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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT

11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Caracterización de las células progenitoras neuronales del epitelio

olfatorio humano

Giovana Sherlyn Claudio Galeana (Becario)

Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro

Programa de Verano Delfín

[email protected]

Área en la que participa: III Medicina y Salud

Dr. Marco Antonio Meraz Ríos (Asesor)

Profesor-Investigador del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (IPN)

[email protected]

MC. Laura Gómez Virgilio (Co-asesor)

Estudiante de doctorado del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (IPN)

[email protected]

Resumen Desde el descubrimiento de la neurogénesis adulta por Joseph Altman en 1965 y de la neurogénesis en el epitelio

olfatorio por Granziadei en 1978, las células progenitoras del epitelio olfatorio han tenido una gran relevancia en el

estudio de las enfermedades neurodegenerativas; aumentando el interés desde el descubrimiento de una asociación

entre la pérdida de la detección de olores y enfermedades como Alzheimer y Parkinson. Sin embargo, existen

cambios que están relacionados al proceso degenerativo dado por la edad, más que por alguna patología. Es por ello

que en el presente estudio se llevó a cabo la caracterización de estas células, encontrando que existe una diferencia

en la proliferación y expresión de algunas proteínas asociadas a neurogénesis con respecto a la edad de diferentes

donantes. Se utilizaron muestras de siete pacientes de entre 28 y 46 años, encontrando que el tiempo de duplicación

varía entre los grupos de edades además de que, en el grupo de edad de 40 años, hay una disminución considerable

en la tasa de proliferación de las células en comparación con el grupo de 20 y 30 años; además de esto, se encontró

que en este grupo existe una disminución en la expresión de nestina y un aumento en la expresión de β3-tubulina, lo

cual sugiere que éstas se encuentran más comprometidas con un linaje neuronal. Estos resultados podrán determinar

el proceso neurogénico presente en un estrato de la población y validar el análisis de posteriores muestras de

pacientes con patologías asociadas a modificaciones en este proceso.

Palabras Clave: Neurogénesis, Epitelio Olfatorio, células progenitoras, proliferación, marcadores neurogénicos.

Abstract Since the discovery of adult neurogenesis by Joseph Altman in 1965 and neurogenesis in the olfactory epithelium by

Granziadei in 1978, progenitor cells of the olfactory epithelium have had great importance in the study of

neurodegenerative diseases; increasing interest since the discovery of an association between loss of odor detection

and diseases like Alzheimer and Parkinson. However, there are changes that are related to degenerative process

given age, rather than by disease. That is why the present study was conducted to characterize these cells, finding

that there is a difference in the proliferation and expression of some proteins associated neurogenesis regarding the

age of different donors. samples from seven patients aged 28 to 46 years were used, finding that the doubling time

varies between age groups besides there is a considerable decrease in the age group of 40 years in the rate of cell

proliferation compared the group of 20 and 30 years; besides this, it was found that in this group there is a decrease

in nestin expression and increased expression of β3-tubulin, suggesting that these are more engaged with a neuronal

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación


lineage. These results may determine the neurogenic process in a stratum of the population and further validate the

analysis of samples from patients with diseases associated with changes in this process.

Keywords: Neurogenesis, Olfactory Epithelium, progenitor cells, proliferation, neurogenic markers.

Introducción

Hasta el siglo pasado el dogma de la neurogénesis establecía que las neuronas eran incapaces de

regenerarse en etapa adulta, es decir, se pensaba que dicho proceso se presentaba solamente

durante la etapa embrionaria. En el año de 1965 Joseph Altman demostró la existencia de zonas

en el cerebro adulto en donde persiste la neurogénesis, específicamente la zona subventricular

(ZSV) de los ventrículos laterales y la zona subgranular (ZSG) del giro dentado del hipocampo

