

𝐹𝑃 = 𝐴𝐸𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑡𝑎𝑝𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 "𝑥"

𝐴𝐸𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑡𝑎𝑝𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

En un protocolo de purificación, además de lograr la mayor purificación posible de la enzima

también importa conservar la mayor cantidad de enzima activa (Utotales). La forma usual de

expresarlo es a través del rendimiento (ecuación 3), calculado como el porcentaje de U totales que

contiene la muestra en determinada etapa de la purificación respecto al total de U en la muestra

inicial.

Ecuación 3: Rendimiento

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) = 𝑼𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑡𝑎𝑝𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 "𝑥"

𝑼𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑡𝑎𝑝𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙. 100





En las diferentes muestras que fueron conservadas en el práctico anterior (F0, F1 y E) se

determinó las U de lisozima/mL y la concentración de proteínas en mg/mL. Estos dos valores nos

permitirán determinar la actividad específica de cada una de las fracciones, y así evaluar la calidad

del proceso de purificación.

1.2 ELECTROFORESIS

El término electroforesis hace referencia a un conjunto de técnicas donde se produce la

separación de partículas cargadas por la acción de un campo eléctrico (𝐸). Cuando una molécula

cargada se encuentra en presencia de un E, se ejerce sobre ella una fuerza eléctrica (𝐹𝑒) que

depende de la intensidad de 𝐸 y de la carga (𝑞) de la molécula. Esta fuerza acelera a la molécula

hasta alcanzar una velocidad constante, la cual produce el desplazamiento de las moléculas hacia

el polo eléctrico de signo opuesto. En consecuencia, cuando se encuentran sometidas a un campo

eléctrico, las moléculas con cargas de diferentes magnitudes se desplazarán a diferentes

velocidades, separándose entre ellas. Este comportamiento de las partículas es válido si las

mismas se encuentran en el vacío. En una situación más real, cuando las moléculas no se

encuentran en el vacío, sino que se encuentra en una solución o soporte, existen otras fuerzas que

también afectan su movimiento por un campo eléctrico. Estas son: la fuerza de fricción (𝐹𝑓) con

el medio, que dificulta su movimiento, y las fuerzas generadas por la energía cinética propia de

las moléculas en solución (movimiento browniano), que provocan movimientos aleatorios (figura

1 A).

FIGURA 1. (A) Fuerzas que actúan sobre una molécula con carga eléctrica negativa dentro de un fluido cuando está expuesta a un campo eléctrico. (B) Formación del frente de movimiento para una molécula con carga negativa.

La suma de todas estas fuerzas hace que cada molécula migre con una velocidad proporcional a

su densidad de carga (relación carga/radio, 𝑞

𝑟), formando un frente de movimiento. Este último se

forma debido a que las moléculas, aunque sean idénticas, no migran en forma totalmente

homogénea (figura 1 B). En resumen, las moléculas con diferente relación 𝑞

𝑟 se desplazarán a

diferentes velocidades y por lo tanto, si inicialmente estaban juntas, podrán separarse unas de

otras dependiendo de las características de la muestra y las condiciones experimentales.

Si la electroforesis se realiza en solución libre, el gran ancho del frente de migración hace que

esta técnica no sea eficiente para la separación de moléculas. Sin embargo, si se utiliza un medio

sólido estabilizante (impregnado en la solución) como soporte para la separación de moléculas

bajo el campo eléctrico, el ancho del frente de migración se reduce y con ello se optimiza el

proceso de separación. Esto dio origen a lo que se conoce como electroforesis en zona o en

soporte. Los soportes de mayor uso en la actualidad son los geles de poliacrilamida o de agarosa.

Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos: restrictivos y no restrictivos. Los

soportes no restrictivos son aquellos que no influyen en la migración de las moléculas y la

separación depende solamente de la densidad de carga de los componentes de la muestra. Los

soportes restrictivos participan activamente en la separación ejerciendo un efecto tamiz. En este

caso la separación depende de la densidad de carga y del tamaño de las moléculas. Estos soportes

se describen con más detalle en el Anexo.





1.2.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE= PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Los geles de poliacrilamida están formados por largas cadenas de poliacrilamida interconectadas

entre sí por puentes químicos o entrecruzamientos (generando algo similar a una matriz con

poros). Estos geles se obtienen mediante la co-polimerización de moléculas de acrilamida (que

forman cadenas lineales) y el compuesto bifuncional bisacrilamida (N, N’-metilenbisacrilamida)

que puede formar parte de dos cadenas (“agente entrecruzador”), creando así un entramado

tridimensional (figura 2A).

La mera mezcla de acrilamida y bisacrilamida no genera la formación del gel, sino que es

necesario el agregado de un iniciador de la reacción de polimerización y un catalizador.

Generalmente se utiliza persulfato de amonio (APS) para iniciar la reacción de polimerización y

TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina) para catalizar la propagación de la misma. El

oxígeno inhibe la polimerización y por lo tanto estos geles deben prepararse en moldes

parcialmente cerrados (en tubos o entre dos placas de vidrio, figura 2B) para minimizar la

exposición al oxígeno del aire.

Variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida se pueden obtener geles con poros de

tamaños determinados. Es fácil encontrar en la bibliografía tablas que indican las proporciones a

mezclar de cada monómero para obtener un gel con el tamaño de poro deseado. Los geles de

poliacrilamida son soportes restrictivos si se preparan de forma tal que el tamaño de sus poros es

semejante al tamaño de los componentes de la muestra. En este caso, dos moléculas con la misma

densidad de carga pero con diferente tamaño pueden separarse, dado que el soporte dificultará el

pasaje de las moléculas de mayor tamaño (efecto tamiz del gel).

FIGURA 2. (A) Esquema de las cadenas entrecruzadas de poliacrilamida que forman un gel. En negro, los residuos de acrilamida, y en rojo, los de bisacrilamida. (B) Equipo de electroforesis vertical para geles de poliacrilamida

preparados entre placas.

Para aumentar la resolución de la electroforesis en geles de poliacrilamida (mejorar la separación

de las moléculas), se utiliza frecuentemente lo que llamaremos un sistema discontinuo. En este

tipo de sistema se utiliza un gel preparado en dos capas: en la parte superior un gel concentrador

(o gel stacking) donde se carga la muestra y, a continuación, un gel separador donde

efectivamente ocurrirá la separación de las moléculas (figura 3). Entre otras, el gel concentrador

y el separador se preparan con diferente grado de entrecruzamiento y pH.

La migración de las moléculas de la muestra por el gel concentrador hace que estas moléculas se

apilen formando una banda muy fina (se concentren en el frente de movimiento o corrida) antes

de iniciar el proceso de separación por el gel separador. Esto se logra debido a que el gel





concentrador tiene poros muy grandes (se comporta como un gel no restrictivo); además, este gel

se prepara en un buffer de baja fuerza iónica y con un pH cercano al pI de la glicina.

FIGURA 3. Esquema de una electroforesis en geles de poliacrilamida con un sistema discontinuo

¿Por qué preparar el gel concentrador en estas condiciones de fuerza iónica y pH?

Tengamos en cuenta dos cosas: 1) los iones cloruro migran más rápido que las moléculas de

proteínas, y 2) el buffer de corrida (buffer que se coloca en los compartimentos de los electrodos)

contiene iones glicina (figura 3A), que al pH del gel concentrador tienen baja movilidad. Mientras

se mantenga esta situación (es decir, mientras no se disipa el gradiente de pH entre gel

concentrador y gel separador), las proteínas de la muestra tienen comparativamente mucho mayor

densidad de carga que la glicina, y migrarán más rápido que ésta. De esta forma, las moléculas de

proteínas se apilan, se concentran en una delgada banda o frente. De esta forma, todas las proteínas

entrarán juntas al gel separador (figura 3B). Dicho gel tiene pH alcalino y poros suficientemente

pequeños como para actuar como soporte restrictivo. A partir de allí, la separación entre las

moléculas tendrá lugar de acuerdo a la movilidad individual de cada proteína en el campo

eléctrico, algo que además dependerá de las características de las moléculas y del tipo de

electroforesis del que se trate (figura 3C).

