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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA INFORMES DE LABORATORIO Nombre Licenciatura Grupo

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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

INFORMES DE LABORATORIO

Nombre

Licenciatura

Grupo

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. OBJETIVOS ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2.1 Seguridad en el laboratorio

Describa las precauciones que debe tomar para preparar las soluciones de los siguientes productos químicos: Seroalbúmina bovina ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Hidróxido de sodio …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2.2 Material volumétrico y equipos del laboratorio

2.2.1 Describa qué material volumétrico utilizaría para tomar los siguientes volúmenes

Volumen (mL) Pipeta u otro material volumétrico

100,0 ± 0,1

5,0 ± 0,1

0,500 ± 0,004

0,250 ± 0,004

0,085 ± 0,001

0,0020 ± 0,0005

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

2.3 Espectro de absorción UV de la BSA

2.3.1 Complete la tabla con los valores de absorbancia medidos.

λ (nm) A

230

240

250 260

270

280

290

300

310

320

2.3.2 Grafique el espectro de absorción UV.

2.3.3 Indique cuáles son las λmáximas que observa en el espectro. ¿Con cuáles cromóforos presentes

en las proteínas se relacionan cada uno de estos máximos?

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

2.4 Coeficiente de extinción molar a 280 nm de la BSA

2.4.1 Preparación de soluciones de BSA a de diferente concentración. Complete el siguiente cuadro de acuerdo a la información del esquema de preparación de las soluciones B a H (Sección 4.4 de la Cartilla de Práctico)

Solución Factor de Dilución Concentración (M)1

B

C

D

E

F

G

H 1concentración molar final de las soluciones de BSA teniendo en cuenta que la masa molecular es de 66.400 Da.

2.4.2 Complete el siguiente cuadro con las medidas de absorbancia a 280 nm de las muestras B, C, D, E, F, G, H.

Tubo Concentración (M) A280 nm

Medida 1 Medida 2 Valor promedio

B

C

D E

F

G

H

2.4.3 ¿Cuál es el tubo que tiene la solución más diluida?, ¿y la más concentrada? Exprese dichas concentraciones en mM, μM y nM.

Solución Tubo Concentración

(M) Concentración

(mM) Concentración

(μM) Concentración

(nM)

más diluida

más concentrada

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

2.4.4 Grafique la A280 nm en función de la concentración (M) de las soluciones de BSA.

2.4.5 Calcule el coeficiente de extinción molar a 280 nm de la BSA.

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

3. CONCLUSIÓN

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INFORME 1

PRÁCTICO DE BIOQUIMÍCA

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EN EL LABORATORIO

4. EJERCICIOS (NO OBLIGATORIOS)

8.1. Obtenga en el sitio internet de sigma la ficha técnica, de seguridad (Material Safety Data Sheet o MSDS), y el certificado de análisis de la Acrilamida A8887 (SIGMA) teniendo en cuenta que el número de lote es BCBD3922V. ¿Qué precaución tendría al preparar una solución de acrilamida? Justifique.

8.2. ¿Cuántos gramos de NaOH se necesitan para preparar 400 ml de solución 0,6 mol/litro? Determínelos siguiendo los pasos indicados abajo.

Paso 1: Investigar en la tabla periódica la masa atómica de los componentes del NaOH.

Na= O= H=

Paso 2: Con dichos datos calcule la Masa Molecular del NaOH

Paso 3: Cálculo de la Masa de NaOH en 1.000 ml (1L) de solución a 0,6 mol/L

Paso 4: Masa contenida en los 400 ml de NaOH

(B) Una vez obtenido este valor lo que debe hacerse en el laboratorio es pesar ………..g de NaOH y disolverlo en aproximadamente ……..ml de agua y luego enrasar el matraz colocando agua hasta que llegue a ………ml. De esta forma se obtendrá una solución de NaOH ……... Molar.

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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

INFORME 2

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

1. OBJETIVO

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………….....................................................................

............................................................................................................................................