(Altman, 1965). En ambas regiones o nichos neurogénicos las células capaces de autorrenovarse

y dar origen a las diferentes estirpes propias del cerebro (neuronas, astrocitos y oligodendrocitos)

reciben el nombre de células precursoras neurales, cuyo proceso neurogénico implica las etapas

de proliferación, migración, diferenciación e integración a los circuitos neuronales existentes. La

manera de determinar el estadio en el que estas células se encuentran se basa en la ausencia o

presencia de algunas proteínas características de cada etapa, las cuales son proteínas asociadas a

citoesqueleto o factores de transcripción. El proceso de neurogénesis implica el desplazamiento

de la célula precursora en un estadio inmaduro hacia la zona en donde se buscará integrar. Para el

caso de la ZSG, las células migran hacia la zona granular del hipocampo y maduran finalmente

en neuronas granulares. Por otro lado, desde la ZSV las células precursoras migran a través de la

vía rostral migratoria (RM) hacia el bulbo olfatorio dando lugar a las células periglomerulares,

también llamadas células mitrales. Las células mitrales en el sistema olfatorio hacen sinapsis con

las neuronas sensoriales olfatorias en estructuras llamadas glomérulos (M, Gaggiano; J, Kauer;

D, Hunter, 1994)

En el epitelio olfatorio, las neuronas sensoriales olfatorias están en contacto directo con el

ambiente y los patógenos o sustancias tóxicas de éste. Estas neuronas viven entre 30-69 días y

son continuamente reemplazadas con células multipotenciales localizadas en la región basal del

epitelio (Calof & Chikaraishi 1989; Caggiano et al., 1994). Estas últimas pueden proliferar,

diferenciarse y además tienen la capacidad de reconstituir por completo el epitelio olfatorio

(Granziadei & Monti-Graziadei, 1978). Debido a lo anterior, a la región del epitelio olfatorio se

le denomina la tercera región neurogénica extracraneal, ya que no forma parte del sistema

nervioso central, aunque si del periférico y se encuentra íntimamente relacionada con nuevas

neuronas provenientes de la zona subventricular, es decir, el bulbo olfatorio.

Dada la accesibilidad de la región olfatoria con respecto a la craneal, estas células

representan un prometedor modelo de estudio de enfermedades neurodegenerativas; desórdenes

neurodegenerativos como Alzheimer y Parkinson han sido asociados con una deficiencia en la

identificación de olores. Las evidencias clínicas y patológicas sugieren que la deficiencia en la

detección de olores podría facilitar la detección temprana de patologías (Ruan Y., et al., 2012;

Hawkins & Pearlson, 2011).

Sin embargo, la pérdida olfatoria es común en la población mayor. De acuerdo con una

investigación, la prevalencia del deterioro del olfato es alta en personas con edad avanzada y

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

aumenta conforme a la edad (Murphy et al., 2002); aunque este tipo de procesos

neurodegenerativos asociados a la edad pueden tener varios mecanismos involucrados. En un

modelo murino se han demostrado cambios en la proliferación de las células progenitoras del

epitelio olfatorio que están relacionados al proceso degenerativo dado por la edad, más que por

alguna patología; sin embargo, estudios similares no se han llevado a cabo en humanos (Weiler

E. & Farbman A., 1997).

Dada la necesidad de entender si existen alteraciones en el epitelio olfatorio relacionadas

a la edad más que al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas, en este proyecto de

investigación, se buscó caracterizar a las células progenitoras neuronales, determinando si existe

una diferencia en la proliferación y expresión de algunas proteínas asociadas a neurogénesis con

respecto a la edad de diferentes donantes. El objetivo de dicha comparación es determinar el

proceso neurogénico presente en un estrato de la población y validar el análisis de posteriores

muestras de pacientes con patologías asociadas a modificaciones en el proceso neurogénico.

Metodología

Diseño experimental. Este estudio fue aprobado por el comité de ética del CINVESTAV en la

Ciudad de México. Todos los procedimientos se llevaron a cabo después de obtener por escrito

un consentimiento informado que incluía el permiso para cultivar y analizar las muestras de

epitelio olfatorio de los donantes. Las muestras se obtuvieron de siete donantes de entre 28 y 46

años; sus

características se muestran en la Tabla I.

