CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS DE GLP-1 Y SUS … · pulmonar durante la etapa fetal, neonatal y...

CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS DE GLP-1

Y SUS ANÁLOGOS EN LA FUNCIÓN Y

MADURACIÓN PULMONAR.

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR.

MARINA ROMANÍ PÉREZ.

Noviembre 2013.

Departamento de Biología Funcional

y Ciencias de la Salud.

Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud.

CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS DE GLP-1 Y SUS

ANÁLOGOS EN LA FUNCIÓN Y MADURACIÓN PULMONAR.

Memoria para optar al Grado de Doctor.

Presentada por:

Marina Romaní Pérez.

Agradecimientos.Agradecimientos.Agradecimientos.Agradecimientos.

No quisiera concluir este trabajo sin agradecer a todas aquellas personas que me han acompañado en el

camino. Un camino largo y duro pero lleno de grandes momentos que sin duda nunca olvidaré. Como me

recuerda una persona a la que admiro: “Cuando te encuentres de camino a Ítaca, desea que sea largo el

camino, lleno de aventuras, lleno de conocimientos”. Sin duda, ha sido un camino largo, pero lleno de

aventuras y nuevos conocimientos y llegado a este punto, soy consciente de que todo esfuerzo ha

merecido la pena.

En primer lugar, me gustaría expresar mi agradecimiento al Doctor Federico Mallo. Le agradezco el

haberme permitido trabajar en su laboratorio y el haber depositado en mí su total confianza para

desarrollar este trabajo. Sus sugerencias e ideas siempre han llegado a buen puerto.

A Lucas, por su gran apoyo durante estos años, su buen humor, su agradable compañía y sin duda, sus

grandes aportaciones sin las que este trabajo no sería posible. No quisiera olvidarme de su ayuda

técnica que tantas veces me ha salvado y de sus amplios conocimientos que me han dado explicación a

muchas de mis dudas.

Eva, te agradezco el haberme apoyado desde el principio. Juntas iniciamos este trabajo, me diste la

confianza necesaria para despegar y eso siempre te lo agradeceré. Gracias por haberme enseñado tantas

cosas útiles, tanto en el trabajo como en lo personal. Te agradezco todos tus consejos, el haberme

apoyado tanto y el haberme ayudado en el laboratorio hasta horas intempestivas. El no perder nunca la

confianza en mí. Agradezco también tu positivismo y el darme siempre ánimos.

A Verónica, gracias por hacerme reír, por tu apoyo incondicional, por escucharme, por entenderme, por

tu gran ayuda en los experimentos y por compartir conmigo largas jornadas en el laboratorio. Te

agradezco el tranquilizarme en momentos de crisis, siempre con una sonrisa y tus sugerencias siempre

acertadas. Sin duda, has hecho que estos años fueran extraordinarios.

A mis compañeros Juan y Hugo. Agradezco vuestra agradable compañía en las horas del café. Y vuestra

disposición a ayudarme siempre que lo necesité.

A mis compañeros que ya no están y con los que empecé, Mayte, Ángela y Manuel. Gracias por vuestra

ayuda en el laboratorio y acertados consejos.

Gracias al laboratorio de Neurociencia, al que acudía para charlar y pedir consejos técnicos y a las

acertadas aportaciones de Antonio. En especial a Alba, por estar ahí siempre que te necesité.

Empezamos y acabamos juntas. Gracias por entenderme, escucharme y aconsejarme. Por nuestras

charlas interminables y absoluta comprensión.

A Basti por hacer que mis visitas al Cacti fuesen tan agradables y por sus consejos para que mis PCRs

fuesen perfectas. A Rosa por sus sugerencias en el campo de la histología.

A Ana Boente. Te agradezco todos tus consejos que me han ayudado tanto y de los que he tomado buena

nota. Tus agradables visitas siempre han sido momentos divertidos y de relax.

A la Doctora Pilar Santisteban, por haberme recibido en su laboratorio y hacerme sentir como en casa.

A toda la gente que conocí allí y que hizo que mi estancia fuese tan agradable. A Christian por ser un

gran maestro y buena persona, sin duda he aprendido muchísimo gracias a sus enseñanzas en el campo

de la biología molecular.

Hay personas que forman parte de mi vida desde hace años y que me han apoyado durante todo este

largo camino. A aquellas personas que han estado ahí incondicionalmente ofreciéndome ayuda de

manera desinteresada, a todas ellas, gracias.

Mis amigas, con las que he compartido tantas vivencias y buenos momentos durante tantos años y con las

que seguiré compartiendo durante muchos más aunque nos separe la distancia, os agradezco que estéis

ahí siempre que os necesito.

A mis compañeras y grandes amigas de la facultad, por vuestro interés, por escucharme y por los buenos

momentos, gracias.

A mi familia, por cuidarme y por estar siempre a mi lado, gracias. A Gerardo, por inculcarme que los

valores del conocimiento superan toda frontera.

A mis padres, por ser el gran apoyo que tuve y siempre tendré. Porque sois un ejemplo a seguir, porque

vuestros consejos siempre son acertados, porque me habéis enseñado a seguir mi camino y a luchar por

lo que quiero. Gracias por todo lo que me habéis dado. A mi hermana. Aloia, gracias por tu apoyo

inagotable, por aconsejarme tan sabiamente, por escucharme y por preocuparte siempre por mí.

Dedicado a mi familia.

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El efecto insulinotrópico de la hormona incretina GLP-1 (péptido relacionado con el glucagón de

tipo 1) así como su capacidad de mantener la homeostasis de la glucosa ha suscitado gran interés como

agente terapéutico en el tratamiento de la diabetes tipo 2. En la última década, las investigaciones se han

enfocado en el desarrollo de análogos de GLP-1 con una mayor estabilidad en la circulación que el

péptido endógeno como son la Exendina-4 y el Liraglutide.

Además, tanto GLP-1 como sus análogos ejercen otros efectos extra-pancreáticos e

independientes del control de la glucemia como en el sistema cardiovascular y en la fisiología pulmonar,

entre otros.

El propósito de este trabajo fue estudiar los efectos de los análogos de GLP-1 en la función

pulmonar durante la etapa fetal, neonatal y adulta. Haciendo hincapié en la síntesis de los componente del

surfactante pulmonar como sistema clave de la estabilidad alveolar.

Sus acciones como agentes moduladores de la función pulmonar durante la organogénesis

sugieren aplicaciones terapéuticas potenciales de estos péptidos en patologías respiratorias asociadas a

inmadurez pulmonar tras el nacimiento. Asimismo, los efectos de Liraglutide descritos en el sistema

cardiopulmonar independientes del control de la glucemia en un modelo de diabetes en etapa adulta

pueden resultar de gran utilidad para mitigar las deficiencias en la circulación pulmonar asociada a la

diabetes.

Por tanto nuestras investigaciones aportan nuevos conocimientos sobre los efectos de los

análogos de GLP-1 independientes de la homeostasis de la glucosa, los cuales podría tener ciertas

aplicaciones terapéuticas.

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Ínî]_Ínî]_Ínî]_Ínî]_....

Pág. 1. Introducción…………………………………………………………………………………..... 3

1.1. GLP-1……………………………………………………................................................... 3

1.1.1. Síntesis, metabolismo y secreción………………………………………………......... 3

1.1.2. Mecanismos de acción de GLP-1…………………………………………………….. 6

1.1.3. Acciones de GLP-1………………………………………………………………........ 7

1.1.3.1. Acción de GLP-1 en el páncreas endocrino………………………. 7

1.1.3.2. Efectos extra-pancreáticos de GLP-1……………………………... 8

1.2. Agonistas de GLP-1R…………………………………………………………………...... 12

1.2.1. Exendina-4 (Ex4)……………………………………………………………………... 12

1.2.2. Liraglutide……………………………………………………………………………. 13

1.2.3. Efectos biológicos de Ex4 y Liraglutide…………………………………………....... 14

1.2.3.1. Glucorregulación………………………………………………….. 14

1.2.3.2. Efectos independientes de la homeostasis de la glucosa………….. 16

1.3. Fisiología respiratoria……………………………………………………………………. 18

1.3.1. Estructura del sistema respiratorio…………………………………………………… 18

1.3.1.1. Tráquea……………………………………………………………. 18

1.3.1.2. Árbol bronquial…………………………………………………… 19

1.3.1.3. Región respiratoria del sistema respiratorio………………………. 19

1.3.2. Intercambio gaseoso en los pulmones………………………………………………... 20

1.3.3. Perfusión pulmonar…………………………………………………………………... 20

1.3.4. Sistema renina-angiotensina………………………………………………………….. 21

1.3.4.1. Componentes del sistema renina-angiotensina…………………… 21

1.3.4.2. Localización de los componentes del sistema renina-angiotensina

en el pulmón………………………………………………………………

23

1.3.4.3. Alteraciones en el equilibrio del sistema renina-angiotensina……. 24

1.3.5. El epitelio alveolar……………………………………………………………………. 25

1.3.6. Surfactante Pulmonar………………………………………………………………… 26

1.3.6.1. Secreción del surfactante pulmonar………………………………. 28

1.3.6.2. Proteínas surfactantes hidrofílicas: SP-A y SP-D………………… 30

1.3.6.3. Proteínas surfactantes hidrofóbicas: SP-B y SP-C………………... 31

1.3.7. Desarrollo pulmonar………………………………………………………………….. 33

1.3.7.1. Etapas de desarrollo pulmonar……………………………………. 34

1.3.7.2. Factores reguladores de la maduración pulmonar………………… 35

1.3.7.3. Factores de riesgo en el desarrollo de patologías respiratorias…… 40

1.3.7.3.1. En la etapa fetal………………………………………………........ 40

1.3.7.3.2. En la etapa adulta…………………………………………………. 41


Pág.

2. Objetivos……………………………………………………………………………………….. 45

3. Material y Métodos……………………………………………………………………………. 49

3.1. Animales de experimentación…………………………………………………………… 49

3.2. Fármacos y reconstitución……………………………………………………………...... 50

3.3. Diseños experimentales…………………………………………………………………... 51

3.3.1. Caracterización de la expresión del receptor de GLP-1 en pulmón en distintos

periodos de desarrollo…………………………………………………………………

51

3.3.2. Identificación del receptor de GLP-1R en cultivo primario de neumocitos tipo II de

rata adulta……………………………………………………………………………..

52

3.3.3. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa fetal y neonatal. 54

3.3.3.1. Efectos de los análogos de GLP-1 en la síntesis de los

componentes del sistema surfactante en un modelo de desarrollo

pulmonar completo......................................................................................

54

3.3.3.2. Efectos de los análogos de GLP-1 en la función pulmonar en un

modelo de hipoplasia pulmonar inducida por

nitrofen…………………………………………………………………….

56

3.3.3.2.1. Caracterización de los efectos de análogos de GLP-1 en la

maduración pulmonar de fetos de 21 días en un modelo de hipoplasia

pulmonar inducida por nitrofen…………………………...........................

56

3.3.3.2.2. Caracterización de los efectos de Liraglutide en la supervivencia

neonatal en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida por

nitrofen….………………………………………………………………...

58

3.3.3.3. Influencia de la ingesta durante la gestación en el desarrollo del

pulmón………………………………………………………….................

59

3.3.3.3.1. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta en

ratas gestantes.…………………………………………………………..

59

3.3.3.3.2. Modelo de subnutrición durante la gestación………………........... 60

3.3.4. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa adulta: Diabetes y

Obesidad…………………………………………………………………………........

61

3.3.4.1. Modelo de diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina………… 61

3.3.4.2. Modelo de obesidad……………...……………………………….. 63

3.4. Obtención de muestras…………………………………………………………………… 63

3.4.1. Sangre………………………………………………………………………………… 63

3.4.2. Líquido amniótico……………………………………………………………………. 64

3.4.3. Tejidos pulmonar y cardiaco..………………………………………………………... 64


Pág.

3.5. Determinaciones hormonales en suero o plasma (Radioinmunoensayo)…………....... 64

3.6. Determinación de proteínas en líquido amniótico y en tejido mediante ELISA……... 65

3.7. Determinación de glucosa en suero……………………………………………………… 65

3.8. Análisis de los niveles de mRNA………………………………………………………… 65

3.8.1. Extracción de RNA total…………………………………………………………....... 65

3.8.2. Reverso Transcripción………………………………………………………………... 66

3.8.3. PCR semicuantitativa a tiempo final……………………………………………......... 66

3.8.4. PCR a tiempo real…………………………………………………………………….. 68

3.9. Determinación de expresión proteica. (Western-Blot)………………………………..... 69

3.9.1. Lisis celular y extracción de las proteínas totales……………………………………. 69

3.9.2. SDS-PAGE…………………………………………………………………………… 70

3.9.3. Inmunoblotting……………………………………………………………………….. 70

3.10. Ensayos de movilidad electroforética…………………………………………..... 72

3.11. Estudios histológicos……………………………………………………………… 74

3.11.1. Inmunofluroescencia……………………………………………………………….. 74

3.11.2. Tinción hematoxilina-eosina………………………………………………….......... 74

3.11.3. Análisis estadístico…………………………………………………………………. 75

4. Resultados……………………………………………………………………………………… 79

4.1. Caracterización del patrón de expresión de GLP-1R en pulmón en distintas etapas

de desarrollo……………………………………………………………………………….

79

4.2. Localización de GLP-1R en tejido pulmonar………………………………………… 80

4.3. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa fetal y neonatal……. 81

4.3.1. Efectos de los análogos de GLP-1 en la síntesis de los componentes del sistema

surfactante en un modelo de desarrollo pulmonar completo………………….............

82

4.3.1.1. Acción de Ex4 en la síntesis de las proteínas surfactantes SP-A y

SP-B……………………………………………………………………………

82

4.3.1.2. Acción de Liraglutide en la síntesis de las proteínas surfactantes

SP-A y SP-B………………………………………………………………

85

4.3.2. Efectos de los análogos de GLP-1 sobre la función pulmonar en un modelo de

hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen…….……………………………………...

88

4.3.2.1. Caracterización de los efectos de los análogos de GLP-1 sobre la

maduración pulmonar en fetos de 21 con hipoplasia pulmonar inducida

por nitrofen….…………………………………………………………….

89


Pág.

4.3.2.2. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la

supervivencia neonatal en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida

por nitrofen………………………………………………………………..

99

4.3.3. Influencia de la ingesta durante la gestación sobre el desarrollo del

pulmón………………………………………………………………………………

100 4.3.3.1. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta

durante la gestación……………………...………………………………..

101

4.3.3.2. Caracterización del modelo de subnutrición……………………… 103

4.3.3.3. Efecto de las variaciones en el patrón de ingesta durante la

gestación sobre el desarrollo fetal y pulmonar…………………………....

104

4.4. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa adulta: Diabetes y

Obesidad…………………………………………………………………………………

115

4.4.1. Modelo de diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina……………………………. 115

4.4.1.1. Seguimiento del cuadro diabético…………………..…………….. 115

4.4.1.2. Evaluación de anomalías cardiovasculares……………………….. 117

4.4.1.3. Estudio del sistema renina-angiotensina en el pulmón…………… 119

4.4.1.4. Análisis de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B………………. 122

4.4.1.5. Análisis de expresión de GLP-1R en pulmón………………...…... 123

4.4.1.6. Análisis de expresión de Nkx2.1………………………………… 124

4.4.1.7 Análisis de los niveles circulantes de corticosterona……………… 124

4.4.2. Modelo de obesidad…………………………………………………………………. 125

5. Discusión……………………………………………………………………………………….. 129

6. Conclusiones…………………………………………………………………………………… 151

7. Bibliografía…………………………………………………………………………………….. 155

Listado de abreviaturas……………………………………………………………………………. 193

Ínî]_ ^_ figur[s.Ínî]_ ^_ figur[s.Ínî]_ ^_ figur[s.Ínî]_ ^_ figur[s.

Pág.

Figura_1: Procesamiento proteolítico del porglucagón................................................................... 4

Figura_2: Acciones de GLP-1……………………………………………………………………… 7

Figura_3: Efectos cardioprotectores de GLP-1…………………………………………………… 11

Figura_4: Agonistas de GLP-1R resistentes a la degradación por DPPIV: Liraglutide y

Exendina-4…………………………………………………………………………………………...

12

Figura_5: Estructura de la región respiratoria…………………………………………………… 20

Figura_6: Componentes del sistema renina-angiotensina………………………………………... 23

Figura_7: Epitelio alveolar…………………………………………………………………………. 26

Figura_8: Composición del surfactante pulmonar……………………………………………….. 27

Figura_9: Estructura de las SPs hidrofílicas (SP-A y SP-D) e hidrofóbicas (SP-B y SP-C)…… 28

Figura_10: Ciclo de vida del surfactante pulmonar en la superficie alveolar…………………... 29

Figura_11: Etapas de desarrollo pulmonar y su correspondencia con las semanas de

gestación en humanos y días de gestación de rata…………………………………………………

34

Figura_12: Efectos de los glucocorticoides en el desarrollo pulmonar………………………….. 37

Figura_13: Esquema representativo de las etapas de desarrollo pulmonar estudiadas para el

análisis de la ontogenia de GLP-1R en el pulmón…………………………………………………

52

Figura_14: Esquema representativo del protocolo experimental para la evaluación de los

efectos de los análogos de GLP-1 en la síntesis de las SPs en el pulmón…………………………

55

Figura_15: Esquema representativo del protocolo experimental para el estudio de la función

pulmonar en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida en respuesta al tratamiento

prenatal con análogos de GLP-1 (Ex4 y Liraglutide)……………………………………………..

57

Figura_16: Esquema representativo del protocolo experimental para la evaluación de los

efectos de Liraglutide en la supervivencia neonatal en un modelo de hipoplasia pulmonar

inducida………………………………………………………………………………………………

58

Figura_17: Protocolo experimental para el análisis de los efectos de Liraglutide en la ingesta

diaria de ratas gestantes…………………………………………………………………………….

60

Figura_18: Esquema representativo del protocolo experimental para el análisis de la función

pulmonar de E21 en un modelo de subnutrición durante la gestación…………………………..

60

Figura_19: Diseño experimental desarrollado para el estudio de los efectos de Liraglutide en

la función pulmonar en un modelo de diabetes inducida por STZ………………………………

62

Figura_20: Análisis de expresión de GLP-1R en pulmones de rata macho y hembra

pertenecientes a distintas etapas de desarrollo fetal y postnatal…………………………………

80

Figura_21: Caracterización de GLP-1R en el tejido pulmonar…………………………………. 81

Figura_22: Estudio de los efectos de Ex4 sobre la síntesis de SP-A en distintas etapas de

desarrollo pulmonar………………………………………………………………………………...

83


Pág.

Figura_23: Efecto de Ex4 sobre los niveles de expresión de SP-B……………………………….. 84

Figura_24: Unión de Nkx2.1/TBE en pulmones de E18, E20 y P1 tras el tratamiento con Ex4

durante la gestación…………………………………………………………………………………

85

Figura_25: Caracterización de SP-A en tejido pulmonar y líquido amniótico a lo largo del

desarrollo y tras la administración de Liraglutide durante la gestación………………………...

86

Figura_26: Efectos de Liraglutide sobre los niveles de SP-B en pulmones de E18, E20, P1 y

líquido amniótico…………………………………………………………………………………….

87

Figura_27: Niveles de corticosterona y 17ß-estradiol en suero de neonatos y ratas gestantes… 88

Figura_28: Peso corporal de ratas gestantes a lo largo del protocolo experimental…………… 90

Figura_29: Efectos de la administración de Ex4, Liraglutide y Dexametasona en la

maduración pulmonar en un modelo de hipoplasia pulmonar inducido por nitrofen………….

92

Figura_30: Análisis del desarrollo del corazón de fetos de 21 días……………………………… 93

Figura_31: Análisis histológico (Tinción Hematoxilina-Eosina) de la estructura alveolar en

E21……………………………………………………………………………………………………

95

Figura_32: Expresión de las proteínas del Surfactante Pulmonar (SP-A & SP-B) en pulmones

de fetos de 21 días con desarrollo completo (Control) e incompleto (NTF) tras el tratamiento

con Ex4 (EX4), Liraglutide (LIR) o bien Dexametasona (DEX)…………………………………

97

Figura_33: Expresión de GLP-1R en pulmones de fetos con desarrollo completo (C) y fetos

con desarrollo incompleto (NTF) tratados con Ex4, Liraglutide, Dexametasona o Vehículo…..

98

Figura_34: Porcentaje de Supervivencia Neonatal en un modelo de inmadurez pulmonar,

efectos del tratamiento prenatal con Liraglutide o bien Dexametasona…………………………

100

Figura_35: Análisis de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta durante la gestación……….. 102

Figura_36: Análisis del peso corporal de hembras gestantes……………………………………. 103

Figura_37: Análisis de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta en un modelo de

subnutrición………………………………………………………………………………………….

104

Figura_38: Porcentaje de variación de la ingesta durante la gestación…………………………. 105

Figura_39: Evaluación del grado de desarrollo pulmonar debido a variaciones de la ingesta

durante la gestación…………………………………………………………………………………

107

Figura_40: Efectos de la variación de ingesta durante la gestación en el patrón de expresión

de las proteínas surfactantes SP-A (A) y SP-B (B)………………………………………………...

109


de GLP-1R…………………………………………………………………………………………...

111


de Nkx2.1……………………………………………………………………………………………..

111


Figura_43: Efectos de la variación de la ingesta durante la gestación en los niveles proteicos

del GR (glucocorticoid receptor) en los extractos nucleares del tejido pulmonar de E21♂……..

Pág.

113

Figura_44: Análisis de los niveles de mRNA de los receptores de angiotensina (AT1-R y AT2-

R)……………………………………………………………………………………………………..

114

Figura_45: Perfil y variación del peso corporal de ratas diabéticas (STZ) y no diabéticas

(Control), tratadas con Liraglutide (LIR) o bien vehículo (VEH)……………………………….

116

Figura_46: Validación del modelo de diabetes experimental……………………………………. 117

Figura_47: Evaluación del grado de hipertrofia del ventrículo derecho en un modelo de

diabetes tipo 1 inducida por STZ…………………………………………………………………...

118

Figura_48: Evaluación de la función cardiaca mediante la determinación de BNP-32 en

ventrículo derecho en un modelo de diabetes tipo 1 inducida por STZ………………………….

119

Figura_49: Análisis del patrón de expresión de los componentes del sistema renina-

angiotensina en pulmón en un modelo de diabtetes tipo 1 inducida por STZ…………………...

120

Figura_50: Niveles de mRNA de AT1-R y AT2-R………………………………………………... 122

Figura_51. Análisis del patrón de expresión de las proteínas surfactantes SP-A & SP-B en un

modelo experimental de diabetes tipo 1……………………………………………………………

123

Figura_52: Patrón de expresión de GLP-1R en un modelo experimental de diabetes tipo 1

tratados con Liraglutide o Vehículo………………………………………………………………..

124

Figura_53: Patrón de expresión del factor de transcripción Nkx2.1 en un modelo

experimental de diabetes tipo 1……………………………………………………………………..

124

Figura_54: Niveles circulantes de corticosterona en un modelo de diabetes inducida por

estreptozotocina……………………………………………………………………………………...

125

Figura_55: Caracterización de los niveles de expresión de SP-A (A) y SP-B (B) en pulmones

de ratas Zucker homocigotas con fenotipo obeso (fa/fa) con respecto a ratas heterocigotas no

obesas (fa/+)………………………………………………………………………………………….

126

Figura_56. Análisis de los niveles de GLP-1R en pulmones de animales obesos (fa/fa) y

pulmones de animales no obesos (fa/+)…………………………………………………………….

126

Figura_57: Esquema representativo del efecto local de Liraglutide en el pulmón sobre el

balance del sistema renina-angiotensina en un modelo patológico de diabetes tipo 1…………..

145

Ínî]_ ^_ t[\l[s.Ínî]_ ^_ t[\l[s.Ínî]_ ^_ t[\l[s.Ínî]_ ^_ t[\l[s.

Pág.

Tabla_1: Funciones de las proteínas surfactantes……………………………………… 33

Tabla_2: Componentes de la reacción de reverso transcripción y concentración final

de trabajo…………………………………………………………………………………..

66

Tabla_3: Secuencias de los primers, condiciones y productos de amplificación

empleados para la reacción de PCR de cada gen estudiado……………………………

67

Tabla_4: Concentración de los componentes de la reacción de PCR…………………. 67

Tabla_5: Componentes de los geles de poliacrilamida para un mini -gel……………... 70

Tabla_6: Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en el inmunoblotting…….. 71

Tabla_7: Número medio de fetos por camada obtenidos en cada grupo

experimental……………………………………………………………………………….

90

Tabla_8: Número medio de fetos por camada en los diferentes grupos

experimentales…………………………………………………………………………….

105

1. Intro^u]]iòn.

1. Introû]]iòn.1. Introû]]iòn.1. Introû]]iòn.1. Introû]]iòn.

3

A principios del siglo XX se descubrió que ciertos péptidos sintetizados en la mucosa intestinal y

secretados tras la ingesta de alimentos reducían los niveles de glucosa en sangre tras estimular la

secreción de insulina en el páncreas endocrino (Bayliss WM y cols., 1902; Moore B y cols., 1906). Años

más tarde, dicho fenómeno, conocido con el término de efecto incretina, se confirmó tras determinar que

la administración oral de glucosa produce un mayor incremento de los niveles plasmáticos de insulina

respecto a la administración intravenosa (Mcintyre N y cols., 1964; Elrick H y cols., 1964).

Existen dos incretinas: GIP (glucose dependent inulinotropic peptide) y GLP-1 (glucagon like

peptide-1). Ambos péptidos son secretados en respuesta a la ingesta de carbohidratos y lípidos y ejercen

efectos insulinotrópicos. Estas hormonas son responsables del 50-70% de los niveles plasmáticos de

insulina tras la ingesta.

Considerando que los individuos diabéticos presentan un efecto incretina reducido respecto a

individuos sanos, las incretinas se han estudiado en profundidad y en la actualidad sus derivados

representan agentes terapéuticos eficaces en el tratamiento de esta patología.

1.1. GLP-1.

1.1.1. Síntesis, metabolismo y secreción.

GLP-1 se sintetiza por procesamiento post-traduccional del producto proteico del proglucagón

(Figura 1). El gen del proglucagón en humanos se localiza en el brazo largo del cromosoma 2 y presenta 5

intrones y 6 exones de los cuales el exón 4 contiene la secuencia que codifica para GLP-1 (White JW y

cols., 1986). El gen del proglucagón se expresa en el páncreas endocrino, en las células L intestinales y en

neuronas del hipotálamo o de la región caudal del tronco cerebral. La transcripción del gen da lugar a un

único mRNA independientemente del tipo celular en el que se exprese, el cual se traduce en un precursor

1. 1. 1. 1. Introû]]iòn.Introû]]iòn.Introû]]iòn.Introû]]iòn.

4

de 180 aminoácidos que es procesado de forma diferente en función del tejido para dar lugar a péptidos

específicos en el páncreas, intestino o cerebro (Mojsov S y cols., 1982).

En el procesamiento post-traduccional del proglucagón intervienen las prohormona convertasas

(PC; prohormone convertase) PC1/3 y PC2 que son enzimas proteolíticas. En las células α del páncreas,

PC2 cataliza la proteolisis de proglucagón para dar lugar al glucagón, cuya secuencia aminoacídica se

corresponde con el fragmento del proglucagón comprendido entre el aminoácido 33 y el 61 y a dos

péptidos considerados inactivos hasta la fecha; el polipéptido pancreático relacionado con glicentina

(GRPP; glicentin related pancreatic polypeptide) y al fragmento mayor del proglucagón (MPF; major

proglucagon fragment) (Holst JJ y cols., 1994).

El procesamiento post-traduccional del proglucagón en las células L del intestino y en el cerebro

está dirigido por PC1/3 a partir del cual se libera glicentina, oxintomodulina, GLP-1, cuya secuencia se

corresponde con los residuos 72-108 del proglucagón y GLP-2 (glucagon like peptide-2), el cual presenta

una secuencia que se corresponde con los residuos 126-158 del proglucagón (Orskov C y cols., 1986).

Figura_1: Procesamiento proteolítico del porglucagón. Glucagon-like peptides. Tomado de Kieffer TJ y Habener JF.

Endocrine Reviews, 1999; 20(6):876-913.

GLP-1 es sintetizado en las células L del intestino localizadas principalmente en la parte distal del

íleon y colon proximal y también en algunas regiones del cerebro (Drucker DJ y cols., 1988),

158


5

concretamente en: neuronas de tracto solitario (NTS; nucleus of the solitary tract ) que emiten

proyecciones hacia el núcleo paraventricular (PVN; paraventricular nucleus) y al núcleo arcuato (ARC;

arcuate nucleus) (Vrang N y cols., 2007; Tauchi M y cols., 2008).

Las células L intestinales son células enteroendocrinas intercaladas entre los enterocitos del

epitelio intestinal que establecen contacto directo con los nutrientes a través de la superficie apical y con

el tejido nervioso y vascular a través de la superficie basolateral, por lo que la secreción de GLP-1 puede

ser estimulada por una gran variedad de nutrientes y factores endocrinos o nerviosos.

La secreción de GLP-1 es bifásica. Así, se ha descrito una fase temprana de secreción (15-30

minutos tras la ingesta de alimentos) mediada de forma indirecta por los nutrientes a través de factores

hormonales y nerviosos y una fase tardía (30-60 minutos) estimulada por el contacto directo de las células

L intestinales con los propios nutrientes (Hermann C y cols.., 1995).

La secreción temprana de GLP-1 es mediada por un bucle neuroendocrino en el que intervienen

fibras nerviosas del nervio vago (Rocca AS y cols., 1999), neurotransmisores como GRP (gastrin

releasing peptide) (Roberge JN y cols., 1996) y acetilcolina (Anini Y y cols., 2002) y por hormonas

como GIP (Roberge JN y cols., 1993). La segunda fase de secreción tardía de GLP-1 es estimulada de

forma directa por el contacto con los nutrientes digeridos, (Roberge JN y cols., 1991) fundamentalmente

carbohidratos y lípidos.

La síntesis y secreción de GLP-1 es estimulada por numerosas señales intracelulares entre las que

se incluye PKA, PKC, calcio y MAPK (Drucker DJ y cols., 1989; Brubaker PL 1988).

Existen múltiples formas de GLP-1 que son secretadas in vivo, entre las que se incluyen las

formas inactivas GLP-1(1-37) y GLP-1(1-36)NH2 y las formas activas GLP-1(7-37) y GLP-1(7-36)NH2.

Las formas activas presentan la misma capacidad para estimular la secreción de insulina (Orskov C y

cols., 1993) siendo GLP-1(7-36)NH2 la molécula más abundante en humanos (Orskov C y cols., 1994).

La eliminación de GLP-1 de la circulación puede ocurrir por vía renal (Ørskov C y cols., 1992;

Ruiz-Grande C y cols., 1993), metabolización hepática, o bien por degradación tisular mediada por

dipeptidil peptidasa IV (DPPIV).

La enzima dipeptidil peptidasa IV (DPPIV: dipeptidyl peptidase IV) es una serina-proteasa ubicua

que rompe los enlaces del extremo amino-terminal de péptidos que contienen residuos de alanina o

prolina en posición 2. El penúltimo residuo de GLP-1 es una alanina, por lo que es rápidamente

metabolizado por DPPIV dando lugar a GLP-1(9-37)NH2 o GLP-1(9-36)NH2 que carecen de actividad,

por lo que las moléculas activas tienen una vida media en sangre de 2 minutos o menos tras ser secretadas

(Deacon CF y cols., 1995).