............................................................................................................................................

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.1 Complete el siguiente esquema con los resultados esperados:

Fo: Clara de huevo diluída en

buffer pH…………

FRACCIÓN

Fo

CM-Sephadex

FRACCIÓN NO RETENIDA O PERCOLADO (F1)

Carga neta: ............. Composición esperada: ..................................................................................................................................

FRACCIÓN RETENIDA

Carga neta: ............. Composición esperada: ........................................................................................................................................................

CM Sephadex: Intercambiador:…………………………. Equilibrada en buffer pH: …………….

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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

INFORME 2

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

2.2 Complete el siguiente cuadro de purificación:

Muestra Volumen

1 (mL) FD2

A280

nm3

Concentración

de proteína4

(mg/mL)

Proteína total5

(mg totales)

Porcentaje de

recuperación

(%)

F0 100%

F1

Lavado 1

Lavado 2

Lavado 3

Lavado 4

Eluido 1

Eluido 2

Eluido 3

Eluido 4

Eluido 5

1 volumen total de la muestra 2 FD= factor de dilución necesario para poder medir la absorbancia. 3 correspondiente a cada muestra diluida 4 en la muestra original sin diluir (tenga en cuenta el factor de dilución) y considere 𝐴280𝑛𝑚 =

1 equivalente a una concentración de proteínas igual a 1 mg/mL debido a la abundancia natural de los

residuos aromáticos en las proteínas. 5 tenga en cuenta el volumen total de la muestra original

2.2.1 Teniendo en cuenta los porcentajes de recuperación de proteína en F1, en los

lavados y en las eluciones, determine si recuperó la proteína total inicialmente ofrecida

(F0) al intercambiador. ¿Este resultado es el que esperaba?

2.2.2 ¿Qué porcentaje de la proteína ofrecida se unió al intercambiador? ¿Este

resultado es el que esperaba?

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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

INFORME 2

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

2.3 Dibuje el cromatograma de elución (A280nm vs. tubo de elución o volumen de

elución). No olvide rotular los ejes.

2.3.1 Indique cuántos picos obtuvo y a qué piensa que corresponden.

2.3.2 Indique el volumen de elución de los picos obtenidos.

2.3.3 ¿Podría afirmar que logró separar a la lisozima del resto de las proteínas de la

clara de huevo? Explique

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PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

INFORME 2

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

3. CONCLUSIÓN

Indicar directamente si el objetivo del práctico fue logrado. Describir el o los resultados

que demostraron el cumplimiento o no del objetivo.

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INFORME 3

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. OBJETIVOS

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.1. Actividad lisozima de las muestras

2.1.1 Realice los Gráficos de D.O 450 nm vs tiempo (minutos) en la computadora y complete la

siguiente tabla con los resultados obtenidos para sus muestras:

Muestra ΔDO/min ΔDO/min ΔDO/min Promedio1

ΔDO/min

F0

F1

EA

C-

C+

1Sólo promedie las pendientes negativas, es decir aquéllas donde se detectó actividad lisozima.

2.1.2 ¿Por qué se considera que hay lisozima activa en la muestra cuando la pendiente del gráfico

de densidad óptica versus tiempo es negativa?

2.1.3 ¿Considera necesario el uso de controles en este o en cualquier experimento? Justifique.

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INFORME 3

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

2.2.3 Realice los cálculos necesarios y complete la siguiente tabla:

Muestra ΔDO/min promedio Actividad1 (U) Actividad/mL2 (U/mL)

F0

F1

EA 1Unidades de enzima presentes en el volumen de muestra utilizado para el ensayo de actividad lisozima; 2Unidades de enzima presentes en cada mL de muestra; 3Volumen total de cada muestra; 4cantidad total de unidades de enzima en cada muestra.

1 Unidad (U) se define como la cantidad de enzima que produce una disminución en la turbidez a λ 450 nm de 0,001 unidades en 1 minuto, en las condiciones definidas del ensayo. 2.2.3 ¿En qué muestra/s detectó lisozima activa y en cuál/es no? ¿Coincide con los resultados que

esperaba? Justifique.