Existe una gran variedad de tipos de electroforesis, aquí trataremos brevemente la electroforesis

desnaturalizante (SDS-PAGE) que realizaremos en nuestro práctico. En el Anexo se describe

además: la electroforesis nativa, isoelectroenfoque (IEF) y la electroforesis bidimensional (2D).

1.2.3 Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)

En una SDS-PAGE trabajaremos con las proteínas en forma desnaturalizada. Las muestras se

tratarán con un detergente, un agente reductor y temperatura.

1) El detergente más utilizado es el dodecil sulfato de sodio (SDS del inglés, Sodium Dodecyl

Sulfate) (figura 4A), un detergente aniónico que a través de su cola hidrocarbonada (hidrofóbica),

se une a las regiones hidrofóbicas de las proteínas, provocando la desestabilización de las

estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, sin afectar la estructura covalente de las cadena

polipeptídicas. En concentraciones adecuadas, este detergente se une a la mayoría de las proteínas

en una relación masa/masa constante (1,4 g de SDS/ g de proteína; aproximadamente una

molécula de SDS cada dos residuos de aminoácido). Esto implica que, en los complejos que forma

el SDS con una determinada proteína, la carga intrínseca de ésta pasa a ser minoritaria frente al





alto número de moléculas cargadas del detergente. Por tanto, el complejo SDS/proteína se

comportará como una entidad con carga negativa, independientemente del pH del medio y del pI

de la proteína. Además, como la cantidad de SDS por unidad de masa de proteína es constante

para la mayoría de las proteínas, todos los complejos SDS/proteína tendrán la misma densidad de

carga.

2) En aquellas proteínas que tienen puentes disulfuro, para lograr que la cadena polipeptídica esté

completamente extendida, es necesario romperlos tratándolas con un agente reductor, usualmente

2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT).

3) En las condiciones que acabamos de describir y con la ayuda de una tratamiento térmico, las

proteínas estarían completamente extendidas, y recubiertas de moléculas de SDS (figura 4B).

FIGURA 4. Estructura química del detergente SDS (A). Esquema de la acción del detergente SDS y del reductor sobre las proteínas. Las proteínas adoptan una estructura en forma de bastón recubiertas de SDS (B).

Luego de estos tratamientos con el detergente, el agente reductor y el calor, la forma de los

complejos SDS-proteínas serían similar a largos bastones con carga negativa. De esta manera,

dado que la carga por unidad de superficie es constante para todas las proteínas, la separación en

la SDS-PAGE se realiza exclusivamente en función del tamaño (masa molecular) de la proteína.

Debido a que existe una relación lineal entre la movilidad electroforética y el logaritmo de la masa

molecular (log MM) de las proteínas, es posible estimar el peso molecular de proteínas

desconocidas. Esta es una aplicación muy utilizada del SDS-PAGE y se describe en el Anexo.

1.2.4 Detección de las proteínas en el gel

Dado que la gran mayoría de las proteínas son incoloras, después de su separación por

electroforesis es necesario contar con un método para visualizarlas. Los métodos más

frecuentemente utilizados son tinciones con sustancias que se unen de manera bastante específica

a las proteínas, pero que tienen poca afinidad por el soporte del gel. Se pueden utilizar compuestos

coloreados (que se visualizan directamente) o fluorescentes (hay que iluminarlos con una luz de

longitud de onda determinada para ver la fluorescencia). Las técnicas utilizadas más

frecuentemente para la visualización de proteínas son las tinciones directas con Azul de

Coomasie (Coomasie Brillant Blue, detecta hasta 0,2-0,5 ng de proteína por banda) y con Nitrato

de plata (detecta hasta 0,1 ng de proteína por banda). En la figura 5 se muestra un ejemplo de una

corrida de SDS-PAGE donde las proteínas se revelaron con Azul de Coomasie.





FIGURA 5. Ejemplo de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomasie. En los carriles a, b, c y d se observan al menos

8, 2, 1 y 1 bandas proteicas de diferentes tamaños. En el carril e se sembró un marcador de tamaño molecular (mezcla

de 6 proteínas de tamaño diferente y conocido). Con una flecha se indica el sentido de la corrida electroforética.

2. OBJETIVOS

2.1. Calcular la Actividad específica de las muestras obtenidas en la práctica de cromatografía de

intercambio iónico (Fo, F y EA).

2.2. Realizar una electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) para

separar las proteínas presentes en las muestras de la cromatografía de cromatografía de

intercambio iónico

3. REACTIVOS

Acrilamida (A)

Bisacrilamida (B)

N, N, N´,N'-tetrametiletilendiamina

(TEMED)

Persulfato de amonio (APS)

Dodecil sulfato de amonio (SDS)

Tris base

Glicina

Azul de bromofenol

β-mercaptoetanol

Glicerol

Coomassie Brillant Blue R-250

Etanol

Ácido acétic

MUESTRAS

Alícuotas guardadas del práctico de intercambio iónico: Fo, F1 y Ea.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Solución stock A-B (30 %, 0,8 %). Se prepara una solución de acrilamida 30% (p/v) y

bisacrilamida 0.8% (p/v), en agua. La solución se filtra con filtro de poro de 0,45 µm y se

almacena a 4 ºC en botella oscura.





APS 10 %. Solución de persulfato de amonio 10% (p/v) en agua. Las alícuotas se pueden

conservar a 4 °C por cortos períodos, o a -20 °C por mayor tiempo.

SDS 10 %. Solución de dodecilsulfato de sodio 10% (p/v) en agua. La solución debe ser

clara y transparente. Se almacena a temperatura ambiente (a bajas temperaturas el detergente

precipita, formando una suspensión blanca; si eso ocurre, calentar a 37 °C hasta que

desaparezca el precipitado).

Buffer para gel separador. Solución stock 4X. Tris HCl 1,5M pH 8,8 y SDS 0,4% (p/v).

Buffer para gel concentrador (stacking gel). Solución stock 4X. Tris HCl 0,5 M pH 6,8 y

SDS 0,4 % (p/v).

Buffer de corrida. Solución stock 5X. Tris base 125 mM, Glicina 1,25 M, SDS 0,5% (w/v).

Buffer de muestra. Solución stock 4X. Pesar 1,52 g de Tris base, 2 g de SDS y 1 mg de azul

de bromofenol1. Agregar 2 mL de β-mercaptoetanol y 20 mL de glicerol2. Ajustar a pH 6.8

con HCl, agregar agua en cantidad suficiente para 50 mL. Alicuotar y conservar a -20 °C.

Solución colorante de Coomassie. Solución acuosa de Coomassie Brillant Blue R-250 0,2

% (p/v), etanol 30 % (v/v) y ácido acético 7% (v/v). Filtrar la solución con papel Whatman

Nº 1.

Solución decolorante. Solución acuosa de etanol 30% (v/v), ácido acético 7 % (v/v).

Nota 1: el azul de bromofenol cumple dos propósitos: por un lado, facilitar la visualización de la

muestra en el momento de la siembra en el gel, y por otro lado, sirve como guía durante el

transcurso de la electroforesis ya que esta molécula migra a la velocidad del frente de migración.

Nota 2: el glicerol cumple la función de hacer más densa la muestra. Esto facilita que la misma

ingrese al pocillo durante el sembrado del gel.


Equipo de electroforesis vertical

Fuente de corriente contínua con voltaje e intensidad regulables.

5. PRECAUCIONES

La ACRILAMIDA y la BISACRILAMIDA en solución son potentes neurotoxinas que se

absorben a través de la piel, generando un daño acumulativo ante una exposición prolongada. A

pesar de que la poliacrilamida (acrilamida polimerizada) no es considerada neurotóxica,

igualmente debe ser tratada con los mismos cuidados ya que pueden existir pequeñas cantidades

de los monómeros sin polimerizar dentro del gel. Por este motivo, la manipulación de las

soluciones de acrilamida debe ser muy cuidadosa, usando guantes. La manipulación de la

acrilamida sólida que se utiliza para la preparación de la solución stock debe hacerse con

mascarilla y en campana de extracción de gases.