DPPIV se encuentra ampliamente distribuida en diversos tejidos entre los que se incluyen: el

riñón, pulmón, glándula adrenal, hígado, intestino, bazo, testículos, páncreas, sistema nervioso central y

superficie de linfocitos y macrófagos. De igual forma, DPPIV se localiza en células endoteliales de los

vasos sanguíneos de la mucosa intestinal (Hansen L y cols., 1999) y de forma soluble en la sangre


6

(Mentlein R, 1999), por lo que más de la mitad de GLP-1 que se incorpora a la circulación sistémica se

encuentra inactiva.

En individuos sanos los niveles plasmáticos de GLP-1 se incrementan entre 2 y 3 veces tras la

ingesta (Elliott RM y cols., 1993), mientras que en individuos obesos (Ranganath LR y cols., 1996) o con

diabetes tipo 2 (Vaag AA y cols., 1996) la respuesta secretora de GLP-1 tras la ingesta está

significativamente reducida.

1.1.2. Mecanismo de acción de GLP-1.

Las acciones de GLP-1 están mediadas por el receptor específico descrito hasta la fecha (GLP-1

receptor, GLP-1R). El cDNA para GLP-1R de rata y humano fue aislado y secuenciado en 1992 a partir

de transfecciones transitorias de librerías de cDNA procedentes de islotes pancreáticos de rata en células

COS. La secuencia fue identificada mediante el marcaje del ligando (GLP-1) con un isótopo radiactivo

(Thorens B, 1992). La secuencia aminoacídica de GLP-1R procedente de células pancreáticas humanas

comparte un 90% de homología con la secuencia descrita en rata (Dillon JS y cols., 1993).

Este receptor posee 463 aminoácidos y presenta 8 regiones hidrofóbicas de las cuales, el extremo

hidrofóbico amino terminal contiene la región de unión al ligando (Mann R y cols., 2007) mientras que

las 7 regiones hidrofóbicas restantes se corresponden con los dominios transmembrana.

El receptor GLP-1R, pertenece a la misma familia de los receptores de glucagón y GIP (Mayo KE

y cols., 2003) y está acoplado a proteínas Gα (Gαs, Gαq, Gαi y Gα0) (Montrose-Rafizadeh C y cols., 1999;

Hallbrink M y cols., 2001). La unión de GLP-1 a su receptor induce un incremento de la concentración de

Ca+2 intracelular, activa la adenilato ciclasa (AC; adenylate cyclase) y la fosfolipasa C (PLC;

phospholipase C). Como consecuencia se produce una activación de las rutas de transducción de señales

AMPc, PKA, PKC, PI3K y MAPK (Drucker DJ y cols., 1987; Wheeler MB y cols., 1993; Holz GG y

cols., 1995). Cinco minutos después de ser activado, GLP-1R se internaliza por endocitosis

produciéndose una desensibilización de la respuesta celular a GLP-1. En este proceso está implicada la

fosforilación de tres dobletes de serina de la región citosólica de GLP-1R (Widmann C y cols., 1997).

GLP-1R se encuentra ampliamente distribuido en numerosos tejidos, entre los que se incluyen:

los islotes pancreáticos, riñón, pulmón, estómago, hipotálamo, hipófisis, corazón, tejido adiposo, músculo

esquelético e hígado, entre otros (Shimizu I y cols., 1987; Bullock BP y cols., 1996; Richter G y cols.,

1990; Uttenthal LO y cols., 1990; Yamato E y cols. 1997; Vendrell J y cols., 2011; Delgado E y cols.,

1995; Villanueva-Peñacarrillo ML y cols., 1995).


7

1.1.3. Acciones de GLP-1.

Se han descrito diversas acciones biológicas de GLP-1 (figura 2), en el páncreas endocrino,

sistema nervioso central y periférico, estómago, hígado, tejido adiposo, músculo esquelético, sistema

cardiovascular y pulmón, entre otros.

Figura_2: Acciones de GLP-1. Tomado de Drucker DJ. Cell metabolism, 2006; 3:153-165.

1.1.3.1. Acción de GLP-1 en el páncreas endocrino.

� Célula ß.

Como se ha descrito previamente, GLP-1 es una de las hormonas responsables del efecto

incretina ya que tanto GLP-1 (7-37) como GLP-1(7-36)NH2 inducen la secreción de insulina en las

células ß pancreáticas (Mojsov S y cols., 1987) de manera dependiente de glucosa. GLP-1 actúa

conjuntamente con la glucosa induciendo la transcripción del gen de la insulina (Drucker DJ y cols.,

1987), promoviendo la estabilidad de su mRNA y estimulando su biosíntesis, y contribuyendo así a

recuperar los depósitos de insulina en la célula ß (Drucker DJ y cols., 1987). Los mecanismos por los

cuales GLP-1 induce la transcripción del gen de la insulina incluyen la activación de rutas de señalización

tanto dependientes como independientes de AMPc/PKA, así como incremento del Ca+2 intracelular

(Fehmann H-C y cols., 1992). Además, GLP-1 induce la unión del factor de transcripción Pdx-1

(pancreatic and duodenal homeobox 1) a la región promotora del gen de la insulina (Wang X y cols.,

1999).

Por otra parte, GLP-1 aumenta tanto la expresión de los transportadores de glucosa como la de

glucokinasa mejorando la sensibilidad a la glucosa de las células ß y potenciando la secreción de insulina

inducida por un determinado nivel de glucosa (Holz GG y cols., 1993).


8

Los agonistas del receptor GLP-1R inducen la proliferación y neogénesis de las células ß e

inhiben su apoptosis (Wang Q and Brubaker PL, 2002; Li Y y cols., 2003) incrementando la masa de

células ß. Estas acciones proliferativas y antiapoptóticas son dependientes de la expresión del factor de

transcripción Pdx-1 (Li Y y cols., 2005).

� Célula α y δ.

GLP-1 inhibe la secreción de glucagón en las células α de manera dependiente de glucosa y

estimula la secreción de somatostatina en las células δ (Ørskov C y cols., 1988). El efecto estimulador de

GLP-1 sobre la secreción de somatostatina es causado por un efecto directo sobre la célula δ (Fehmann

HC y cols., 1991) mientras que las acciones sobre la secreción de glucagón pueden deberse tanto a un

mecanismo directo sobre la célula α (Heller RS y cols., 1997) como a un mecanismo indirecto tras

inducir la secreción de insulina y somatostatina. Se considera que la capacidad de GLP-1 para reducir la

secreción de glucagón es tanto o más importante que el estimulo de insulina que produce, y conociendo el

papel fisiopatológico de glucagón en la alteración glucémica de la diabetes, este efecto es uno de los

principales soportes de la acción terapéutica de los análogos de GLP-1 en esa patología (Holst JJ, 2007).

1.1.3.2. Efectos extra-pancreáticos de GLP-1.

Además de sus acciones sobre el páncreas endocrino, GLP-1 actúa sobre el sistema nervioso

central y periférico, tracto gastrointestinal, sistema cardiovascular, músculo, tejido adiposo e hígado, así

como en el pulmón. Sin embargo, la mayoría de las acciones de GLP-1 sobre estos tejidos está sin definir

en detalle.

� Sistema nervioso central y periférico.

Se ha identificado la presencia de GLP-1R en diferentes regiones del sistema nervioso central y

periférico, donde GLP-1 parece estar implicado en la regulación de diversas funciones entre las que se

incluyen la ingesta, la motilidad gástrica, y acciones sobre el sistema cardiovascular.

La expresión de GLP-1 en el sistema nervioso central se localiza principalmente a nivel del

núcleo del tracto solitario (Larsen PJ y cols., 1997a). Las neuronas de este núcleo emiten proyecciones

axónicas hacia distintos núcleos hipotalámicos que expresan GLP-1R entre ellas el paraventricular (NPV)

y el núcleo arcuato (ARC) y también extrahipotalámicos como la amígdala (Merchenthaler I y cols.,

1999). GLP-1R también se ha localizado en las fibras nerviosas aferentes del nervio vago, donde la unión

de su ligando genera impulsos nerviosos hacia los núcleos del tracto solitario y, desde éstos, hacia el

hipotálamo. La función más destacable de GLP-1 y mejor estudiada en el sistema nervioso central es la

regulación de la ingesta, donde ejerce una potente acción anorexigénica. Se ha demostrado que la

administración, tanto central como periférica, de los agonistas de GLP-1R reduce la ingesta de alimentos

y de bebida así como el peso corporal. Estos efectos se han observado tanto en individuos sanos como en


9

individuos diabéticos u obesos (Turton MD y cols., 1996; Meeran K y cols., 1999; Szayna M y cols.,

2000).

GLP-1 es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y acceder al sistema nervioso central

(Kastin AJ y cols., 2002) interaccionando de forma directa con GLP-1R localizado en los núcleos

hipotalámicos de regulación de la saciedad.

GLP-1 también regula la ingesta a través del nervio vago que transmite impulsos nerviosos a los

centros de saciedad, tal y como se ha demostrado en experimentos con ratas vagotomizadas en las que se

pierde el efecto anoréctico de GLP-1 al ser administrado de forma periférica (Abbott CR y cols., 2005;

Talsania T y cols., 2005). También de forma indirecta, GLP-1 regula la ingesta al inhibir el vaciamiento

gástrico (Wettergren A y cols., 1997) lo que aumenta la distensión del estómago y se asocia con

sensación de saciedad.

� Regulación de ejes neuroendocrinos.

GLP-1 interviene en la regulación de los ejes gonadotropo, tirotropo y corticotropo. GLP-1

induce la secreción de TSH (thyroid stimulating hormone) (Malendowicz LK y cols., 2002), LH (Beak

SA y cols., 1998) y corticosterona (Kinzig KP y cols., 2003; Gil-Lozano M y cols.. 2010 y 2013) tras la

activación de células neuroendocrinas del hipotálamo (Larsen PJ y cols., 1997b).

� Estómago.

GLP-1 inhibe la secreción ácida en el estómago, atenúa la motilidad y retarda el vaciamiento

gástrico (Wettergren A y cols., 1997) a través del nervio vago (Holmes GM y cols., 2009) contribuyendo

al control de la glucemia, porque la ralentización del vaciamiento gástrico permite que la digestión y

absorción de los nutrientes sea más lenta y por tanto menores niveles de glucosa postprandial.

� Hígado, tejido adiposo y músculo.

GLP-1 también ejerce sus acciones sobre hígado, tejido adiposo y músculo esquelético. Estudios

in vitro demuestran que GLP-1 induce la captación de glucosa por hepatocitos y miocitos favoreciendo la

síntesis de glucógeno (D´Alessio D y cols., 2004, review; Luque MA y cols., 2002). Además,

incrementa el metabolismo de glucosa en cultivo celular de adipocitos 3T3 L1 (Egan JM y cols., 1994;

Wang Y y cols., 1997) y presenta acciones tanto lipolíticas como lipogénicas (Villanueva-Peñacarrillo

ML y cols., 2001).

Se han descrito algunos efectos de GLP-1 en hígado y músculo esquelético que no pueden ser

explicados por la activación de GLP-1R por lo que no se descarta que GLP-1 se una a otro receptor

todavía no descrito hasta la fecha (Nishizawa M y cols., 2000; Yang H y cols., 1998; Montrose-Rafizadeh

C y cols., 1997, Pérez-Tilve D. y cols., 2007).


10

� Función cardiovascular.

Las acciones cardiovasculares de GLP-1 resultan de especial interés en el estudio de los

tratamientos para la diabetes mellitus tipo 2, puesto que se trata de una patología asociada frecuentemente

a complicaciones cardiovasculares.

Sus acciones se han relacionado con efectos cardioprotectores, actuando sobre células del

micardio y del endotelio vascular. Además, GLP-1 posee efectos reguladores de la presión arterial, que

pueden ser ejercidos de forma directa sobre el sistema cardiovascular, o bien indirecta, a través del

sistema nervioso (Figura 3).

El receptor GLP-1R se ha identificado tanto en corazón de rata (Bullock BP y cols., 1996) como

humano (Wei Y y cols., 1996). En cardiomiocitos de rata, la unión de GLP-1 y consiguiente activación de

su receptor, incrementa los niveles intracelulares de AMPc sin modificar la contracción muscular (Vila

Petroff MG y cols., 2001). En ratones GLP-1R -/- la capacidad de contracción del ventrículo izquierdo en

respuesta a la administración de adrenalina es menor con respecto a los ratones wild type (Gros R y cols.,

2003). Además, estos ratones deficientes en GLP-1R muestran un mayor espesor de las paredes

ventriculares, sugestiva de hipertrofia.

Se ha descrito la presencia de GLP-1R en células endoteliales vasculares (Nyström T y cols.,

2004) y en células del músculo liso de los vasos (Ban K y cols., 2008). GLP-1 reduce la producción de

especies reactivas de oxígeno (ROS) en una línea de células endoteliales humanas en respuesta a la

glucemia (Ishibashi Y y cols., 2010; Oeseburg H y cols., 2010). Además, GLP-1 tiene efectos reparadores

de la microvasculatura cardiaca en respuesta al estrés oxidativo y apoptosis por inhibición de Rho

mediada por AMPc/PKA (Wang D y cols., 2013).

La administración intravenosa de GLP-1 incrementa la frecuencia cardiaca y la presión arterial

sistólica y diastólica de ratas (Barragán JM y cols., 1994) mediante un mecanismo dependiente de la

activación de GLP-1R (Barragán JM y cols., 1996) en el corazón o bien de forma indirecta a través del

sistema nervioso autónomo simpático. La administración central de GLP-1 aumenta la presión arterial

también a través del simpático, proceso en el que intervienen neuronas del hipotálamo paraventricular,

núcleo arcuato y neuronas catecolaminérgicas eferentes del núcleo del tracto solitario (Yamamoto H y

cols., 2002).

Además, GLP-1 puede intervenir en la regulación de la presión sanguínea a través de la secreción

ANP (atrial natriuretic peptide). Se ha descrito que el receptor GLP-1R se expresa en las células atriales

cardíacas y su activación induce la secreción del ANP, lo que a su vez reduce la presión sanguínea

sistémica (Kim M y cols., 2013).


11

Figura_3: Efectos cardioprotectores de GLP-1. Tomado de Ravassa S, Zudaire A, Díez J. GLP-1 and cardioprotection: from

bench to bedside. Cardiovasc Res. 2012; 94(2):316-323.

Los efectos insulinotrópicos y anorexigénicos de GLP-1 intervienen de modo indirecto,

mejorando la función cardiaca. Así, se ha descrito que el incremento de insulina en plasma mejora la

captación de glucosa por los miocitos, mientras que la pérdida de peso en sujetos obesos debido a la

administración de agonistas de GLP-1R presenta efectos cardioprotectores (Ussher JR y Drucker DJ,

2012, review).

� Pulmón.

Hasta la fecha, existen pocos estudios que relacionen la actividad de GLP-1 con la función

pulmonar. Richter G y colaboradores mediante estudios de unión ligando-receptor en membranas

celulares de pulmones de rata demostraron la presencia de GLP-1R en el pulmón (Richter G y cols.,

1990). Posteriormente, el mismo grupo mostró mediante autoradiografía que el receptor GLP-1R se

localiza en las glándulas submucosas de la tráquea y en el músculo liso de los vasos sanguíneos. Así,

GLP-1 estimula la secreción del mucus en las glándulas traqueales y produce relajación de las arterias

pulmonares (Richter G y cols., 1993). Más recientemente, se identificó la presencia de GLP-1R en

neumocitos tipo II mediante hibridación in situ (Bullock BP y cols., 1996).

Tanto GLP-1 (7-36)NH2 como Ex4 estimulan, de forma dosis-dependiente, la secreción de

fosfatidilcolina (PC; phosphatidylcholine), principal componente lipídico del surfactante pulmonar, en

cultivo primario de neumocitos tipo II. Este efecto es revertido por Ex(9-39), antagonista competitivo de

GLP-1R, y una vez formado el complejo ligando-receptor, se produce activación de proteín-kinasas


12

dependientes de AMPc (Benito E y cols., 1998a: Vara E y cols., 2000), por lo que las acciones de GLP-1

y Ex4 son mediadas por GLP-1R.

1.2. Agonistas de GLP-1R.

Numerosos estudios han puesto de manifiesto la importancia fisiológica de GLP-1 en el

mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. Entre ellos, los trabajos llevados a cabo en ratones GLP-

1R-/- han revelado la existencia de una menor secreción de insulina e intolerancia a la glucosa respecto a

animales wild type (Scrocchi LA y cols., 1996). En humanos, se ha descrito que los pacientes con diabetes

tipo 2 presentan una reducción en la secreción de GLP-1 en respuesta a la ingesta y por tanto, un efecto

incretina reducido con respecto a individuos sanos (Toft-Nielsen MB y cols., 2001). Estos pacientes

presentan además, deficiencias en la función de las células ß pancreáticas (Festa A y cols., 2008).

Las acciones pleiotrópicas de GLP-1 lo hacen esencial para el mantenimiento de la homeostasis

de la glucosa por lo que ha sido considerado para el tratamiento de diabetes tipo 2, sin embargo su acción

como agente terapéutico se encuentra limitada debido a su corta vida media en circulación. Por tal

motivo, se han desarrollado agonistas del receptor GLP-1R resistentes a la degradación por DPPIV que

permitan prolongar los efectos glucorreguladores. Entre los principales agonistas del receptor de GLP-1

se encuentran Exendina-4 (Ex4) y Liraglutide (Figura 4) que ya están en uso para el tratamiento de la

diabetes mellitus tipo II.

Figura_4: Agonistas de GLP-1R resistentes a la degradación por DPPIV: Liraglutide y Exendina-4. Tomado de

Malm-Erjefältl M y cols., Drug Metab Dispos. 2010; 38(11):1944-1953.

1.2.1. Exendina-4.

Ex4 es un péptido de 39 aminoácidos originalmente aislado de las secreciones salivares del

lagarto Heloderma suspectum (Eng J y cols., 1996), comúnmente conocido como Monstruo de Gila. Su

secuencia presenta un grupo amida en el extremo carboxiterminal y un 53% de homología con la

DPPIV

DPPIV


13

secuencia aminoacídica de GLP-1, lo que permite unirse y activar GLP-1R (Thorens B y cols., 1993;

Göke R y cols., 1993). A pesar de la homología entre ambos péptidos, éstos presentan un origen evolutivo

diferente puesto que Ex4 no es codificado por el gen del proglucagón del lagarto (Chen YE y cols., 1997).

La secuencia aminoacídica de Ex4 le confiere resistencia a la degradación por DPPIV por la

presencia de una glicina en lugar de alanina o prolina en posición 2, que evita el corte enzimático en esa

posición. Esto confiere una vida media mucho más larga para Ex4, que se ha estimado entre 60 y 90

minutos en la circulación sanguínea (Kolterman OG y cols., 2005).

La activación de GLP-1R por Ex4 desencadena acciones glucorreguladoras de forma incluso más

potente que el propio péptido endógeno (Young AA y cols., 1999; Greig NH y cols., 1999; Parkes D y

cols., 2001), hecho que no puede ser atribuido a una distinta afinidad por GLP-1R. Entre las acciones de

Ex4 se incluyen; secreción de insulina dependiente de la glucosa (Parkes DG y cols., 2001), inhibición de

la inadecuada secreción de glucagón en respuesta a glucosa (Kolterman OG y cols., 2003), reducción del

vaciamiento gástrico (Kolterman OG y cols., 2003) y reducción de la ingesta de alimentos (Szayna M y

cols., 2000). Estudios in vitro e in vivo han demostrado que Ex4 induce la proliferación de la célula ß así

como la neogénesis de los islotes pancreáticos (Xu G y cols., 1999; Tourrel C y cols., 2001; Tourrel C y

cols., 2002).

La mayoría de las acciones de Ex4 en la glucorregulación son realizadas a través de GLP-1R de

igual forma que lo hace el péptido endógeno, sin embargo se han descrito algunos efectos de Ex4 que

difieren de los realizados por GLP-1 por lo que se ha postulado la existencia de otro receptor específico

para Ex4 todavía no identificado (Idris I y cols., 2002; Pérez-Tilve D. y cols.. 2007.).

1.2.2. Liraglutide.

Liraglutide es un análogo sintético de GLP-1. Comparte un 97% de homología con la secuencia

de GLP-1 (7-37) de humano y difiere del péptido endógeno en que presenta un residuo de glutamato

asociado a la lisina en posición 26. Esto permite la unión de un ácido graso de 16 carbonos [N-ε-(α-L-

glutamyl-(N-γ-palmitoyl))], en esa posición. Además, la lisina en posición 34 es sustituida por arginina

(Knudsen LB y cols., 2000). El grupo palmitoil se une covalentemente a la albúmina plasmática

protegiendo la molécula de la degradación enzimática sin modificar su capacidad de unirse y activar a el

GLP-1R (Knudsen LB et al, 2000). La absorción subcutánea de Liraglutide es lenta y su vida media en

plasma es de 12-13 horas (Agersø H y cols., 2002), unas diez veces superior a la vida media de Ex4. El

Liraglutide ha sido aprobado para el tratamiento de la diabetes tipo 2 tanto en Europa como en Estados

Unidos.

Estudios realizados en modelos animales de diabetes tipo 2 demuestran que Liraglutide mejora el

control glucémico y rescata la función de la célula ß (Rolin B y cols., 2002). Además, previene la

ganancia de peso y reduce la ingesta de alimentos en ratas con obesidad inducida por la dieta (Raun K y

cols., 2007). Por otro lado, Liraglutide muestra efectos cardioprotectores tal y como muestran estudios in

vivo (Noyan-Ashraf MH y cols., 2009) e in vitro (Hattori Y y cols., 2010).


14

1.2.3. Efectos biológicos de Ex4 y Liraglutide.

1.2.3.1. Glucorregulación.

� Control de la glucemia, secreción de insulina y glucagón.

La administración intraperitoneal de Ex4 mejora la glucemia en modelos animal de diabetes tipo

2 (Young AA y cols., 1999). Ex4 reduce la glucemia en ratones db/db de manera más potente que GLP-1

puesto que con una menor dosis del fármaco se consigue un efecto más prolongado que en el caso del

péptido endógeno. Diversos estudios realizados sobre los efectos de Ex4 en el control de la glucemia en

modelos animales de diabetes tipo 2 demuestran que la acción de Ex4 es cinco mil veces más potente que

GLP-1 (Nielsen LL y cols., 2004).

Estudios en ratas obesas diabéticas (ZDF; Zucker diabetic fatty rats) que presentan obesidad,

resistencia a la insulina, hiperglucemia y disfunción de la célula ß, muestran una mejora en el control de

la glucemia así como mayor sensibilidad a insulina tras el tratamiento crónico con Ex4 con respecto a

animales que recibieron el correspondiente vehículo. Asimismo, el efecto es mayor en ratas obesas

diabéticas que en ratas no obesas y no diabéticas (Young AA y cols., 1999).

Una inyección diaria de Liraglutide por vía subcutánea mejora la homeostasis de la glucosa en

sujetos con diabetes tipo 2, ya que se reducen los niveles de glucosa postpandrial tras una semana de

tratamiento, hecho que se asocia a una mejora de la función de las células ß y α (Degn KB y cols., 2004).

En modelos animales de obesidad y diabetes tipo 2 (ratones db/db) los niveles de glucosa en plasma

disminuyen tras la administración de Ex4 y Liraglutide, siendo el efecto de Liraglutide más prolongado

que el de Ex4 (Rolin B y cols., 2002).

GLP-1, Ex4 y Liraglutide presentan un efecto insulinotrópico dependiente de glucosa, por tanto,

inducen la secreción de insulina en condiciones de normoglucemia o hiperglucemia pero no en situación

de hipoglucemia. Ex4 estimula la secreción de insulina por las células ß del páncreas de manera

dependiente de glucosa tal y como demuestran estudios in vitro (Parkes DG y cols., 2001). En modelos

animales de diabetes (ratones db/db) la administración crónica de Ex4 incrementa los niveles plasmáticos

en ayuno de insulina con respecto a los animales diabéticos no tratados (Greig NH y cols., 1999).

Los sujetos diabéticos presentan niveles plasmáticos de glucagón elevados respecto a individuos

no diabéticos. Sobre esta base, la administración de Ex4 a pacientes diabéticos tipo 2 produce una

reducción de la secreción de glucagón tanto en ayuno como tras la ingesta. Este hecho contribuye a una

mejora en la glucemia (Kolterman OG y cols., 2003). Los efectos de Ex4 sobre la secreción de glucagón

son dependientes de glucosa.

� Efectos sobre las células ß.

Ex4 provoca un incremento en la masa de las células ß, hecho de especial interés para impedir la

progresión de la diabetes. Este efecto refleja tres procesos aditivos: estimulo de la proliferación,


15

inhibición de la apoptosis y neogénesis de las células ß (Zhou J y cols., 1999; Stoffers DA y cols., 2000;

Li Y y cols., 2003).

El incremento de la masa de las células ß por la acción, tanto de Ex4 como de GLP-1, es debido a

la actividad moduladora del factor de transcripción Pdx-1 de estos péptidos. Pdx-1 es imprescindible para

el desarrollo y regeneración del páncreas endocrino (Stoffers DA y cols., 2000) puesto que regula genes

esenciales de la función pancreática como los de insulina, glucokinasa y el gen del transportador de

glucosa tipo 2 (GLUT-2) (Doyle ME y cols., 2007). Además, se ha descrito que Ex4 induce la

diferenciación de células epiteliales de los conductos pancreáticos a células que expresan insulina y

glucagón, lo que explicaría la reducción de glucosa y la mejora de la tolerancia oral a glucosa en ratas

parcialmente pancreatomizadas tras el tratamiento con Ex4 (Xu G y cols., 1999).

Por otra parte, Ex4 reduce el riesgo de desarrollar diabetes, tal y como demuestran experimentos

en ratas con crecimiento intrauterino retardado y tratadas con Ex4 durante la etapa neonatal. Según

reflejan estos estudios, el tratamiento con Ex4 induce la proliferación celular, recuperando la masa de

células ß y la función del páncreas endocrino (Stoffers DA y cols., 2003).

En ratones diabéticos db/db el tratamiento con Liraglutide durante dos semanas, produce un

incremento tanto de la masa celular como de la tasa de proliferación de las células ß. Este efecto es más

potente que el inducido por Ex4 (Rolin B y cols., 2002).

Estudios en islotes pancreáticos aislados de neonatos de rata, demuestran que Liraglutide inhibe

de forma dosis-dependiente la apoptosis celular inducida por citoquinas y ácidos grasos. El efecto de

Liraglutide es realizado a través de GLP-1R, ya que la inhibición de la apoptosis por Liraglutide no

ocurre cuando se realizan incubaciones en presencia de Ex9-39, antagonista de GLP-1R. Además, este

efecto está mediado por la activación de la vía del AMPc y PI3K (Bregenholt S y cols., 2005). Las

señales intracelulares AMPK/mTOR también están implicadas en los efectos de Liraglutide sobre la

proliferación de las células ß, tal y como demuestran los estudios realizados en la línea celular de islotes

pancreáticos INS-1 (Miao XY y cols., 2013).

� Ingesta de alimentos y peso corporal.

Al igual que ocurre con GLP-1, Ex4 reduce la ingesta de alimentos y el peso corporal.

Experimentos realizados en la cepa de ratas obesas diabéticas ZDF, muestran que el tratamiento crónico

con Ex4 reduce la ingesta de alimentos y el peso corporal, hecho que se relaciona con una pérdida

significativa de la grasa abdominal y visceral (Szayna M y cols., 2000). Asimismo, Ex4 reduce la ingesta

de alimentos en individuos sanos (Edwards CM y cols., 2001).

El crecimiento retardado intrauterino se relaciona con el desarrollo posterior de diabetes tipo 2 e

incremento del peso corporal. El tratamiento crónico con Ex4 durante la etapa neonatal produce una

reducción del 20% en el peso corporal a las 2 semanas de desarrollo postnatal, tanto en ratas con

crecimiento intrauterino normal, como en ratas con crecimiento intrauterino retardado y con respecto a


16

ratas no tratadas (Stoffers DA y cols., 2003). Este efecto sobre la reducción en el peso corporal inducida

por Ex4 se mantiene durante la etapa adulta.

Estudios realizados en modelos animales de obesidad inducida por la dieta, demostraron que la

administración crónica de Liraglutide reduce el incremento de peso corporal. Asimismo, Liraglutide

reduce la ingesta calórica y aumenta la sensibilidad periférica a la insulina (Raun K y cols., 2007; Kirsten

Raun y cols., 2007).

En otros estudios, se analizaron los efectos de Liraglutide sobre la ingesta de alimentos, peso

corporal y perfil lipídico en un modelo animal de obesidad, resistencia a insulina y disfunción de la célula

ß (ratas UCD-T2DM), animales que desarrollan diabetes en la etapa adulta. El tratamiento prolongado

con Liraglutide reduce el peso corporal, la ingesta de alimentos y mejora el perfil lipídico y la función de

la célula ß en comparación con los animales que no recibieron tratamiento. En este mismo modelo animal

se observó que Liraglutide retrasa hasta 4 meses el desarrollo de la diabetes tipo 2 en etapa adulta con

respecto a animales no tratados (Cummings BP y cols., 2010).

1.2.3.2. Efectos independientes de la homeostasis de la glucosa.

� Acciones cardiovasculares.

Ensayos tanto in vitro como in vivo, demuestran que Ex4 presenta acciones angiogénicas. La

activación de GLP-1R por Ex4 estimula la migración de células endoteliales (HUVECs: human umbilical

vein endothelial cells), induce su proliferación en anillos aórticos cultivados ex vivo e incrementa la

formación de nuevos vasos sanguíneos y el flujo sanguíneo (Kang HM y cols., 2013). Por otro lado, la

activación de GLP-1R por Ex4 desencadena acciones proliferativas en cultivo celular de células

endoteliales de arteria coronaria humana (HCAECs: human coronary arterial endothelial cells ) mediante

la activación de la vía PI3K/Akt (Erdogdu O y cols., 2010) e inhibe la apoptosis (Erdogdu O y cols.,

2013). Estudios realizados en cultivos celulares de cardiomiocitos ventriculares de neonatos han

demostrado que la activación de GLP-1R por Ex4 atenúa la apoptosis celular en condiciones de alta

concentración de glucosa (Younce CW y cols., 2013).

El tratamiento con Ex4 mejora la función cardiaca, la captación de glucosa y la función

microvascular en un modelo animal de diabetes inducida por estreptozotocina (Wang D y cols., 2013).

Liraglutide presenta acciones vasodilatadoras puesto que incrementa la actividad de la enzima

óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS: endothelial nitric oxide synthase) en cultivo de HUVECs y por

tanto incrementa la producción de NO (Hattori Y y cols., 2010). Asimismo, estudios in vitro en células

HUVEC demuestran que Liraglutide reduce de forma dosis-dependiente la expresión de endotelina-1, un

potente vasoconstrictor, mediante la inhibición de la fosforilación de NFk-B (nuclear factor kappa-B ) y

su traslado al núcleo celular (Dai Y y cols., 2013). Dichos efectos también se observaron en condiciones

de alta concentración de glucosa.

Liraglutide previene el incremento, promovido por hiperglucemia, de los niveles de moléculas

que inducen la adhesión celular o bien inhiben la fibrinólisis, como son VCAM-1 (vascular cell adhesión


17

molecule-1) o PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) en cultivo de células endoteliales humanas (Liu

H y cols., 2009). Estudios in vitro revelan que Liraglutide tiene efectos anti-oxidativos y anti-

inflamatorios sobre células endoteliales (Shiraki A y cols., 2012).

Además, Liraglutide mejora la función cardiaca en un modelo animal de obesidad inducida por la

dieta (Noyan-Ashraf MH y cols., 2013). También se ha visto que mejora la función cardiaca en un

modelo experimental de infarto de miocardio inducido, mostrando un incremento de la supervivencia y

reducción de la zona infartada, así como un incremento de la expresión de genes cardioprotectores (Akt,

GSK3ß, PPARß- δ, Nrf-2 y HO-1) con respecto a ratones no tratados (Noyan-Ashraf MH y cols., 2009).