Obtención de las células progenitoras neuronales del epitelio olfatorio. El protocolo de

obtención de las células se basó en lo reportado por Benítez-King en 2011 con algunas

Donantes Edad Sexo

Donante 1 28 años Femenino

Donante 2 32 años Masculino






Tabla I. Características de los donantes.



modificaciones. Las células se colocaron en un tubo de 50mL con medio DMEM/F12

suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de antibiótico y 2% de glutamina, se disociaron

mecánicamente utilizando una micropipeta automática. Las células disociadas se cultivaron en

placas previamente tratadas con poli-D-lisina para mejorar su adherencia y así permitir su

crecimiento y expansión.

Determinación del tiempo de duplicación de las células progenitoras de epitelio olfatorio

humano. El protocolo de tiempo de duplicación (TD) se basó en lo reportado en el manual de

ATCC Animal Cell Culture Guide, sembrando en placas de 12 pocillos 30,000 células/cm2, por

duplicado, levantando y contando las células con la cámara de Neubauer, como se específica en

el manual señalado previamente, cada 24hrs durante 4 días. Los números de células se graficaron

contra el tiempo, obteniéndose una curva cuya regresión no lineal permitió determinar el TD

experimental. El TD teórico se estableció con la fórmula mostrada en la figura I.

Figura I. Fórmula para calcular tiempo de duplicación. Obtenida del manual de la ATCC Animal Cell Culture Guide.

Ensayo de incorporación y detección de BrdU. El ensayo de incorporación de bromo

deoxiuridina (BrdU) se llevó acabo de acuerdo al protocolo establecido en la hoja técnica de la

casa comercial (Roche, no. de catálogo: 11 296 736 001); con las siguientes modificaciones: se

cultivaron 60,000 células/cm2 en una placa de 96 pocillos y se dejaron creciendo durante 48

horas; la incubación con BrdU se realizó durante dos horas; se fijó con etanol acidificado a -20°C

durante 20 minutos. La incubación con el anticuerpo primario (anti-BrdU, dilución 1:20) y el

anticuerpo secundario (anti-ratón fluoresceinado, dilución 1:20) fue de 1 hora a 37°C para cada

uno. El montaje se realizó con 10µL de medio de montaje fluorogel (Electron Microscopy

Sciences, no. de catálogo: 17985-10)

Inmunocitoquímica. El ensayo de inmunocitoquímica o inmunofluorescencia se llevó a cabo

según el protocolo establecido por Faraz en 2015, con las siguientes modificaciones: se

sembraron 60,000 células/cm2 en una placa de 96 pocillos con cubreobjetos previamente

colocados; se dejaron creciendo durante 24 horas. Las células se fijaron con paraformaldehído al

4% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con PBS 1X pH 7.4 –

Tritón 0.2% por 30 minutos a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpo primario se

realizó a 4°C durante toda la noche. Los núcleos se tiñeron con DAPI a una concentración final

de 10µg/mL por 10 minutos.

TD= T In2/In (Xe/Xb) TD: Tiempo de duplicación.

T: tiempo de duplicación.

Xb: número de células al comienzo de la incubación.

Xe: número de células al final del tiempo de incubación.


Los anticuerpos primarios se utilizaron a las siguientes diluciones: anti-nestina (Genetex,

no. de catálogo GTX30671, 1:500), anti-Ki67 (abcam, no. de catálogo ab66155, 1:500), anti-

GFAP (Dako, no de catálogo Z 0334, 1:1500) y anti-βIII-tubulina (Promega, no. de catálogo

G7121, 1:500).

Los anticuerpos secundarios se utilizaron a las siguientes diluciones: anti-ratón Alexa

594 (Invitrogen, no. de catálogo A11032, 1:500) y anti-conejo Alexa 488 (Invitrogen, no. de

catálogo A11034, 1:500).

Western blot. La técnica de Western blot fue llevada a cabo según el protocolo establecido por

Faraz en 2015, con las siguientes modificaciones: los lisados proteicos fueron separados en un

gel de poliacrilamida al 15% y otro al 8% y transferidos a membranas de nitrocelulosa de 0.2um

(GE Healtcare, no. de catálogo: 10600006). Dichas membranas se bloquearon con leche (BioRad,

no. de catálogo 170-6404) durante una hora y media a temperatura ambiente. La incubación con

los anticuerpos secundarios fue de una hora a temperatura ambiente. Para el análisis

densitrométrico se utilizó el software ImageLab 5.2.1.