2.2.4 Compare la concentración de lisozima activa (U/mL) de la clara de huevo (Fo) y de la fracción

de lisozima purificada. ¿Esta medida le permite evaluar si la lisozima fue purificada?

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INFORME 3

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

2.2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

2.2.1 Complete la tabla con los valores de las lecturas de absorbancia de las soluciones de estándar:

Concentración de

estándar (mg/mL)

Absorbancia a 595 nm

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Promedio Promedio

menos el blanco

Blanco

2.2.2 Complete la tabla con los valores de las lecturas de absorbancia de las muestras:

Muestra

Absorbancia a 595 nm

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Promedio Promedio

menos el blanco

F0

F1

EA

Blanco

2.2.3 ¿Por qué es necesario preparar un Blanco?

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INFORME 3

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

2.2.4. Curva de calibración de Bradford. Dibuje los ejes y grafique los valores de absorbancia a 595

nm promedio en función de la concentración de proteína estándar.

2.2.5 Considerando que la curva de calibración de Bradford ajusta a una recta (y=ax+b) calcule la

pendiente (a) y la ordenada en el origen (b). Escriba la fórmula considerando el valor de estos

parámetros

2.2.6. Indique cuál es el rango lineal de su curva de calibración

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INFORME 3

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LISOZIMA Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

2.2.7 Explique qué haría para determinar la concentración proteica de una muestra problema si:

a) el valor de Absorbancia promedio de la muestra problema se encuentra por fuera del rango

superior de la curva de calibración

b) si el valor de Absorbancia promedio de la muestra problema se encontrara por debajo del rango

inferior de la curva

2.3.8. Calcule la concentración de proteínas de las muestras utilizando la curva de calibración y

complete la tabla:

Muestra Dilución

Concentración

proteica de la

muestra diluida

(mg/mL)

Factor

de

dilución

Concentración proteica de la

muestra teniendo en cuenta el

factor de dilución

(mg/mL)

F0

F1

EA

3. CONCLUSIÓN

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INFORME 4 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA PUREZA Y ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

1. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.1 ACTIVIDAD ESPECÍFICA

2.1.1 Realice los cálculos necesarios y complete el cuadro de purificación:

Muestra

Actividad por cada mL de

muestra 1

(U/mL)

Volumen 1

(mL)

Actividad

total

(U)

Concentración

proteica 1

(mg/mL)

Actividad

Específica (U/mg)

Factor de

purificación

Rendimiento 1

(%)

F0 1 100

F1

-----------

------

EA

C+

1 Complete con los valores determinados en el práctico 3

2.1.2 Si el proceso de purificación realizado fue exitoso, ¿cuál de las muestras (Fo, F1 o EA) tendrá mayor actividad específica? Justifique.

2.1.3 ¿Para qué es necesario calcular la actividad total de las muestras? ¿Y el rendimiento?

2.1.4 ¿Qué porcentaje de lisozima activa recuperó luego de la purificación por intercambio iónico? ¿Coincide con los resultados que esperaba? Justifique.

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INFORME 4 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA PUREZA Y ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

2.1.5 Compare la actividad específica de su fracción de lisozima purificada por intercambio iónico con la de la lisozima purificada de origen comercial. 2.1.6 De acuerdo a la composición proteica de la clara de huevo, que otro paso de purificación o que modificaciones le haría al protocolo para mejorar el rendimiento y el factor de purificación.

2.1.7 ¿Los resultados que tiene hasta el momento le permiten evaluar la presencia de otras proteínas contaminantes en su muestra de lisozima?

2.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)

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INFORME 4 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA PUREZA Y ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

2.2.1 Preparación de las muestras

Calcule el volumen de muestra y agua, requeridos en cada caso siguiendo la Tabla. Además, calcule el buffer de muestra (4x) que debe agregar para que el mismo quede a concentración 1x en el volumen total a cargar.