Liraglutide, mediante la activación de GLP-1R, induce la relajación de los anillos aórticos de

forma independiente del endotelio. La secreción de ANP, la vasorelajación y la reducción en la presión

sanguínea tras la administración de Liraglutide no se observa en ratones knock-out para GLP-1R (Kim M

y cols., 2013)

� Efectos sobre la fisiología pulmonar.

Los únicos estudios realizados sobre agonistas de GLP-1R y pulmón han sido los realizados por

Benito E y cols. (1998) y Vara E (2000) en los que se demuestra que Ex4 estimula la síntesis y secreción

del principal componente lipídico del surfactante pulmonar, PC (phosfatidylcholine). No existe ningún

estudio hasta la fecha acerca de las acciones de Liraglutide sobre el componente proteico del surfactante

pulmonar, ni otros parámetros morfológicos o funcionales relacionados con el pulmón, aparte de los que

se mostrarán en esta tesis.


18

1.3. Fisiología del sistema respiratorio.

El sistema respiratorio, que comprende los pulmones y la secuencia de conductos aéreos, tiene

como función principal proporcionar O2 desde la atmósfera a los tejidos y eliminar el CO2 desde los

tejidos al exterior.

El mecanismo respiratorio incluye los siguientes procesos funcionales:

• Ventilación, movimiento de aire desde el exterior hacia los pulmones y viceversa.

• Intercambio del O2 del aire inspirado en los alveolos por CO2 de la sangre, también llamado

respiración externa.

• Transporte de O2 y CO2 en la sangre hasta y desde las células.

1.3.1. Estructura del sistema respiratorio.

El sistema respiratorio se subdivide en dos porciones; la región conductora y la respiratoria. La

región conductora, situada fuera y dentro de los pulmones, lleva aire desde el medio externo hasta los

pulmones. La región respiratoria, localizada dentro de los pulmones, tiene como función el intercambio

de O2 por CO2. La región conductora comprende la cavidad nasal, boca, nasofaringe, faringe, laringe,

tráquea, bronquios primarios, bronquios secundarios y terciarios, bronquiolos y bronquiolos terminales.

En esta región no sólo se transporta el aire inspirado sino que también se filtra, se humedece y se calienta

antes de que llegue a la región respiratoria de los pulmones. La región respiratoria está compuesta por

bronquiolos respiratorios, conductos y sacos alveolares y alveolos. Cada región pulmonar presenta células

epiteliales y mesenquimáticas especializadas y específicas de la región anatómica (Gartner LP y Hiat JL,

2002).

1.3.1.1. Tráquea.

La tráquea es un tubo cartilaginoso que se inicia en la laringe y termina tras bifurcarse para

formar los bronquios principales. Está reforzada por anillos de cartílago hialino abiertos hacia la parte

posterior, unidos por músculo liso y tejido conectivo.

El epitelio que forma parte de la mucosa de la tráquea contiene seis tipos celulares: células

caliciformes, células cilíndricas ciliadas, células basales, células en cepillo, células serosas y células

neuroendocrinas. Las células más abundantes son las células caliciformes, responsables de la síntesis y

secreción de mucina; las células cilíndricas ciliadas, cuya acción ciliar desplaza el material particulado y

el moco hacia la nasofaringe para eliminarlos y las células basales relativamente indiferenciadas que son

consideradas células madre que proliferan para remplazar otras células del epitelio. Las células en cepillo

son células con microvellosidades que han sido relacionadas con funciones sensoriales. Las PNEC

(pulmonary neuroendocrine cells) se localizan por todo el epitelio pulmonar. Estas células se disponen de

forma aislada, aunque son más abundantes, en la tráquea y los bronquios (Cho T y cols., 1989), mientras

que en regiones más ramificadas se disponen agrupadas formando los llamados cuerpos neuroendocrinos

(NEBs; neuroendocrine bodies) que contienen gránulos neurosecretores y están inervados por fibras


19

aferentes y eferentes (Scheuermann DW, 1997), por lo que se asocian a quimio-recepción y secreción.

Las acciones de los NEBs son paracrinas, endocrinas y neuroendocrinas (Scheuermann DW, 1997), y

además se han relacionado con vasoconstricción en respuesta a hipoxia (Hernandez-Vasquez A y cols.,

1978; Lauweryns JM y cols., 1977; Cutz E y cols., 1993). El número de PNECs y NEBs se reduce de

forma considerable en la etapa post-natal, por ello, se relaciona con la regulación del desarrollo pulmonar

(Gosney JR, 1993).

1.3.1.2. Árbol bronquial.

El árbol bronquial está formado por conductos aéreos localizados fuera de los pulmones como

son los bronquios primarios, y conductos aéreos localizados dentro de los pulmones como son los

bronquios secundarios y terciarios, los bronquiolos, los bronquiolos terminales y los bronquiolos

respiratorios.

El árbol bronquial se inicia con la bifurcación de la tráquea dando lugar a los bronquios primarios

derecho e izquierdo. El bronquio derecho se ramifica en tres bronquios secundarios que se dirigen a los

tres lóbulos derechos y el bronquio izquierdo se bifurca en dos bronquios secundarios que se dirigen a los

dos lóbulos izquierdos del pulmón. Las ramificaciones de los bronquios secundarios de diámetro inferior

son los bronquios terciarios que se ramifican en bronquiolos y que contienen las células de Clara

(Massaro GD y cols., 1994). Las células de Clara son células cuboidales no ciliadas predominantemente

localizadas en los bronquiolos. Se consideran células progenitoras que se dividen y se diferencian en otras

células epiteliales para el mantenimiento del epitelio bronquial (Reynolds SD y cols., 2010). Además,

degradan toxinas del aire inhalado, y son células secretoras de apo-proteínas del surfactante pulmonar,

CCSP (Clara cell secretory protein) con acciones antiinflamatorias (Miele L y cols., 1988), y de

citoquinas y mucina (Reynolds SD y cols., 2010).

1.3.1.3. Región respiratoria del sistema respiratorio.

Los bronquiolos terminales se subdividen para formar los bronquiolos respiratorios, que son la

primera región del sistema respiratorio y cuya pared se encuentra interrumpida por los conductos

alveolares en donde ocurre el intercambio gaseoso. Los conductos alveolares se hacen cada vez más

numerosos a medida que los bronquiolos respiratorios se van estrechando. Tras varias ramificaciones,

cada bronquiolo respiratorio termina en un conducto alveolar (Figura 5). Los conductos alveolares

terminan en evaginaciones ciegas o sacos alveolares que son un conjunto de más de dos alveolos, por lo

que los conductos alveolares son disposiciones lineales de los alveolos. Los alveolos forman la unidad

respiratoria estructural y funcional, ya que sus paredes delgadas permiten el intercambio gaseoso entre el

aire y la sangre de los capilares adyacentes.


20

Figura_5: Estructura de la región respiratoria. Tomada de Texto atlas de histología Gartner LP Y Hiat JL. 2002.

1.3.2. Intercambio gaseoso en los pulmones.

Para el intercambio gaseoso es necesario que sucedan tres procesos funcionales; la ventilación

alveolar, la difusión de los gases y el transporte de los gases por la sangre.

La ventilación supone el movimiento de aire entre la atmósfera y los alveolos pulmonares, lo que

permite que los gases se renueven al intercambiarse a través de la membrana alveolo-capilar desde el

espacio alveolar a los capilares perialveolares (Córdova A. y cols., 1994a). La membrana alveolo-capilar

está por capas sucesivas que integran: una sustancia tenso-activa (el surfactante pulmonar), el epitelio

alveolar, la membrana basal epitelial y la membrana basal capilar y el endotelio capilar. El proceso de

intercambio gaseoso se realiza mediante difusión simple, por lo que depende del gradiente de presión

parcial del gas entre los alveolos y la sangre, del coeficiente de difusión de los gases y del grosor y

superficie de la membrana alveolo-capilar, que se relacionan según la ecuación de Fick (Córdova A y

cols., 1994b). El O2 difunde desde los alveolos a los capilares y el CO2 desde los capilares a los alveolos.

1.3.3. Perfusión pulmonar.

La circulación pulmonar se inicia en la arteria pulmonar que, desde el ventrículo derecho, se

divide en rama pulmonar izquierda y derecha. Ambas ramas se dirigen a cada pulmón sufriendo sucesivas

ramificaciones de manera similar a como ocurre en el árbol bronquial, hasta formar los capilares peri-


21

alveolares. Una vez que ocurre el intercambio gaseoso, las vénulas pulmonares recogen la sangre

oxigenada y la conducen hacia las venas pulmonares que finalmente desembocan en la aurícula izquierda.

Una oxigenación adecuada de la sangre requiere la distribución del flujo sanguíneo hacia los

alveolos mejor oxigenados (Guyton AC y Hall EJ, 2006). Este proceso se regula mediante la

vasoconstricción de los capilares que contactan con alveolos en los que la presión parcial O2 se reduce

hasta los 75mmHg produciéndose un aumento de la resistencia vascular. Dicho efecto es contrario a lo

que ocurre en la circulación sistémica, donde se produce vasodilatación en respuesta a concentraciones

bajas de O2, y permite mantener la relación ventilación-perfusión de todas las áreas pulmonares en niveles

óptimos.

Varias investigaciones han relacionado las acciones de angiotensina II (AII) con la

vasoconstricción de la circulación pulmonar en respuesta a la hipoxia (McMurtry IF, 1984; Alexander JM

y cols., 1976).

1.3.4. Sistema renina-angiotensina.

El sistema renina-angiotensina es considerado como un sistema endocrino cuya principal función

es el mantenimiento de la presión arterial, balance de Na+ y volumen extracelular corporal (Hall JE,

2003). El angiotensinógeno, sintetizado en el hígado, pasa a la circulación donde es metabolizado por la

enzima renina producida por el aparato yuxtaglomerular del riñón (Persson PB y cols., 2004) y dando

lugar al decapéptido angiotensina I (AI) (Ménard J y cols., 1983). A continuación, la enzima conversora

de angiotensina (ACE; angiotensin coverting enzyme), presente fundamentalmente en la superficie de

células endoteliales de los capilares del pulmón (Ng KK y Vane JR, 1967), actúa sobre la AI dando lugar

al octapéptido angiotensina II (AII). La AII es considerada como la principal responsable de las acciones

generales del sistema renina-angiotensina (Paul M y cols., 2006, review).

Los estudios realizados en las últimas décadas, revelan una mayor complejidad del sistema

debido al descubrimiento de nuevos metabolitos biológicamente activos y a la localización de los

componentes del sistema renina-angiotensina en diversos tejidos, donde ejercen acciones locales de

manera independiente a los niveles circulantes de los péptidos precursores y que no pueden ser explicadas

con las teorías clásicas.

1.3.4.1. Componentes del sistema renina-angiotensina.

En 1956, se describió la principal enzima generadora de AII, ACE (Skeggs LT y cols., 1956).

Décadas después, se descubrió que ACE además inactiva el péptido vasodilatador angiotensina (1-7)

[A(1-7)] (Deddish PA y cols., 1998). Posteriormente, Donoghue y colaboradores (Donoghue y cols.,

2000), descubrieron una enzima con un 42% de homología con ACE pero con diferente actividad

bioquímica, puesto que su afinidad catalítica por AII es 400 veces mayor que por AI (Rice GI y cols.,

2004). Esta enzima fue denominada ACE2, y es responsable de la síntesis de A(1-7) a partir de AII

(Ferrario CM y cols., 2005).


22

La AII se aisló en 1940 (Braun-Menendez E y cols., 1940) y posteriormente se definió como un

potente vasoconstrictor (Page IH y cols., 1940). Los receptores de AII fueron identificados en 1974 como

receptores de membrana acoplados a proteínas G (Glossmann H y cols., 1974). Posteriormente, se

identificaron dos tipos de receptores de membrana para AII, AT1-R y AT2-R (Murphy TJ y cols., 1991;

Kambayashi Y y cols., 1993; De Gasparo M y cols., 2000, review).

AT1-R se localiza en los vasos sanguíneos y se desensibiliza con gran rapidez tras la unión de su

ligando (Griendling KK y cols., 1987). Su expresión se encuentra regulada por su principal agonista, AII.

De forma aguda, el aumento de los niveles de AII incrementa la activación de AT1-R, mientras que la

exposición crónica, reduce su expresión (Lassègue B y cols., 1995; Mehta PK y cols., 2007, review).

La mayor parte de las funciones fisiológicas conocidas de AII son mediadas por AT1-R (Peach

MJ, 1981 Catt KJ y cols., 1987), cuya activación induce vasoconstricción (Ferrario CM y cols., 1970),

proliferación, diferenciación y migración celular (Taniyama Y y cols., 2004). La unión de AII a AT2-R

desencadena acciones opuestas como son acciones apoptóticas y antiproliferativas (Yamada T y cols.,

1996) así como vasodilatadoras (You D y cols., 2005).

La expresión de AT2-R es muy abundante durante la etapa fetal, donde parece estar implicado en

el desarrollo del sistema vascular, y se reduce considerablemente tras el nacimiento (Shanmugam S y

cols., 1996). La expresión de AT2-R en etapa adulta se ha detectado en las células epiteliales de la región

bronquial, glándulas mucosas y de forma poco frecuente en las células endoteliales (Bullock GR y cols.,

2001). A pesar de que se considera que AT2-R media acciones opuestas a las desencadenadas por AT1-R

(Yamada T y cols., 1996), bajo ciertas condiciones patológicas como la hipertrofia cardiaca, la activación

de AT2-R desencadena la misma respuesta celular que AT1-R (Levy BI y cols., 1996). Su expresión se

encuentra regulada por diversos factores, así, los glucocorticoides y AII, por medio de AT1-R, reducen la

expresión de AT2-R (Kijima K y cols., 1995; Saito M y cols., 2008) mientras que interleuquina 1ß,

insulina, e IGF-1 la aumenta (Ichiki T y cols., 1995; Kambayashi Y y cols., 1996).

A(1-7) fue considerado como un péptido inactivo durante décadas. El descubrimiento de diversas

acciones biológicas inducidas por A(1-7) como la estimulación de la secreción de vasopresina (Schiavone

MT y cols., 1988) y la reducción de la presión sanguínea (Campagnole-Santos MJ y cols., 1989), permitió

incluir este péptido como un agente activo del sistema renina-angitensina.

A(1-7) se sintetiza a partir de AII por acción de la ACE2 y sus funciones son realizadas a través

de un receptor de membrana acoplado a proteínas G, el receptor Mas (Mas-R) (Santos RA y cols., 2003),

que ejerce efectos antiproliferativos, antihipertróficos y vasodilatadores (Grobe JL y cols., 2007;

Savergnini SQ y cols., 2010). Además de desencadenar respuestas celulares opuestas a las de AII, A(1-7)

inhibe sus acciones por ser una antagonista competitivo de AT1-R en concentraciones fisiológicas

(Gironacci MM y cols., 1999; Zhu Z y cols., 2002). Por otra parte, estudios in vitro han demostrado la

formación de hetero-oligómeros entre Mas-R y AT1-R que reducen la actividad de éste último un 50%.

En concordancia con los resultados obtenidos en líneas celulares, los ratones deficientes en Mas-R

presentan una mayor vasoconstricción por acción de AII (Kostenis E y cols., 2005)


23

El sistema renina-angiotensina puede considerarse como un sistema que media acciones

vasoconstrictoras y proliferativas a través de los componentes AII/ACE/AT1-R y acciones

vasodilatadoras y antiproliferativas a través de A(1-7)/ACE2/ Mas-R. Por otro lado, AII/ACE/AT2-R

además de desencadenar acciones vasodilatadoras y antiproliferativas, en ciertos estados patológicos se

han descrito las acciones opuestas (Levy BI y cols., 1996) (Figura 6). El balance entre los componentes

vasoconstrictores y vasodilatadores definirá las acciones locales predominantes del sistema.

Figura_6: Componentes del sistema renina-angiotensina.

1.3.4.2. Localización de los componentes del sistema renina-angiotensina en el pulmón.

El pulmón es susceptible a las acciones locales del sistema renina-angiotensina debido a la

expresión de sus componentes en este tejido.

La AII es sintetizada de forma muy abundante en el tejido pulmonar por la enzima ACE

(Campbell DJ y cols., 1995), localizada fundamentalmente en la superficie luminal de las células

endoteliales.

Los receptores de AII, AT1-R y AT2-R, se distribuyen ampliamente en el pulmón en distintos

tipos celulares. AT1-R se expresa en células vasculares del músculo liso, macrófagos, fibroblastos

(Bullock GR y cols., 2001) y neumocitos tipo II (Wang R y cols., 1999). AT2-R se localiza en células de

las glándulas mucosas, en algunas células endoteliales, en células epiteliales de la porción bronquial

(Bullock GR y cols., 2001) y alveolar, como en los neumocitos tipo II (Wang R y cols., 1999) y en

fibroblastos (Königshoff M y cols., 2007).

La enzima de síntesis de A(1-7), ACE2, se localiza en células epiteliales (células de Clara y

neumocitos tipo II), células endoteliales y células vasculares de músculo liso (Wiener RS y cols., 2007).

AT2-RAT1-R

Mas-R

AngII

AngI

Angiotensinógeno

ACEACE2

Ang (1-7)

Vasoconstricción.Proliferación.

Vasodilatación.Apoptosis.

-


24

El receptor de A(1-7), Mas-R, se localiza fundamentalmente en las células endoteliales (Peiró C y

cols., 2013; Fraga-Silva RA y cols., 2013) aunque experimentos realizados con células del epitelio

alveolar sugieren su presencia en este tipo celular (Uhal BD y cols., 2011).

1.3.4.3. Alteraciones en el equilibrio del sistema renina-angiotensina.

El sistema renina-angiotensina es un factor clave en la fisiología pulmonar, ya que las

alteraciones en la expresión y actividad de sus componentes a nivel local se han relacionado con

patologías pulmonares.

En el pulmón, la sobrestimulación de los componentes vasoconstrictores y proliferativos frente a

los vasodilatadores y apoptóticos generan disfunción endotelial, vasoconstricción (Orfanos SE y cols.,

2000) e hipertrofia (Mehta PK y cols., 2007, review), lo que suele ir asociado al desarrollo de hipertensión

pulmonar.

La hipertensión pulmonar se caracteriza por resistencia vascular con incremento de la presión

arterial como consecuencia de la proliferación e hipertrofia de fibroblastos y células vasculares de

músculo liso además de inflamación (Rabinovitch M, 2012, review). La resistencia vascular persistente

conduce a hipertrofia ventricular derecha con fallo cardiaco e incluso a la muerte. El desequilibrio local

de los agentes vasoactivos y con acciones proliferativas o apoptóticas se relacionan con desarrollo de

hipertensión pulmonar (Farber HW y cols., 2004, review).

Las alteraciones vasculares de la hipertensión pulmonar son revertidas mediante la inhibición de

los agentes vasoconstrictores y proliferativos (AII/ACE/AT1-R) y la estimulación de los agentes

vasodilatadores y apoptóticos (A(1-7)/ACE2/Mas-R o AII/ACE/AT2-R) (Ferreira AJ y cols., 2009). La

sobreestimulación de ACE2 muestra efectos protectores en otras patologías pulmonares como el síndrome

de distrés respiratorio agudo (Imai Y y cols., 2005) o la fibrosis pulmonar (Li X y cols., 2008).

Existen números estudios que demuestran los efectos protectores de A(1-7)/ACE2/Mas-R en la

fisiopatología respiratoria. Así, en un modelo animal de distrés respiratorio agudo inducido, la

administración de ACE2 recombinante humana inhibe el incremento de AII, reduce la hipoxemia y la

hipertensión pulmonar (Treml B y cols., 2010). Asimismo, la sobreexpresión de ACE2 revierte el

aumento de la presión ventricular sistólica derecha, la fibrosis pulmonar y el desequilibrio entre los

componentes del sistema renina-angiotensina en un modelo animal de hipertensión (Yamazato Y y cols.,

2009) o de fibrosis pulmonar inducida (Shenoy V y cols., 2010).

Los péptidos vasoactivos del sistema renina-angiotensina, no solo ejercen efectos en el sistema

vascular, sino que también se han descrito algunas acciones en el epitelio pulmonar ya que los receptores

de AII, AT1-R y AT2-R, se han localizado en los neumocitos tipo II que forman parte del epitelio de los

alveolos. Aunque A(1-7) produce acciones en este tipo celular, la localización pulmonar de su receptor,

Mas-R, no ha sido determinada (Uhal BD y cols., 2011).


25

A pesar de las acciones proliferativas descritas en otros tipos celulares, la AII induce apoptosis en

cultivo primario de neumocitos tipo II de rata y en una línea tumoral de células epiteliales de pulmón

humano (A549) a través de AT1-R (Wang R y cols., 1999). ACE2 inhibe las acciones apoptóticas de AII

en cultivo primario de neumocitos tipo II de rata por dos vías: al reducir la acumulación de AII y a través

de las acciones directas de A(1-7), puesto que dichos efectos son revertidos por un antagonista de Mas-R

(Uhal BD y cols., 2011). Considerando que la apoptosis de las células epiteliales es un proceso crítico en

el desarrollo de fibrosis pulmonar, los efectos antiapoptóticos descritos de ACE2 en los neumocitos tipo

II resultan beneficiosos en el tratamiento de este tipo de patología.

1.3.5. El epitelio alveolar.

El epitelio alveolar, que proporciona una superficie de intercambio gaseoso en humanos de 140m2

aproximadamente, comprende dos tipos de células epiteliales; los neumocitos tipo I y los neumocitos tipo

II (Crapo JD y cols., 1983).

Los neumocitos tipo I son células planas que ocupan el 95% del epitelio alveolar (Crapo JD y

cols., 1983). Existen pocos estudios sobre este tipo celular, y se considera que su principal función es

establecer una fina barrera física entre el espacio alveolar y los capilares permitiendo el intercambio

gaseoso (Gartner LP Y Hiat JL, 2002). Sin embargo, se han descrito algunas acciones relacionadas con el

transporte iónico activo. Así, los neumocitos tipo I contribuyen al mantenimiento del balance del fluido

alveolar, puesto que se ha demostrado la existencia de un transporte de Na+ activo en neumocitos tipo I a

través de los canales ENaC (epithelial sodium channel ) (Johnson MD y cols., 2002).

Los neumocitos tipo II, a pesar de ser más numerosos que los neumocitos tipo I, ocupan el 5%

restante de la superficie alveolar debido a su pequeño tamaño (Gartner LP Y Hiat JL, 2002). Son células

cuboidales entremezcladas entre los neumocitos tipo I. Entre las funciones de los neumocitos tipo II se

incluye la reparación del epitelio alveolar, ya que son capaces de dividirse y diferenciarse a neumocitos

tipo I (Andreeva AV y cols., 2007, review). Además, también contribuyen en la respuesta inmune a nivel

pulmonar mediante la secreción de interleuquinas (Crestani B y cols., 1994; Thorley AJ y cols., 2007) y

en el mantenimiento del balance del fluido alveolar (Yue G y cols., 1995). Sin embargo, su principal

función y la más extensamente estudiada es la síntesis y secreción del surfactante pulmonar.

La característica más distintiva de los neumocitos tipo II es la presencia de unos orgánulos

especializados conocidos con el nombre de cuerpos laminares (LBs; lamellar bodies). Cada neumocito

tipo II contiene entre 120-180 LBs (Young SL y cols., 1991) que presentan múltiples membranas

concéntricas (Figura 7) (Schmitz G y cols., 1991). Estos orgánulos especializados contienen el surfactante

pulmonar que es secretado hacia el espacio alveolar.


26

Figura_7: Epitelio alveolar. T1 cell (type 1 pneumocyte), T2 cell (type 2 pneumocyte), LBs (lamellar bodies) y ECM

(extracellular matrix) Modificado de Whitsett JA, Kalinichenko VV. J Clin Invest. 2011; 121(7):2543-5. .ECM, matriz

extracelular.

1.3.6. Surfactante Pulmonar.

La primera vez que la tensión superficial se relacionó con la superficie alveolar fue en 1929,

cuando von Neergaard descubrió que la presión necesaria para llenar los pulmones de aire era mayor que

la necesaria para llenarlos de agua (Córdova A y cols., 1994c). A partir de ese momento, se consideró la

existencia de una capa alveolar que reduce la tensión superficial para estabilizar la respiración.

Fue en 1955 cuando Pattle RE definió la presencia de una fina monocapa lipídica distribuida a lo

largo del epitelio alveolar. En 1957, Clements demostró que la película superficial procedente de

extractos pulmonares alcanzaba un valor de tensión superficial muy bajo en respuesta a condiciones de

compresión (Clements JA y cols., 1957)

Hoy en día se sabe que el surfactante pulmonar es un complejo lipoproteico sintetizado y

secretado por los neumocitos tipo II hacia el espacio alveolar en donde forma una monocapa, (Weibel ER

y cols., 1968; Goerke J y cols., 1974) y que presenta importantes funciones fisiológicas que permiten la

respiración adecuada, entre las que se incluye:

• Reducción del esfuerzo muscular necesario para la ventilación al facilitar la distensión pulmonar

(Córdova A y cols., 1994).

• Reducción de la tensión superficial, lo que evita el colapso alveolar al final de la espiración y

estabiliza los alveolos de menor tamaño (Farrell PM y cols., 1975).

• Protección frente a agentes oxidantes e infecciones (Heffner JE y Repine JE, 1989; Coonrod JD y

cols. 1984).

LBs


27

Aproximadamente el 88% del surfactante pulmonar está formado por fosfolípidos, un 2%

representa lípidos neutros como el colesterol y el 10 % restante son proteínas (Figura 8).

Figura_8: Composición del surfactante pulmonar. Modificado de Jobe AH y cols., Clin Perinatol. 2001; 28(3):655-669.

La fosfatidilcolina (PC; phosphatidylcholine) es el fosfolípido más abundante (70-80% de la

composición lipídica) y principal responsable de la disminución de la tensión superficial. Entre el 50 y el

70% de la PC está saturada en forma de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC;

dipalmitoylphosphatidylcholine). Otros fosfolípidos menos abundantes son el fosfatidilglicerol (10%),

fosfatidiletanolamina (5%), fosfatidilinositol (3%), fosfatidilserina, lisofosfatidilcolina y esfingomielina

presentes en cantidades pequeñas, menos del 2% (Haagsman HP Y van Golde LMG, 1991, review).

Mediante centrifugaciones diferenciales del fluido bronquio-alveolar se han podido identificar 4

tipos de proteínas surfactantes (SPs; surfactant proteins. Figura 9), que se clasifican en hidrofílicas (SP-A

y SP-D) e hidrofóbicas (SP-B y SP-C) (Haagsman HP y Diemel RV, 2001, review).

SP-A y SP-D pertenecen a un subgrupo de las lectinas conocidas bajo el nombre de colectinas o

lectinas tipo C (Drickamer K y Taylor ME, 1993). Estas proteínas son oligómeros con dominios de unión

a carbohidratos en el extremo carboxi-terminal y un dominio de tipo colagénico en el extremo amino-

terminal. SP-A se halla unida al componente lipídico del surfactante, mientras que SP-D se encuentra

libre en el fluido bronquio-alveolar (Haagsman HP y Diemel RV, 2001, review).

Tanto SP-A como SP-D se relacionan con el sistema inmune innato, ya que reconocen una gran

cantidad de patógenos (Crouch EC, 1998; Haagsman HP, 1998, review) y se unen a macrófagos.

En 1979, se descubrió la presencia de proteínas hidrofóbicas en el surfactante pulmonar

contenidas en los cuerpos laminares aislados de pulmones de cerdo y en el fluido bronquio-alveolar

2%

8%

10%

30%

40%5%

2%

2%

1%

10%

SP-A

SP-B

SP-C

SP-D

DPPC

Unsaturaded

Phosphotidylcholine

Phosphatidylglycerol

Other

Phospholypids

Neutral

Lipids


28

(Phizackerley PJ y cols., 1979). Se identificaron dos tipos de proteínas (SP-B y SP-C) con un alto

contenido en aminoácidos hidrofóbicos (Glasser SW y cols., 1987).

Figura_9: Estructura de las SPs hidrofílicas (SP-A y SP-D) e hidrofóbicas (SP-B y SP-C). Haagsman HP y Diemel RV

Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2001; 129(1):91-108. Review.

1.3.6.1. Secreción del surfactante pulmonar.

La secreción masiva del surfactante pulmonar ocurre en el primer día de vida postnatal. En la

etapa fetal el pulmón está lleno de fluido, siendo innecesaria la presencia del surfactante pulmonar en la

superficie alveolar. Tras el nacimiento, el fluido que llena la cavidad pulmonar es reabsorbido

activamente por fuerzas osmóticas generadas por canales de Na+ (Hummler E y cols., 1996) localizados

en epitelio alveolar. La primera respiración postnatal requiere la presencia del agente tensoactivo que

estabilice los alveolos y reduzca la tensión superficial.

Una vez sintetizados, los componentes del surfactante pulmonar son transportados hacia los LBs

para ser secretados a la luz alveolar por exocitosis. La incorporación de los componentes ocurre a través

de transportadores de membrana ABC (ATP binding cassette transporter) localizados en los LBs (Bates

SR y cols., 2005; Shulenin S y cols., 2004).


29

El surfactante, una vez secretado, sufre una serie de transformaciones complejas en las que sus

componentes adoptan una estructura con forma de red tridimensional denominada mielina tubular (Figura

10). En esta red quedan retenidos los fosfolipidos para su posterior incorporación en la monocapa alveolar

(Goerke J y cols., 1998).

El principal estímulo para que se produzca la secreción del surfactante pulmonar es la distensión

de los neumocitos tipo II causada por la respiración (Wirtz HR Y Dobbs LG, 1990). Este mecanismo se

relaciona con un aumento del Ca+2 intracelular que promueve la exocitosis de los LBs (Ashino Y y cols.,

2000).

Existen tres mecanismos moleculares que median la secreción del surfactante pulmonar que

consisten en la activación de la adenilato ciclasa con la consecuente formación de AMPc, proteín-kinasas

dependientes de AMPc y PKC e incremento del Ca+2 intracelular que implica la activación de proteín-

kinasas dependientes de Ca+2-calmodulina (Rooney SA, 2001, review).

El inicio del parto es uno de los principales estímulos en la secreción del surfactante pulmonar en

la etapa fetal (Rooney SA y cols., 1977), en este mecanismo parecen estar implicados los agonistas ß-

adrenérgicos (Marino PA Y Rooney SA, 1981).

Los agonistas colinérgicos estimulan la secreción del surfactante de forma indirecta por medio de

catecolaminas, que estimulan los receptores ß-adrenérgicos localizados en la membrana plasmática de los

neumocitos tipo II (Rooney SA, 2001, review).

El ATP incrementa la secreción del surfactante por medio de receptores purinérgicos localizados

en los neumocitos tipo II. Este mecanismo parece ser mediado por los neumocitos tipo I que secretan

ATP en respuesta a estímulos mecánicos que actúa sobre los neumocitos tipo II (Patel AS y cols., 2005).

Otros factores implicados en la estimulación de la secreción del surfactante pulmonar son: el

péptido liberador de gastrina (Asokananthan N y cols., 1996), la interleuquina-1ß y el factor de necrosis

tumoral α (Benito E y cols., 1998b), las lipoproteínas de baja y alta densidad (Pian MS Y Dobbs LG,

Inspiration �� Expiration

Figura_10: Ciclo de vida del surfactante

pulmonar en la superficie alveolar.