Todos los anticuerpos primarios utilizados se diluyeron 1:1000 en leche a una

concentración de 5% y 2ul de azida de sodio por ml de leche para conservarlos después de

usarlos. Los anticuerpos primarios anti-nestina y anti-βIII-tubulina fueron los mismos que se

utilizaron para la inmunocitoquímica; anti PCNA (Millipore, no. de catálogo 05-347) y anti-

actina (sobrenadante de hibridoma donado por el Dr. José Manuel Hernández Hernández,

departamento de Biología Celular, CINVESTAV) sólo se utilizaron para esta técnica.

El anticuerpo secundario utilizado fue el siguiente: anti ratón IgG de cabra conjugado

con peroxidasa de rábano (Jackson Immunoresearch, no. de catálogo 115-035-146, 1:5000).

Resultados

El tiempo de duplicación de las células progenitoras de epitelio olfatorio humano varía de

acuerdo a la edad. Se encontró un tiempo de duplicación variado entre los grupos de edades, la

figura II muestra la curva de crecimiento obtenida experimentalmente de cada una de las edades y

su comparación conjunta. De forma experimental se encontró un tiempo de duplicación de 34.46h

para el donante de 28 años; en el grupo de 30 años se encontró un TD de 38.37 para el de 32

años, 54.92h para el de 36 años y de 112.7h para el de 37 años; por otro lado, en el grupo de 40

años se encontró un TD de 52.12h para el de 42 años, 54.92h para el de 43 años y de 37.48h para

el de 46.



0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

tiempo (horas)

Nú

mero

de célu

las

28 años

32 años

36 años

37 años

42 años

43 años

46 años

Determinación del tiempo de duplicación de las células progenitoras del epitelio olfatorio pertenecientes a todos los donantes

A


0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

28 años

Determinación del tiempo de duplicación de las células progenitoras del epitelio olfatorio perteneciente al donante de 28 años

0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

32 años


E

B

C

D

0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

36 años


0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

37 años




Figura II. Curva de crecimiento y confluencia observada al microscopio de campo claro de las muestras utilizadas en

el estudio. A) Compilado de todas las muestras; B) 28 años; C) 32 años; D) 36 años; E) 37 años; F) 42 años; G) 43

años; H) 46 años. Análisis realizado por medio del software GraphPad Prism 6.

En la tabla II se indican los tiempos de duplicación obtenidos tanto de manera teórica

como experimental. En algunas muestras hay diferencias considerables entre uno y otro valor,

sobre todo en la muestra del donante de 37 años, esto quiere decir que las células particularmente

de este donante se alejan del comportamiento de un crecimiento logarítmico exponencial

indicado en la fórmula utilizada para calcular el tiempo teórico.

0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

25000042 años

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s


0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000


43 años

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s

0 25 50 75 100 125 150

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

25000046 años

tiempo (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s


F

G

H


Tabla II. Tiempo de duplicación obtenido de forma teórica y experimental de cada

muestra.

La tasa de proliferación en células progenitoras de epitelio olfatorio humano varía de

acuerdo a la edad. Como se muestra en la figura III, se encontró que en 28 años, el porcentaje de

células positivas a BrdU es de 16.53%, lo cual no es significativamente diferente a los de la

mayoría del grupo de 30 años con un porcentaje de 14.69% para 36 años y de 18.31% para 37

años; esto a diferencia de 32 años con un porcentaje del 8.65%. Sin embargo, el grupo de 20 años

si tiene diferencia significativa con el grupo de 40 años, donde en 42 años tiene un porcentaje de

BrdU positivas de 7.2%, el de 43 años de 9.66% y de 46 años de 9.61%. Por otro lado, el grupo

de 30 años sí tuvo una diferencia significativa con respecto al grupo de 40 años.