El SDS es un detergente iónico que, si bien es un componente usual de la pasta de dientes, algunos

champúes y otros cosméticos, cuando está en estado sólido se presenta en escamas muy livianas

que vuelan fácilmente en el aire. En ese estado, el SDS provoca irritación de las mucosas, por lo

que deber ser pesado utilizando mascarilla y lentes de protección.

El TEMED es tóxico, por lo que debe evitarse el contacto con la piel.





6. PROCEDIMIENTO





7. ANEXO

7.1. Diferentes tipos de soporte para electroforesis

Como se describió anteriormente cuando se utiliza la electroforesis en zona, la muestra se dispone

inicialmente en una pequeña zona del soporte, y posteriormente ésta lo va recorriendo impulsado

por el campo eléctrico. Para que esta situación sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del

proceso de separación, es necesario contrarrestar el efecto de la difusión y las posibles corrientes

de convección. Para ello se utilizan diferentes tipos de medios o soportes que son reticulados

moleculares que forman un entramado tridimensional que impide o reduce dicha difusión y

permite la entrada de agua en sus poros. El tamaño de estos poros debe permitir el paso de

moléculas voluminosas como son los ácidos nucleicos y las proteínas. Además, el soporte debe

ser inerte, es decir, no debe tener cargas que interfieran con la migración de las moléculas de la

muestra. Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos: restrictivos y no restrictivos.

Soportes no restrictivos: el tamaño de poro del soporte es tal que no opone impedimento al paso

de las moléculas, por lo cual éstas son separadas principalmente en función de la densidad de

carga (una medida de la cantidad de carga por unidad de volumen de una partícula). Papel de

filtro y láminas de acetato de celulosa son los ejemplos más representativos.

Soportes restrictivos: en estos soportes el tamaño de poro opone resistencia al paso de las

moléculas. El ejemplo característico son los geles de agarosa y los geles de poliacrilamida, que

no sólo evitan la convección y minimizan la difusión, sino que además contribuyen al proceso de

separación. Estos geles están formados por redes tridimensionales de polímeros. La manera en

que se preparan los geles permite obtener poros con tamaños determinados, de manera

reproducible. Dentro de ciertos límites, cuanto mayor es el tamaño de la molécula, mayor es el

impedimento del pasaje por los poros durante el proceso electroforético, de modo que existe un

efecto de tamizado molecular. En el caso de los soportes restrictivos, la separación

electroforética dependerá no solo de la densidad de carga de las moléculas, sino también de su

tamaño y de su forma geométrica. Por ejemplo, dos proteínas con igual densidad de carga pero

tamaños diferentes probablemente no podrán ser separadas mediante electroforesis en papel, en

tanto que, si la diferencia de tamaño es suficiente, podrían ser separadas por electroforesis en un

gel de poliacrilamida con poros de tamaño adecuado.

7.2 Diferentes tipos de electroforesis

Electroforesis nativa: En esta metodología se procuran condiciones en las cuales las proteínas

no se desnaturalicen, es decir, que mantengan su estructura nativa. De esta manera, en muchos

casos es posible mantener intactos los complejos supramoleculares que puedan formar algunas

proteínas, o conservar la estructura cuaternaria en proteínas oligoméricas. Este tipo de

electroforesis, al no desnaturalizar la muestra, permite realizar ensayos bioquímicos posteriores a

la separación.

Isoelectroenfoque (IEF): Esta técnica se basa en la separación de las proteínas en base al punto

isoeléctrico de los componentes de la muestra. En este caso, a lo largo del soporte hay un gradiente

de pH (esto se logra con un tipo de sustancias llamadas anfolitos). La región del ánodo es ácida y

la del cátodo es alcalina (ver figura 5). Veamos un ejemplo: si un analito inicialmente se encuentra

en una región del gel de pH inferior a su punto isoeléctrico tendrá carga positiva, y al aplicar el

campo eléctrico migrará hacia cátodo. En el recorrido irá encontrando un aumento del pH del

medio debido al gradiente de pH que existe en el gel. Llegará a un punto donde el pH del medio

es igual al punto isoeléctrico (pI) del analito. En esa zona, la carga neta del analito será cero, y

por lo tanto, no será atraído por ninguno de los polos del campo eléctrico. De esta forma, las

moléculas anfotéricas se concentrarán o enfocarán en zonas estrechas donde coincide su pI con

un pH específico del gradiente de pH del gel. Esta metodología permite determinar





experimentalmente un parámetro fisicoquímico intrínseco de las proteínas: su pI (es necesario

contar con estándares de pI conocido). En general, mediante IEF se alcanzan excelentes

resoluciones de proteínas cuyos pI difieren sólo en 0,02 unidades de pH; las bandas de proteína

son muy nítidas debido al efecto de enfocado.

Electroforesis bidimensional (2D) (figura 6): Los métodos analizados anteriormente separan

mezclas complejas de proteínas y bajo condiciones óptimas se puede llegar a discriminar hasta

100 zonas (bandas) diferentes en un gel. Cuando es necesario analizar muestras de mayor

complejidad, como por ejemplo extractos totales de células o tejidos, donde el número de especies

moleculares es de varios miles, los métodos descritos anteriormente pueden resultar insuficientes.

La electroforesis bidimensional resulta de la combinación de dos técnicas electroforéticas

realizadas una consecutiva a la otra. El procedimiento más usado se basa en la separación en una

primera instancia (primera dimensión) mediante isoelectroenfoque y luego, el conjunto de

bandas electroenfocadas es sometido a una SDS-PAGE, que las separa por masa molecular

(segunda dimensión).

FIGURA 6. Esquema de electroforesis 2D. La primera dimensión es un IEF y la segunda es una

SDS-PAGE.

7.3 Determinación de masa molecular por SDS-PAGE

La movilidad relativa de un analito (representado como Rf) es el cociente entre la distancia que

migró ese analito dividido por la distancia que migró el marcador de frente de corrida

(frecuentemente azul de bromofenol). Dentro de ciertos límites, y para geles del mismo tipo

(tamaño de poro, pH, etc.) este valor es característico de cada analito. En particular, en la

electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE, la Rf es inversamente proporcional al logaritmo de la

masa molecular. En otras palabras, si se hace un gráfico de log MM en función de Rf, se obtiene

una recta (figura 7). Esto puede aplicarse para determinar la masa molecular aparente de una

proteína desconocida, si se cuenta con un estándar de proteínas de masa molecular conocida que

permita trazar una curva de calibración.

En otros pocillos del mismo gel se colocan las muestras problema, y se determina el Rf de cada

una. La curva de calibración permite estimar el PM de acuerdo a la Rf de las moléculas problema.





FIGURA 7. Curva de calibración para determinar la masa molecular aparente por SDS-PAGE. A

la derecha se muestra el perfil de migración de los estándares de peso molecular conocido y a la

izquierda el gráfico log PM vs. Rf.

7.4 Métodos de detección de proteínas en gel

Método de detección Límite de

detección Método de visualización

Amido Black

Hasta 0,6 – 1,5

μg de proteína

por banda. Directo

Colorantes fluorescentes

(Fluorescamina, 1-

anilina-8-sulfonato de

naftaleno)

Similar a la

tinción con

Nitrato de plata.

El gel debe ser escaneado con un equipo capaz

de detectar la fluorescencia

Marcado con moléculas

radioactivas

Superior a la

tinción con

Nitrato de plata.

El gel se pone en contacto con una película de

rayos-X durante un tiempo apropiado

(autorradiografía).

Revelado específico de

enzimas presentes en el

gel

Depende del

sustrato

utilizado.

Dependiendo del sustrato utilizado, la

actividad enzimática puede evaluarse

directamente en el gel o recortar y eluir las

bandas proteicas y ensayar la actividad

enzimática en solución.

Electrotransferencia e

inmunodetección

(western blot)

Depende de las

condiciones de

trabajo y

anticuerpos

utilizados.

Depende de los anticuerpos utilizados. El

método consiste en transferir las proteínas

separadas por electroforesis desde el gel a una

matriz (generalmente nitrocelulosa o

membranas de difluoruro de polivinilideno,

PVDF). Estas matrices permiten el revelado

mediante cualquier método general para

proteínas y localizar proteínas de interés

utilizando anticuerpos específicos para ellas.