LB, lamellar bodies; TB, tubular myelin; γ,

tensión superficial; SAP, surface associated

phase; DPPC, dipalmitoylphosphatidylcholine.

Modificado de Goerke J, Biochim Biophys

Acta. 1998; 1408(2-3):79-89.


30

1997; Voyno-Yasenetskaya TA y cols., 1993), el factor activador plaquetario (Benito E y cols., 2002) y

GLP-1 (Benito E y cols., 1998a).

1.3.6.2. Proteínas surfactantes hidrofílicas, SP-A y SP-D.

� SP-A.

El producto primario obtenido tras la traducción del mRNA de SP-A es una secuencia

aminoacídica altamente conservada (Haagsman HP y cols., 2001, review) que contiene 248 aminoácidos

(Weaver TE y Whitsett JA, 1991, review).

El extremo amino-terminal de SP-A en humano y rata incluye un péptido señal de 20

aminoácidos seguido por 7-10 aminoácidos que contienen residuos de cisteína implicados en la formación

de puentes disulfuro con otras cadenas polipeptídicas de SP-A (Benson B y cols., 1985; Haas C y cols.,

1991). Siguiendo el extremo amino-terminal, se encuentra el domino de tipo colagénico que consiste en

una secuencia aminoacídica que al asociarse con otras 2 cadenas polipeptídicas de SP-A forma una triple

hélice. En este domino se suceden 13 tripletes de Gly-X-Y, donde Y frecuentemente es hidroxiprolina,

que son interrumpidos por una secuencia de Pro-Cys-Pro-Pro. A esta secuencia se unen 6 triples hélices

formando una estructura en forma de ramillete (Haagsman HP y Diemel RV, 2001, review) (Figura 9).

Unido al dominio de tipo colagénico se encuentra el domino carboxi-terminal de 130 aminoácidos, de

éstos, 18 residuos están implicados en el reconocimiento de carbohidratos gracias a la existencia de 4

cisteínas que forman puentes disulfuro en la propia cadena (Haagsman HP y cols., 1989). La unión de SP-

A a carbohidratos (residuos de manosa) es dependiente de Ca+2 (Haagsman HP y cols., 1987), y se

relaciona con su función en el sistema inmune innato (Weaver TE y Whitsett JA, 1991, review). Entre el

dominio de tipo colagénico y la región de unión a carbohidratos se localiza la secuencia de unión a lípidos

que incluye 21 residuos que forman una hélice de carácter anfipático (Ross GF y cols., 1986).

Además de la formación de oligómeros por asociación del producto primario de la traducción,

SP-A sufre otro tipo de procesamiento post-traduccional. Así, la incorporación de ácido siálico a la forma

precursora (26kDa) puede dar lugar a formas maduras de peso molecular variable (32-36kDa) (Whitsett

JA y cols., 1985).

SP-A es la proteína surfactante más abundante y la primera en ser descubierta (Haagsman HP y

Diemel RV, 2001, review). Interviene en la formación de la película que forma el surfactante a lo largo

del epitelio alveolar, puesto que proporciona el entramado al cual se unen los lípidos (Voorhout WF y

cols., 1991). Asimismo, SPA interviene en la homeostasis del surfactante, ya que induce la captación y

secreción de los fosfolípidos en cultivo primario de neumocitos tipo II mediante su unión a receptores

específicos de membrana (Kuroki Y y cols., 1988; Ryan RM y cols., 1989). Por otro lado, interviene en la

respuesta inmune innata protegiendo la mucosa respiratoria frente a patógenos y alérgenos (Wright JR,

2005, review).

A pesar de ser la proteína surfactante más abundante, no parece ser imprescindible para la función

pulmonar. Así, ratones knock-out para SP-A (-/-) no muestran problemas respiratorios ni alteraciones en el


31

metabolismo de los lípidos del surfactante (Korfhagen TR y cols., 1996), sin embargo, tienen una mayor

susceptibilidad a infecciones respiratorias que los ratones wild type (LeVine AM y cols., 1997).

� SP-D.

En 1988, Pearson y colaboradores descubrieron una glicoproteína en el medio de cultivo de

neumocitos tipo II, también aislada del lavado bronquio-alveolar y del surfactante pulmonar de rata

(Persson A y cols., 1988; Persson A y cols., 1989). Dicha glicoproteína, con peso molecular superior al de

SP-A (43kDa) fue denominada SP-D y presenta una estructura similar a la de SP-A. En su secuencia

aminoacídica se distingue un extremo amino-terminal, una región de tipo colagénica y el extremo

carboxi-terminal de reconocimiento de carbohidratos que contiene secuencias consenso de Asn-Gly-Ser.

SP-D presenta una estructura cruciforme por asociación de cuatro trímeros (Figura 9). El dominio de tipo

colagénico es más largo que el descrito para SP-A (Haagsman HP y cols., 2001, review). La principal

función de SP-D es su papel en el sistema inmune innato, a través de la opsonización y activación del

complemento, (Holmskov U y cols., 1994) aunque también se ha descrito su asociación con

fosfatidilinositol del surfactante pulmonar de manera dependiente de Ca+2 (Ogasawara Y y cols., 1992).

1.3.6.3. Proteínas surfactantes hidrofóbicas: SP-B y SP-C.

� SP-B.

SP-B se localiza en neumocitos tipo II y en células de Clara del epitelio bronquial. El producto

primario de la traducción del mRNA de SP-B en humano contiene 381 aminoácidos (Glasser SW y cols.,

1987) y en rata 379 aminoácidos (Emrie PA y cols., 1989).

El precursor de SP-B contiene un extremo amino-terminal, cuya secuencia en humano se

corresponde con los aminoácidos en posición 24-200; un péptido señal de 20 a 23 aminoácidos; la

secuencia de la proteína madura, de 79 aminoácidos (201-279) y un extremo carboxi-terminal (280-381),

(Haagsman HP y cols., 2001, review). La secuencia aminoacídica de SP-B se encuentra altamente

conservada, ya que el precursor muestra un 67% de homología entre especies y la proteína madura un

80% (Weaver TE y cols., 1991, review).

El precursor de SP-B (~42kDa) sufre un procesamiento post-traduccional en el que se libera el

extremo amino-terminal, dando lugar a un péptido del que se escinde el extremo carboxi-terminal

mediante proteolisis originándose la proteína madura de 6-8kDa (Glasser SW y cols., 1987). La proteína

madura muestra hélices anfipáticas y regiones hidrofóbicas, lo que le confiere capacidad de asociación

con fosfolípidos (Figura 9) (Hawgood S y cols., 1987). La proteína madura dimeriza mediante la

formación de enlaces disulfuro en posición Cys48 (Johansson J y cols., 1991), dando lugar a un

oligopéptido de ~18kDa. Esta dimerización parece ser necesaria para la actividad de la proteína in vivo

(Veldhuizen EJ y cols., 2000).

SP-B es imprescindible para la función respiratoria, ya que mutaciones en el gen que lo codifica,

causan enfermedades pulmonares severas (Nogee LM, 1998). De igual forma, algunas patologías de


32

insuficiencia respiratoria en etapa neonatal, como el síndrome RDS (repsiratory distress syndrome) y en

etapa adulta, como el síndrome ARDS (acute respiratory distress syndrome), se asocian con

polimorfismos de SP-B (Floros J y cols., 1998). Las alteraciones asociadas a las deficiencias en SP-B han

sido evaluadas en ratones knock out para SP-B (-/-). Estos animales, a pesar de que presentan pulmones

normales durante el desarrollo fetal, manifiestan una reducción del volumen pulmonar con ausencia de

mielina tubular y morfología anormal de los cuerpos laminares en los neumocitos tipo II. Las alteraciones

descritas en animales SP-B (-/-) dan lugar a un fallo respiratorio letal tras el nacimiento (Clark JC y cols.,

1995).

� SP-C.

El péptido precursor de SP-C contiene 179 aminoácidos y un peso molecular aproximado de

22kDa (Haagsman HP y Diemel RV, 2001; Rooney SA y cols., 1994, reviews). Este péptido incluye; la

secuencia de la proteína madura de 5kDa bajo condiciones reductoras (Glasser SW y cols., 1988), un

extremo amino-terminal y un extremo carboxi-terminal imprescindible para el tráfico intracelular

(Haagsman HP y cols., 2001; Rooney SA y cols., 1994, reviews).

La proteína madura es altamente hidrofóbica, debido a la presencia de valinas y leucinas en

posición 9-34 de la secuencia que forman hélices alfa permitiendo su asociación a bicapas lipídicas

(Vandenbussche G y cols., 1992), y a la unión covalente de un ácido palmítico a cisteínas en el extremo

amino terminal de la proteína madura (Curstedt T y cols., 1990), lo que aporta estabilidad a la monocapa

lipídica del surfactante (Qanbar R y cols., 1996).

La presencia de aminoácidos con carga positiva, lisina y prolina en posición 11 y 12 de la

proteína madura respectivamente, está altamente conservada y permite la interacción de SP-C con los

fosfolípidos de la monocapa del surfactante con carga negativa (Creuwels LA y cols., 1995).

SP-C, localizada exclusivamente en los neumocitos tipo II, presenta las mismas funciones que las

descritas para SP-B. SP-C no parece ser igual de imprescindible para la función respiratoria que SP-B,

puesto que los ratones knock out para SP-C (-/-) muestran una fisiología respiratoria normal sin cambios

significativos en la morfología pulmonar (Glasser SW y cols., 2001).

A pesar de que el componente lipídico es el principal responsable de las propiedades tensoactivas,

las SPs son esenciales para la función respiratoria, puesto que contribuyen en las propiedades biofísicas

de los lípidos surfactantes.

La administración de SP-B y SP-C sintéticos a conejos nacidos de forma prematura y mantenidos

con respiración artificial, mostraron una reducción de la tensión superficial manteniendo la estabilidad

alveolar de manera similar a lo ocurrido tras la administración de la fracción lipídica del surfactante

(Suzuki Y y cols., 1986). En humanos, la capacidad respiratoria de niños prematuros con RDS mejora de

manera significativa tras la administración exógena de surfactante compuesto por SP-B y SP-C (Merritt

TA y cols., 1989, review)


33

De igual forma, SP-A y SP-D también mejoran la estabilidad alveolar al contribuir en la

asociación de la fracción lipídica a la monocapa (Hawgood S y cols., 1987; Ogasawara Y y cols., 1992)

(Tabla_1).

SP-B y SP-A forman la mielina tubular, donde poseen un papel fundamental en el ensamblado de

los fosfolípidos y permitiendo su organización estructural (Suzuki Y y cols., 1989) (Tabla_1).

SP-A, SP-B y SP-C promueven que los neumocitos tipo II lleven a cabo la recaptación de los

fosfolípidos de la monocapa (Wright JR y cols., 1987; Claypool WD y cols., 1984), contribuyendo así al

reciclaje de fracción lipídica. La secreción de PC por los neumocitos tipo II puede ser inhibida por SP-A

(Dobbs LG y cols., 1987) (Tabla 1).

.

Funciones de las SPs SP-A SP-B SP-C SP-D

1. Contribución a las propiedades tensoactivas de los fosfolípidos. + + + +

2. Formación de mielina tubular. + + - ¿?

3. Turnover de los fosfolípidos del surfactante. + + + -

4. Inhibición de la secreción del surfactante. + - - -

5. Inducción de la fagocitosis de patógenos. + - - +

Tabla_1: Funciones de las proteínas surfactantes. Modificado de Weaver TE y Whitsett JA , Biochem J. 1991; 273(Pt 2):249-

264. Review.

1.3.7. Desarrollo pulmonar.

El desarrollo del sistema respiratorio implica la diferenciación y proliferación de 40 tipos

celulares así como la ramificación de los conductos aéreos. Dicho proceso está regulado por diversas

señales moleculares que definen un patrón espacio-temporal de interacción entre células epiteliales y

mesenquimáticas, proliferación celular, deposición de componentes de la matriz extracelular, secreción de

factores de crecimiento y expresión de receptores (Pinkerton KE y Joad JP, 2000, review).

En mamíferos, el desarrollo pulmonar se inicia en la embriogénesis y continúa con tres etapas

fetales; etapa pseudoglandular, canalicular y sacular. El crecimiento pulmonar completo se alcanza en la

etapa postnatal, momento en el que se forman el 80% de los alveolos. En la figura 11 se muestran los días

de gestación en humanos, que se corresponden con cada etapa de desarrollo pulmonar, así como su

correspondencia con las etapas de gestación en la rata (DiFiore JW y Wilson JM, 1994).


34

Figura_11: Etapas de desarrollo pulmonar y su correspondencia con las semanas de gestación en humanos y días de

gestación de rata. Modificado de Metzger RJ y cols., Nature 2008 ;453(7196):745-750. E, días de vida fetal, P, días de vida

postnatal.

1.3.7.1. Etapas de desarrollo pulmonar.

� Etapa embrionaria.

Los pulmones comienzan a formarse a partir de la evaginación del intestino anterior que se divide

dicotómicamente para formar conductos tubulares que invaden el tejido mesenquimático. Las

ramificaciones originadas en este periodo representarán la parte más proximal del futuro árbol traqueo-

bronquial.

Los factores de transcripción definen el adecuado patrón espacio temporal que permite el

desarrollo pulmonar durante la embriogénesis. Entre ellos se incluyen: HNF-3ß o Foxa-2 (hepatocyte

nuclear factor 3ß) y TTF-1 o Nkx2.1 (thyroid trasncription factor 1 o NK2 homeobox 1)

En esta etapa, la vascularización pulmonar comienza a formarse a partir de los arcos aórticos.

� Desarrollo pulmonar fetal.

• Etapa pseudoglandular.

Los conductos aéreos continúan ramificándose hasta formar los bronquiolos terminales, que

presentan en las regiones más distales, células epiteliales con morfología cuboidal. En esta etapa, la

proliferación y diferenciación celular es regulada, temporal y espacialmente, por las interacciones entre

células epiteliales y mesenquimáticas, por moléculas de la matriz extracelular (Roman J y McDonald JA,

1992; Durham PL y Snyder JM 1995) y por factores de crecimiento.

En esta etapa continúa la formación de los vasos sanguíneos siguiendo el mismo patrón espacial

que el árbol bronquial.

Etapa Embrionaria Etapa

Pseudoglandular Etapa Canalicular Etapa Sacular

Etapa alveolarE13-E18

E18-E20E21-P1

P5_P10_P15_P20_P25_P30

<E13RATA

HUMANO Semana_10 Semana_20 Semana_30 Semana_40 3 meses----2años

Periodo postnatal


35

• Etapa Canalicular.

En la etapa canalicular se diferencian las células epiteliales que formarán parte de la futura

membrana respiratoria, a través de la cual, se realizará el intercambio gaseoso. En esta etapa se inicia la

síntesis de los componentes del surfactante pulmonar. En la rata, las proteínas surfactantes comienzan a

ser detectables el día 18.5 del periodo fetal (E18.5) coincidiendo con el inicio de la etapa de desarrollo

(Schellhase DE y cols., 1989).

• Etapa Sacular.

Las regiones más periféricas de los conductos forman espacios aéreos ensanchados denominados

sáculos. Los sáculos ensanchan y alargan el espacio aéreo mediante la adición de nuevas generaciones de

conductos respiratorios, incrementando de manera significativa la superficie de intercambio gaseoso.

Durante esta etapa, la red de capilares continúa creciendo en longitud y diámetro.

� Etapa postnatal.

• Etapa Alveolar.

La formación de los alveolos continúa en el periodo postnatal. En esta etapa, se incrementan los

conductos aéreos y la superficie de intercambio gaseoso por ramificaciones dicotómicas y septación de

los sacos terminales (Zeltner TB y cols., 1987). Inicialmente, los septos se encuentran rodeados por una

doble capa de capilares. A lo largo de la etapa alveolar ocurre la maduración de la microvasculatura en la

que los capilares se fusionan formando una única capa (Mund SI y cols., 2008).

1.3.7.2. Factores reguladores de la maduración pulmonar.

Las proteínas surfactantes comienzan a ser detectables en la etapa canalicular del desarrollo

pulmonar. En la rata esta etapa se corresponde con los días de desarrollo fetal E18.5-E20 (Figura 11). El

contenido proteico de SP-A, SP-B y SP-C se incrementa 3 veces en E19 con respecto a los niveles

detectados en E18. En la etapa sacular (E21), las proteínas surfactantes aumentan de 6 a 9 veces respecto

a los niveles detectados en la etapa previa de desarrollo, pero sin mostrar cambios significativos con

respecto al primer día de vida postnatal (Schellhase DE y cols., 1989).

A lo largo del desarrollo fetal, se produce un aumento de la síntesis de las SPs en el pulmón. El

objetivo de este incremento, es alcanzar la concentración necesaria, que permita la función respiratoria

adecuada durante la etapa postnatal. Existen diversos factores que regulan la síntesis de las proteínas

surfactantes, entre los que se incluyen factores hormonales como los glucocorticoides o los esteroides

gonadales y factores de transcripción como Nkx2.1.

� Glucocorticoides.

Al final de la gestación, el incremento de la secreción de glucocorticoides es imprescindible para

la maduración anatómica y funcional del pulmón (Liggins GC y cols., 1994).


36

Las acciones fisiológicas de los glucocorticoides son ejercidas mediante su unión al receptor

citoplasmático (GR; glucocorticoid recepetor). La unión ligando-receptor induce su dimerización y

translocación al núcleo celular, donde se une a secuencias consenso o elementos respuesta a

glucocorticoides (GRE; glucocorticoid response element), localizadas en las regiones promotoras de los

genes cuya expresión regula (Parker M, 1983). Además, los glucocorticoides también pueden regular la

expresión génica por interacción con otros factores de transcripción o modulando la estabilidad de las

moléculas de mRNA (Beato M, 1989).

En etapas tempranas del desarrollo, los pulmones son susceptibles a las acciones locales de los

glucocorticoides. Estudios en tejido fetal han demostrado que la expresión de la enzima que inactiva el

cortisol (11ß-deshidrogenasa tipo 2) se encuentra reducida, lo que lleva a un incremento en los niveles

locales de cortisol (Condon J y cols., 1998) que actúan sobre el desarrollo pulmonar.

Los ratones knock out para GR presentan retraso en el desarrollo del pulmón durante la etapa

canalicular y/o sacular, y mueren pocas horas después del nacimiento por fallo respiratorio (Cole TJ y

cols., 1995). El uso de ratones deficientes en GR en las células epiteliales o en las mesenquimáticas,

permitió desvelar el papel fundamental de los glucocorticoides sobre las células mesenquimáticas durante

el desarrollo pulmonar, siendo más limitadas sus acciones sobre las células epiteliales (Habermehl D y

cols., 2011).

Liggins y Howie, a finales de los años 60, fueron los primeros en descubrir los efectos

estimuladores de los glucocorticoides sobre la maduración pulmonar y en considerarlos para el

tratamiento prenatal en madres con riesgo de sufrir partos prematuros (Liggins GC, 1968; Liggins GC,

1969; Liggins GC y Howie RN, 1972). La administración prenatal de glucocorticoides, entre 48h y 7 días

antes del parto, reduce considerablemente la muerte de niños prematuros debido al síndrome de distrés

respiratorio (RDS: respiratory distress syndrome) (Crowley PA, 1995).

Los efectos de los glucocorticoides en la maduración pulmonar (Figura 12) incluyen por un lado,

cambios estructurales a lo largo del desarrollo pulmonar mediante la reducción de las paredes alveolares y

el incremento del volumen pulmonar (Polglase GR y cols., 2007), y por otro, inducción de la síntesis del

surfactante pulmonar (Ligins GC, 1969). Estas acciones ocurren como consecuencia de la modulación

que ejercen los glucocorticoides sobre diferentes factores de crecimiento (Jaskoll T y cols., 1996), efecto

activador de la enzima de síntesis de PC (Gross I y cols., 1983) e inducción de la transcripción de las

proteínas surfactantes.


37

Figura_12: Efectos de los glucocorticoides en el desarrollo pulmonar. Tomado de Bolt RJ y cols., Pediatr Pulmonol. 2001; 32(1):76-91. G, glucocorticoides; R, receptor de glucocorticoides.

Las acciones de los glucocorticoides sobre la síntesis de proteínas surfactantes SP-A y SP-B

ocurren gracias a la presencia de elementos de respuesta a glucocorticoides en sus regiones promotoras

(White RT y cols., 1985; Pilot-Matias TJ y cols., 1989).

La regulación de la transcripción de SP-A por glucocorticoides es dependiente de la dosis. Así,

concentraciones menores a 10nM incrementan los niveles de mRNA y proteicos de SP-A en explantes de

pulmones fetales (Ballard PL y cols., 1986). Por el contrario, concentraciones superiores a 1µM inhiben

la expresión de SP-A (Boggaram V y cols., 1989) debido a alteraciones en la estabilidad del RNA

(Boggaram V y cols., 1991). Sin embargo, las concentraciones de glucocorticoides que inhiben la

expresión de SP-A, estimulan la transcripción de SP-B y SP-C, tal y como se ha demostrado en estudios

en explantes de pulmones fetales (Liley HG y cols., 1989).

A pesar de los efectos beneficiosos de la terapia prenatal con glucocorticoides en la maduración

pulmonar, la exposición durante la etapa perinatal puede tener consecuencias negativas a corto o largo

plazo. Estudios en ratas gestantes han demostrado que, la administración de dexametasona durante la

gestación, da lugar a fetos que desarrollan hipertensión, hiperglucemia, y alteraciones del comportamiento

y del eje corticoadrenal en la etapa adulta (Seckl JR, 2004).

� AMPc.

En las regiones promotoras de los genes que codifican las proteínas surfactantes SP-A y SP-B, se

ha identificado la secuencia consenso del elemento respuesta de AMPc (CRE; cAMP response element)

(Sano K y cols., 1987; Pilot-Matias TJ y cols., 1989). La proteína nuclear CREB se une a CRE tras ser

fosforilada por kinasas dependientes de AMPc, por lo que la transcripción de dichos genes se verá

inducida por estímulos que activen la adenilato ciclasa y que incrementen, en último término, la

concentración intracelular de AMPc (Berk AJ, 1989, review).

La incubación de explantes de pulmones de fetos con agentes activadores de la adenilato-ciclasa,

o bien análogos de AMPc, induce un incremento en los niveles de mRNA y proteicos de SP-A


38

(Mendelson CR y cols., 1986). Los efectos estimuladores de estos agentes sobre la expresión de SP-B son

menores que los ejercidos sobre SP-A y además, no se asociaron a un aumento de los niveles proteicos

(Liley HG y cols., 1989).

� Nkx2.1

El factor de transcripción tiroideo TTF-1 o Nkx2.1, es un factor de transcripción nuclear

perteneciente a la familia de los genes homeóticos de la familia Nkx2. Contiene un homeodominio que se

une a secuencias específicas de DNA (TBE; TTF-1-binding element) regulando la expresión de genes

implicados en la organogénesis (Guazzi S y cols., 1990).

Nkx2.1 fue inicialmente identificado como uno de los tres factores de transcripción que regulan la

expresión de genes específicos del tiroides (Damanate G y cols., 2001). A lo largo del desarrollo

embrionario Nx2.1 se ha localizado, además de en el tiroides, en el diencéfalo y en el pulmón (Lazzaro D

y cols., 1991).

En el pulmón, Nkx2.1 ha sido definido como factor imprescindible, tanto en el inicio de la

morfogénesis dirigiendo la formación de los conductos respiratorios, como más tarde, en la etapa

canalicular, regulando la síntesis de las proteínas surfactantes por los neumocitos tipo II (Kimura S y

cols., 1996).

En ratón, Nkx2.1 se expresa principalmente en los neumocitos tipo II del epitelio alveolar, en el

epitelio de los bronquios y bronquiolos y en menor medida en la tráquea (Boggaram V, 2009, review).

Los niveles de expresión de este factor no sufren cambios a lo largo del desarrollo fetal (Hösgör M y

cols., 2002). Los ratones knock out para Nkx 2.1 (-/-) presentan pulmones rudimentarios al nacer, debido

a una hipoplasia en fase pseudoglandular (Yuan B y cols.., 2000; Kimura S y cols., 1996).

La secuencia consenso de unión a Nkx2.1 se ha localizado en la región promotora de SP-A

(Bruno MD y cols., 1995), SP-B (Bohinski RJ y cols., 1994) y SP-C (Kelly SE y cols., 1996). Además de

homeodomio, Nkx2.1 presenta 7 residuos de serina que pueden ser fosforilados (Zannini M y cols.,

1996). Un aumento en el grado de fosforilación del factor de transcripción por PKA, se relaciona con la

activación de la transcripción génica de SP-A (Li J y cols., 1998) y SP-B (Yan C y cols., 1997) tal y como

revelan estudios in vitro en la línea de células epiteliales pulmonares H441 y en cultivo primario de

neumocitos tipo II.

� Esteroides gonadales.

La síntesis de los componentes del surfactante pulmonar en fetos macho se encuentra retardada

con respecto a fetos hembra de la misma etapa de desarrollo (Nielsen HC y cols., 1981). Este hecho se

asocia con una mayor incidencia de patologías respiratorias asociadas a partos prematuros (Farrell PM y

cols., 1975) y una menor eficacia del tratamiento con glucocorticoides en fetos macho (Torday JS y cols.,

1984). Esto es debido al efecto inhibidor de los andrógenos en el desarrollo pulmonar. Así, el tratamiento

con 5α-dehidrotestosterona (5α-DHT) durante la diferenciación sexual en conejos, inhibe la síntesis de la


39

fracción lipídica del surfactante en fetos hembra retrasando su desarrollo, mientras que el tratamiento con

antiandrógenos lo incrementa en fetos macho alcanzando el mismo nivel de desarrollo pulmonar que fetos

hembra de la misma edad (Nielsen HC y cols., 1982).

Los efectos de los andrógenos en la morfogénesis del pulmón ocurren a través de EGF (epidermal

growth factor) y TGF-ß1 (transforming growth factor ß1). Estos factores de crecimiento regulan la

comunicación celular entre los fibroblastos y los neumocitos tipo II, hecho esencial para la diferenciación

de estos últimos y la síntesis de los componentes del surfactante pulmonar (Seaborn T y cols., 2010,

review).

EGF es un potente mitógeno que estimula la proliferación y la diferenciación celular (Wu JX y

cols., 1993). Se ha descrito que acelera el desarrollo pulmonar al estimular la comunicación entre

fibroblastos y neumocitos tipo II (Nielsen HC, 1989), a través del receptor de EGF (EGF-R) localizado en

los fibroblastos. Las acciones de EGF se traducen en un aumento de la síntesis de DPPC y de la expresión

de SP-A y SP-C (Whitsett JA y cols., 1987; Nielsen HC y cols., 1997). La máxima expresión de EGF-R

en los fibroblastos, se corresponde con el momento de la gestación en la que se inicia la comunicación

entre los fibroblastos y los neumocitos tipo II, hecho que ocurre más tarde en fetos macho (Rosenblum

DA y cols., 1998).

El factor de crecimiento mitogénico, TGF-ß1, es producido por los fibroblastos del pulmón en

desarrollo (Torday JS y cols., 1990) e inhibe la comunicación entre fibroblastos y neumocitos tipo II a

través del receptor de TGF-ß (TGF-ß-R), por lo que reduce la síntesis de DPPC, SP-A y SP-C (Torday JS

y cols., 1990; Whitsett JA y cols., 1987). La expresión de TGF-ß-R en pulmones en desarrollo se reduce

antes en hembras que en machos.

Los estrógenos también son factores hormonales reguladores del desarrollo pulmonar. Los

receptores de estrógenos α y ß son más abundantes en pulmones de etapas tempranas de desarrollo

postnatal que en pulmones de etapa adulta (Beyer C y cols., 2003), y su activación incrementa la síntesis

de la fracción lipídica del surfactante, así como la expresión de SP-A y SP-B y proliferación de los

neumocitos tipo II (Seaborn T y cols., 2010, review)

A lo largo de la gestación, los pulmones en desarrollo se encuentran expuestos a los esteroides

gonadales circulantes, tanto de procedencia materna como fetal y placentaria. Desde la etapa canalicular

(16.5GD, gestational day) hasta el fin de la etapa alveolar (día 30 de desarrollo postnatal, P30), los

pulmones de ratones macho muestran niveles de testosterona y androstendiona mayores que los

observados en los pulmones de hembra (Boucher E, y cols., 2010). Por tanto, durante el desarrollo, los

pulmones de fetos macho están expuestos a niveles más altos de testosterona circulante que los fetos

hembra, mientras que los niveles de estradiol son similares tanto en machos como en hembras.

En la etapa fetal y adulta, los pulmones son susceptibles a la acción local de los andrógenos

(Milewich L y cols., 1986), tanto en machos como en hembras.

Se ha identificado la localización de la enzima 17ß-HSD tipo 5, que sintetiza andrógenos activos,

en los neumocitos tipo II de pulmones de fetos macho y hembra. La expresión de esta enzima se


40

incrementa en la etapa canalicular, momento en el que se inicia la síntesis del surfactante (Provost PR y

cols., 2004). Así mismo, en explantes de pulmones fetales humanos se ha detectado la expresión de la

enzima de síntesis de 5α-DHT, que regula la ramificación de los conductos respiratorios (Kimura Y y

cols., 2003).

Adicionalmente, en pulmones en desarrollo se han localizado otras enzimas de la ruta de síntesis

de estrógenos como 17ß-HSD tipo 1 y 17ß-HSD tipo 7 (Seaborn T y cols., 2010, review) y citocromo

P450 aromatasa (Pezzi V y cols., 2003).

Las diferencias en el desarrollo pulmonar debidas al sexo parecen ser debidas principalmente a la

mayor exposición a niveles circulantes de andrógenos en fetos macho durante el desarrollo. Sin embargo,

las diferencias en los efectos paracrinos de los andrógenos debidas al sexo, todavía no se han determinado

con exactitud. Los estudios realizados hasta la fecha no revelan cambios significativos en las enzimas de

síntesis de andrógenos entre pulmones de fetos macho o hembra (Provost PR y cols., 2004).

� Acción local del sistema renina-angiotensina.

La producción local de angiotensina es imprescindible en el desarrollo fetal de múltiples órganos

por su acción proliferativa y de diferenciación celular. Sus acciones autocrinas y paracrinas están

implicadas en el desarrollo de diversos órganos como riñones, corazón, vasculatura y glándulas adrenales

(Paul M y cols., 2006, review).

La localización de los componentes del sistema renina-angiotensina, como son la renina, el

angiotensinógeno, ACE y los receptores de AII (AT1-R y AT2-R) en los pulmones en desarrollo de rata,

son detectados al menos desde GD15 lo que sugiere un papel regulador de AII en la morfogénesis

pulmonar (Nogueira-Silva C y cols., 2012).

AII estimula la formación de conductos respiratorios en explantes de pulmones fetales de rata a

través de AT1-R, hecho reproducido de manera similar por antagonistas de AT2-R. La inhibición de

AT2-R durante el desarrollo fetal mejora el crecimiento pulmonar y la función respiratoria en un modelo

de hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen (Nogueira-Silva C y cols., 2012).

1.3.7.3. Factores de riesgo en el desarrollo de patologías respiratorias.

1.3.7.3.1. Etapa fetal.

Las deficiencias cuantitativas y/o cualitativas del surfactante pulmonar provocan la pérdida de la

capacidad de reducción de la tensión superficial causando colapso alveolar al final de la espiración, y por

tanto, insuficiencia respiratoria.

Avery y Mead fueron los primeros en relacionar las deficiencias de surfactante pulmonar con el

síndrome de distrés respiratorio (RDS) (Avery ME y Mead J, 1959), principal causa de muerte en niños

prematuros.


41

La prematuridad es uno de los factores de riesgo en este síndrome como consecuencia de la

inmadurez pulmonar y debido a que los neumocitos tipo II sintetizan el surfactante pulmonar de forma

deficiente.