Donantes TD teórico TD experimental

28 años 34.79 34.46

32 años 41.90 38.37

36 años 49.02 54.92

37 años 76.71 112.7

42 años 49.55 52.12

43 años 54.95 54.92

46 años 43.94 37.48

A



Figura III. Ensayo de incorporación y detección de BrdU en células progenitoras neuronales del epitelio olfatorio

humano. A) Imágenes tomadas con un microscopio de epifluorescencia, se muestran los núcleos teñidos con DAPI

en azul y los núcleos positivos a BrdU en verde (flechas). B) Análisis estadístico realizado por medio del software

GraphPad Prism 6. No se obtuvo una diferencia significativa entre el grupo de 20 años y el de 30 años. Por otro lado,

sí se observa una diferencia significativa entre los grupos de 20 y 40 años y los de 30 y 40 años. N = 2, ** p > 0.001.

Las células progenitoras del epitelio olfatorio humano son positivas a algunos marcadores

de neurogénesis. Como se muestra en la figura IV, se encontró una expresión citoplasmática de

nestina. Esta expresión fue muy parecida en todas las muestras, encontrándose ligeramente

aunmentada en la de 20 años con respecto a los demás. Por otro lado, también se encontró una

expresión positiva a Ki67 de forma nuclear en algunas células. En cuanto a β3-tubulina, se

encontró una expresión positiva de forma citoplasmática, encontrandose ligeramente más baja en

las muestras de 28 años con respecto a las demás. Por otro lado, el marcador nuclear GFAP tuvo

una expresión negativa en las muestras procesadas.

Grupo 20

años Grupo 30

años Grupo 40

años

B


A

B



Figura IV. Localización y expresión de proteínas asociadas a neurogénesis en muestras representativas provenientes

de cada grupo de estudio. A) Imágenes de microscopía confocal en donde se muestran en el canal rojo las células

positivas a la proteína nestina, en el canal verde las células positivas a Ki67 y finalmente en el canal azul los núcleos

teñidos con DAPI. B) Imágenes de microscopía confocal en donde se muestran en el canal rojo las células positivas a

la proteína β3-tubulina, en el canal verde las células positivas a GFAP y finalmente en el canal azul los núcleos

teñidos con DAPI. C) De arriba hacia abajo, en la primera línea se muestran imágenes de campo claro de una

muestra representativa de cada grupo de edades. En la segunda y tercera línea se muestran las imágenes de

microscopía confocal del empalme de los marcadores nestina, Ki67 y DAPI, y β3-tubulina, GFAP y DAPI

respectivamente, en el extremo izquierdo, en la segunda línea, se muestra el control de anticuerpos secundarios, es

decir, las células no fueron incubadas con el anticuerpo primario, sino que solamente con los anticuerpos secundarios

y así determinar la especificidad de dichos anticuerpos primarios.

La expresión de las proteínas asociadas a neurogénesis varía de acuerdo a la edad. Se

encontró una expresión de la proteína β3-tubulina variable entre los grupos de edades. Como se

muestra en la figura V, la densitometría fue de 0.45 para el donante de 28 años; 0.85 para el de 32

años; 0.62 para el de 36 años y de 1.08 para el de 37 años; en el grupo de 40 años se encontró una

densitometría de 0.47 para el de 42 años; 0.68 para el de 43 años y de 0.71 para el de 46 años.

En las densitometrías de nestina, se encontró una de 0.16 para el de 28 años; 0.36 para el

de 32 años; 0.82 para el de 36 años y 0.16 para el de 37 años. En el grupo de 40 años se encontró

una de 0.17 para el de 42 años; 0.13 para el de 43 años y de 0.11 para el de 46 años.

C


Figura V. Niveles de expresión de proteínas asociadas a neurogénesis. A) Imágenes de los blots mostrando la

expresión de nestina y β3-tubulina en cada una de las edades. B) Densitometría de la expresión de β3 tubulina de los

tres grupos de edades. Se observa una diferencia significativa entre la mayoría de individuos de los tres grupos. C)

Densitometría de la expresión de nestina de los tres grupos de edades. Se observa una diferencia significativa entre

los grupos de 20 y 30 años, sin embargo, no hay diferencias significativas entre los grupos de 20 y 40 años ni entre

los grupos de 30 y 40 años. N = 2, ** p > 0.001. Análisis realizado por medio del software ImageLab y GraphPad

Prism 6.