Muestra

Concentración de proteínas

(mg/ml)1

Masa de proteína

(μg) a cargar en

el gel

Volumen de muestra

(µL)

Volumen de H2O 2

(µL)

Volumen de buffer

de muestra (4X)

Volumen total a cargar

(μL)

F0 30 20

F1 30 20

EA 10 20

Enzima comercial

10 20

1 Complete con los valores determinados para sus muestras en el práctico 3 2 A agregar si fuese necesario

2.1.2 ¿Qué pasaría si carga mucha proteína en el gel? ¿Y si carga muy poca cantidad?

3. CONCLUSIONES

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INFORME 5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

1. OBJETIVOS

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

…………………...........................................................................................................................................

2. RESULTADOS

2.1 Complete el esquema de del gel con los resultados obtenidos para todos los grupos. Indique qué muestra

se aplicó en cada carril y complete la referencia de los polos (negativo y positivo).

2.2 Explique cómo ubicó la banda correspondiente a la lisozima.

2.3 Compare la composición proteica de Fo, F1 y EA, así como las fracciones EA de los diferentes

grupos. Indique si los resultados fueron los esperados.

2.4 ¿Observa la presencia de alguna proteína contaminante en su muestra de lisozima? ¿Podría

estimar su masa molecular aparente?

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INFORME 5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

2.5 ¿Si la lisozima estuviese contaminada con otra proteína que tiene la misma masa molecular

podría evaluarlo por SDS-PAGE? Justifique.

2.6 ¿De acuerdo a los resultados obtenidos considera necesario agregar otro paso al protocolo de

purificación de la lisozima? Justifique su respuesta y en caso afirmativo proponga la técnica

que utilizaría.

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INFORME 5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

3 Principio de separación de la Cromatografía de gel filtración

3.1 Complete el siguiente texto de acuerdo a los resultados que obtuvo en la separación la mezcla de

colorantes realizada en columna PD-10 con matriz Sephadex G-25.

(i) El componente que eluyó en los 3,5 mL es _________________. Es el compuesto que tiene _____________

masa molecular.

(ii) El segundo componente en salir es _____________________, de masa molecular __________.

(iii) Determine el factor de dilución del Azul Dextrano: _______

3.2 Indique en qué fracción piensa que eluirían las proteínas y en cuál las sales si hubiera aplicado la muestra

EA (de la práctica de intercambio iónico) a esta columna de Sephadex G-25 (rango de fraccionamiento 1000 a

5000 Da) equilibrada en buffer PBS.

Las proteínas de EA eluirían en _____________________ porque _____________________________.

Las sales presentes en EA eluirían en _____________________ porque ________________________.

3.3 Realice un esquema del perfil de elución o cromatograma que piensa que obtendría si aplicara

su muestra EA a una columna de Sephadex G-75 (rango de fraccionamiento 3000 a 70000 Da)

equilibrada en buffer PBS.

3.4 ¿Cuáles son las principales similitudes y diferencias entre la cromatografía de gel filtración y la

electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)?

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INFORME 5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

3.5 Ejercicio

(a) Teniendo en cuenta que la enzima comercial está pura, ¿a qué piensa puede corresponder el pico

1 en el cromatograma de la Fig 1.?.

(b) Si usted realizara una cromatografía, en las mismas condiciones, utilizando su Ea, ¿Esperaría

observar un perfil cromatográfico similar al de la Lizozima comerical? Justifique.

Figura 1. Se realizaron 4 cromatografías: (i) una luego de aplicar 1 mL de Azul Dextrano a 2 mg/mL, se detectó la Abs a 620 nm a la salida de la columna para detectarlo, (ii) luego de finalizada la corrida cromatográfica (es decir al pasar al menos 60 mL de fase móvil) se aplicó a la columna 1 mL de naranja de Metilo a 0.1 mg/ml y se detectó la Abs a 490 nm para detectarlo, (iii) posteriormente se aplicó 1 mL de Lisozima comercial pura y se detectó la misma siguiendo la Abs a 280 nm, (iv) finalmente se aplicó 1 ml de la tirosin-fosfatasa bacteriana a 2 mg/ml y se siguió la Abs a 280 nm. El gráfico muestra las UAbs obtenidas en función del volumen de elución. El flujo de la columna fue del orden de 1ml/min, y el Vt de la columna es de 60 mL.