Desde 1959 hasta la fecha se han realizado múltiples investigaciones con el fin de introducir el

surfactante como terapia del RDS.

El crecimiento retardado intrauterino (IUGR; intrauterine growth restriction) también es

considerado un factor de riesgo en el desarrollo de dificultades respiratorias en la etapa postnatal. Las

causas de IUGR pueden ser múltiples, como la malnutrición materna, hipertensión del embarazo

(preclampsia) e infarto placentario, entre otras.

El bajo peso al nacer incrementa el riesgo de sufrir RDS (Bernstein IM y cols., 2000) y de

desarrollar enfermedad pulmonar obstructiva crónica en la etapa adulta (Baker DJ y cols., 1991). Estos

fetos están sometidos durante su desarrollo a hipoxemia, hipoglucemia y altos niveles de cortisol, lo que

influye en el crecimiento del pulmón fetal. De hecho, la subnutrición durante la gestación reduce el grado

de diferenciación de los neumocitos tipo II (Curle DC y Adamson IY, 1978), la síntesis del componente

lipídico del surfactante y la superficie alveolar (Lin Y y cols., 1991). La subnutrición no solo afecta al

desarrollo del feto, sino que también repercute en la función pulmonar durante la etapa postnatal. Así, se

ha demostrado en cobayas que una restricción calórica del 50% provoca una inhibición en desarrollo

alveolar tras el nacimiento (Lechner AJ, 1985).

1.3.7.3.2. Etapa adulta.

� Diabetes.

La progresión de la diabetes tipo 1 y tipo 2 se asocia a complicaciones respiratorias como

consecuencia de las microangiopatías, la inflamación o cambios en la morfología pulmonar causados por

la hiperglucemia.

A medida que progresa el cuadro diabético se produce una reducción de la capacidad de difusión

de CO, parámetro empleado para evaluar la función respiratoria (Sandler M y cols., 1987), y de la

velocidad de intercambio gaseoso. La reducción de estos parámetros es debida al incremento del espesor

de la lámina basal de los capilares pulmonares, así como del epitelio alveolar (Vracko R y cols., 1979), lo

que reduce la permeabilidad gaseosa alveolo-capilar (Ozsahin K y cols., 2006).

Los cambios histológicos producidos en el tejido pulmonar son consecuencia del aumento de la

síntesis de colágeno y de los componentes de la matriz extracelular en respuesta a la hiperglucemia, tal y

como muestran los pulmones de ratas con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) (Kida K y cols.,

1983). Dichas alteraciones en el tejido, causan una reducción en el tamaño de la luz alveolar (Ofulue AF

y cols., 1988) y producen un estrechamiento de la red de los capilares sanguíneos en el pulmón (Vracko R

y cols., 1979). Todo ello puede provocar variaciones en la ratio ventilación-perfusión.

La reducción del diámetro de los capilares pulmonares asociada a la diabetes implica un

incremento de la resistencia vascular, y por tanto, a un aumento de la presión arterial. Así, el modelo


42

animal ApoE-/- resistente a la insulina, muestra hipertensión pulmonar arterial con hipertrofia ventricular

derecha (Hansmann G y cols., 2007). De igual modo, las arterias pulmonares en un modelo de rata

diabética inducida por estreptozotocina (STZ), no responden a estímulos vasoactivos debido a la

disfunción endotelial (Lopez-Lopez JG y cols., 2008; Gurney AM y cols., 2009), agravando las

complicaciones cardiovasculares.

Asimismo, la progresión de la diabetes produce deficiencias en el surfactante pulmonar. Los

neumocitos tipo II de pulmones de ratas con diabetes inducida por STZ muestran una morfología alterada

(Plopper CG y Morishige WK, 1978) con respecto a animales no diabéticos y presentan deficiencias en la

síntesis (Uhal BD y cols., 1986) y secreción (Brown LA y Longmore WJ, 1986) de los fosfolípidos del

surfactante pulmonar. Estas alteraciones son consecuencia en parte de la reducción de la actividad de la

adenilato ciclasa (Brown, 1991).

� Obesidad.

La obesidad, al igual que la diabetes, es considerada como un factor de riesgo en el desarrollo de

disfunción respiratoria. Algunos estudios consideran la obesidad como causa de alteraciones de la

mecánica respiratoria, aumento de la resistencia de los conductos respiratorios, y modificaciones en el

patrón respiratorio, así como en el intercambio gaseoso (Salome CM y cols., 2011, review).

En individuos obesos la presión parcial de CO2 se incrementa, hecho que se relaciona con

hipoventilación (Zwillich CW y cols., 1975), fallo respiratorio y muerte prematura (Bray GA, 1985).

La obesidad se asocia con altos niveles de leptina (Considine RV y cols., 1996), hormona que

regula el apetito y la actividad metabólica (Campfield LA y cols., 1998) mediante su unión al receptor

Ob-Rb en el hipotálamo (Rohner-Jeanrenaud F y Jeanrenaud B, 1996). Estudios en ratones deficientes en

leptina, ob/ob, han permitido dilucidar las acciones de la leptina en el sistema respiratorio. La evaluación

de la función pulmonar de ratones ob/ob revela la existencia de hiperventilación alveolar e hipercapnia

crónica (Tankersley C y cols., 1996). Algunos estudios sugieren que la leptina puede actuar como un

factor de crecimiento en el pulmón y como factor regulador del control central de la respiración

(O'Donnell CP y cols., 2000) estabilizando la función pulmonar.

Por otra parte, el análisis de pulmones de ratas obesas y diabéticas (ZDF) que portan un defecto

genético del receptor de leptina que resulta no funcional, muestra alteración de las estructuras pulmonares

con incremento de los triglicéridos, reducción en el volumen alveolar, engrosamiento de los capilares

sanguíneos, reducción del volumen de sangre capilar y un mayor contenido de LBs en los neumocitos tipo

II (Foster DJ y cols., 2010).

2. o\j_tivos.

2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.

45

HIPÓTESIS:

Estudios preliminares describen ciertas acciones de GLP-1 en el pulmón, como es la

inducción de la secreción de las glándulas submucosas de la tráquea, la relajación de las arterias

pulmonares y la secreción del componente lipídico del surfactante pulmonar.

Estos trabajos se han desarrollado en modelos in vitro y hasta la fecha la contribución

de GLP-1 en la fisiología respiratoria no se ha estudiado en profundidad. Esto unido a la

demostración de la presencia del receptor de GLP-1 en el pulmón de forma abundante, sugieren

que GLP-1 podría tener importantes efectos morfogénicos y funcionales sobre el pulmón, y

abren la posibilidad cierta de que GLP-1 sea mucho más que una incretina, una hormona

pleiotrópica con múltiples dianas orgánicas.

Por ello el objetivo general de la presente tesis doctoral fue caracterizar las acciones de

GLP-1 en la función pulmonar en el periodo fetal y etapas tempranas de vida postnatal así como

en patologías metabólicas en la etapa adulta relacionadas con disfunción respiratoria como es la

diabetes y obesidad, en modelos animales.

2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.2. O\j_tivos.

46

Para el desarrollo del objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:

1. Caracterizar el patrón de expresión de GLP-1R a lo largo del desarrollo pulmonar fetal

y postnatal en la rata.

2. Analizar los efectos de los análogos de GLP-1, Ex4 y Liraglutide en la síntesis de las

principales proteínas surfactantes (SP-A&SP-B) en distintas etapas del desarrollo

pulmonar.

3. Evaluar las acciones de Ex4 y Liraglutide en la maduración del pulmón en dos modelos

animales de hipoplasia pulmonar inducida por administración de NTF o bien por

subnutrición durante la gestación.

4. Estudiar la repercusión de Liraglutide en la función cardiopulmonar en un modelo

experimental de diabetes tipo 1 en la etapa adulta, en especial a través del sistema de

angiotensinas.

5. Caracterizar la composición del componente proteico del surfactante pulmonar en un

modelo animal de obesidad en relación con GLP-1.

3. M@TERI@L

Y

MÉTODOS.

3. M[t_ri3. M[t_ri3. M[t_ri3. M[t_ri[l y Métoôs.[l y Métoôs.[l y Métoôs.[l y Métoôs.

49

3.1. Animales de experimentación.

Los animales empleados para el estudio fueron ratas de la cepa Sprague-Dawley hembras de 12

semanas de edad y peso entre (150-250g) y machos adultos con un peso comprendido entre (250-300g).

Para llevar a cabo gran parte del trabajo experimental se emplearon fetos de 18, 20 y 21 días de

desarrollo para lo cual se realizaron apareamientos programados con el fin de conocer con exactitud el día

de gestación de los animales.

Se realizó un seguimiento del ciclo estral de ratas hembra vírgenes mediante frotis vaginales

diarios. Únicamente se emplearon ratas hembra que presentaron dos ciclos estrales regulares

consecutivos. Una vez en fase de proestro (etapa previa a la ovulación) se reubicaron en jaulas a razón de

una hembra por macho. Transcurridas 24 horas se comprobó el apareamiento determinando la presencia

de tapón vaginal considerando ese día como día 1 de gestación (GD1, gestational day). El estado de

preñez se confirmó mediante el seguimiento diario del ciclo estral durante 1 semana al permanecer en

etapa de diestro (W) constante.

También se emplearon ratas macho Zucker (Crl: ZUC(Orl)-Leprfa) homocigotas con fenotipo

obeso (fa/fa) y heterocigotas con fenotipo no obeso (fa/+). Para nuestros estudios se emplearon animales

de 13 semanas de vida con un peso de 400±60g en el caso de fa/fa y 340±40g en el caso de fa/+.

Las ratas de la cepa Sprague-Dawley fueron suministradas por el animalario General de la

Universidad de Santiago de Compostela (Santiago de Compostela, España) mientras que las ratas Zucker

fueron proporcionadas por los laboratorios Charles Rivers (LÁrbresle, Francia).

Los animales permanecieron estabulados en el animalario de la Universidad de Vigo para su

aclimatación antes de la realización de los experimentos en grupos de 4 ratas por jaula, bajo condiciones

controladas de temperatura (22±2°C) y con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas (9:00-21:00) sin

3. M[t_ri[l y Métoôs.3. M[t_ri[l y Métoôs.3. M[t_ri[l y Métoôs.3. M[t_ri[l y Métoôs.

50

restricción de comida y agua a menos que se especifique lo contrario. Se suministró pienso comercial

(A04 mantenimiento SAFE, PANLAB, Barcelona, España). Todos los experimentos fueron realizados de

acuerdo con la legislación del Estado Español y de la Unión Europea para el uso de animales con un fin

experimental (RD 1201-2005, RD 53-2013 y Directiva del Consejo 2010/63/EU).

3.2. Fármacos y reconstitución.

� Administración prolongada de estímulos:

Ex4 y Liraglutide, [Lys (γ-Glu-palmitoyl)26,Arg34)-GLP-1 (7-37)] fueron suministrados por

Bachem (Bubendorf, Suiza).

La Ex4 se reconstituyó en agua destilada autoclavada y filtrada y se almacenó en alícuotas a

-20°C. En el momento de su administración, las alícuotas se descongelaron y fueron llevadas a la

concentración de trabajo con solución salina filtrada (NaCl, 0.9%).

El Liraglutide se reconstituyó en ácido acético al 5% filtrado y autoclavado. Las alícuotas

obtenidas se almacenaron a -20°C hasta su utilización, momento en el que fue diluida con solución salina

filtrada (NaCl, 0.9%) hasta alcanzar la concentración necesaria y con un porcentaje final de ácido acético

del 0.01%.

La dexametasona fue suministrada por Merck (Madrid, España). Las concentraciones de trabajo

se obtuvieron tras diluir la solución stock en solución salina (NaCl, 0.9%). Las alícuotas se almacenaron a

temperatura ambiente hasta su utilización.

Las dosis de los fármacos se especifican en cada protocolo experimental.

� Inducción de hipoplasia pulmonar durante el desarrollo fetal:

[Nitrofen 2,4-dichloro-4´-nitrophenyl ether] (NTF) fue suministrado por Sigma Aldrich (St.

Louis, MO, EE. UU.). 100mg de NTF se reconstituyeron en 1ml de aceite de oliva virgen extra puro

calentado previamente a 50°C. La solución se preparó justo en el momento de ser administrada.

� Inducción de diabetes tipo I:

La estreptozotocina (STZ) [N-Metilnotrosocabomil D-glucosamina], facilitada por Sigma Aldrich

(St. Louis, MO, EE.UU.) se preparó en el momento de ser administrada. Puesto que se inactiva con la luz

su preparación se realizó en oscuridad y se reconstituyó en tampón citrato 0.1M pH 4.5 para ser

administrada a una dosis de 70mg/Kg.

� Control de hiperglucemia:

El control de la hiperglucemia en ratas con diabetes tipo I inducida se realizó mediante la

administración de insulina humana de acción prolongada Insulatard FlexPen (Novo Nordisk, Bagsværd,

Dinamarca). La dosis empleada para el control de la glucemia en ratas diabéticas fue de 0.5 o 1 U.I. /Kg,

dependiendo del experimento.

� Anestésico:

Los animales se anestasiaron para la obtención de las muestras de sangre mediante punción

yugular. El anestésico empleado fue pentobarbital sódico (C11H17N2O3Na) suministrado por Sigma


51

Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El pentobarbital sódico es un barbitúrico de acción corta, con una

potente acción sedante y anticonvulsionante. La dosis empleada fue de 50mg/Kg administrada por vía

intraperitoneal.

3.3. Diseños experimentales.

3.3.1. Caracterización de la expresión del receptor de GLP-1 en pulmón en distintos periodos de

desarrollo.

El objetivo del procedimiento experimental fue caracterizar la expresión de GLP-1R en pulmón

de rata a lo largo del desarrollo fetal y postnatal.

Para ello se emplearon pulmones de rata macho y hembra pertenecientes a distintas etapas de

desarrollo.

Las etapas de desarrollo pulmonar estudiadas fueron las siguientes:

• Etapa fetal:

� Etapa Canalicular (E18-E20), para lo que se emplearon fetos macho y hembra de 18 días y

20 días de vida intrauterina (E18 y E20).

� Etapa Sacular, fetos de 21 días de vida intrauterina (E21).

• Etapas tempranas de desarrollo postnatal:

� Primer día de vida postnatal (P1), etapa de desarrollo que se corresponde con la etapa sacular

y en el que se inicia la respiración del ambiente aéreo.

� Etapa Alveolar. Ratas de edades comprendidas entre el día 5 de vida (P5) postnatal y 30 días

de vida postnatal. Este periodo fue estudiado cada 5 días (P5, P10, P15, P20, P25, P30).

La expresión de GLP-1R en las distintas etapas de desarrollo pulmonar se comparó con los

niveles de expresión en la etapa peri puberal y adulta, etapas en las que el pulmón ha finalizado su

desarrollo y es completamente funcional.

Tal y como demuestran estudios previos realizados en nuestro laboratorio, las ratas hembra de la

cepa Sprague–Dawley alcanzan la pubertad el día 35 de vida (apertura vaginal) mientras que los machos,

el día 44 (separación balanoprepucial).

Se analizaron los niveles de expresión de GLP-1R en pulmones de ratas hembra de 35 días de

vida y de ratas macho de 44 días de vida (etapa peri puberal). Para el estudio de la etapa adulta, se

emplearon pulmones de ratas hembra de 38 días de vida y pulmones de ratas macho de 46 días de vida.

Los animales de distintas etapas de desarrollo pre y postnatal se obtuvieron mediante

apareamientos programados tal y como se detalla en el apartado 3.1 de animales de experimentación.

Para la obtención de tejidos en etapas fetales, las ratas gestantes se sacrificaron mediante

decapitación en la etapa correspondiente (E18, E20 o E21) y los fetos se aislaron del útero mediante

cesárea. En el caso de etapas postnatales, se permitió el nacimiento de las crías. En el día 1 de vida


52

extrauterina se homogenizaron las camadas alcanzando una media aproximada 12 crías por camada (6

hembras y 6 machos). La figura 13 muestra las etapas de desarrollo pulmonar estudiadas:

Figura_13: Esquema representativo de las etapas de desarrollo pulmonar estudiadas para el análisis de la ontogenia de

GLP-1R en el pulmón.

3.3.2. Identificación del receptor de GLP-1R en cultivo primario de neumocitos tipo II de rata

adulta.

La caracterización del patrón de expresión de GLP-1R en pulmón en los distintos periodos de

desarrollo pulmonar sugiere un papel importante de su ligando en la morfogénesis y fisiología del

pulmón. Por ello decidimos identificar la expresión del GLP-1R en cultivo primario de neumocitos tipo

II, responsables de la síntesis y secreción del surfactante pulmonar, el cual es uno de los factores

limitantes en la función respiratoria.

El método empleado para el aislamiento y cultivo primario de neumocitos tipo II se basa en el

método de Dobbs LG. y cols., 1986, en el que se suceden cuatro etapas: perfusión, obtención de la

suspensión celular, adherencia y cultivo.

• Perfusión.

El pulmón es un órgano extensamente irrigado por lo que la pureza del cultivo dependerá en gran

medida de la ausencia de glóbulos rojos.

La perfusión se llevó a cabo en ratas anestesiadas tras una inyección intraperitoneal de

pentobarbital sódico a una dosis de 50mg/Kg. Para la perfusión de la circulación pulmonar se abrió la

cavidad torácica y se realizó una incisión en la aorta para interrumpir la circulación periférica.

Seguidamente, se administró una solución de heparina 0.1% desde el ventrículo derecho hacia la

arteria pulmonar para evitar la coagulación en los capilares. Mediante una bomba de perfusión se

suministró de igual forma solución salina (0.9% NaCl) y una solución isoosmótica, solución II (140mM

NaCl, 5mM KCl, PBS, 10mM HEPES, 2mM CaCl2 y 1.3mM MgSO4, pH 7.4) hasta que el tejido quedó

libre de eritrocitos. Se aislaron los pulmones y se realizaron 8 lavados de 1ml con una solución

isoosmótica, solución I (140mM NaCl, 5mM KCl, PBS, 10mM HEPES, 6mM glucosa, 0.2mM EGTA,

pH 7.4) a través de la tráquea para eliminar los macrófagos. A continuación, se realizó una digestión

enzimática para degradar los componentes de la matriz extracelular tras introducir 10ml por pulmón de

Etapa CanalicularEtapa Sacular

Etapa alveolarE18-E20

E21-P1

P5_P10_P15_P20_P25_P30

Etapa Peripuberal/Adulta

P35_P38_P44_P46

♀

♂


53

solución II con elastasa (0.366mg/ml equivalente a 1.46U/ml, Sigma Aldrich, Madrid, España) y

colagenasa (2mg/ml, Sigma Aldrich, Madrid, España) por la tráquea e incubar durante 20 minutos a

37°C.

Todos los procedimientos detallados a continuación se llevaron a cabo en campana de flujo

laminar y las soluciones empleadas fueron previamente filtradas y autoclavadas.

• Obtención de la suspensión celular.

Una vez finalizada la digestión enzimática, se descartaron los principales conductos aéreos.

Cada pulmón se cortó en pequeños trozos con bisturí en presencia de 4ml de solución II

autoclavada y filtrada conteniendo DNasa I (200U/ml, Thermo Scientific, Madrid, España) para inhibir la

formación de agregados celulares. La reacción enzimática se paró tras añadir 5ml de FBS (fetal bovine

seum) inactivado a 56°C durante 30 minutos en agitación (Sigma Aldrich, Madrid, España).

Se añadió al tejido digerido 20 ml de solución II y se incubó a 37°C en agitación (130 ciclos/min)

durante 5 minutos. Seguidamente la suspensión celular se filtró empleando filtros de nylon de 100 µm y

de 20µm de tamaño de poro (Millipore, Madrid, España) para eliminar de la suspensión las células del

tejido pulmonar de mayor diámetro (neumocitos tipo I, 50-100µm). Tras el filtrado se eliminaron las

células de mayor tamaño, pero no las que presentan un diámetro menor de 20 µm como es el caso de los

macrófagos y linfocitos.

La suspensión se ajustó a un volumen de 50ml con solución II y se centrifugó a 130g durante 8

minutos a 25°C. El pellet se resuspendió en DMEM (Dubelco´s modified eagle´s medium, Sigma Aldrich,

Madrid, España) sin FBS a razón de 3x106 células/ml.

• Adherencia.

El aislamiento de los neumocitos tipo II del resto de la suspensión es posible gracias al hecho de

que carecen de receptores de inmunogloblinas Fc que sí están presentes en los macrófagos y los

leucocitos. Para la adherencia de estas células se emplearon placas estériles de 100mm no tratadas

(IWAKI ®, Afora, Barcelona, España) previamente incubadas con 5ml de IgG de rata (500µg/ml en Tris

50mM pH 9.5, Sigma Aldrich, Madrid, España) durante 3h a 22°C.

Tras retirar la solución de IgG y realizar varios lavados con DMEM para eliminar la IgG no unida

a la placa, se añadieron 10ml de la suspensión celular (3x106 células/ml). La unión de macrófagos y

leucocitos a IgG se permitió tras una incubación de al menos 1h a 37°C, 5% CO2.

• Cultivo.

Tras la fijación de los macrófagos y los leucocitos, se recogió la suspensión celular que contiene

los neumocitos tipo II. Se centrifugó la suspensión celular a 130g durante 8 minutos y el pellet obtenido

fue resuspendido en DMEM con 10% de FBS, 2mM de L-glutamina, 100U/ml de penicilina y 100mg/ml

de estreptomicina (Gibco, Life Technologies, Barcelona, España). Finalmente las células fueron

sembradas a una densidad aproximada de 1x106células/ml en placas de 24 pocillos (IWAKI®, Afora,

Barcelona, España).


54

Tras 24 horas de cultivo, se extrajo el RNA total de neumocitos tipo II. Se caracterizó la

expresión de GLP-1R mediante el análisis de los niveles de mRNA, de igual forma se comprobó la pureza

del cultivo mediante el análisis de expresión de SP-C, proteína exclusiva de neumocitos tipo II.

3.3.3. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa fetal y neonatal.

Los diseños experimentales que se muestran a continuación tuvieron como objetivo el estudio de

los efectos de los agonistas de GLP-1R (Ex4 y Liraglutide) en la función pulmonar en fetos y neonatos

con desarrollo pulmonar completo e incompleto.

3.3.3.1. Efectos de los análogos de GLP-1 en la síntesis de los componentes del sistema surfactante

en un modelo de desarrollo pulmonar completo.

En este experimento se analizaron los efectos de Ex4 y Liraglutide sobre el surfactante pulmonar

en la etapa canalicular de desarrollo pulmonar (pulmones de fetos de 18 y 20 días, E18 y E20) así como

en el primer día de vida postnatal (P1) correspondiente con la etapa sacular.

Para la obtención de pulmones de fetos y neonatos, se llevaron a cabo apareamientos

programados tal y como se describe en el apartado 3.1 de animales de experimentación.

Las ratas gestantes se dividieron en cuatro grupos experimentales que recibieron vehículo (VEH,

0.9% NaCl, n=15), Ex4 (EX4, 5µg/Kg, n=15), Liraglutide (LIR, 100µg/Kg, n=15) o bien dexametasona

(40µg/Kg, n=5).

El vehículo así como Ex4 y Liraglutide se administraron subcutáneamente (s.c) cada 12 horas.

Los efectos de los análogos de GLP-1 (Ex4 y Liraglutide) en el surfactante en pulmones en desarrollo se

compararon con los observados tras la administración de dexametasona, un glucocorticoide sintético

empleado en clínica para estimular el desarrollo pulmonar de neonatos con riesgo de ser prematuros. Con

el fin de evitar el retardo en el crecimiento fetal debido a la sobreexposición de glucocorticoides durante

el desarrollo, la dexametasona se administró una vez al día (9 a.m) de forma subcutánea.

Los grupos tratados con vehículo, Ex4 o bien Liraglutide se subdividieron a su vez en tres grupos

de experimentación (n=5) correspondientes a cada etapa de desarrollo estudiada: etapa canalicular (E18 y

E20, fetos de 18 y 20 días de vida intrauterina, repectivamente) y etapa sacular (primer día de vida

postnatal, P1). En el caso del grupo tratado con dexametasona, únicamente se estudió el primer día de

vida postnatal (P1).

Los tratamientos se iniciaron el día 14 de gestación, coincidiendo con la etapa previa a la etapa

canalicular (inicio de la síntesis de los componentes del surfactante) y finalizaron en GD18, GD20 y hasta

al término de la gestación (GD22).

En la etapa de gestación correspondiente se procedió al sacrificio de las ratas gestantes mediante

decapitación y se recogió sangre troncal. Seguidamente, los fetos fueron extraídos mediante cesárea del

útero materno; fetos de 18 días (E18) y fetos de 20 días (E20). Se permitió el nacimiento de las crías de

cada camada para el grupo experimental correspondiente al primer día de vida postnatal (P1). Fetos y


55

neonatos fueron separados en macho y hembra y sus pulmones se aislaron y se congelaron a -80°C hasta

su procesamiento.

El diseño experimental se muestra en la figura 14:

Figura_14: Esquema representativo del protocolo experimental para la evaluación de los efectos de los análogos de GLP-1

en la síntesis de las SPs en el pulmón. EX4 (Exendina-4); LIR (Liraglutide); DEX (dexametasona).

A continuación se detallan las señales estudiadas relacionadas con la función y el desarrollo del pulmón:

� Análisis de las principales proteínas del surfactante pulmonar: se caracterizó el patrón de

expresión (de mRNA y de proteína) de SP-A y SP-B en los pulmones de fetos macho E18 y

E20 así como de neonatos macho (P1). También se determinaron los niveles proteicos de SP-

A y SP-B en el líquido amniótico extraído de los sacos amnióticos de los fetos macho.

� Evaluación de los efectos indirectos de Ex4 y Liraglutide sobre el surfactante a través de una

posible variación de los niveles de estrógenos y glucocorticoides: se determinaron los niveles

circulantes de 17β-estradiol y corticosterona en suero obtenido a partir de la sangre troncal de

ratas gestantes en GD18, GD20 y tras el parto (GD22) tratadas con Ex4, Liraglutide o

vehículo. Asimismo, se midieron los valores circulantes de corticosterona en suero de

neonatos procedentes de ratas tratadas durante la gestación con análogos de GLP-1 o bien

vehículo.

♀ GD1-------------GD14

GD22-GD23n=5

GD18n=5

GD20n=5

EtapaCanalicularEtapa

Sacular

VEH (0.9% NaCl, s.c)EX4 (5µg/Kg, 12h, s.c)LIR (100µg/Kg, 12h, s.c)DEX (40µg/Kg, 24h, s.c)

E18

E20

P1Pulmones E18, E20 y P1.Líquido amniótico E18 y E20 .Sangre troncal de ratas gestantes (GD18, GD20 y GD22).Sangre troncal de P1.


56

3.3.3.2. Efectos de los análogos de GLP-1 sobre la función pulmonar en un modelo de hipoplasia

pulmonar inducida por nitrofen.

Considerando la importancia de la síntesis y secreción de los componentes del surfactante

pulmonar en el desarrollo de patologías respiratorias neonatales, se llevaron a cabo protocolos

experimentales en los que se desarrolló un modelo de inmadurez pulmonar durante la organogénesis.

Uno de los modelos animales inducidos más empleados en el estudio de este tipo de patologías

consiste en la administración intragástrica del herbicida Nitrofen (NTF, 2,4-dicloro-fenil-p-nitrofenil éter)

en roedores gestantes (Stone L.C y cols., 1981).

Este modelo experimental de inmadurez pulmonar reproduce de manera similar las deficiencias

observadas en el síndrome de distrés respiratorio de humanos, como hipoplasia pulmonar y alteraciones

en los componentes del surfactante (Losada A y cols., 2000; Mysore MR y cols., 1998; Guarino N y cols.,

2000). Su toxicidad es dependiente de la dosis y del momento de gestación en el que es administrado de

forma oral. La dosis y periodo de administración más empleada son 100mg del teratógeno administrados

oralmente en ratas gestantes entre el día 9-11 de gestación (Manson JM, 1989).

Los experimentos detallados a continuación tuvieron como objetivo el estudio de los efectos de

los agonistas de GLP-1R (Ex4 y Liraglutide) sobre la función pulmonar en un modelo de hipoplasia

pulmonar inducida por la administración de NTF durante la gestación.

En ambos protocolos experimentales se retrasó el crecimiento del pulmón durante el desarrollo

fetal mediante la administración oral de NTF en ratas hembra el día 9 de gestación. La administración de

los agonistas de GLP-1R se inició en ambos casos experimentales en GD14, siendo posterior al momento

en el que se alcanza la mayor concentración de NTF en tejido fetal (a las 72 horas de ser administrado) lo

que aumenta las garantías de daños en el tejido pulmonar (Costlow RD y Manson JM, 1983). Por otra

parte, el tratamiento es previo a la producción del surfactante cuya deficiencia es principal causa de fallos

respiratorios debidos a la inmadurez del pulmón.

3.3.3.2.1. Caracterización de los efectos de análogos de GLP-1 en la maduración pulmonar de fetos

de 21 días en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen.

Se llevaron a cabo apareamientos programados tal y como se detalla en el apartado 3.1 de

animales de experimentación. Se establecieron dos grupos de ratas gestantes (n=20); el grupo tratado con

Nitrofen (NTF) que recibió 100mg de NTF disueltos en 1ml de aceite de oliva extra puro y administrado

intragástricamente (i.g) mediante una sonda en el día 9 de gestación y el grupo control (C) que recibió de

igual forma el vehículo.

El día 14 de gestación, C y NTF se dividieron en 4 grupos experimentales (n=5) los cuales se

trataron con Ex-4 (5µg/Kg: C+EX4 o NTF+EX4), Liraglutide (100µg/Kg: C+LIR o NTF+LIR),

dexametasona (20µg/Kg: C+DEX o NTF+DEX) o vehículo (0.9% NaCl: C+VEH o NTF+VEH). La

administración de los fármacos se realizó de forma subcutánea cada 12 horas en el caso de Ex4 y

Liraglutide y cada 24 horas en el caso de dexametasona. El tratamiento se llevó a cabo hasta el día 21 de


57

gestación. El peso corporal de las ratas gestantes se monitorizó diariamente. Al finalizar el tratamiento

(GD21) los animales se sacrificaron por decapitación, se recogió sangre troncal y los fetos macho y

hembra fueron extraídos del útero mediante cesárea.

Se recogió líquido amniótico, los fetos se pesaron, los pulmones y corazones se aislaron, y se

pesaron e inmediatamente se congelaron a -80°C hasta ser procesados.

La figura 15 muestra de forma esquemática el desarrollo experimental:

Figura_15: Esquema representativo del protocolo experimental para el estudio de la función pulmonar en un modelo de

hipoplasia pulmonar inducida en respuesta al tratamiento prenatal con análogos de GLP-1 (Ex4 y Liraglutide).

La función pulmonar de fetos de 21 días (E21) se estudió mediante los siguientes procedimientos:

� Caracterización del grado de desarrollo pulmonar de E21: se registró el peso corporal de los fetos

así como el peso de sus pulmones. La ratio entre el peso del pulmón y el peso corporal se empleó

como indicador de desarrollo pulmonar. El porcentaje de hipoplasia pulmonar se calculó según

Baptista MJ y cols., 2005.

� Análisis histológico del tejido pulmonar: se evaluó la estructura alveolar en pulmones de fetos

macho de cada grupo experimental.

� Estudio del componente proteico del surfactante pulmonar: se determinaron los niveles proteicos

y de mRNA de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B en pulmones de fetos macho.