Discusión

En el presente estudio se realizó una caracterización de las células progenitoras neuronales,

determinando si existe una diferencia en la proliferación y expresión de algunas proteínas

asociadas a neurogénesis con respecto a la edad de diferentes donantes. Estas células han sido

recientemente utilizadas para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como Parkinson o

Alzheimer dado que su obtención es mediante un raspado, lo cual resulta mucho más accesible

A

B C



que realizar una biopsia de tejido; esto, aunado a las recientes evidencias de una deficiencia en la

detección de olores presente en patologías neurodegenerativas, hacen de este un buen modelo de

estudio (Ruan Y., et al., 2012; Hawkins & Pearlson, 2011).

Se encontró que el tiempo de duplicación de las células provenientes de donadores de

grupos de edades de 20, 30 y 40 años es muy variable, ya que al obtener la curva de crecimiento

se encontraron tiempos de duplicación de entre 34.46 hrs a 112.7 hrs, estos resultados además

variaron aún más al realizar el cálculo de tiempo de duplicación con una fórmula logarítmica.

Esto demuestra que, las células obtenidas por un raspado como este caso, en su mayoría no sigue

un comportamiento logarítmico estándar de duplicación, como se puede observar en las gráficas

de la figura II, a excepción de las muestras de 36 y 46 años que se comportaron de una forma

bastante parecida a la curva logarítimica de crecimiento. Entre los grupos se encontró un tiempo

de duplicación de 34.46 hrs para la muestra de 28 años; en el grupo de 30 años se puede

encontrar que el tiempo de duplicación aumenta de 38.37 hrs a 112.7 hrs según se acercan al

grupo de 40 años; en este último grupo se observa una caída en el tiempo de duplicación en la

edad mayor (46 años) de 37.48 hrs, siendo que las otras dos edades de este grupo tienen un

tiempo de duplicación mayor. Esto nos da indicios de que, a una edad mayor se presentan

cambios a nivel neurogénico que pueden traducirse en modificaciones en la proliferación celular

en el epitelio olfatorio humano. El determinar el tiempo de duplicación dio la pauta para conocer

cuantas horas eran necesarias en promedio para que estas células tuvieran un ciclo celular

completo y así realizar el ensayo de incorporación de BrdU, el cual determina el porcentaje de

células presentes en la fase S del ciclo celular.

En cuanto al ensayo de incorporación y detección de BrdU, se encontró que las células

provenientes del donante de 28 años tuvieron un porcentaje de células positivas a BrdU de

16.53%, esto no tiene una diferencia significativa con el porcentaje de células positivas a BrdU

provenientes de la mayoría de los donantes del grupo de 30 años; sin embargo, tanto el porcentaje

de células positivas a BrdU del donante del grupo de 20 años como los porcentajes de células

positivas a BrdU de los donantes del grupo de 30 años tienen una diferencia significativa con los

porcentajes de células positivas a BrdU provenientes de los donantes del grupo de 40 años; en

este último grupo se puede observar una gran caída en las células que incorporan BrdU, lo cual

sugiere que a partir de esta edad empieza a haber una menor cantidad de células que entran a la

fase S del ciclo celular. Estos resultados resultan complementarios a los obtenidos con el ensayo

de tiempo de duplicación ya que las células BrdU positivas nos dan una muestra de las células

que se encuentran dentro de la fase S del ciclo celular al momento de realizar el ensayo; en

comparación con el ensayo de tiempo de duplicación que nos dice un promedio del tiempo

necesario para que las células realicen una duplicación. Estos resultados podría estar hablando de

que existe una caída en la proliferación dependiente de la edad de las células progenitoras

neuronales del epitelio olfatorio humano; esto en parte se correlaciona con lo encontrado en ratas

ya que también existe un cambio en la proliferación dependiente de la edad (Weiler E. &

Farbman A., 1997); sin embargo, estos cambios comienzan a ser significativos en una etapa

mayor, de 40 años aproximadamente.