Debido a que la unión antígeno-anticuerpo es

específica se logra de esta forma identificar a

la proteína.

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

1.1 INTRODUCCIÓN- Cromatografía de filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel (conocida también como: exclusión molecular, gel

permeación, filtración molecular o tamiz molecular), es una técnica por la cual las moléculas en

solución se separan según su tamaño y su forma. Considerando que la gran mayoría de las

proteínas globulares tienen una forma esferoidal y que hay una relativa linealidad entre el tamaño

y la masa de la molécula, en general, podemos decir que la separación en la cromatografía de

filtración en gel es en función de la masa molecular.

El soporte sólido o matriz que compone la fase estacionaria está formado por millones de esferas

de aspecto poroso, asemejando una esponja. Las esferas tienen un tamaño homogéneo

(aproximadamente entre 0,01 y 0,3 mm) y los poros son del orden de las decenas de nanómetros

(10-9 m; escala molecular), Ver Fig 1.

Existen diferentes tipos de matrices para cromatografía de filtración en gel. Entre los parámetros

que definen los diferentes tipos de matrices se encuentra el material de la matriz, el tamaño de las

esferas y el tamaño de los poros presentes en las esferas. Entre los materiales con los cuales se

puede construir una matriz de gel filtración tenemos: dextrano, agarosa y acrilamida.

Las matrices más utilizadas están compuestas de polisacáridos de agarosa (polímero de D-

galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa producido por las algas rojas), dextrano (polímero de glucosa

unidas por enlaces α-1,6 y ramificaciones α-1,3 producido por la bacteria Leuconostoc

mesenteroides), o polímeros sintéticos (poliacrilamida, polimetacrilato, polivinilo). A

continuación, se presenta una lista de matrices, su material, su nombre comercial y el fabricante

que las produce. En nuestro caso usaremos matrices de Sephadex que es una marca registrada de

geles de dextrano (polímero ramificado de glucosas entrecruzadas).

Figura 1. Matriz de filtración molecular. Las moléculas de mayor tamaño que el poro no ingresan a la

matriz (El esquema no está a escala; el diámetro de los poros es ~1.000 a 10.000 veces más pequeño que

el de las esferas de la matriz).


Fabricante Nombre comercial Material

BioRad Bio Gel P poliacrilamida

Bio Gel A agarosa

GE

Sephadex dextrano

Sepharose agarosa

Sephacryl poliacrilamida

Superdex agarosa - dextrano

Merck-Millipore Fractogel Polimetacrilato

Toyopearl TSKgel SW Sílica

TSKgel Alpha polivinilo

Matrices Sephadex G, de la compañía GE (antes Amersham-Pharmacia), con sus respectivos

rangos de fraccionamiento, y el tamaño de partículas (gruesa, media, fina, superfina):

Tipo de matriz

Tamaño de la partícula seca

(µm

Rango de fraccionamiento

(Da)

Sephadex G10 40-120 0-700

Sephadex G 25 coarse 100-300 1000-5000

Sephadex G 25 medium 50-150 1000-5000

Sephadex G 25 fine 20-80 1000-5000

Sephadex G 25 superfine 10-40 1000-5000

Sephadex G 50 coarse 100-300 1500-30000

Sephadex G 50 medium 50-150 1500-30000

Sephadex G 50 fine 20-80 1500-30000

Sephadex G 50 superfine 10-40 1500-30000

El Sephadex es una matriz con apariencia de gel, formado por entrecruzamiento de moléculas de

dextrano con epiclorhidrina. Variando la cantidad de epiclorhidrina y/o dextrano se obtienen geles

de diferente porosidad. Geles abiertos con pocos entrecruzamientos o geles cerrados con muchos

entrecruzamientos. Por lo tanto, los distintos Sephadex difieren en el grado de entrecruzamiento,

en su grado de hinchamiento y rango de fraccionamiento.

Los Sephadex con diferentes tamaños de poro (G10, G25, G50, etc) se encuentran disponible en

diferentes tamaños de partículas: gruesas (coarse), medias, finas, o superfinas que una vez

hidratados van a definir los diferentes tamaños de esferas. Las partículas finas se empaquetan

mejor que las gruesas dando una mejor resolución (separación de moléculas). Sin embargo, esto

obliga a utilizar flujos de solvente más bajos (mayor tiempo). Por lo tanto, al momento de elegir

la matriz, hay que evaluar dos factores: calidad de separación y duración del experimento.

Estas matrices se compran en forma de polvo (el cual se hidrata para obtener el gel), o ya

hidratados en una solución conservante (ej: etanol 20 %). Los Sephadex tipo G son aptos para

trabajar en medio acuoso. Los Sephadex tipo LH tienen sus cadenas de dextranos modificadas

con grupos hidroxipropilo, por lo cual son útiles para trabajar con solventes orgánicos poco

polares o en mezcla de solventes orgánicos y agua. Las matrices de Sephadex son estables en un

rango amplio de condiciones de trabajo, aunque generalmente se trabaja en condiciones

moderadas de pH y fuerza iónica.


En una cromatografía de gel filtración, no existe interacción química entre los analitos y la fase

estacionaria (es químicamente inerte). La separación o fraccionamiento tiene lugar de acuerdo al

acceso que los analitos tengan al interior de las esferas de la fase estacionaria, que a su vez, está

determinado por su masa molecular y por el tamaño de los poros de las esferas de la fase

estacionaria. Cuanto menor es el tamaño del analito en relación al tamaño de los poros de las

esferas, éste podrá realizar un mayor recorrido en el interior de la fase estacionaria y por lo tanto

demorará más en salir o eluir de la columna. De esta forma, los analitos que realicen recorridos

diferentes (con mayor o menor acceso a la fase estacionaria) saldrán de la columna a diferentes

tiempos o volúmenes de elución y se separarán.

Para ayudarnos a comprender cómo ocurre la separación consideremos un ejemplo donde tenemos

una mezcla de moléculas con tamaños moleculares superiores al tamaño del poro, así como

también moléculas con tamaños moleculares menores al poro. Las moléculas de mayor tamaño

no lograrán acceder al interior de las esferas, por lo cual, al ir agregando fase móvil, estas

moléculas fluirán por fuera de las esferas que forman la fase estacionaria. Es decir, su recorrido

quedará restringido al volumen de fase móvil que hay entre las esferas. Se dice entonces que estas

moléculas son excluidas de la matriz (Fig. 1).Por otro lado, las moléculas de tamaño menor al

poro podrán acceder al interior de las esferas que constituyen la fase estacionaria, realizando un

camino dentro de las esferas, y por ello un recorrido mucho mayor para llegar a la salida de la

columna cromatográfica. En otras palabras, cuanto menor es el tamaño de la molécula, mayor es

la probabilidad de que ingrese a uno o más poros, y por lo tanto, más largo es el camino que

recorre dentro del laberinto de poros que constituye la fase estacionaria. En consecuencia, los

analitos eluyen en orden decreciente de masa molecular (Fig. 2).

Finalmente, cuando las moléculas son suficientemente pequeñas, éstas ingresarán siempre a

cualquier poro que encuentren en su camino. Dichas moléculas son las que recorren el camino

más largo, y por tanto, las últimas en eluir.

Cada matriz tiene un límite de exclusión que se define como el tamaño molecular a partir del cual

las moléculas a separar no pueden ingresar a los poros (son excluidas) y pasarán a través de la

fase estacionaria sin experimentar un retraso en su camino hacia la salida de la columna. Según

el tamaño de poros de una matriz podemos también definir un intervalo o rango de

fraccionamiento, es decir, un rango de tamaños moleculares que esa matriz podrá separar o

Flujo de la fase móvil

IFigura 2. Esquema de una columna de cromatografía de gel filtración en la que se aplica una muestra

compuesta por tres analitos capaces de realizar caminos diferentes en la columna y separarse.


resolver. Por ejemplo, el intervalo de fraccionamiento de la matriz Sephadex G75 es de 3.000 -

80.000 Da. Estos valores están determinados en base al tamaño de proteínas globulares y los

proporciona el fabricante de la matriz.