� Evaluación de los efectos de NTF en el desarrollo del corazón: se calculó la ratio entre el peso del

corazón y el peso corporal de fetos para definir la acción de NTF en la organogénesis del

corazón.

Hipoplasia pulmonarInducida durante la

organogénesis

GrupoControl

(C)n=20

♀GD1----------------------------GD14

PulmónCorazón

Grupo Nitrofen(NTF)n=20

Organogénesis (Desarrollo pulmonar)

Vehículo�� C+VEH n=5 o NTF+VEH n=5. 0.9% NaCl.

Liraglutide �� C+LIR n=5 o NTF+LIR n=5. 100µg/Kg/12h/s.c

Dexametasona��C+DEX n=5 o NTF+DEX n=5. 20µg/Kg/24h/s.c

Exendina-4 �� C+EX4 n=5o NTF+EX4 n=5. 5µg/Kg/12h/s.cGD9

GD9

100mg NTF i.g(1ml de aceite de oliva)

1ml de aceite de oliva(i.g)

Etapa sacular

E21


58

3.3.3.2.2. Caracterización de los efectos de Liraglutide en la supervivencia neonatal en un modelo

de hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen.

Tras analizar los efectos de los agonistas de GLP-1R en el surfactante y en el desarrollo del

pulmón en fetos de 21 días en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida, se determinó la acción de

Liraglutide en la tasa de supervivencia neonatal.

Para ello se llevó a cabo un procedimiento experimental similar al descrito en el apartado

3.3.3.2.1.

Se establecieron dos grupos experimentales de ratas gestantes, el grupo control (C, n=10) que dio

lugar a neonatos con desarrollo pulmonar completo, recibió en GD9 1ml de aceite de oliva administrado

por vía oral mediante una sonda orogástrica. De igual forma, el grupo NTF (n=15) recibió 100mg de

NTF, disuelto en 1ml de aceite de oliva, dando lugar a neonatos con desarrollo pulmonar incompleto.

Ambos grupos (C y NTF) fueron tratados con Liraglutide a una dosis de 100µg/Kg cada 12 horas de

forma subcutánea (C+LIR o NTF+LIR, n=5) o bien vehículo (C+VEH o NTF+VEH, n=5) desde GD14

hasta el nacimiento de las crías. Otro grupo de ratas gestantes tratadas con NTF recibieron una inyección

intraperitoneal de dexametasona al día (0.4mg/Kg) desde GD19 hasta GD21 (NTF+DEX, n=5) según

estudios previos (Losada A. y cols., 2000). Para el análisis de la supervivencia neonatal de cada grupo

experimental, se permitió el nacimiento de las crías que fueron monitorizadas a lo largo de 7 días.

El diseño experimental se detalla en la figura 16 que se muestra a continuación:

Figura_16: Esquema representativo del protocolo experimental para la evaluación de los efectos de Liraglutide en la

supervivencia neonatal en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida.

Hipoplasia pulmonarInducida duranteorganogénesis

Grupo Control (C)

n=10

♀GD1---------------------------GD14Grupo

Nitrofen (NTF)n=15

Organogénesis (Desarrollo pulmonar)

Vehiculo�� C+VEH n=5 o NTF+VEH n=5. 0.9% NaCl.

Liraglutide �� C+LIR n=5 o NTF+LIR n=5. 100µg/Kg/12h/s.c

Dexametasona��NTF+DEX n=5. 0.4mg/Kg/24h/i.p

GD9

GD9

100mg NTF i.g(1ml aceite de oliva)

1ml aceite de oliva(i.g)

P1 P8

Etapa Alveolar

GD19 GD20 GD21


59

3.3.3.3. Influencia de la ingesta durante la gestación en el desarrollo del pulmón.

Los cambios en el patrón de ingesta durante la gestación incrementan el riesgo de desarrollar

patologías en la etapa postnatal. Tal y como demuestran estudios previos, la subnutrición durante el

desarrollo fetal se asocia a resistencia a insulina, hipertensión u obesidad en el periodo postnatal (Jones

AP y cols., 1982; Woodall SM y cols., 1996 y Hales CN, 1991).

Considerando la importancia de la nutrición durante la gestación en el desarrollo de patologías,

nos propusimos evaluar la influencia de la ingesta en el desarrollo pulmonar en el día previo al

nacimiento (E21).

El efecto anorexigénico de Liraglutide se ha constatado en diversos estudios (Kanoski SE y cols.,

2011; Raun K y cols., 2007). Sin embargo, se desconoce si dicho efecto ocurre durante la gestación,

periodo en el que se incrementa de forma considerable la demanda nutricional.

Por ello, se analizó el patrón de ingesta de ratas gestantes en respuesta a la administración

periférica de Liraglutide desde GD14 o bien desde GD18 hasta GD21.

Por otra parte, con el fin de evaluar el posible retraso en el desarrollo pulmonar causado por

deficiencias en el aporte calórico durante la gestación, se desarrolló un modelo de subnutrición mediante

la reducción del 30% de la ingesta calórica desde GD14 hasta GD21. De igual forma, se analizaron las

acciones de Liraglutide en este modelo animal.

3.3.3.3.1. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta en ratas gestantes.

El objetivo de este experimento fue determinar los efectos de la administración periférica de

Liraglutide en la ingesta durante la gestación.

Se establecieron cuatro grupos experimentales de ratas gestantes; un grupo control alimentado

ad-libitum (n=4) tratado con vehículo, un grupo alimentado ad-libitum tratado con Liraglutide

(100µg/Kg, s.c cada 12h) desde GD14 hasta GD21 (LIR_GD14, n=4), un grupo pair-fed con la misma

ingesta diaria desde GD14 hasta GD21 que el grupo LIR_GD14 [(pair-fed(LIR_GD14), n=4] y tratado

con vehículo y por último, un grupo alimentado ad-libitum tratado con Liraglutide (100µg/Kg, s.c cada

12h) desde GD18 hasta GD21 (LIR_GD18, n=4).

A lo largo del desarrollo experimental se registró la ingesta diaria de las ratas gestantes de cada

grupo. La figura 17 indica de forma esquemática el desarrollo experimental.


60

Figura_17: Protocolo experimental para el análisis de los efectos de Liraglutide en la ingesta diaria de ratas gestantes.

3.3.3.3.2. Modelo de subnutrición durante la gestación.

Para el desarrollo del modelo de subnutrición, la ingesta diaria de las ratas gestantes se redujo

en un 30% con respecto a la cantidad de alimento consumida por el grupo control alimentado ad-libitum.

Se establecieron tres grupos; el grupo control que recibió vehículo y tuvo libre acceso a la

comida (n=4) y dos grupos sometidos a restricción calórica (RC) desde GD14 hasta GD21. Tras 4 días de

subnutrición, es decir, en GD18, uno de los grupos recibió vehículo (RC+VEH, n=4) mientras que al otro

se trató con Liraglutide (RC+LIR_GD18, n=4, 100µg/Kg, s.c cada 12h) hasta GD21. El tratamiento se

inició en GD18 ya que en este momento de la gestación la administración de Liraglutide no modificó la

ingesta de alimentos.

La figura 18 muestra de forma esquemática el diseño del experimento.

Figura_18: Esquema representativo del protocolo experimental para el análisis de la función pulmonar de E21 en un

modelo de subnutrición durante la gestación.

En ambos protocolos experimentales (3.3.3.3.1 y 3.3.3.3.2) las ratas se sacrificaron en GD21 y

los fetos (E21) se extrajeron del útero materno. Los pulmones se aislaron y posteriormente se

almacenaron a -80°C hasta su procesamiento.

GD21

LIR_GD14n=4

Ad libitum

Pair-Fedn=4

VEH: 0.9% NaCl

LIR: 100 µg/kg/12h/s.c.

LIR_GD18n=4

Ad libitumPulmones de E21

CONTROL(Ad libitum)

n=4

Ratas gestantes


VEH: 0.9% NaCl

Ratas gestantes

CONTROL(Ad libitum)

n=4

Restricción calórica

30% (R.C)n=8

GD21

Pulmones de E21

GD

14

GD

18

VEH: 0.9% NaCl


VEH: 0.9% NaClR.C + VEHn=4

R.C + LIRn=4


61

Las señales evaluadas para determinar los efectos de la restricción calórica en la función pulmonar fueron

las siguientes:

� Parámetros basales: registro diario de ingesta y peso corporal de ratas gestantes.

� Análisis del grado de desarrollo pulmonar en fetos de 21 días: se registró el peso corporal de E21

así como el peso de sus pulmones para determinar la ratio peso del pulmón/ peso corporal

(P.P/P.C) como indicador de desarrollo pulmonar.

� Caracterización de señales implicadas en el desarrollo del pulmón en fetos macho de 21 días: se

estudiaron los niveles de expresión de mRNA de los receptores de angiotensina II, AT1-R y AT2-

R, ya que regula la formación de los alveolos durante el desarrollo pulmonar.

� Estudio de las proteínas surfactantes en pulmón de fetos macho de 21 días: se analizaron los

niveles de mRNA y proteicos de SP-A y SP-B así como los niveles de mRNA del factor de

transcripción Nkx2.1.

� Análisis del patrón de expresión de GLP-1R en pulmones de fetos macho de 21 días.

� Evaluación de la acción local de glucocorticoides en pulmones de fetos macho de 21 dias: se

determinaron los niveles proteicos de GR en los núcleos celulares de los pulmones de fetos.

3.3.4. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa adulta: Diabetes y Obesidad.

Dado que los análogos de GLP-1 están siendo empleados para el tratamiento de la diabetes tipo 2 y

de la obesidad y dichas patologías se han relacionado con disfunciones respiratorias, se analizó el papel

de Liraglutide en un modelo de diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina, así como en un modelo

genético de obesidad animal.

3.3.4.1. Modelo de diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina.

La estreptozotocina es un antibiótico de amplio espectro citotóxico que cuando se administra a

ratas de manera intraperitoneal o intravenosa a altas dosis (50-70 mg/Kg) produce la destrucción de las

células β pancreáticas en un periodo de 24 horas.

La diabetes experimental fue inducida en ratas macho adultas tras 4 horas de ayuno mediante la

administración intraperitoneal de estreptozotocina a una dosis efectiva de 70 mg/Kg disuelta en tampón

citrato 0.1M, pH 4.5 tal y como se realizó en estudios previos en nuestro laboratorio (Gil-Lozano y cols.,

2010). El día de la administración de estreptozotocina es considerado el día 1 del periodo experimental,

D1.

Transcurridas 24 horas (D2) se midieron los niveles de glucosa en sangre para determinar los

animales en los cuales se hizo efectiva la diabetes. Únicamente aquellos animales que mostraron

hiperglucemia severa fueron incluidos en el estudio, con valores superiores a 450 mg/dL. El cuadro

diabético se mostró en un 82% de las ratas tratadas con estreptozotocina (STZ, n=14). El grupo control

(C, n=14) recibió una inyección intraperitoneal del vehículo (tampón citrato, 0.1M, pH 4.5).


62

Desde D7 hasta D13 ambos grupos (C y STZ) se trataron con Liraglutide de forma subcutánea

cada 12 horas a una dosis de 100µg/Kg (C+LIR o STZ+LIR, n=7) o bien 0.9% NaCl (C+VEH o

STZ+VEH, n=7). En el día 14, los animales se sacrificaron, se recogió sangre troncal y se procedió a la

extracción de los tejidos.

Las ratas tratadas con STZ recibieron 1UI/Kg de insulina cada 12 horas de forma subcutánea

desde D2 hasta D6 para el control de la glucemia. La dosis de insulina se redujo a la mitad (0.5 UI/Kg

cada 12 horas) en el momento en el que se inició el tratamiento con Liraglutide (desde D7 hasta D14). El

grupo control recibió una inyección subcutánea de 0.9% Na Cl cada 12 horas desde D2 hasta D13.

La figura 19 muestra el desarrollo experimental:

Figura_19: Diseño experimental desarrollado para el estudio de los efectos de Liraglutide en la función pulmonar en un

modelo de diabetes inducida por STZ.

Una vez finalizado el experimento se procedió al análisis de los parámetros detallados a continuación:

� Seguimiento del cuadro diabético: el peso corporal (P.C) fue registrado diariamente. Se

determinaron los niveles de péptido C en D8, D10 y D14 así como los niveles de glucosa en D2,

D6, D8, D10 y D14 en plasma obtenido tras punción yugular. Se midieron los niveles de péptido

C como indicador de los niveles de insulina ya que se cosegrega en cantidades equimolares y

tiene mayor estabilidad en la sangre.

� Evaluación del desarrollo de hipertrofia del ventrículo derecho: tras el sacrificio, se extrajeron los

ventrículos cardiacos izquierdo y derecho que fueron pesados e inmediatamente almacenados a

-80°C hasta su procesamiento. Se determinó la ratio entre el peso del ventrículo derecho y

ventrículo izquierdo corregido por el peso corporal como indicador de incremento de la masa

ventricular derecha. La confirmación de la hipertrofia del ventrículo derecho se realizó

Grupo Control(C, n=14)

Grupo Diabetes Inducida

(STZ, n=14)

D1 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14

Insulina: 1UI/Kg/12h/s.c Insulina: 0.5 UI/Kg/12h/s.c

STZ: 70mg/Kg, i.p

0.1M tampón citratato, pH 4.5

(C+VEH, n=7)

(C+LIR, n=7)

(STZ+VEH, n=7)

(STZ+LIR, n=7)

VEH: 0.9% NaCl

LIR: 100 µg/Kg/ 12h/ s.c

Sangre troncalTejido pulmonarVentriculos

♂Adulto


63

determinando los niveles proteicos de BNP-32 (B-type natriuretic peptide-32), marcador de

insuficiencia cardiaca en el ventrículo derecho.

� Estudio de la acción del sistema renina-angiotensina en pulmón: se tomaron muestras de tejido

pulmonar de cada grupo experimental y se realizó un análisis del patrón de expresión de ACE

(angiotensin converting enzyme, responsable de la síntesis de AII), de ACE2, enzima que

metaboliza AII dando lugar a A (1-7) y de los receptores AT1-R y AT2-R sobre los que actúa AII

y que presentan acciones opuesta.

� Análisis del componente proteico del surfactante pulmonar: en las muestras de pulmón también

se determinaron los niveles proteicos y de mRNA de las principales proteínas que forman parte

del surfactante, SP-A y SP-B.

� Evaluación de efectos indirectos a través del eje HPA (hypothalamic pituitary adrenal axis.): se

determinaron los niveles circulantes de corticosterona en D2, D6, D8, D10 y D14.

3.3.4.2. Modelo de obesidad.

Los estudios relacionados con la obesidad se desarrollaron mediante el uso de ratas Zucker macho

(Zucker Fatty Rats). La cepa presenta una mutación espontánea en el receptor de la leptina lo que se

traduce en un fenotipo obeso puesto que los animales con esta mutación presentan resistencia a la leptina.

La mutación se descubrió en 1961 por el Dr. Lois Zucker (Zucker LM y Zucker TF., 1961). El fenotipo

obeso se manifiesta a las 5 semanas de edad y a las 40 semanas las ratas fa/fa presentan casi el doble de

peso corporal que los animales heterocigotos. Además, también muestran hiperfagia, hiperlipemia,

hiperleptinemia e hiperinsulinemia. Para nuestros estudios se emplearon los pulmones de animales obesos

homocigotos (fa/fa) así como de individuos no obesos heterocigotos para la mutación (fa/+).

En este modelo animal se caracterizaron los niveles de expresión de mRNA de las proteínas

surfactantes (SP-A y SP-B) en el pulmón así como los del GLP-1R.

3.4. Obtención de muestras.

3.4.1. Sangre.

Se obtuvieron muestras de sangre troncal por decapitación de los animales al final de cada

protocolo experimental o sangre venosa por punción yugular (0.7ml) en ratas anestesiadas.

La sangre troncal se recogió en tubos sin ningún tipo de agente anticoagulante. Las muestras se

dejaron reposar al menos 10 minutos en hielo para permitir la coagulación y facilitar la separación del

suero.

Para la medición de péptido C en plasma, las muestras de sangre se recogieron en vacutainers con

inhibidores de proteasas (aprotinina 250KIU). y anticoagulante K3EDTA (15%).

La sangre se centrifugó a 2200rpm durante 20 minutos a 4°C para la obtención de suero o plasma.

Las muestras se almacenaron a -20°C hasta que se realizaron las correspondientes determinaciones.


64

3.4.2. Líquido amniótico.

El líquido amniótico de cada feto se recogió en tubos eppendorf tras romper la bolsa amniótica

con una aguja 25G. El líquido amniótico recogido se centrifugó a 1000g durante 20 minutos a 4°C para

eliminar los restos celulares. Las muestras se almacenaron a -20°C hasta su utilización.

3.4.3. Tejidos pulmonar y cardiaco.

Los pulmones de distintas etapas de desarrollo se congelaron a -80°C hasta la extracción del RNA

y de la proteína total. Puesto que las patologías respiratorias debido a inmadurez pulmonar son más

frecuentes en niños prematuros varones que en hembras debido al retardo en la maduración del pulmón de

machos, únicamente se procesó el tejido pulmonar total procedente de fetos o neonatos macho. Mientras

que de los pulmones de ratas adultas de los diferentes modelos utilizados (diabéticas y obesas) se aisló un

área del lóbulo pulmonar derecho.

Los ventrículos izquierdo y derecho de los corazones de ratas adultas diabéticas y no diabéticas se

separaron de las aurículas, se pesaron y se almacenaron a -80°C.

El sexo de los fetos fue determinado realizando un examen de las gónadas mediante una lupa y el

de los neonatos fue determinado realizando un examen de la distancia ano-genital.

3.5. Determinaciones hormonales en suero o plasma (Radioinmunoensayo).

El RIA es un método que permite determinar la concentración de un antígeno mediante su

interacción con un anticuerpo específico, de forma muy sensible puesto que la señal que se cuantifica es

radioactiva. En un radioinmunoensayo competitivo el antígeno no marcado (frío) de la muestra compite

por unirse al anticuerpo con un antígeno marcado radioactivamente. El resultado son dos tipos de

complejos antígeno-anticuerpo, uno con el antígeno frío y otro con el antígeno marcado, por lo que la

señal es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. Para la

cuantificación es necesario separar la fracción libre (antígeno marcado o frío no unido al anticuerpo) de la

fracción ligada (antígeno frío o marcado unido al anticuerpo) y luego medir la radiactividad en un

contador de radiación.

Los niveles de corticosterona y 17β-estradiol en suero o péptido C en plasma, se midieron

mediante kits de RIA específicos suministrados por DRG-Instruments (Marburg, Alemania) siguiendo las

instrucciones detalladas por el fabricante.

La sensibilidad del ensayo de corticosterona fue de 7.7 ng/ml. La concentración mínima detectada

en el ensayo de péptido C fue de 11.61 pM, mientras que en el caso del kit empleado para determinar

17β-estradiol fue de 1.39 pg/ml.

Para una ED50 (effective dose), el coeficiente de variación (CV) intra-ensayo del kit de RIA de

corticosterona fue de 2.18% y el CV inter-ensayo fue de 4.41%. El CV intra-ensayo para ED50 del kit de

RIA para 17β-estradiol fue de 4.7% y de 6.59% para el péptido C.


65

3.6. Determinación de proteínas en líquido amniótico y en tejido mediante ELISA.

La concentración de SP-A y SP-B en líquido amniótico de fetos fue medida mediante ELISA para

lo que se usó el kit de ELISA para SP-A y SP-B de Cushabio Biotech (Wuhan,China). El procedimiento

se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. La dosis mínima detectable del kit de ELISA

para SP-A fue de 1.56 ng/ml y 0.78pg/ml para SP-B. El CV intra-ensayo e inter-ensayo para SP-A a una

dosis efectiva ED50 fueron de 10% y 11.6% respectivamente. El kit de ELISA de SP-B tuvo un CV intra e

inter- ensayo de 5.8% y 10% respectivamente.

La concentración de BNP-32 en los ventrículos derecho se determinó mediante un kit de ELISA

(Assaypro, Saint Charles, Missouri, EE. UU.). Las proteínas totales fueron extraídas según se detalla en el

apartado 3.9.10 y se cuantificaron mediante el método Bradford (Bradford, M.M., 1976). En el ensayo se

emplearon 100µg de proteína total en el caso de los grupos controles y 50µg para detectar BNP-32 en

ventrículos de ratas tratadas con STZ ya que, en este grupo experimental, se esperaba una

sobreproducción de BNP-32. Tras finalizar la lectura de absorbancia, los valores de concentración

obtenidos se corriegieron por el factor de dilución correspondiente. La dosis mínima detectable del

ensayo fue de 0.03ng/ml. El coeficiente de variación intra-ensayo fue de 14.23% para ED50.

3.7. Determinación de glucosa en suero.

La concentración de glucosa en suero se midió mediante el kit comercial RTU (Biomérieux, Marcy

l´Etoile, Francia) siguiendo las instrucciones especificadas.

3.8. Análisis de los niveles de mRNA.

3.8.1. Extracción de RNA total.

La extracción del RNA total se llevó a cabo mediante el método de Chomczynski P. y Sacchi N.

(Chomczynski P y Sacchi N., 1987), que se basa en la capacidad del fenol para separar el homogenizado

celular en dos fases con distinta solubilidad; una fase orgánica e interfase que contiene lípidos, restos

celulares y proteínas y una fase acuosa menos densa que contiene ácidos nucleicos, polisacáridos y

pequeñas moléculas hidrosolubles. El fenol suele emplearse en combinación con cloroformo para

aumentar la eficiencia de la separación dando lugar a fases acuosas menos contaminadas. El DNA es

selectivamente retenido entre la interfase y la fase orgánica por lo que en la fase acuosa permanece solo el

RNA. Una vez separado el RNA los pasos sucesivos de la extracción están destinados a aislar el RNA

mediante precipitación a baja temperatura empleando alcoholes y centrifugaciones secuenciales.

Los tejidos se homogeneizaron mecánicamente (disgregador ULTRA-TURRAX T8, IKA®,

Staufen, Alemania) con solución desnaturalizante (solución D: 21.15mM de citrato de sodio pH 7, 0.42%

sarcosil, 40% tiocinato de guanidina y 0.75% β-mercaptoetanol). Tras la homogeneización se añadió

acetato sódico (2M, pH 4), cloroformo:isoamiloalcohol (49:1) y fenol saturado en agua. Las muestras se

centrifugaron a 12000 rpm durante 20 minutos a 4°C, se recogió el sobrenadante que contiene el RNA

total que precipita en contacto con isopropanol a -20°C. El RNA se purificó de nuevo con solución D e


66

isopropanol. Finalmente se realizó un lavado con etanol al 70% y el RNA asilado se disolvió en H2O con

DEPC (dietil pirocarbonato, agente inhibidor de RNasas) para su posterior cuantificación.

La cuantificación del RNA se realizó con un espectrofotómetro (Beckman DU®530 Life Science

UV/VIS) mediante la determinación de la absorbancia a 260nm. El factor de conversión para determinar

la concentración de RNA es 1 unidad de absorbancia que se corresponde con 40µg/mL de RNA.

Mediante la razón 260/280nm se comprobó la pureza del RNA de cada muestra (1.8-2).

3.8.2. Reverso Transcripción.

Tras determinar la concentración de RNA se procedió a la síntesis de cDNA mediante reverso

transcripción, partiendo de 1.5µg de RNA total. Los componentes de la reacción se especifican en la tabla

2.

Componente de la

reacción

Concentración

final

H2O DEPC

Tampón RT 1X

dNTPs 0.5mM

Random primers 10 µM

Inhibidor de RNasa 0.33 U/ µL

M-MLV 6.67 U/µL

RNA 1.5µg en 30µL

El volumen final de la reacción fue de 30 µl, la reacción de reverso transcripción se realizó en un

termociclador (Matercycle gradient, Ependorf, Madrid, España) mediante el siguiente protocolo: 1 h de

incubación a 37°C, 5 minutos de elongación a 42°C y 5 minutos a 95°C para la inactivación de la enzima.

Finalmente las muestras se mantuvieron a 4ºC.

3.8.3. PCR semicuantitativa a tiempo final.

El cDNA obtenido tras la RT se llevó a un volumen final de 100µl con H2O DEPC (15ng/µl). La

reacción de PCR fue realizada en un termociclador (Matercycle gradient, Ependorf, Madrid, España)

para los genes especificados en la tabla 3 en donde se muestran los primers específicos. Los primers se

diseñaron mediante Primer-Blast (National Center for Biotechnology Information NCBI, EE.UU.) a partir

de las secuencias de los genes de interés disponibles en GenBank® (NCBI, EE.UU.) considerando las

secuencias intrónicas. Los primers se seleccionaron teniendo en cuenta los parámetros óptimos de

longitud (18-24pb), contenido de G/C (40-60%) y Tm similar. Para la reacción de PCR se emplearon 10µl

de cDNA (150ng) que se amplificó tras la adición de los reactivos detallados en la tabla 4. Las

condiciones de temperatura así como los ciclos de amplificación se optimizaron para cada uno de los

genes estudiados. Paralelamente, se amplificó el RNA ribosómico 18S de cada muestra, que se empleó

como gen normalizador y como control interno de la reverso transcripción.

Tabla_2: Componentes de la reacción de reverso

transcripción y concentración final de trabajo. Los

componentes de la reacción fueron suministrados por

Thermo Scientific (Madrid, España), salvo los random

primers que fueron porporcionados por GeneLink

(Hawtharne, NY, EE. UU.)


67

Gen (GenBank accession No)

Secuencia de los Primers (5´-3´) condiciones de PCR

SP-A (NM_017329)

Forward: 5´-AAGTGCTGCCCTCTGACCT-3´

95°C - 2min [95°C - 30s; 60°C - 45s; 72°C -

45s] x 23

72°C - 10min Producto de amplificación:

342 pb

Reverse: 5´-TACTTGAGTTGGGGTCTGGG-3´

SP-B (NM_138842)

Forward: 5´-GTTCCACTGCAGATGCCATTG-3 ́

95°C - 2min. [95°C -30s; 63°C - 30s; 72°C -

10s] x 20 72°C - 10min.

Producto de amplificación: 215 pb

Reverse: 5´-CATGTGCTGTTCCACAAACTGC-3 ́

SP-C (NM_017342)

Forward: 5´-TGCTGCCCCGTGCATCTCAA-3´

95°C - 2min. [95°C -30s; 61°C - 30s; 72°C -

10s] x 25 72°C - 10min.


Reverse: 5´-TTCACTCAGGGCGAGGCGTT-3 ́

GLP-1R (NM_012728)

Forward: 5´AGTAGTGTGCTCCAAGGGCA 3´

95°C - 5min. [95°C - 30s; 52°C - 30s; 72°C -

10s] x 25 72°C - 10min.


Reverse: 5´-CGGTGGGGTACGCACTTTCTT-3´

18S (NR_046237)

Forward: 5´- GGCTACCACATCCAAGGAA-3 ́

95°C -5min. [95°C - 30s; 52°C - 30s; 72°C -

10s] x 10 72°C - 10min.


Reverse: 5´-CTGGAATTACCGCGGCT-3 ́

Tabla_3: Secuencias de los primers, condiciones y productos de amplificación empleados para la reacción de PCR de cada

gen estudiado.

Componentes

de la Reacción

Concentración final

H2O DEPC

Tampón PCR 1X

MgCl 2 2mM

dNTPs 0.2mM

primer Forward 0.2µM

primer Reverse 0.2µM

Dream DNATaq-polimerasa 0.025U/µL

cDNA 150ng en 50µL

Tabla_4: Concentración de los

componentes de la reacción de PCR.

Los reactivos fueron proporcionados

por Thermo Scientific (Madrid,

España) y los primers por STAB-

VIDA (Setúbal, Portugal).


68

El producto final de reacción se visualizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%

diluido en TBE 1X (TBE 5X: 5.4% Tris base, 2.75% ácido bórico, 2% EDTA 0.5M, pH 8.0) teñido con

bromuro de etidio. A cada muestra se le añadió el volumen necesario de tampón de carga 6X (30%

glicerol, 0.25% azul de bromofenol, 0.25% xileno de cianol) para obtener una concentración final 1X.

Los productos de amplificación se visualizaron y se capturaron mediante el sistema de documentación de

geles ChemiDoc XRS (Bio-Rad, California, EE.UU.) que permite la corrección del background. Los

cambios relativos en la amplificación de los productos de los genes estudiados de cada grupo

experimental se determinó mediante densitometría usando el software Bio-Rad ChemDoc XRS Image

Lab™ software 3.0 (Bio-Rad, California, EE.UU.) y representado como porcentaje de densidad óptica (%

DO). En todos los ensayos se llevó a cabo una reacción sin cDNA como control negativo. La

especificidad de los productos de PCR se confirmó por secuenciación realizada en el Centro de Apoyo

Científico y Tecnológico a la Investigación (C.A.C.T.I.) de la Universidad de Vigo.

3.8.4. PCR a tiempo real.

De forma más precisa se realizó la cuantificación de la expresión génica mediante PCR a tiempo

real, para lo cual se emplearon ensayos prediseñados RealTime ready single assay (Roche Diagnostics,

Barcelona, España) que contienen los primers específicos del gen de interés así como una sonda

TaqMan®. Las sondas TaqMan® son sondas de hibridación específicas que presentan dos tipos de

fluoróforos; un reporter (R) o donador en el extremo 5´ y un quencher (Q) o aceptor en el extremo 3´. La

detección de la señal de fluorescencia emitida por la sonda se basa en FRET (fluorescence resonance

energy transfer entre los fluoróforos. El reporter emite fluorescencia cuando es excitado a una

determinada longitud de onda, la cual es absorbida por el quencher únicamente cuando ambos fluoróforos

se encuentran próximos. Durante la amplificación, la Taq polimerasa degrada el extremo 5´ de la sonda

gracias a su actividad exonucleasa a medida que se desplaza a lo largo de la cadena en su acción de

síntesis. En este caso, la fluorescencia emitida por el reporter no es absorbida por el quencher debido a

que se encuentran separados tras la hidrólisis por lo que la señal es detectada a medida que se produce la

amplificación. El fluoróforo reporter detectado por el equipo fue FAM (6-carboxifluoresceína, absorción

a 495 y emisión a 520) mientras que el quencher empleado fue TAMRA (carboxi-tetrametil rodamina,

absorción a 544 nm y emisión a 576 nm). Los ensayos que se utilizaron fueron para la amplificación de

las proteínas surfactantes SP-A (ID 503158) y SP-B (ID 505403), GLP-1R (ID 503229) así como los

componentes del sistema renina-angiotensina, ACE (ID503125), ACE2 (ID505454), AT1-R (ID503930)

y AT2-R (ID504672). Como gen normalizador se empleó el RNA ribosómico 18S (ID 502300).

La PCR a tiempo real de cada muestra se realizó por duplicado en el termociclador de PCR

Tiempo Real (Applied Biosystem® 7900HT, California, EE.UU.) empleando 1X Fast Start Universal

Probe Master Rox (Roche Diagnostics, Barcelona, España) y 10ng de cDNA para la amplificación de SP-

A, SP-B y GLP-1R y 20ng de cDNA para la amplificación de ACE, ACE2, AT1-R y AT2-R. Las

condiciones de la reacción fueron una pre-incubación de 10 minutos a 95°C seguido por 45 ciclos de:


69

desnaturalización a 95°C de 10 segundos e hibridación de los primers y la sonda TaqMan® a 60°C

durante 30 segundos. En cada ensayo se incluyeron controles negativos sin cDNA, que no fueron

amplificados.

Los niveles relativos de mRNA se calcularon mediante el método 2-∆∆Ct. El Ct (threshold cycle)

se determinó por el software del sistema de detección que posee un umbral de fluorescencia establecido.