En cuanto a la expresión de las proteínas asociadas a neurogénesis, se encontró una

expresión citoplasmática de la proteína nestina, la cual es una proteína del filamento intermedio,

propia de precursores neurales y que resultó ser muy variable en el grupo de 30 años y en el

grupo de los 40 años se observa una tendencia a disminuir según la edad aumenta.

Por otro lado en el caso de la proteína de microtúbulos β3-tubulina, marcador de

progenitoras neuronales, se encontró un caso similar pero de forma contraria al de la nestina ya

que en el grupo de 40 años, mientras mayor es la edad de las personas, la expresión de β3-

tubulina se ve aumentada. Esto significa que las células en este grupo de edad pierden su

característica de precursoras neurales y se encuentras más comprometidas con un linaje neuronal.

Otro dato a tomar en cuenta es que no se encontrarón células positivas a GFAP, la Proteína

Acídica Fibrilar Glial, por sus siglas en inglés, la cual es una proteína que forma los filamentos

intermedios del citoesqueleto y es encontrada en astrocítos, el hecho de dar negativa quiere decir

que estas células no tienen un linaje astrocítico.

Conclusión

En el presente estudio, se determinó el porcentaje de células progenitoras neuronales del epitelio

olfatorio positivas a BrdU y así cuantificar su tasa de proliferación.

Se mostró la expresión y localización de las proteínas Nestina, β3-tubulina, GFAP y

Ki67 en las células progenitoras neuronales del epitelio olfatorio mediante inmunofluorescencia;

además de que se cuantificó la expresión de las proteínas Nestina y β3-tubulina en las células

progenitoras del epitelio olfatorio mediante Western blot.

Las células progenitoras neuronales del epitelio olfatorio se obtuvieron de donantes de

28 a 46 años, encontrando que, con respecto a la proliferación, se encontró una variación

dependiente de la edad; sin embargo, estos resultados deben de ser corroborados utilizando una

mayor cantidad de muestras por cada grupo y aumentando los grupos de edades para poder

comprobar si la tendencia se sigue respetando. Además de esto, resulta necesario incluir en el

grupo muestras provenientes de donadores del sexo femenino dado que todas las células

utilizadas en este estudio fueron provenientes de donadores del sexo masculino, a excepción del

donador de 28 años; esto es importante ya que debe ser comprobado si además de la edad, la

proliferación podría variar de acuerdo al sexo.

Se mostró una tendencia a reducir la expresión del marcador de precursores neurales

nestina y de aumentar el marcador de progenitores neuronales β3-tubulina, esto puede sugerir que

estas células se encuentran en un estado de diferenciación mayor, comprometiendose a un linaje

neuronal, lo cual se podría corroborar con la inducción de diferenciación neuronal y determinar si

pueden generarse mas neuronas en menos tiempo en dichas muestras con respecto a las otras.

Finalmente, los resultados obtenidos permitieron determinar parte del proceso

neurogénico presente en un estrato de la población, en este caso la proliferación celular y el

compromiso neuronal en el cual se encuentran.



Agradecimientos

Primeramente me gustaría agradecer al Dr. Marco Antonio Meraz Ríos por haberme aceptado en

su laboratorio para realizar mi estancia de verano y que con su amplio conocimiento me permitió

adquirir herramientas básicas en la investigación que me ayudarán a formar mi vida profesional.

Me gustaría además agradece sinceramente a mi co-asesora, la M.C. Laura Gómez

Virgilio por su esfuerzo y dedicación, ya que me guió de la mano durante todo este proceso. Su

conocimiento, persistencia y paciencia me ayudaron mucho a adentrarme al mundo de la

investigación, inculcando en mi un sentido de responsabilidad, seriedad y amor al trabajo en el

laboratorio en este periodo tan corto.

Un agradecimiento especial a todo el grupo de trabajo del laboratorio ya que

desinteresadamente me apoyaron en todo momento, resolviendo cada una de mis dudas y

ayudando a resolver los problemas que se me presentaron.

Por último quisiera agradecer a mi familia y amigos por todo el apoyo y paciencia

durante esta estancia, ya que supieron entender mis horarios y estuvieron ahí en mis días difíciles.

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