Tomando el ejemplo de las matrices de Sephadex G75, las moléculas de tamaño mayor a 80.000

Da no son capaces de acceder al interior de las esferas del gel (tienen un tamaño mayor al tamaño

de los poros) son excluidas y eluyen primero a la salida de la columna. Las moléculas con un

tamaño entre 3.000 Da y 80.000 Da acceden al interior de las esferas de la matriz y realizan un

recorrido mayor (quedan retenidas) por lo cual teóricamente eluyen y se separan entre sí por orden

decreciente de tamaño molecular. Finalmente, las moléculas con un tamaño menor a 3.000 Da no

presentan restricciones en su camino hacia el final de la columna, y por lo tanto, son las últimas

en eluir y no se separan entre sí. Ver Figura 2.

Se pueden entonces distinguir 3 situaciones diferentes:

I. Las moléculas cuyo tamaño sea mayor al poro, seguirán un trayecto más corto y eluirán

primero, en conjunto.

II. Las moléculas cuyo tamaño esté comprendido en el rango de fraccionamiento de la

matriz, ingresas a través de los poros de la matriz y eluirán según su masa molecular (en

orden de tamaño decreciente; se separan unas de otras; es decir, hay fraccionamiento).

III. Las moléculas suficientemente pequeñas (con un tamaño por debajo del límite inferior

del rango de fraccionamiento) eluirán juntas al final de la corrida cromatográfica (ya que

realizan el recorrido más largo dentro de la matriz, ingresando a la mayoría de los poros

y no se separán entre sí).

Los resultados de una cromatografía de filtración molecular se presentan en forma de perfil o

diagrama de elución (Fig. 3). La muestra a separar se siembra en la columna cromatográfica, y a

medida que se agrega fase móvil, se van recogiendo los eluídos a la salida de la columna. Si

estamos separando o fraccionando proteínas, podemos detectar la salida de las mismas midiendo

la absorbancia a 280 nm del líquido recolectado en cada tubo. El perfil de elución se presenta

como la variación de concentración del analito (proteína en nuestro caso) que eluye de la columna

en función del volumen de fase móvil que pasó a través de la columna. Ver Figura 3.

Figura 3. Perfil de elución (o cromatograma) de una cromatografía de filtración en gel. “CV” indica “volumen

de columna”. Las moléculas de tamaño intermedio están comprendidas dentro del rango de fraccionamiento

de la matriz de gel filtración.


A partir de los diagramas de elución se puede determinar el volumen de elución Ve de un analito

dado, el cual es característico de cada molécula en un sistema cromatográfico determinado. La

forma de determinarlo va a estar influenciada por el volumen de muestra que se siembra. Cuando

el volumen de la muestra que se inyecta a la columna es despreciable comparado con el volumen

de elución, la posición del máximo del pico en el diagrama de elución se toma como el Ve. Para

una misma columna, en exactamente la mismas condiciones experimentales, el Ve es propio de

cada molécula.

Sin embargo, el Ve no es suficiente para describir el comportamiento de un analito, ya que este

parámetro depende de las características de la columna (por ejemplo, longitud, volumen, etc).

Una forma de independizarnos de la columna es determinar la constante de distribución, Kd:

Kd = (Ve - V0) / Vi

Donde:

el volumen de elución Ve o volumen de solvente necesario para eluir un compuesto de

una columna.

el volumen muerto V0, es el volumen de solvente que queda en el exterior de la matriz,

es decir, el volumen que queda por fuera de las esferas. Volumen donde eluyen las

moléculas con un tamaño mayor al límite superior del rango de fraccionamiento.

el volumen de la fase estacionaria Vi o volumen disponible dentro de la matriz y al

cual acceden las moléculas más pequeñas. Dicho de otra manera, el volumen de

solvente que llena los poros de las esferas.

De esta forma, el Kd representa la fracción de fase estacionaria disponible para la difusión de un

soluto dado.

El V0 puede determinarse fácilmente de forma experimental ya que corresponde al volumen de

elución de cualquier molécula de tamaño mayor que el límite superior del rango de

fraccionamiento (moléculas excluidas). En la práctica, se suele usar una molécula coloreada como

el Azul Dextrano, que es un polímero de muy alto peso molecular (2.000.000 Da) unido

covalentemente a un cromóforo que le confiere color azul.

El inconveniente durante la determinación de Kd es que necesitamos conocer el volumen de

solvente en el espacio dentro de los poros (Vi). La determinación experimental de Vi no es simple.

Por esta razón, para describir el comportamiento cromatográfico de un soluto en una filtración

molecular es más práctico utilizar la constante de distribución aparente o Kav:

Kav = (Ve - V0) / (Vt - V0)

Para determinar esta constante, el Vi se relaciona con el volumen total (o geométrico) y el volumen

muerto resultando (Figura 4):

Vi = Vt - V0

Donde el volumen total (Vt ) es el volumen que ocupa el solvente dentro y fuera de la matriz. Se

determina experimentalmente como el volumen geométrico de la columna (Vt = π h r2).


El Kav es independiente del tamaño (longitud, volumen) de la columna. Por lo tanto, en

experimentos con diferentes columnas (pero con el mismo tipo de matriz) es de esperar que un

analito determinado tenga el mismo Kav.

1.2 Algunas aplicaciones

Fraccionamiento de mezclas

Una de las aplicaciones más comunes de la cromatografía de exclusión molecular es el

fraccionamiento de una mezcla de analitos de diferente tamaño molecular, como polisacáridos,

ácidos nucleicos, proteínas, péptidos y oligopéptidos.

Para ello debe elegirse la matriz o fase estacionaria apropiada según el peso molecular estimado

o conocido de los componentes de la mezcla y su grado de oligomerización (es decir si en solución

son monómeros, dímeros, etc.).

Determinación de la masa molecular aparente

En el caso de proteínas globulares es posible determinar mediante esta metodología la masa

molecular en solución. Para ello se realizan cromatografías de exclusión molecular con proteínas

de masa molecular conocida, que serán utilizadas como estándares. A partir del cromatograma de

elución de cada una de las proteínas estándar se determina su Ve. Con dichos valores se calculan

los Kav correspondientes y se hace un gráfico del logaritmo de la masa molecular (log PM) en

función de Kav (curva de calibración). Posteriormente, en iguales condiciones experimentales

(columna, buffer, volumen de muestra, etc.) se aplica a la columna la proteína a analizar, se

determina su Ve y se calcula el correspondiente Kav. Con este valor, recurriendo a la curva de

calibración, se puede estimar la masa molecular aparente por interpolación.

Esta técnica permite trabajar en condiciones que no afecten la estructura nativa de la proteína.

Una aplicación interesante es que si conocemos la masa molecular de una cadena polipeptídica

(que podría haberse determinado previamente por electroforesis desnaturalizante), la

cromatografía de filtración en gel brinda la posibilidad de determinar si en condiciones nativas

dicha proteína se encuentra como un monómero (una única subunidad) o en forma multimérica

(dímero, trímero, tetrámero, etc.). También permite comparar la masa obtenida en condiciones

Figura 4. Representación esquemática de los parámetros Vt, Vo y (Vt-Vo) de una

columna de cromatografía de exclusión molecular o gel filtración.


nativas o desnaturalizantes y analizar si coinciden o no.