Se utilizó ROX como fluoróforo interno de referencia pasiva. Los valores de Ct obtenidos de cada

muestra se normalizaron con el correspondiente valor de Ct del gen 18S para así obtener ∆Ct. Los niveles

de expresión relativa de cada grupo experimental se calcularon con respecto al ∆Ct del grupo control o

calibrador, obteniéndose ∆∆Ct.

3.9. Determinación de expresión proteica. (Western-Blot).

La técnica de Western-blot se basa en la observación de proteínas en una membrana mediante el

uso de anticuerpos específicos para la proteína diana cuya señal puede ser visualmente detectada

mediante diversos métodos.

Para el desarrollo del ensayo es necesaria la extracción de las proteínas totales que se separan en

función del peso molecular mediante electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-

PAGE, geles de poliacrilamida desnaturalizantes). Una vez separadas, las proteínas totales se transfieron

a un soporte sólido (membrana) que es incubado con anticuerpos específicos asociados a sistemas

enzimáticos capaces de generar una señal visual y cuantificable.

3.9.1. Lisis celular y extracción de las proteínas totales.

La lisis celular se realizó mediante homogeneización de los tejidos con tampón RIPA (PBS 1X,

1% nonidet-40, 0.5% desoxicolato sódico y 0.1% SDS). Los inhibidores de proteasas (leupeptina

10µg/ml, aprotinina 5µg/ml, PMSF 0.6mM y 1mM de ortovanadato sódico) se añadieron en el momento

de la homogeneización. Se añadieron 300µl de tampón de lisis por cada 100mg de tejido. El

homogeneizado se centrifugó a 13200 rpm a 4°C durante 15 minutos, tras lo que se recogió el

sobrenadante que contiene las proteínas totales. Las proteínas se cuantificaron mediante el método

colorimétrico de Bradford utilizando el kit Bio-Rad protein assay, (Protein assay dye reagent, Bio-Rad®,

Madrid, España) y empleando como estándar para la recta de calibrado BSA (albúmina de suero bovino,

Sigma-aldrich, Madrid, España). Una vez determinada la cantidad de proteína de cada muestra se

prepararon alícuotas a la concentración necesaria para cada análisis.

La desnaturalización, reducción y carga de las proteínas totales se realizó mediante la adición del

tampón de carga (tampón de carga 4X: 50% glicerol, 10% SDS, 5% β-mercaptoetanol, 0.4M Tris [pH

6.8] y 0.5% azul de bromofenol) e incubación a 95°C, 5 minutos.

Para la detección de SP-A se cargaron 24µg de proteínas totales y para SP-B, 48µg. Una vez

extraídas las proteínas nucleares (detallado en el apartado 3.10.1), se emplearon 30µg de proteínas

nucleares para el análisis de GR (glucocorticoid receptor).


70

3.9.2. SDS-PAGE.

La separación de las proteínas en función del peso molecular se realizó mediante SDS-PAGE con

distinta concentración de acrilamida:N,N-metilenobisacrilamida (30% Acrylamide/bis solution 37.5:1

Bio-Rad, Madrid, España) en función del peso molecular de las proteínas diana. El resolving gel para la

detección de SP-A (26-38 kDa) fue al 12%; para SP-B (6 kDa) al 15% y para GR (110kDa), al 7.5%. El

staking gel fue siempre al 4% de bis:acrilamida.

Una vez polimerizados con ayuda de un iniciador, el TEMED (N,N,N,N-

tetramethylethylenediamine, Sigma-Aldrich, Madrid , España) y un catalizador, el amonio persulfato

(APS, Amonium Persulfate, Sigma-Aldrich, Madrid, España), los geles se montaron en el sistema de

electroforesis Mini Protean® System, (Bio-Rad, California, EE.UU.), sumergidos en running buffer

(Running buffer 5X: 1.5% Tris, 7.2% glicina, 0.5% SDS). Tras cargar las proteínas así como el marcador

de peso molecular (Precision Plus Protein TM All Blue Standards, BioRad), se aplicó un campo eléctrico

de 100V durante 2 horas aproximadamente.

Los componentes de los geles se muestran en la tabla 5:

Resolving gel 5ml de gel

(ml) Satcking gel

5ml de gel

(ml)

Concentración 7.5% 12% 15% Concentración 4%

H2O destilada 3.35 1.6 1.1 H2O destilada 1.75

Mix Acrilamida30% 1.75 2 2.5 Mix Acrilamida30% 0.372

Tris 1.5M pH 8.8 1.75 1.3 1.3 Tris 1.5M pH 6.8 0.277

SDS 10% 0.035 0.050 0.050 SDS 10% 0.022

APS 10% 0.050 0.050 0.050 APS 10% 0.025

TEMED 0.005 0.002 0.002 TEMED 0.0022

Tabla_5: Componentes de los geles de poliacrilamida para un mini-gel (0.75mm x 10cm x 8cm)

3.9.3. Inmunoblotting.

� Transferencia semi-seca.

Las proteínas totales o nucleares separadas mediante SDS-PAGE se transfirieron a membranas de

PVDF (Immun-Blot™ PVDF Membrane, Bio-Rad, California, EE. UU.), previamente activadas con

metanol, mediante transferencia semi-seca al aplicar un voltaje de 15V durante 2 horas. La eficiencia de

transferencia se comprobó mediante tinción de la membrana con rojo Ponceau (Sigma Aldrich, Madrid,

España).

� Incubación con anticuerpos.

Las membranas con las proteínas transferidas se incuabaron durante 1 hora a temperatura

ambiente con leche en polvo libre en grasas al 5% disuelta en PBS-Tween 0.2%, para bloquear uniones

inespecíficas de los anticuerpos. Seguidamente se incuabaron con el anticuerpo específico para cada


71

proteína. Se realizaron tres lavados de 5 minutos con PBS-Tween 0.2% y se procedió a la incubación con

el anticuerpo secundario. Las condiciones de incubación así como las concentraciones de los anticuerpos

utilizados se detallan en la tabla 6. Los anticuerpos se diluyeron en leche al 5% PBS-Tween 0.2%. Todos

los anticuerpos empleados son policlonales.

Proteína Anticuerpo

primario Concentración

Anticuerpo

secundario Concentración

SP-A

(surfactant

protein-A)

anti-SP-A

sc-7700 1:200

anti-cabra

IgG-HRP

sc-2020

1:10000

SP-B

(surfactant

protein-B)

anti-SP-B

251406 1:250

anti-conejo

IgG-HRP

sc-2004

1:2500

β-actina

anti-β-actina

sc-130657 1:500

anti-conejo

IgG-HRP

sc-2004

1:2500

GR

(glucocorticoid

receptor)

anti-GR

ab16510 1µg/ml

anti-conejo

IgG-HRP

sc-2004

1:3000

TBP

(TATA-binding

protein)

anti-TBP

ab63766 1:500

anti-conejo

IgG-HRP

sc-2004

1:2000

Tabla_6: Anticuerpos primarios y secundarios utilizados en el inmunoblotting. Las incubaciones con los anticuerpos

primarios se realizaron durante toda la noche a 4°C en agitación, mientras que las incubaciones con los anticuerpos secundarios

fueron de 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Los anticuerpos primarios para SP-A y β-Actina así como los anticuerpos

secundarios fueron proporcionados por Santa Cruz Biotechnology Inc, (Heidelberg, Alemania). El anticuerpo primario para SP-B

por Abbiotec (San Diego, CA, EE. UU.), mientras que los anticuerpos para GR y TBP fueron suministrados por Abcam

(Cambridge, Reino Unido). ß-Actina se empleó como control de carga interno de las proteínas totales, mientras que para las

proteínas nucleares se utilizó TBP.

Tras la incubación con el anticuerpo secundario se realizaron tres lavados con PBS-Tween 0.2%

de 5 minutos, a continuación las membranas se incubaron con ECL Plus (AmershamTM, Reino Unido), la

señal luminiscente se capturó mediante BioRad ChemiDoc XRS y el análisis de imagen se realizó con

BioRad ChemiDoc XRS_Image Lab 3.0 software. Se optimizó el tiempo de captura de las imágenes de

manera que la señal de luminiscencia cuantificada procede de la fase exponencial de la reacción

enzimática, por lo que la intensidad relativa con respecto al grupo control entre las distintas muestras de

un blot permanece constante entre imágenes consecutivas. En cada ensayo, la cuantificación fue corregida

tras eliminar la señal de fondo o “background”.

Se realizó un proceso de “stripping” para la reutilización de las membranas previamente

incubadas con un determinado anticuerpo lo que permite la detección de otras señales de interés con peso


72

molecular similar. Para ello, las membranas se reactivaron con metanol durante 2 minutos en agitación.

Tras dos lavados con agua destilada de 2 minutos de duración, se realizaron dos incubaciones con tampón

de stripping (2% SDS, 62.5nM Tris pH 6.8, 100nM β-mercaptoetanol) a 50°C durante media hora. Se

eliminó el exceso de tampón de stripping mediante dos lavados con PBS-tween 0.2% de 15 minutos y dos

lavados de 10 minutos.

3.10. Ensayos de movilidad electroforética.

La técnica EMSA se basa en la observación de la movilidad del complejo proteína:DNA en un

gel de poliacrilamida no desnaturalizante debido a que el complejo proteína: DNA migra más lentamente

que fragmentos de DNA libres lineales (Ceglarek JA y cols., 1989).

Entre los componentes del ensayo se incluyen proteínas nucleares, la sonda diana y competidores

específicos relacionados y competidores no específicos de validación.

Las proteínas nucleares contienen la proteína objeto de estudio.

La sonda es un oligonucleótido marcado de 20-50 pb que presenta el elemento respuesta o de

unión de la proteína.

Los competidores no específicos [poly(dI-dC)] son fragmentos de DNA con secuencias repetitivas

que proporcionan un exceso de regiones inespecíficas de unión a las que se unen las proteínas del lisado

nuclear, evitando que se unan al oligonucleótido marcado.

Los competidores específicos relacionados permiten determinar la especificidad de la banda

resultante del complejo proteína:sonda marcada. El competidor específico relacionado contiene la

secuencia consenso de unión de la proteína diana. Se suele añadir la sonda no marcada en exceso (x100)

lo que suele ser suficiente para eliminar cualquier interacción específica con la sonda marcada,

eliminando o reduciendo cualquier resultado positivo.

Para validar completamente el ensayo se suele realizar otro control interno en el que se añade una

sonda no relacionada, no marcada en exceso que contiene sitios de unión con baja afinidad por la proteína

diana y que no competirá con las interacciones específicas por lo que en este caso permanecerá la señal.

Como en el caso de los competidores inespecíficos, los competidores específicos no marcados

deben ser añadidos a la reacción antes de añadir la sonda marcada pero después de que el competidor

inespecífico haya sido incubado con la proteína.

El complejo proteína:DNA se separa del DNA libre mediante electroforesis con geles no

desnaturalizantes como TBE-poliacrilamida. Normalmente se emplean geles de poliacrilamida de

concentración comprendida entre 4-8%.

El EMSA se realizó para evaluar los efectos de la administración de Ex4 durante la gestación

sobre la unión del factor de transcripción Nkx2.1, presente en los extractos nucleares de pulmones de

fetos y neonatos, al elemento de respuesta de las proteínas surfactantes.


73

� Extracción de las proteínas nucleares.

Los tejidos se cortaron en pequeños trozos para su homogeneización en una solución de lavado

(fosfato sódico 10mM pH 7.5 y NaCl 125mM) empleando un mortero de porcelana. El homogenizado se

centrifugó a 1000g durante 5 minutos a 4°C. Las células se incubaron durante 10 minutos en hielo con un

tampón de extracción hipotónico (10mM HEPES/KOH [pH 7.9], 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 0.1mM

EDTA [pH 8.0] y 0.1Mm EGTA [pH 8.0]). Tras la incubación las células turgentes se centrifugan a

13.000g a 4°C durante 5 minutos tras lo cual el pellet se resuspendió y se incubó en agitación durante 20

minutos en hielo en un tampón hipertónico (20mM HEPES/KOH pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 420mM NaCl,

0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 25% glycerol y 1% nonidet-40). Ambos tampones contenían 1mM

ditiotreitol (DTT) e inhibidores de proteasas:, 0.5Mm PMSF, 2µg/ml leupeptina y 1µg/ml aprotinina. Tras

una centrifugación a 13000g durante 5 minutos a 4°C, se recuperó el sobrenadante que contiene los

extractos nucleares.

La concentración de proteínas se determinó mediante el método de Bradford.

La pureza de la extracción se validó mediante Western-blot en el que se comprobó la ausencia de

α-Tubulina en los extractos nucleares.

� Migración del complejo proteína:DNA.

Para el ensayo de movilidad electroforética se empleó como sonda un oligonucleótido sintético

correspondiente a la secuencia comprendida entre la posición -126 a -102 del promotor de sftp-b de rata

que contiene la región consenso de unión de Nkx2.1. Esta región presenta alta homología con la sonda

SPB-f1 humana (Bohinski RJ y cols., 1994).

La hibridación de la sonda se llevó a cabo con 10µg de la secuencia forward y reverse en 100µl

de tampón con 1mM Tris [pH 7.4] y 0.5 mM NaCl a 96°C durante 3 minutos con agitación tras lo cual se

dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente. El marcaje de la sonda se realizó mediante el

radioisótopo (γ-P32) unido a ATP incorporado por T4 polinucleótido Kinasa (Promega, Madison, WI,

EE.UU.). La sonda se purificó mediante columnas Sephadex G25 (Roche Applied Science, Indianapolis,

IN, EE. UU.).

Una vez marcada la sonda, 10µg de los extractos nucleares se incubaron con 2X “binding mix

buffer” (80mM HEPES [pH 7.9], 1Mm DTT, 0.4mM EDTA, 50% ficoll, 400mM KCl y 0,3ug/µL de

Poly- (dI-dC) durante 15 minutos en hielo. Tras lo cual, se añadió la sonda marcada (30000 cpm) y la

mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Paralelamente se realizaron los controles de

validación del ensayo en los que se añadió la sonda no marcada en exceso (x100, oligonucleótido

relacionado) o bien un oligonucleótido no relacionado no marcado en exceso (x100). De igual forma se

incubó Nkx2.1 sintetizado mediante el sistema de lisado de reticulocitos TNT (Promega, Madison, WI,

EE.UU.) con la sonda marcada.


74

El complejo proteína:DNA se separó en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5% con

un amperaje constante de 20mA. La señal radioactiva se detectó mediante exposición del gel seco con una

película de rayos X a -70°C.

3.11. Estudios histológicos.

Los tejidos empleados para estudios histológicos se fijaron mediante inmersión en formalina 10%

durante 4 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, los tejidos se congelaron lentamente sobre hielo

seco embebidos en medio OCT (Sakura Finetek, Europe B.V., Alphen aan den Rijn, Países Bajos) y se

mantuvieron congelados a -80°C hasta su procesamiento. Se realizaron cortes histológicos de 10µm

mediante el criostato (MICROM HM, 505E, International GmbH, Walldorf, Alemania). Los cortes se

fijaron con acetona y se lavaron con PBS para la inmunoflorescencia y la tinción de Hematoxilina-Eosina.

3.11.1. Inmunofluroescencia.

La localización de GLP-1R en pulmón se determinó mediante inmununofluorescencia en pulmones

de fetos de 20 días y en neonatos, Como control positivo, se empleó tejido pancreático de rata macho

adulta. Las uniones inespecíficas se blquearon tras una incubación de 1h a temperatura ambiente con

NGS (normal goat serum) al 1.5%. Los cortes se incubaron durante toda la noche a 4°C en atmósfera

húmeda con una dilución de 1:500 de anticuerpo primario GLP-1R (Abcam, ab39072, Cambridge, Reino

Unido).

La localización de GLP-1R se determinó mediante una incubación de 1 hora a temperatura

ambiente con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con FITC (1:250), (Abcam, ab6717,

Cambridge, Reino Unido).

Los cortes histológicos se lavaron con PBS 1X tras las incubaciones con los anticuerpos.

Finalmente, se montaron con el medio de montaje ProLong Gold antifeade con DAPI para la tinción de

los núcleos (Life technologiesTM, Barcelona, España). La imágenes se obtuvieron con el microscopio

confocal Leica SP5 (LAS AF 2.0 software) con los objetivos de 10X y 20X. Para la detección de la señal

de FITC se empleó una longitud de onda de 488/493-581nm y de 405/415-526nm para la detección de la

señal de DAPI. No se observó señal de fluorescencia en los controles negativos para cada tejido que

fueron obtenidos siguiendo el mismo procedimiento sin anticuerpo primario.

3.11.2. Tinción hematoxilina-eosina.

La tinción de hematoxilina-Eosina (H&E) se realizó para evaluar los efectos de Liraglutide y Ex4

en la estructura alveolar de fetos con desarrollo pulmonar retardado inducido tras la administración de

NTF. Los cortes se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 10 minutos y con Eosina durante 30

segundos, seguidamente se sumergieron en una batería de alcoholes (etanol 80°, 96° y 100°) y xilol

durante 5 segundos en cada uno. Finalmente los cortes una vez secos, se montaron con medio de montaje


75

y se observaron en un microscopio óptico Olympus (BX51) equipado con una cámara digital (Olympus

DP71) para la captura de imágenes.

3.12. Análisis estadístico.

Todos los datos obtenidos se representaron como media ± el error estándar (± SEM). El análisis

estadístico se realizó mediante el programa estadístico IBM® SPSS® Statistics Versión 19. La evaluación

de las diferencias significativas entre dos grupos independientes se llevó a cabo mediante el test no

paramétrico U de Mann Whitney, mientras que las comparaciones entre más de dos grupos

independientes se analizaron tras aplicar el test de Kruskal-Wallis para k muestras independientes,

seguido por un test de comparaciones múltiples por parejas. Las diferencias entre grupos fueron

consideradas estadísticamente significativas al obtenerse valores de P <0.05.

4. RESULT@DOS.

4. R_sult[ôs.4. R_sult[ôs.4. R_sult[ôs.4. R_sult[ôs.

79

4.1. Caracterización del patrón de expresión de GLP-1R en pulmón en distintas etapas de

desarrollo.

Una vez finalizada la organogénesis del pulmón, los cambios estructurales acontecidos son

irreversibles. Así, las anomalías ocurridas en alguna de las fases de desarrollo pulmonar pueden dar lugar

a patologías respiratorias en la etapa adulta. Por tal motivo, resulta de especial interés el estudio de los

factores que regulan el patrón espacio-temporal en la morfogénesis pulmonar.

Con el fin de definir el posible papel mediador de GLP-1 en la función respiratoria, nos

propusimos caracterizar la expresión de su receptor, GLP-1R, en distintas etapas de desarrollo pulmonar,

así como en la etapa adulta en la que la maduración pulmonar es completa.

En la figura 20 se muestran los niveles de mRNA de GLP-1R en pulmones de ratas macho y

pulmones de ratas hembra en diferentes estadios de desarrollo fetal y postnatal. Tal y como se observa,

las etapas fetales estudias; etapa canalicular (E18 y E20) y sacular (E21), presentan niveles muy bajos, o

prácticamente indetectables, de mRNA de GLP-1R en comparación con la etapa de desarrollo postnatal.

En el día 1 de vida (P1) la expresión de GLP-1R mostró un potente incremento (~ 5 veces) con respecto a

etapas previas. Este perfil de expresión se observa tanto en pulmones de ratas macho como en hembras.

Durante la etapa alveolar, los niveles de mRNA de GLP-1R permanecieron prácticamente

invariables en todas las edades estudiadas con respecto al primer día de vida. Únicamente, se produjo un

incremento significativo de los niveles de mRNA de GLP-1R en pulmones aislados de ratas macho de 15

y 30 días, hecho que no se reprodujo en el análisis de los pulmones obtenidos de ratas hembra.


80

Figura_20: Análisis de expresión de GLP-1R en pulmones de rata macho y hembra pertenecientes a distintas etapas de

desarrollo fetal y postnatal. Los valores se representaron como la media de 5 determinaciones independientes ± error estándar.

*P<0.05 vs P1. Las diferencias significativas entre más de dos grupos independientes se determinaron utilizando el test de

Kruskal-Wallis. E, día de desarrollo embrionario; P, día de vida postnatal; nd, no detectable.

4.2. Localización de GLP-1R en tejido pulmonar.

Los resultados obtenidos del análisis del patrón de expresión de GLP-1R en las distintas etapas de

desarrollo sugieren un papel importante de GLP-1 en la función pulmonar, ya que la expresión de su

receptor se incrementa aproximadamente 4 veces en el primer día de vida postnatal, tanto en machos

como en hembras, con respecto a etapas fetales.

Una vez confirmada la presencia de GLP-1R en el tejido pulmonar, y teniendo en cuenta la

variedad de células que lo constituyen, se procedió a estudiar mediante inmunofluorescencia la

localización de GLP-1R en pulmones de fetos de 20 días y en pulmones de neonatos.

Tal y como se puede apreciar en la figura 21A, GLP-1R se encuentra ampliamente distribuido

por todo el tejido pulmonar en E20 y P1, mientras que en páncreas de rata adulta, utilizado como control

positivo, su localización se circunscribe a los islotes pancreáticos. La presencia de GLP-1R es,

aparentemente, más abundante en pulmones de neonatos que en tejido fetal, lo cual es concordante con

los resultados del análisis de los niveles de mRNA.

Los neumocitos tipo II son responsables de la síntesis y secreción del surfactante pulmonar hacia

la superficie alveolar, factor clave en la función respiratoria. Dada la importancia de estas células en la

función celular, se estudió la presencia de GLP-1R por RT-PCR en neumocitos tipo II aislados de

pulmones de rata adulta.

En la figura 21B se muestra una imagen representativa del análisis de expresión de GLP-1R y

SP-C en neumocitos tipo II y tejido pulmonar completo. Mediante este procedimiento se verificó la

presencia de GLP-1R en neumocitos tipo II. Por otro lado, la amplificación de SP-C mediante RT-PCR

M

E18 E20 E21 P1 P5P10 P15 P20 P25 P30 P35 P38

% D

O m

RN

A G

LP-1

R/1

8S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

nd

E1

8E

20

E2

1P

1P

5P

10

P1

5P

20

P2

5P

30

P3

5P

38

N

GLP-1R

18S

190bp

178bp

500pb

100pb

500pb

100pb

*

*

♀

Día de desarrollo

P1 P5P10P15P20P25P30P35P38

Día de desarrollo

E18E20E21 P1 P5P10P15P20P25P30P35P38P44P46

% D

O m

RN

A G

LP-1

R/1

8S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

*

*

*♂

GLP-1R

18S

190bp

178bp

500pb

100pb

500pb

100pb

M

E1

8E

20

E2

1P

1P

5P

10

P1

5P

20

P2

5P

30

P3

5P

38

P4

4P

46

N

nd


81

confirmó la identidad del tipo celular aislado, puesto que este gen se expresa de forma exclusiva en este

tipo celular.

4.3. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa fetal y neonatal.

Una vez caracterizado el patrón de expresión de GLP-1R en las sucesivas etapas de desarrollo

pulmonar y una vez determinada su localización en pulmón, se estudió la acción de los agonistas de GLP-

1R (Ex4 y Liraglutide) durante la gestación en la función pulmonar de fetos y neonatos con desarrollo

pulmonar normal así como de fetos con hipoplasia pulmonar inducida.

A.

190bp

180bp

178bp

GLP-1R

SP-C

18S

M

500pb

100pb

500pb

100pb

500pb

100pb

Pul

món

_E20

Pul

món

_P1

Pán

crea

s_A

d

DAPI FITC DAPI-FITC

B.

Figura_21: Caracterización de GLP-1R en el tejido pulmonar. La

localización de GLP-1R en páncreas en etapa adulta y en pulmones de

E20 y neonatos (P1) (A) se obtuvo mediante el marcaje con el

fluoróforo FITC. Los núcleos celulares aparecen marcados con DAPI.

La presencia de GLP-1R en neumocitos tipo II fue confirmada en

cultivo primario de neumocitos tipo II (B). M, marcador de peso

molecular; NII, neumocitos tipo II; N PCR, control negativo de la

PCR.


82

4.3.1. Efectos de los análogos de GLP-1 en la síntesis de los componentes del sistema surfactante en

un modelo de desarrollo pulmonar completo.

Puesto que GLP-1R se localiza, entre otras, en las células responsables de la síntesis y secreción

del surfactante pulmonar y éste es un elemento esencial en la función respiratoria, se evaluaron los

efectos de Ex4 y Liraglutide en la expresión génica y proteica de las principales proteínas del surfactante

(SP-A y SP-B) en pulmones en diferentes etapas de desarrollo (etapa canalicular E18 y E20 y etapa

sacular, P1).

Considerando que la maduración del pulmón está retardada en fetos macho, en los que es más

frecuente que se produzcan alteraciones fisiopatológicas, respecto a fetos hembra (Torday JS y cols.,

1981; Nielsen HC y Torday JS, 1981), se realizó el análisis del grado de desarrollo pulmonar en fetos

macho.

4.3.1.1. Acción de Ex4 sobre la síntesis de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B.

La figura 22A muestra el perfil de mRNA de SP-A en las etapas de desarrollo estudiadas así

como los efectos de Ex4 sobre su expresión.

En pulmones de animales no tratados, los niveles de mRNA de SP-A se incrementaron hasta 4

veces en el primer día de vida postnatal (P1) con respecto al día 18 de desarrollo fetal (E18, etapa

canalicular) y 2.5 veces comparado con los niveles de pulmones de E20 (etapa sacular).

La administración de Ex4 durante la gestación provocó un acusado incremento en la expresión de

SP-A en pulmones de E20, alcanzando niveles similares a los presentes en pulmones de P1 procedentes

de ratas gestantes no tratadas. Además, dichos niveles se mostraron incrementados en pulmones de P1

tratados con Ex4. Los efectos observados fueron similares a los ejercidos por Dexametasona.

En la figura 22B se muestran los niveles proteicos de SP-A determinados mediante Western-blot.

Existen 3 isoformas de la proteína de diferente peso molecular. El precursor de 26kDa, apenas detectable,

da lugar a un producto intermedio de 32kDa y finalmente a la proteína madura de 36kDa tras un proceso

de síntesis y modificaciones post-traduccionales de glicosilación.

El precursor de SP-A únicamente fue detectado en pulmones de P1. De igual forma que en el caso

del patrón de expresión de mRNA, el producto intermedio (32kDa) y la proteína madura (36kDa)

mostraron un fuerte aumento de sus niveles en el primer día de vida con respecto a etapas fetales. Ex4

aumentó los niveles proteicos de SP-A (32kDa y 36kDa) en pulmones de neonatos con respecto al

vehículo. En este caso, no se observaron efectos sobre los niveles proteicos de SP-A tras el tratamiento

con Dexametasona. Los niveles de SP-A en el líquido amniótico de fetos que no recibieron tratamiento

durante su desarrollo, mostraron un moderado incremento, aunque no significativo, en la etapa fetal

estudiada más tardía (E20) con respecto a la etapa previa (E18). El análisis de la concentración de SP-A

en líquido amniótico reveló un incremento de los niveles de SP-A en fetos de 18 días tratados con Ex4

con respecto a su respectivo grupo control, alcanzando la concentración de fetos de 20 días (Figura 22C).


83

En la figura 23 se muestran los niveles de mRNA y de proteína de SP-B en las etapas de

desarrollo estudiadas. En los pulmones de E18 los niveles de mRNA de SP-B no fueron detectables

(Figura 23A).

De forma similar que en el caso del patrón de expresión de SP-A, en el grupo control, los niveles

de mRNA de SP-B en el primer día de vida postnatal se incrementaron hasta 2 veces con respecto a la

etapa fetal previa (E20). El tratamiento con Ex4 incrementó los niveles de expresión de SP-B en

pulmones de neonatos de igual forma que lo hizo Dexametasona.

Los niveles proteicos de SP-B en pulmón mostraron una tendencia al incremento a medida que

avanzó el desarrollo, sin embargo, no se observaron diferencias significativas en dichos niveles entre las

etapas fetales (E18 y E20) y postnatal (P1). Asimismo, el tratamiento con Ex4 o con Dexametasona no

E18 E20 P1

% D

O m

RN

A S

P-A

/18S

0

50

100

150

200

####

*

*

*

26kDa 32kDa 36kDa %

niv

eles

pro

teic

os S

P-A

/ ββ ββ-A

CT

INA

50

100

150

200

* *

##nd nd nd

E18 E20 P1 E18 E20 P1E18 E20 P1

## ##

500pb100pb

500pb

100pb

SP-A

18S

342pb

178pbN

E18 E20 P1E18 E20 P1

36kDa32kDa26kDa

43kDa

SP-A

β-ACTINA

E18 E20

ng/m

L S

P-A

(Lí

quid

o A

mni

ótic

o)

0

20

40

60

80

100

*

VEH EX4 DEX

MA. B.

C. Figura_22: Estudio de los efectos de Ex4 sobre la síntesis de

SP-A en distintas etapas de desarrollo pulmonar. (A) Niveles

de mRNA y (B) niveles proteicos en pulmón. (C) Concentración

de SP-A en líquido amniótico en E18 y E20. Los valores se

representaron como la media ± error estándar de 5

determinaciones independientes (n=5). *P<0.05 Ex4 o Dex vs la

etapa correspondiente de VEH. ##P<0.01 E18 o E20 vs P1. (Test

de Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones). M,

marcador de peso molecular; nd, no detectable, N, control

negativo de la PCR. E, día de desarrollo embrionario; P, día de

vida postnatal.


84

modificaron el perfil proteico con respecto a los niveles basales de fetos que recibieron vehículo (Figura

23B).

El análisis de los niveles proteicos de SP-B en el líquido amniótico de fetos no mostró diferencias

significativas entre las etapas fetales E18 y E20. De igual forma, tampoco se observaron diferencias entre

los grupos tratados con Ex4 y su correspondiente VEH (Figura 23C) en ninguna de las etapas estudiadas.

El análisis de las proteínas surfactantes sugiere que Ex4 podría estimular la expresión de SP-A y

SP-B en las etapas de desarrollo pulmonar estudiadas. Por ello, se determinó la acción de Ex4 sobre el

factor de transcripción Nkx2.1, regulador de la expresión tanto de SP-B (Bohinski RJ y cols., 1994) como

de SP-A (Bruno MD y cols., 1995).

E18 E20 P1

% D

O m

RN

A S

P-B

/18S

0

50

100

150

200

250

300

nd

**

#

E18 E20 P1

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-B/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

50

100

150

200

250

300

SP-B

18S

245pb

178pbN

E18 E20 P1

500pb

100pb500pb100pb

VEH EX4 DEX

E18 E20

pg/m

L S

P-B

(Lí

quid

o A

mni

ótic

o)

0

10

20

30

40

50

60

70

E18 E20 P1

6kDa

43kDa

SP-B

β-ACTINA

MA. B.

C. Figura_23: Efecto de Ex4 sobre los niveles de expresión de

SP-B. (A) Niveles de mRNA en pulmones de E18, E20 y P1, y

niveles proteicos (B). (C) Concentración de SP-B en líquido

amniótico E18 y E20. Los valores se representaron como la

media ± error estándar de 5 determinaciones independientes

(n=5). * P<0.05, Ex4 o Dex vs VEH dentro de la misma etapa . # P<0.05, E18 o E20 vs P1. (Test de Kruskal-Wallis, seguido

por múltiples comparaciones). M, marcador de peso molecular;

nd, no detectable; N, control negativo de la PCR. E, día de

desarrollo embrionario; P, día de vida postnatal.