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INFORME 5

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

(c) Ahora imagine que se colectaron las fracciones correspondientes a dichos picos.

(c1) ¿Cómo determinaría usted a cuál de ellos corresponde la lisozima?

(c2) ¿Qué ensayos podría realizar para determinar su pureza?

(c3) ¿Sería correcto ahora asumir que la enzima está pura?. Justifique

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ANÁLISIS ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

GEL FILTRACIÓN

4. CONCLUSIÓN

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INFORME 6 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ÁCIDOS NUCLEICOS

1. OBJETIVOS

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

2. RESULTADOS

2.1. Cuantificación de la preparación de ADN plasmídico

2.1.1. Complete la siguiente tabla:

A260 nm1

Concentración AN (μg/mL)

Concentración AN (μg/μL)

Considerando que todo es ADN

Considerando que todo es ARN

1Considerar el factor de dilución de la muestra

2.1.2. Calcule el coeficiente de pureza de ADN A260/A280 ________________

2.1.3. En base a este resultado de A260/A280, ¿qué puede decir sobre la pureza de su preparación de ADN respecto de proteínas? ¿Y respecto del ARN y del ADN cromosómico? Justifique su respuesta.

2.2. Electroforesis en gel de agarosa

2.2.1. ¿Por qué migran los ácidos nucleicos en una electroforesis?

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INFORME 6 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ÁCIDOS NUCLEICOS

2.2.2. A partir de los mapas de restricción de los plásmidos pACYC184 y pBR322, complete la siguiente tabla suponiendo que se realizan digestiones con las enzimas de restricción planteadas (tener en cuenta que algunas enzimas pueden tener más de un sitio de corte).

Plásmido Tamaño de fragmento(s) esperado(s)

luego de una digestión con EcoRI Tamaño de fragmento(s) esperado(s) luego

de una doble digestión con EcoRI y SphI

pACYC184

pBR322

2.2.3. En clase se le dio un cultivo de la bacteria Escherichia coli que posee uno de estos plásmidos para realizar una extracción del mismo. Utilizando su preparación de ADN plasmídico y contando con las herramientas vistas en clase, ¿cómo haría experimentalmente para distinguir de cuál de los dos plásmidos se trata?

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INFORME 6 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ÁCIDOS NUCLEICOS

2.2.4. Complete la siguiente figura dibujando el patrón de migración de las bandas esperadas para: MPM: marcador de peso molecular; 1. ADN genómico; 2. Plásmido pACYC184 sin digerir; 3. Plásmido pACYC184 digerido con EcoRI; 4. Plásmido pACYC184 digerido con EcoRI y SphI; 5. Plásmido pBR322 sin digerir; 6. Plásmido pBR322 digerido con EcoRI; 7. Plásmido pBR322 digerido con EcoRI y SphI.

2.2.5 Resultados observados. Realice aquí un esquema del resultado de la electroforesis (incluyendo la muestra de todos los subgrupos). Indique qué se sembró en cada carril.

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INFORME 6 PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA

ÁCIDOS NUCLEICOS

2.2.6. ¿Qué puede decir de la calidad y pureza de las extracciones de ADN plasmídico que se realizaron en el práctico a partir de los resultados de la electroforesis? ¿Qué conformaciones del plásmido se observan?

2.2.7. ¿Cuál de los dos plásmidos (pACYC184 o pBR322) resultó ser su plásmido problema? Justifique.

3. CONCLUSIÓN

Indicar si se cumplieron los objetivos del práctico, discutiendo los resultados que demostraron el cumplimiento o no de cada objetivo.