Desalado o cambio de buffer

Consiste en separar moléculas grandes (por ejemplo proteínas) de otras especies químicas más

pequeñas, tales como sales inorgánicas, agentes reductores, colorantes, etc. Para esto, se

selecciona una matriz cuyo límite de exclusión sea muy bajo, como por ejemplo, Sephadex G-25,

cuyo intervalo de fraccionamiento es de 1.000 a 5.000 Da (la gran mayoría de las proteínas con

las que solemos trabajar tienen masas muy superiores a 5.000 Da). Por lo tanto, en una matriz de

este tipo, las moléculas proteicas eluyen en el volumen muerto, en tanto que los componentes de

bajo peso molecular quedan retrasados. De esta manera, las proteínas eluyen disueltas en el buffer

en el que se había equilibrado previamente la columna. Por ejemplo, la lisozima purificada por

intercambio iónico en el práctico anterior se encuentra en un buffer con una concentración salina

alta (NaCl 0,4 M). Podemos eliminar las sales de la muestra equilibrando una columna de

Sephadex G25 con un buffer que no contenga NaCl y usarla para hacer la cromatografía. Dado

que el PM de la lisozima es ~14.000 Da, ésta eluirá rápidamente, con el volumen muerto de la

columna (esta es la fracción que nos interesa). Los iones Na+ y Cl-, muy pequeños, quedan

retrasados y eluyen al final de la cromatografía, cuando se llegue a pasar un volumen de solvente

igual al volumen total de la columna. De esta manera, obtenemos la lisozima disuelta ahora en el

buffer en el que se había equilibrado la columna al principio del experimento.

2. OBJETIVOS

2.1 Evaluar el proceso de purificación de la lisozima por electroforesis desnaturalizante en gel

de poliacrilamida (SDS-PAGE).

2.2 Familiarizarse con los principios de la cromatografía de exclusión molecular: separación de

dos colorantes de diferente masa molecular.

Figura 5. Matriz de filtración molecular G-25. Las moléculas de mayor tamaño que el poro no ingresan a

la matriz.


3. REACTIVOS

Fase móvil: buffer fosfato salino (usualmente llamado PBS, phosphate buffer saline)

EA obtenida en el práctico 2.

Mezcla de Azul Dextrano (2.000.000 Da) 1 mg/mL y Rojo neutro (289 Da) 0,05 mg/mL.


-Columna empaquetada con Sephadex G-25 medio (el nombre comercial es PD-10). Rango de

tamaño de partículas: 85-260 µm, Dimensiones del lecho empaquetado: 1,45 x 5,0 cm (8,3 mL),

Tamaño de muestra máximo: 2,5 mL, Volumen de muestra eluida: 3,5 mL, Capacidad de

desalado: >90%, Límite de exclusión: 5.000 Da, Estabilidad química: Todos las soluciones

tampón comunes, Rango de pH de trabajo: 2-13.Temperatura de almacenamiento: 4 a 30°C

-Bomba para solvente

-Soporte para columnas, con pinza

-Material volumétrico (tubos, pipetas automáticas)

-Espectrofotómetro

4. PRECAUCIONES

Generalmente las columnas con matriz se conservan en etanol 20% para evitar el crecimiento de

microorganismos. Antes de equilibrarlas con buffer se debe eliminar el etanol lavando con por

lo menos 2 volúmenes de columna de agua pura. Este lavado previo con agua es necesario

porque el contacto del etanol directamente con algunos buffers puede causar la precipitación de

algunos componentes del mismo.

No dejar las columnas sin líquido, no deben secarse nunca. En caso de secarse, la matriz se

resquebraja produciendo caminos preferenciales diferentes al camino impuesto por las partículas

de la matriz.

Cada columna, de origen comercial, presenta una ficha técnica que describe cómo debe ser

utilizada y almacenada, y debe ser leída con atención antes de utilizar la columna.


5. PROCEDIMIENTO


6. BIBLIOGRAFÍA

-Gel filtration in Scopes, R. Protein purification. Principles and practice. 2da edición. Springer-

Verlag. 1988.

-Gel filtration. Principles and Methods:

www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314807262343/litdo

c18102218_20141208003707.pdf

-Sephadex ® LH-60 chromatography in organic solvents. Folleto técnico Pharmacia Fine

Chemicals

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA ÁCIDOS NUCLEICOS

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Extracción de ADN

La extracción de ADN supone separar el ADN del resto de los componentes celulares

para su purificación. Los métodos clásicos de extracción de ADN implican los siguientes pasos:

i) lisis celular y homogeneización de la muestra, ii) separación del ADN de proteínas y restos

celulares, y iii) precipitación del ADN. La pureza lograda determinará qué tan eficientes serán las

reacciones enzimáticas posteriores que usen ese ADN como sustrato o molde.

1.1.1. Lisis celular y homogeneización de la muestra

La lisis celular implica romper las células para liberar el contenido intracelular a la

solución. La metodología a emplear depende de las características de las células y/o tejidos, como

puede ser la presencia o no de paredes celulares. En general, se aplica una combinación de agentes

físicos y químicos, entre los cuales se encuentran:

Detergentes iónicos que disuelven las membranas (ej. SDS o CTAB)

Enzimas que hidrolizan la pared (ej. lisozima para bacterias o zymolasa para levaduras)

Homogeneizadores de vidrio para tejidos blandos

Agitación intensa con microesferas de vidrio

Congelamiento con nitrógeno líquido y pulverización en mortero (células vegetales y hongos)

Un aspecto crítico durante una extracción de ADN es evitar que este sea degradado por la

acción de ADNasas. Estas nucleasas no solo están presentes en las células de origen, sino que

también pueden provenir del ambiente (ej. de las manos del operador). Como estas enzimas

requieren del ión Mg2+ como cofactor para su acción, el agregado al buffer de lisis de un quelante

de iones divalentes como el EDTA suele ser suficiente para evitar la degradación.

1.1.2. Eliminación de proteínas y restos celulares

Existen diferentes métodos que permiten separar el ADN de las proteínas y demás restos

celulares, como las membranas:

Digestión enzimática de proteínas por proteasas, como la proteinasa K.

Extracción con mezclas de solventes orgánicos, como el fenol:cloroformo (tóxicos). Las

proteínas precipitan y quedan en la interfase, entre la fase acuosa y la orgánica, mientras que

el ADN permanece soluble en la fase acuosa.

Extracción cromatográfica por adsorción del ADN a matrices de sílice o por intercambio

aniónico. Es la base de los kits comerciales utilizados comúnmente.

Cualquiera de estas metodologías implica un paso final de centrifugación que separe

efectivamente el ADN en solución o adsorbido de los restos celulares y proteínas. Además, en

general ninguno de estos métodos permite recuperar el ADN libre de ARN, por lo que es necesario

incluir una etapa de tratamiento de la muestra con ARNasa para purificar el ADN.

1.1.3. Precipitación de los ácidos nucleicos

El último paso en la purificación del ADN implica su precipitación. Ésta permite: (i)

eliminar contaminantes, (ii) cambiar el disolvente en el cual se encuentra y (iii) concentrar el

ADN. El método más comúnmente utilizado es la precipitación alcohólica que requiere la

presencia de dos elementos:

i. Un alcohol (ej. etanol o isopropanol) que remueve la capa de solvatación que rodea el

ADN, dejando expuestas las cargas negativas de los grupos fosfato


ii. Cationes provenientes de sales (e.g. NH4+, Na+, Li+, K+) que neutralizan las cargas

negativas de los grupos fosfatos

En estas condiciones, el ácido nucleico deshidratado pierde solubilidad y termina

precipitando, pudiendo recuperarse la mayor parte del mismo por centrifugación. Finalmente, el

precipitado de ADN suele lavarse con alcohol 70 % para remover el exceso de sales, antes de re-

disolverlo en un pequeño volumen de agua o de solución tamponada y conservarlo de esa forma

a -20 °C.

En esta práctica se procederá a extraer un tipo particular de ADN: el plasmídico. ¿Te

acuerdas de lo que es un plásmido?

1.2. Un caso particular: extracción de ADN plasmídico

1.2.1. Los plásmidos

Los plásmidos son moléculas de ADN circulares y covalentemente cerradas que pueden

encontrarse en las bacterias. A diferencia del cromosoma bacteriano, que contiene toda la

información básica para el funcionamiento celular y que tiene un gran tamaño molecular (del

orden de 106 pares de bases), los plásmidos suelen ser de menor tamaño (del orden de 103 - 105

pares de bases) y aportan información que no es esencial para la vida de la bacteria (Figura 1).

Sin embargo, los plásmidos portan genes que le confieren una ventaja adaptativa a la bacteria:

resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas, factores de virulencia, entre otros. En

general, los plásmidos se replican independientemente del cromosoma y suelen encontrarse en un

número de copias característico por célula (incluso miles), dependiendo del tipo de plásmido.

En el laboratorio, los plásmidos naturales se han modificado para transformarlos en

vectores de clonado y de expresión, lo que permite estudiar la función de genes y proteínas. Por

ejemplo, los plásmidos de expresión se utilizan para producir grandes cantidades de una proteína

de interés para la industria, como un fármaco para la salud humana o animal (ej. insulina), o una

enzima para la producción de alimentos (ej. proteasas). Esto requiere introducir en el plásmido el

gen que codifica para la proteína de interés (inserto) y luego introducir el plásmido

“recombinante” en una bacteria donde se pueda replicar. A este conjunto de pasos se le conoce

como “clonado” o “clonación”. Diferentes estrategias experimentales permiten insertar una

secuencia codificante en un plásmido. Una estrategia muy utilizada se basa en el uso de enzimas

de restricción y de ligación (ver más adelante).

1.2.2. La lisis alcalina

La purificación de ADN plasmídico es una práctica corriente en el laboratorio y uno de

los métodos de extracción más conocidos es el de “lisis alcalina”. Este método aprovecha las

diferencias en tamaño del ADN plasmídico y cromosómico para poder separarlos (Figura 2).

El cultivo de bacterias que incluyen el plásmido de interés se centrifuga para remover el

medio de cultivo. El sedimento de bacterias se resuspende en una solución tampón que contiene

EDTA para prevenir la degradación por ADNasas. Luego, se agrega una solución alcalina de

NaOH (pH ≈ 12) que contiene un detergente fuertemente aniónico (SDS). En estas condiciones

Figura 1. Esquema de una célula bacteriana

presentando un cromosoma y varios plásmidos

dentro de la célula


se rompe la pared celular bacteriana, se disuelven las membranas y se desnaturalizan las proteínas,

ocurriendo la lisis celular. Además, a ese pH ocurre la desnaturalización del ADN plasmídico y

cromosómico (se separan las dos hebras del ADN).

El paso clave que permite la separación del ADN plasmídico del cromosómico es la

neutralización rápida del pH de la solución por el agregado de un ácido y el ión potasio. En

estas condiciones, el ADN cromosómico no se renaturaliza y queda “atrapado” junto con las

proteínas desnaturalizadas, los lípidos y el SDS, que precipitan en presencia del K+. En cambio,

el menor tamaño y la conformación superenrollada del ADN plasmídico hacen que este se

renaturalice rápidamente y por ello queda en solución. Luego, mediante una centrifugación se

separan el precipitado que contiene las proteínas, demás restos celulares y el ADN cromosómico

del ADN plasmídico.

Un paso final de precipitación alcohólica permite recuperar el ADN plasmídico en el

disolvente apropiado y a una concentración adecuada. Este método de extracción de ADN plasmídico se basa entonces en la

renaturalización diferencial del ADN plasmídico, quedando el ADN cromosómico en el

precipitado mientras el ADN plasmídico permanece en solución.

Figura 2. Extracción de ADN plasmídico por el método de la lisis alcalina


1.3. Cuantificación y análisis de la pureza de los ácidos nucleicos

1.3.1. Cuantificación por espectrofotometría

Para estimar la concentración de los ácidos nucleicos en solución se utiliza

fundamentalmente la espectrofotometría. Las bases nitrogenadas que los componen absorben la

luz ultravioleta y esta propiedad permite su cuantificación. Cada base presenta un máximo de

absorción a una longitud de onda cercana a 260 nm pero con distinto coeficiente de extinción

molar. Por lo que cada una contribuye de manera distinta a la absorbancia global de los ácidos

nucleicos (Figura 3).

Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico particular depende de la secuencia

de nucleótidos que lo componen, algunas reglas empíricas permiten estimar su concentración a

partir del valor de absorbancia a 260 nm. Una unidad de absorbancia (UA) a 260 nm se

corresponde aproximadamente con:

Entonces, la espectrofotometría proporciona una estimación simple y precisa de la

concentración de ADN en una muestra, siempre y cuando el ADN esté puro. En particular, la

determinación de la concentración es confiable si la muestra no contiene proteínas, ni solventes

orgánicos o sales caotrópicas que distorsionen el resultado final. Esto se debe a que estas

sustancias también absorben a 260 nm.

1.3.2. Evaluación de la pureza por espectrofotometría

Como ya se mencionó, en las preparaciones de ácidos nucleicos es frecuente la presencia

de proteínas como contaminantes. La forma habitual de evaluar la pureza respecto de proteínas

se basa en la diferencia en los máximos de absorción de los ácidos nucleicos (260 nm) y de las

proteínas (280 nm). Así, para una preparación dada se determina su absorbancia a 260 nm y a 280

nm y se calcula el cociente A260/A280. En general, se considera que la preparación es de buena calidad

en relación al grado de pureza cuando:

Para llevar a cabo este análisis de pureza suele hacerse uso de un espectrofotómetro de

microvolúmenes (“Nanodrop”) que permite la determinación de la absorbancia a partir de

pequeños volúmenes de muestra (1 – 2 µL) ya que las preparaciones de ADN suelen ser del orden

de los µL.

Figura 3. Coeficiente de extinción

molar de los nucleótidos a 260 nm

1 UA260 = 50 µg/mL de ADN doble cadena

1 UA260 = 33 µg/mL de ADN cadena simple

1 UA260 = 40 µg/mL de ARN

1 UA260 = 40 g/mL de ARN

ADN A260/A280 ≥ 1,8 ARN A260/A280 ≥ 2,0


1.4. Electroforesis de ácidos nucleicos

La cuantificación y el análisis de la pureza por espectrofotometría no son suficientes para

determinar la calidad de una extracción de ADN. La electroforesis es una técnica complementaria

que permite evaluar la calidad de una extracción por visualización de los ácidos nucleicos en un

gel, entre otras aplicaciones como analizar los productos de una reacción en la que el ADN sirve

de sustrato. Los fundamentos generales de esta técnica se presentaron en la práctica de

electroforesis de proteínas. Aquí se presentarán las particularidades de la electroforesis de ácidos

nucleicos.

En condiciones fisiológicas, los ácidos nucleicos están cargados negativamente por la

presencia de los grupos fosfato. En una electroforesis, estas moléculas tendrán diferencias de

velocidad de migración debido principalmente a su tamaño (largo de la cadena de ADN, en pares

de bases, pb) y a su confirmación (ej. lineal, circular, superenrollado).

Los dos soportes más utilizados para el análisis electroforético de los ácidos nucleicos

son la agarosa y la poliacrilamida. La elección del soporte depende del tamaño de las moléculas

que deben ser separadas: la poliacrilamida es más efectiva para resolver moléculas de bajo peso

molecular (5 a 500 pb), mientras que la agarosa permite resolver moléculas en un amplio rango

de tamaños. En el práctico se realizará una electroforesis en gel de agarosa en un dispositivo

horizontal (Figura 4A). La agarosa es un polímero lineal formado por residuos alternados de D-

y L-galactosa. La concentración utilizada de agarosa determina el tamaño de los poros del gel y,

por lo tanto, el rango de tamaños de los fragmentos de ADN que puede separar (Tabla 1).

Luego de la corrida electroforética, el gel de agarosa se incuba en una solución que

contenga un agente intercalante fluorescente, como el bromuro de etidio o el GelRed. Estos

compuestos emiten fluorescencia cuando se intercalan entre las bases del ADN y se irradian con

luz UV. Así es que se pueden visualizar las bandas correspondientes a los ácidos nucleicos en el

gel teñido cuando este se irradia con UV en un transiluminador (Figura 4B).

Tabla 1. Porcentaje de agarosa recomendado para separar fragmentos de ADN de distinto tamaño

Figura 4. A: cuba de electroforesis horizontal usada para geles de agarosa. B: transiluminador UV para visualización de ácidos nucleicos en gel luego de la electroforesis.


1.4.1. Separación de moléculas de ADN lineales en base al tamaño

En una electroforesis, la velocidad de migración de moléculas de ADN lineales

depende fundamentalmente de su tamaño (pb), debido a que todas tendrán una densidad de

carga constante. A menor tamaño, mayor velocidad de migración, y viceversa.

Para estimar el tamaño en pares de bases de un fragmento de ADN lineal presente en una

muestra problema, se suele incluir en la corrida electroforética un marcador de peso molecular

(MPM). Los MPM son una mezcla de fragmentos lineales de ADN de distinto tamaño que migran

en un gel dejando un patrón de bandas característico de tamaño conocido (pb). Como existe una

relación aproximadamente lineal entre el logaritmo del largo en pb de un ADN lineal y la distancia

migrada, se puede estimar el tamaño del ADN problema comparando las distancias de migración

en el gel respecto del MPM (Figura 5). Es importante destacar que el MPM no permite estimar el

tamaño de un ADN circular.

1.4.2. Efecto de la conformación del ADN circular en la migración

Las moléculas de ADN circular covalentemente cerradas, como los plásmidos, suelen

encontrarse en una conformación superenrollada dentro de las células. Esta es una forma muy

compacta que se da por enrollamiento de la doble hélice sobre sí misma. Al ser el estado natural

dentro de la célula, es la forma mayoritaria que se espera encontrar luego de una extracción. Sin

embargo, la manipulación durante el proceso de extracción puede llevar a roturas de enlaces

fosfodiéster que darán lugar a otras conformaciones. Así, la conformación circular relajada

aparece por la ruptura del enlace fosfodiéster de una sola de las dos hebras del ADN. Esto permite

un relajamiento total de la tensión topológica y, en consecuencia, la pérdida total del

superenrollamiento. Si la rotura del enlace ocurre en ambas hebras, el ADN circular pasa a una

conformación lineal. La linealización también se da cuando el ADN circular se digiere con una

enzima de restricción (ver más adelante).

Las distintas conformaciones de un mismo ADN circular tienen la particularidad de

migrar distinto en una electroforesis (Figura 6). Así, la conformación superenrollada migra una

mayor distancia en el gel que la forma lineal debido a su estado compacto. Por el contrario, la

forma circular relajada se retrasa en el gel respecto de la lineal. Por lo tanto, moléculas de ADN

de igual tamaño e idéntica secuencia nucleotídica migran en una electroforesis con diferente

velocidad en función de su conformación.

Figura 5. Estimación del tamaño de fragmentos lineales de ADN


1.5. Enzimas de restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas que forman parte del sistema de restricción-

modificación de bacterias y fueron una de las primeras herramientas que permitieron empezar a

manipular el ADN. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de

doble cadena de 4 a 8 pares de bases y cortan las dos hebras en un sitio específico. Estas secuencias

son siempre palindrómicas, es decir que la secuencia de nucleótidos es la misma al leerla en el

mismo sentido en ambas hebras.

Según la enzima, se pueden generar dos tipos de extremos en el ADN: cohesivos o romos.

Por ejemplo, la enzima BamHI, extraída de la bacteria Bacillus amyloliquefaciens H, reconoce la

secuencia:

5’GGATCC3’

3’CCTAGG5’

e hidroliza el enlace fosfodiéster en sitios específicos, produciendo así los siguientes fragmentos

de ADN con extremos 5’ salientes cohesivos:

5’G3’ 5’GATCC3’

3’CCTAG5’ 3’G5’

Estos extremos pueden aparearse con cualquier otro extremo complementario.

Fragmentos de cualquier ADN que hayan sido digeridos con la misma enzima de restricción

podrán unirse por los extremos, por apareamiento de bases complementarias. De esta manera, si

se digiere el inserto y el plásmido con la misma enzima se obtienen extremos cohesivos,

complementarios, lo que facilita el clonado del inserto en el plásmido (Figura 5).

En cambio, la enzima EcoRV, extraída de Escherichia coli, reconoce la secuencia

mostrada a continuación y genera extremos romos. Este tipo de enzimas son usadas menos

frecuentemente en experimentos de clonado.

5’GATATC3’

3’CTATAG5’

5’GAT3’ 5’ATC3’

3’CTA5’ 3’TAG5’

Figura 6. Principales conformaciones del ADN plasmídico que pueden llegar a visualizarse luego de una corrida

electroforética en gel de agarosa


Para unir dos fragmentos de ADN y formar el enlace fosfodiéster se utiliza una enzima

llamada ADN ligasa.

1.5.1. Mapas de restricción

Un mapa de restricción es una representación del ADN que muestra la ubicación de los

sitios de corte para distintas enzimas de restricción. Estos sitios constituyen puntos de referencia

sobre la secuencia. Los mapas de restricción son característicos de la secuencia nucleotídica del

ADN y permiten elegir las enzimas adecuadas para clonar un inserto en el mismo. En el práctico

se trabajará con dos plásmidos cuyos mapas de restricción se muestran en la Figura 8.

Figura 7. Esquema simplificado de la primera etapa del clonado de un gen. A: digestión del ADN que contiene el gen

de interés con la enzima EcoRI que genera extremos cohesivos y que permite recuperar la secuencia completa del gen

como un fragmento independiente. B: linealización del plásmido vector por digestión con EcoRI. C: ligación del plásmido con el inserto conteniendo el gen de interés haciendo uso de la enzima ADN ligasa. De esta forma se obtiene

el vector recombinante que contiene el gen de interés. Una etapa final no mostrada implica introducir este vector

recombinante en una bacteria hospedera que lo replique.

Figura 8. Mapa de restricción de los plásmidos pACYC184 y pBR322.


2. OBJETIVOS

1. Extraer ADN plasmídico de un cultivo bacteriano por el método de la lisis alcalina

2. Estimar la concentración y pureza del ADN extraído por espectrofotometría

3. Analizar su calidad por electroforesis en gel de agarosa

4. Analizar el perfil de fragmentos de ADN generados a partir del plásmido digerido con

enzimas de restricción

3. REACTIVOS

3.1. Extracción de ADN plasmídico - Medio de cultivo LB [Triptona 1% (w/v); NaCl 1% (w/v); Extracto de levadura 0,5% (w/v)] - Isopropanol 100% - Etanol 70% (v/v) - ARNasa A [Stock 100x] = 10mg/mL - Solución I [Tris-HCl 25 mM; EDTA 10 mM pH 8.0] - Solución II [NaOH 0.2 N; SDS 1% (w/v)] - Solución III [Acetato de potasio 3 M; Ácido acético glacial 11.5% (v/v)] 3.2. Electroforesis en gel de agarosa - Agarosa - Colorante Gel Red (Biotium) [Stock: 10.000x; Concentración final de trabajo: 3x] - Tampón de corrida TAE 50 X [Tris-Base2 M; Ácido acético glacial5.71% (v/v); EDTA 50 mM;

pH 8,0] - Tampón de carga 6X [xilencianol 0.25% (w/v); azul de bromofenol 0.25% (w/v); glicerol 30%

(v/v)] - Marcador de Peso Molecular

- Extracción de ADN genómico de Escherichia coli

- Solución conteniendo el plásmido problema digerido con EcoRI

- Solución conteniendo el plásmido problema digerido con EcoRI + SphI


Cultivo de Escherichia coli en medio LB

Material volumétrico

Centrífuga de mesada y centrífuga refrigerada

Vórtex

Nanodrop

Termoblock o baño de agua

Balanza

Agarosa

Horno microondas

Cuba de electroforesis horizontal para geles de agarosa

Fuente de poder

Transiluminador UV

Equipo de protección personal como guantes de látex y lentes

5. PRECAUCIONES

Si bien el agente intercalante utilizado (GelRed) es considerado de baja toxicidad, se

recomienda de todas formas el uso de guantes para la manipulación.


6. PROCEDIMIENTO

1. Extracción de ADN plasmídico de un cultivo bacteriano a miniescala (minipreparación) por

el método de lisis alcalina


2. Estimación de la concentración y la pureza del ADN extraído por espectrofotometría


3. Visualización del ADN plasmídico mediante electroforesis en gel de agarosa

.

CARTILLAS DE LABORATORIO - eva.fcien.udelar.edu.uy

Documents

Transcript of CARTILLAS DE LABORATORIO - eva.fcien.udelar.edu.uy