85

Se analizó el efecto de Ex4 sobre la unión de Nkx2.1 a TBE (TTF-1-binding element) mediante

EMSA (Figura 24). La unión Nkx2.1 con su correspondiente elemento respuesta, se visualiza a través de

una señal radiactiva. La señal se apreció de manera más intensa en los pulmones de fetos de 18 y 20 días

tratados con Ex4 que la detectada en su correspondiente grupo control. Dicho efecto no se observó en el

primer día de vida postnatal (P1, etapa alveolar). Según esto, Ex4 indujo la unión de Nkx2.1 a su

elemento respuesta en las etapas fetales pero no en la etapa postnatal.

4.3.1.2. Acción de Liraglutide en la síntesis de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B.

Dada la alta homología que presenta Liraglutide con GLP-1, nos propusimos estudiar sus efectos

sobre la síntesis de las proteínas surfactantes en diferentes etapas de desarrollo (E18, E20 y P1) siguiendo

el mismo procedimiento utilizado para Ex4.

En las figuras 25 y 26 se muestran los efectos observados de la administración de Liraglutide

durante la gestación sobre la expresión génica y proteica de SP-A y SP-B en los pulmones de las etapas

de desarrollo estudiadas, así como los niveles proteicos en el líquido amniótico.

Liraglutide incrementó de forma significativa la expresión génica de SP-A y SP-B en los

pulmones de E20, alcanzando niveles de mRNA próximos a los presentes en los pulmones de P1 del

grupo control (Figura 25A y 26A).

A diferencia de lo ocurrido tras la administración de Ex4, el tratamiento con Liraglutide no

produjo efectos significativos sobre los niveles de mRNA de SP-A ni SP-B en los pulmones de P1.

El análisis del patrón de expresión proteico de SP-A (Figura 25B) mostró la presencia de la

isoforma de 32kDa y la proteína madura de 36kDa, mientras que el precursor no fue detectado.

Contrariamente a lo observado en el tratamiento con Ex4, Liraglutide no produjo efectos significativos

sobre los niveles de proteínas de SP-A en los pulmones de ninguna de las etapas de desarrollo estudiadas.

complejo Nkx 2.1/DNA

Olig

ofr

íoE

18

_V

EH

E

18

_E

X4

E

20

_V

EH

E2

0_

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4P

1_

VE

HP

1_

EX

4O

ligo

rel.

(x10

0)O

ligo

. no

rel.

(X10

0)TN

T

Sonda libre+ + + + + + + + + +- - - - - - - + - -- - - - - - - - + -

Sonda spb-f1*Sonda relacionadaSonda no relacionada

Figura_24: Unión de Nkx2.1/TBE en pulmones de E18,

E20 y P1 tras el tratamiento con Ex4 durante la

gestación. Para el control del ensayo se emplearon oligos

relacionados y no relacionados en exceso (x100) que

fueron incubados con los extractos nucleares previamente

a la adición de la sonda específica marcada

radiactivamente. La ausencia de señal radiactiva en el

control del oligo relacionado y la presencia de señal en el

control del oligo no relacionado confirmó la especificidad

de la unión entre Nkx2.1 y su elemento respuesta. La

incubación de Nkx2.1, sintetizado por un sistema de lisado

de reticulocitos (TNT), con la sonda marcada confirmó la

localización de la señal radiactiva.


86

En cuanto a los niveles proteicos de SP-B (Figura 26B) no se apreciaron cambios significativos

en ninguno de los periodos estudiados tras el tratamiento con Liraglutide, mientras que Dexametasona

incrementó los niveles de proteína de SP-B en los pulmones de P1. Tampoco se apreciaron cambios de

concentración de SP-A ni SP-B en el líquido amniótico de E18 o E20 tratados con Liraglutide con

respecto a su correspondiente grupo vehículo.

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-A/ ββ ββ-A

CT

INA

0

50

100

150

200

250

300

26kDa 32kDa 36kDa

nd nd nd nd nd

##

E18 E20 P1 E18 E20 P1 E18 E20 P1

%D

O m

RN

A S

P-A

/18

S

0

50

100

150

200

250

300

E18 E20 P1

*

*

####

SP-A

18S

342pb

178pbN

E18 E20 P1

500pb

100pb

500pb

100pb

E18 E20 P1

SP-A

β-ACTINA

36kDa32kDa43kDa

E18 E20

ng/m

L S

P-A

(Lí

quid

o A

mni

ótic

o)

0

20

40

60

80

100

120

140

VEH LIR DEX

MA B

CFigura_25: Caracterización de SP-A en tejido pulmonar y

líquido amniótico a lo largo del desarrollo y tras la

administración de Liraglutide durante la gestación. (A)

Niveles de mRNA y niveles proteicos (B). (C) Concentración de

SP-A en líquido amniótico. Los valores fueron representados

como la media ± error estándar de 5 determinaciones

independientes. * P<0.05 LIR o bien DEX vs su correspondiente

VEH. ## P<0.01 E18 o E20 vs P1. (Test de Kruskal-Wallis,

seguido por múltiples comparaciones). M: marcador de peso

molecular; nd: no detectable; N: control negativo de la PCR. E,

día de desarrollo embrionario; P, día de vida postnatal.


87

GLP-1, y especialmente Ex4, son potentes activadores del eje corticoadrenal. Los efectos

descritos de las incretinas sobre las proteínas surfactantes podrían deberse, al menos parcialmente, a un

incremento en los niveles de glucocorticoides circulantes, ya que éstos presentan una intensa acción

estimuladora sobre la síntesis y secreción de los componentes del surfactante. Además, los estrógenos

también estimulan la maduración de las células epiteliales, y por tanto, aceleran la producción del

surfactante pulmonar.

Para monitorizar los posibles cambios originados por el tratamiento con Ex4 sobre los niveles de

corticosterona y 17β-estradiol, que podría afectar al desarrollo de los fetos, se determinaron los niveles

circulantes de dichas hormonas en los sueros de hembras gestantes en diferentes días de gestación.

E18 E20 P1

% n

ivel

es S

P-B

/ ββ ββ-A

CT

INA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

*

% D

O m

RN

A S

P-B

/18S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

*

#

**

E18 E20 P1

nd

N

E18 E20 P1

SP-B

18S

500pb

100pb

500pb

100pb

245pb

178pb β-ACTINA

SP-B

6kDa

43kDa

E18 E20 P1

VEH LIR DEX

E18 E20

pg/m

L S

P-B

(Lí

quid

o am

niót

ico)

0

10

20

30

40

50

60

70

MA B

CFigura_26: Efectos de Liraglutide sobre los niveles de SP-B

en pulmones de E18, E20, P1 y líquido amniótico. Niveles

relativos de mRNA (A) de SP-B y proteicos (B) en pulmones.

(C) Concentración de SP-B en líquido amniótico de E18 y E20.

Los valores fueron representados como media ± error estándar de

5 determinaciones independientes. *P<0.05, **P<0.01 indica las

diferencias entre los grupos tratados con LIR o DEX vs su

correspondiente VEH. #P<0.05, E18 o E20 vs P1 (Test de

Kruskal-Wallis, seguido por múltiples comparaciones). M,

marcador de peso molecular; N, control negativo de la PCR; nd,

no detectable. E, día de desarrollo embrionario; P, día de vida

postnatal.


88

Además, se midió la concentración de corticosterona en los sueros de recién nacidos tanto en el grupo

control como en los grupos tratados con Ex4 y Liraglutide.

La figura 27A muestra los niveles de corticosterona en el primer día de vida tras la administración

de Ex4 y Liraglutide. No se observaron cambios significativos en ninguno de los grupos tratados con

agonistas de GLP-1R con respecto al grupo control.

La administración de Ex4 no produjo efectos significativos sobre la concentración de

corticosterona ni 17β-Estradiol en los días de gestación analizados (Figura 27B).

Por tanto, los efectos de Ex4 o Liraglutide sobre la expresión de SP-A y SP-B no son atribuibles a

cambios ocasionados en los niveles circulantes de corticosterona o 17β-estradiol maternos.

4.3.2. Efectos de los análogos de GLP-1 sobre la función pulmonar en un modelo de hipoplasia

pulmonar inducida por nitrofen.

Los resultados obtenidos del análisis de los efectos de Ex4 y Liraglutide sobre el surfactante

pulmonar sugieren que ambos péptidos podrían modular la síntesis de las proteínas que forman parte del

sistema surfactante. Las deficiencias en la composición del surfactante debidas a un desarrollo pulmonar

incompleto dan lugar a anomalías respiratorias. Una vez demostrado el papel estimulador de los análogos

de GLP-1 sobre la síntesis de las proteínas surfactantes, nos propusimos estudiar las posibles acciones

reparadoras de ambos péptidos en la función pulmonar en un modelo de desarrollo pulmonar incompleto.

Se analizó el grado de desarrollo pulmonar en fetos de 21 días así como la tasa de supervivencia neonatal

en un modelo experimental de hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen.

B.

GD16 GD18 GD20 GD22

Cor

ticos

tero

na (n

g/m

L)

0

200

400

600

800 VEH EX4

GD16 GD18 GD20 GD22

17ββ ββ-

Est

radi

ol (

pg/m

L)

0

20

40

60

80

100

120

nd

VEH EX4

A.

C.

VEH EX4 LIR

Cor

ticos

tero

na (

ng/m

L)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180 Figura_27: Niveles de corticosterona y

17ß-estradiol en suero de neonatos y ratas

gestantes. Se cuantificaron los niveles de

corticosterona en suero de animales de 1 día

de vida (P1) tras el tratamiento con Ex4 o

Liraglutide (A), así como sus

correspondientres grupos controles, VEH.

Los niveles de 17β-estradiol en suero de

animales de 1 día de vida postnatal no

fueron detectados.

Se determinaron los niveles de

corticosterona (B) y 17ß-estradiol (C) en los

días 16, 18 y 20 de gestación así como el día

de parto (GD22). Los valores se

representaron como la media ± error

estándar de 8 determinaciones diferentes.

Test de Kruskal-Wallis, seguido por

múltiples comparaciones. nd, no detectable.


89

4.3.2.1. Caracterización de los efectos de los análogos de GLP-1 sobre la maduración pulmonar en

fetos de 21 días con hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen.

Con el fin de caracterizar los posibles efectos reparadores de Ex4 y Liraglutide sobre el

desarrollo pulmonar en animales con maduración pulmonar incompleta, se generó un modelo

experimental de hipoplasia pulmonar inducida tal y como se detalla en el apartado de material y métodos

(3.3.3.2.1).

El modelo generado se utilizó para evaluar los efectos de los análogos de GLP-1 sobre el grado

de maduración del pulmón fetal (grupo NTF: NTF+EX4 o NTF+LIR). Los resultados obtenidos en este

modelo se compararon con aquellos recabados en pulmones de fetos con desarrollo pulmonar completo

(grupo Control, C: C+EX4 o C+LIR). Paralelamente, otros dos grupos (uno con maduración pulmonar

completa y otro con maduración pulmonar incompleta) fueron tratados con Dexametasona (C+DEX o

NTF+DEX). La comparación de los resultados obtenidos de los tratamientos con Ex4 y Liraglutide con

los generados del estudio del grupo NTF+DEX permitió evaluar y contrastar los efectos de los péptidos

estudiados con las acciones del glucocorticoide sintético empleado en clínica para inducir la maduración

pulmonar.

� Monitorización diaria del peso corporal de ratas gestantes.

El peso corporal de las ratas gestantes se monmitorizó diariamente desde el inicio (GD14) hasta

el fin del tratamiento (GD20) (Figura 28A). Además, se calculó el incremento de peso desde GD14 hasta

GD20 de cada uno de los grupos experimentales (Figura 28B).

Los animales de los distintos grupos presentaron un peso corporal similar (277.26g ± 1.46) el día

en el que comenzó el tratamiento. El análisis del perfil del peso corporal (Figura 28A) reveló que la

administración de Liraglutide (C+LIR o NTF+LIR) durante la gestación no produce cambios

significativos en el peso de las ratas gestantes a lo largo del periodo estudiado con respecto al grupo

control (C+VEH). Además, ambos grupos, C+LIR y NTF+LIR, mostraron un incremento de peso desde

GD14 hasta GD20 similar al observado en el grupo control tratado con solución salina (C+VEH) (Figura

28B).

Por el contrario, la administración de Ex4 desde el día 14 de gestación, redujo de forma

significativa el peso corporal desde GD18, en el caso del grupo que recibió NTF, y únicamente el último

día del estudio (GD20) en el caso del grupo que recibió 1mL de aceite de oliva (C) (Figura 28A).

Además, ambos grupos de ratas gestantes, C y NTF, tratadas con Ex4 mostraron un menor incremento de

peso desde GD14 hasta GD20 con respecto al grupo C+VEH (Figura 28B).

Por otra parte, el tratamiento con Dexametasona disminuyó el peso corporal en GD20 en los

animales pertenecientes al grupo C+DEX, pero no se observaron variaciones en el perfil del peso

corporal de los animales que recibieron NTF (Figura 28A). En ambos grupos, C o NTF, el incremento de

peso desde GD14 hasta GD20 fue significativamente menor tras el tratamiento con Dexametasona, que el

observado en el grupo control (C+VEH), (Figura 28B).


90

� Efectos de los tratamientos administrados durante la gestación en el número de fetos por

camada.

La tabla 7 muestra el número medio de fetos por camada obtenido en cada grupo experimental.

Ninguno de los tratamientos modificó significativamente el número de fetos por camada con respecto al

grupo C+VEH.

Día de Gestación (GD)

GD14GD15

GD16

GD17GD18

GD19GD20

Pes

o C

orpo

ral (

g)

240

260

280

300

320

340

360C+VEH

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEX

Día de gestación (GD)

GD14

GD15

GD16

GD17

GD18

GD19GD20

Pes

o C

orpo

ral (

g)

240

260

280

300

320

340

360 C+VEH

C+EX4

C+LIR

C+DEX

A.

**

*

**

*

**

C+VEH

C+EX4

C+LIR

C+DEX

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LI R

NTF+DEX

∆∆ ∆∆ P

.C (

g) G

D14

-GD

20

0

20

40

60

80

100

** *****

***

B.

Nº de fetos (♂♀)

Grupo Control NTF

VEH 13.33 (± 1.20) 13.75 (± 0.75)

EX4 13.5 (± 1.50) 12 (± 1)

LIR 15.66 (± 0.88) 14 (± 2)

DEX 13.5 (± 0.50) 14 (± 1)

Figura_28: Peso corporal de ratas gestantes a lo largo

del protocolo experimental. Se registró el peso corporal

desde GD14 hasta GD20 de cada grupo (A). Se calculó el

incremento de peso desde el inicio hasta el fin del

tratamiento (B). El peso corporal (P.C) de ratas gestantes

tratadas con EX4, LIR o bien DEX se representó como la

media ± error estándar. *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001

con respecto a los valores del grupo control (C+VEH).

Test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples

comparaciones.

Tabla_7: Número medio de fetos por camada

obtenidos en cada grupo experimental. Los

valores fueron representados como la media ±

error estándar. (Test de Kruskal-Wallis, seguido

por múltiples comparaciones, 5 hembras

gestantes por grupo).


91

� Evaluación del desarrollo pulmonar en fetos macho y hembra de 21 días.

Se registró el peso corporal así como el peso de los pulmones de fetos de 21 días tanto de machos

como de hembras (Figura 29A y Figura 29B). Ambos parámetros permitieron el cálculo de la ratio entre

el peso del pulmón (P.P) y el peso corporal (P.C) (Figura 29C) que se utilizó como índice para evaluar el

grado de desarrollo pulmonar. Además, a partir de la ratio se determinó el porcentaje de hipoplasia

pulmonar de cada grupo experimental (Figura 29D) con respecto al grupo control (C+VEH).

La administración oral de NTF a ratas hembra en su día 9 de gestación redujo 2 veces el peso de

los pulmones de fetos macho y 1.75 veces el peso de pulmones de fetos hembra (Figura 29B). En menor

medida, también se observó un disminución del peso corporal de los fetos que recibieron NTF con

respecto al grupo C+VEH (1.4 veces el peso corporal de fetos macho y 1.34 veces el peso corporal de

fetos hembra; Figura 29A).

La ratio P.P./P.C. del grupo NTF+VEH se redujo con respecto al valor de la ratio de fetos de

C+VEH. Dicha reducción fue de 1.47 veces en el caso de fetos macho y 1.3 veces en el caso de fetos

hembra (Figura 29C).

En relación al grado de hipoplasia pulmonar de fetos procedentes del grupo NTF+VEH (Figura

29D), se observó una reducción de la ratio del 34.87% ± 5.16 en los fetos macho y del 23.42% ± 3.86 en

el caso de los fetos hembra. Dichos resultados confirmaron la presencia de hipoplasia pulmonar en el

modelo experimental inducido por NTF.

La administración de Liraglutide a ratas gestantes del grupo control (C+LIR) no produjo cambios

significativos en los valores de la ratio con respecto a la ratio de fetos del grupo C+VEH (Figura 29C).

Por otra parte, el tratamiento con Liraglutide desde GD14 recuperó la ratio P.P/P.C de los fetos

que recibieron NTF en GD9, alcanzando los valores del grupo C+VEH (Figura 29C). La recuperación de

la ratio fue debida a un aumento significativo del tamaño pulmonar (1.42 veces en el caso de fetos macho

y 1.23 veces en fetos hembra) con respecto al grupo NTF+VEH (Figura 29B). El tratamiento con

Liraglutide redujo el grado de hipoplasia pulmonar inducido por NTF un 23.7% en fetos macho y un

16.4% en el caso de hembras (Figura 29D).

Contrariamente, Ex4 no produjo cambios en el tamaño del pulmón de fetos tratados con NTF

(Figura 29B) por lo que no revirtió la hipoplasia pulmonar inducida por NTF y presentaron una ratio

P.P/P.C (Figura 29C) y un porcentaje de hipoplasia (Figura 29D) similar a la del grupo NTF+VEH.

El tratamiento con Dexametasona durante la gestación recuperó la ratio P.P/P.C del grupo

NTF+DEX, alcanzando los valores del grupo C+VEH en el caso de fetos hembra (Figura 29C). La

administración de Dexametasona produjo un incremento del tamaño de los pulmones de 1.3 veces (Figura

29B) sin modificar el peso corporal (Figura 29A). Sin embargo, dicho efecto reparador no fue observado

en el caso de fetos macho, puesto que el peso pulmonar (Figura 29B) y el peso corporal (Figura 29A)

fueron similares a los valores del grupo NTF+VEH.


92

� Evaluación de los efectos de NTF en el tamaño del corazón.

Puesto que el modelo empleado para inducir la hipoplasia pulmonar fue un modelo teratogénico,

el desarrollo de otros órganos puede verse afectado por modificación de vías de señalización implicadas

en la organogénesis.

La toxicidad del NTF depende de la dosis y del momento de la gestación en el que se administra.

Los órganos más susceptibles a su acción son el pulmón, donde produce hipoplasia, y el corazón, en el

% H

ipop

lasi

a P

ulm

onar

-40

-30

-20

-10

0NTF+V

EH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEX

% H

ipop

lasi

a P

ulm

onar

-40

-30

-20

-10

0NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEX

Control NTF

Pes

o P

ulm

ón, P

.P (

mg)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Control NTF

Pes

o co

rpor

al, P

.C (

g)

0

1

2

3

4

5

6

Control NTF

Pes

o co

rpor

al, P

.C (

g)

0

1

2

3

4

5

6

Control NTF

P.P

/P.C

(m

g/kg

)

0

10

20

30

40

VEH EX4 DEX LIR

Control NTF

Pes

o P

ulm

ón, P

.P (

mg

)

0

50

100

150

200

Col 13 Col 15 Col 17 Col 19

Control NTF

P.P

/PC

(m

g/g)

0

10

20

30

40

******

**

***

#

***

***

*** ***

*** *** ***

#

∆ 2.6%

∆ 23.7%

∆ 3.42%

##

***

***

*** ***##

*** ***

*** ***# #

****

# #

##

#

∆ 0.7%

∆ 16.4%

∆15.2%

**

*

*

A.

B.

C.

♂

♂

♂

♂♀

♀

♀

♀

D.

Figura_29: Efectos de la

administración de Ex4,

Liraglutide y Dexametasona en

la maduración pulmonar en un

modelo de hipoplasia pulmonar

inducido por nitrofen. Efectos

sobre el peso corporal, P.C. (A),

el peso del pulmón, P.P. (B) y

ratio P.P/P.C. (C) de fetos macho

y hembra de 21 días con

desarrollo pulmonar completo (C)

e incompleto (NTF). (D) Se

calculó el grado de hipoplasia

pulmonar representado como

porcentaje de reducción de la

ratio P.P./P.C. con respecto al

grupo control (C+VEH). Los

valores se representaron como la

media ± error estándar (n=14

fetos por grupo). **P<0.01,

***P<0.001 vs C+VEH; #P<0.05, ##P<0.01 vs NTF+VEH. (Test de

Kruskal-Wallis, seguido por

múltiples comparaciones).


93

Figura_30: Análisis del

desarrollo del corazón de fetos de

21 días. (A) Peso de los corazones

de los grupos que recibieron NTF

en GD9 tratados con vehículo, Ex4,

Liraglutide o bien Dex comparado

con el grupo C+VEH. (B) Ratio

entre el peso de los corazones y el

peso corporal. Los valores fueron

representados como la media ±

error estándar (n=14 fetos por

grupo). *P<0.05, **P<0.01 vs

C+VEH; #P<0.05, ##P<0.01 vs

NTF+VEH. (Test de Krukal-Wallis

seguido por múltiples

comparaciones)

que genera malformaciones en el arco aórtico e hipoplasia del ventrículo izquierdo (Gonzalez-Reyes y

cols., 2003).

Se determinó si NTF produjo hipoplasia del corazón para determinar el grado de especificidad del

modelo sobre la organogénesis del pulmón y no sobre el corazón.

Para determinar si NTF retarda el desarrollo del corazón, se pesaron los corazones de E21 macho

y hembra de cada grupo experimental (Figura 30A) y se determinó la ratio entre el peso del corazón y el

peso corporal (Figura 30B).

La administración oral de 100 mg de NTF en GD9 redujo el tamaño del corazón tanto en fetos

macho como en fetos hembra (Figura 30A). Ninguno de los tratamientos revirtió dicho efecto. A pesar de

la reducción del tamaño del corazón, la ratio permaneció invariable con respecto al grupo C+VEH (Figura

30B), salvo en el caso del grupo NTF+DEX que presentó una ratio significativamente menor.

En este modelo, la reducción del tamaño del corazón podría ser atribuible a la disminución del

tamaño corporal (Figura 29A) producida por nitrofen y no a un efecto directo sobre el corazón.

� Análisis de la estructura alveolar tras la inducción de hipoplasia pulmonar y evaluación de

los efectos de los análogos de GLP-1 sobre la morfología del tejido.

La administración de NTF a ratas gestantes interrumpe la maduración del pulmón retrasando el

proceso de ramificación de los conductos aéreos, por lo tanto, en este modelo experimental, los espacios

alveolares deberían mostrarse reducidos (Nogueira-Silva C y cols., 2011).

Tras verificar el desarrollo de hipoplasia pulmonar en el grupo NTF+VEH y caracterizar los

efectos de los análogos de GLP-1 sobre el grado de desarrollo de los pulmones, se evaluaron los cambios

C+VEH

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEX

Pes

o co

razó

n (m

g)

0

5

10

15

20

25

30

***

***

*****##

C+VEH

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEXR

atio

_Pes

o co

razó

n/P

.C (

mg/

g)

0

1

2

3

4

5

6

7

**

C+VEH

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEXR

atio

_Pes

o co

razó

n/P

.C (

mg/

g)

0

1

2

3

4

5

6

7

C+VEH

NTF+VEH

NTF+EX4

NTF+LIR

NTF+DEX

Pes

o co

razó

n (m

g)

0

5

10

15

20

25

30

**

***

*****#

*

A.

B.

♂ ♀


94

morfológicos del tejido. Para ello se realizó un análisis histológico de los pulmones mediante tinción con

Hematoxilina-Eosina para evaluar la estructura de los alveolos de fetos macho de 21 días con hipoplasia

pulmonar inducida así como su morfología tras la administración de los análogos de GLP-1.

Tal y como describen estudios previos, la administración de NTF retrasa el desarrollo del

pulmón. Este hecho se refleja en la reducción del tamaño y en un retardo en la formación de conductos

aéreos.

El grupo NTF+VEH mostró un menor grado de dilatación de los sacos terminales, y por tanto,

una reducción en la superficie de intercambio gaseoso con respecto al grupo C+VEH (Figura 31, 4X).

Asimismo, la administración de NTF produjo una alteración en la organización del epitelio que forma los

sáculos alveolares (40X). Ninguno de los tratamientos (Ex4, Liraglutide o Dexametasona) incrementó la

superficie de intercambio gaseoso, puesto que la estructura de los conductos aéreos parece ser similar al

grupo NTF+VEH (Figura 31, 4X). Sin embargo, Liraglutide y Ex4 restauraron la organización del

epitelio alveolar (Figura 31, 40X), hecho que no se observó tras la administración de Dexametasona.


95

� Niveles de expresión de las proteínas surfactantes en pulmón.

Además de hipoplasia pulmonar, la administración de NTF provoca deficiencias en la

composición del surfactante (Losada y cols. 2000). Se analizaron las principales proteínas del surfactante

pulmonar, SP-A y SP-B (Figura 32), tanto en los pulmones de fetos macho control (C) como en fetos

macho con hipoplasia pulmonar inducida (NTF).

La administración de NTF causó una reducción de los niveles de mRNA de SP-A, dicho patrón

de expresión también se observó en los niveles proteicos (Figura 32A). En lo que a niveles proteicos se

4X 40XC

+V

EH

NT

F+

LIR

NT

F+

EX

4N

TF

+V

EH

NT

F+

DE

X

Figura_31: Análisis histológico

(Tinción Hematoxilina-Eosina) de

la estructura alveolar en E21. Los

pulmones con hipoplasia pulmonar

inducida (que recibieron NTF en

GD9) fueron comparados con

pulmones de fetos con desarrollo

completo (C+VEH). Se muestran los

cortes histológicos de tejido

pulmonar tras la administración de

Ex4, Liraglutide o Dexametasona.


96

refiere, se produjo una disminución, tanto de la proteína madura (36kDa) como de la forma intermediaria

de 32kDa. El precursor de 26kDa no fue detectado en el grupo NTF+VEH.

La administración de Ex4, Liraglutide o bien Dexametasona, provocó una restauración de los

niveles de mRNA de SP-A en los grupos que recibieron NTF. De igual forma, tanto Liraglutide como

Dexametasona, recuperaron el patrón de expresión proteica alcanzando los valores normales de C+VEH.

Sin embargo, Ex4 no incrementó los niveles de proteína SP-A tal y como muestra el panel derecho de la

figura 32A.

Al igual que en el caso de SP-A, NTF también redujo los niveles de mRNA de SP-B (Figura 32B)

con respecto al grupo C+VEH. Los tratamientos con Ex4, Liraglutide o Dexametasona provocaron un

incremento de los niveles de mRNA de SP-B hasta alcanzar los valores basales del grupo C+VEH.


97

Figura_32: Expresión de las proteínas del Surfactante Pulmonar (SP-A & SP-B) en pulmones de fetos de 21 días

con desarrollo completo (Control) e incompleto (NTF) tras el tratamiento con Ex4 (EX4), Liraglutide (LIR) o

bien Dexametasona (DEX). Se analizaron los niveles de mRNA y los niveles proteicos de SP-A (A) así como de SP-B

(B). Los valores semi-cuantitativos se expresaron como la media ± error estándar de 5 determinaciones independientes

(n=5/grupo). *P<0.05 vs C+VEH. Test de Kruskal-Wallis seguido de múltiples comparaciones.

500pb

100pb

500pb

100pb

M

VE

HE

X4

DE

XLI

R

VE

HE

X4

DE

XLI

R N

SP-A

18S

342pb

178pb

Control NTF

M

500pb

100pb

500pb

100pb

VE

HE

X4

DE

XLI

R

VE

HE

X4

DE

XLI

R N

SP-B

18S

245pb

178pb

Control NTF

Control NTF

% D

O m

RN

A S

P-A

/18S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Control NTF

% D

O m

RN

A S

P-B

/18S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

SP-A

β-ACTINA

Control NTF

VE

H

EX

4

LIR

DE

XV

EH

EX

4

LIR

DE

X

36kDa32kDa26kDa

43kDa

SP-B

β-ACTINA

Control NTF

VE

H

EX

4

LIR

DE

X

VE

H

EX

4

LIR

DE

X

6kDa

43kDa

*

*

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-A/ ββ ββ

-AC

TIN

A

0

100

200

300

C NTF C NTFC NTF

nd nd

26kDa 32kDa 36kDa

**

A.

B. DEXLIREX4VEH

**

Col 20 Col 22 Col 24 Col 26

Control NTF

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-B/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

100

200

300

400


98

� Niveles de expresión de GLP-1R en pulmón.

Dado que la expresión de las proteínas surfactantes se encuentra reducida en el modelo de

hipoplasia pulmonar inducida por NTF y la administración de los análogos de GLP-1 recuperan su patrón

de expresión, se analizaron los niveles de mRNA de GLP-1R en los pulmones de fetos (E21) de cada

grupo experimental.

Los fetos con desarrollo pulmonar incompleto (NTF+VEH) presentaron niveles menores de

expresión de GLP-1R en el tejido pulmonar (Figura 33) con respecto a fetos con pulmones maduros

(C+VEH). La reducción de la expresión de GLP-1R en fetos con hipoplasia, fue revertida tras el

tratamiento con Liraglutide (NTF+LIR) o con Dexametasona (NTF+DEX) alcanzando los valores

presentes en el grupo control (C+VEH). El efecto contrario se obtuvo con la administración de Ex4.

Tanto Liraglutide como Dexametasona provocaron un aumento de los niveles de mRNA de GLP-1R (~2

veces) en fetos del grupo control (C+LIR o C+DEX) con respecto a los niveles basales del grupo

C+VEH.

Control NTF

% D

O m

RN

A G

LP-1

R/1

8S

0

50

100

150

200

250

300

DEX

LIR

EX4

VEH

*

*

* *

#

#

MGLP-1R

18S

500pb

100pb

500pb

100pb

VE

HE

X4

DE

XLI

R

VE

HE

X4

DE

XLI

R N

190pb

178pb

Control NTF

Figura_33: Expresión de GLP-1R en

pulmones de fetos con desarrollo completo

(C) y fetos con desarrollo incompleto (NTF)

tratados con Ex4, Liraglutide,

Dexametasona o Vehículo. Los valores semi-

cuantitativos se representaron como la media ±

error estándar de cinco determinaciones

independientes (n=5/grupo). *P<0.05 vs

C+VEH. #P< 0.05 vs NTF+VEH. Test de

Krukal-Wallis seguido por múltiples

comparaciones.


99

4.3.2.2. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la supervivencia neonatal en un modelo

de hipoplasia pulmonar inducida por nitrofen.

La completa maduración pulmonar durante el desarrollo fetal permite una apropiada función

respiratoria tras el nacimiento, ya que los pulmones tienen una extensión alveolar suficiente que permite

el intercambio gaseoso. Además, estos neonatos muestran una correcta síntesis y secreción del

surfactante pulmonar que evita el colapso alveolar al final de la espiración.

Como se ha descrito en los resultados previos, el modelo de inmadurez pulmonar experimental

inducido por la administración de NTF durante la gestación dio lugar a fetos con pulmones hipoplásicos

y deficiencias en la síntesis de las proteínas surfactantes (SP-A & SP-B). Puesto que la superficie de

intercambio gaseoso no es apropiada para permitir la respiración y las deficiencias del surfactante

provocarían colapso de los sacos alveolares, el modelo experimental desarrollado debería presentar una

tasa de supervivencia neonatal muy baja con respecto a fetos con desarrollo pulmonar completo. Por ello,

nos propusimos desarrollar un protocolo experimental en el que se indujo inmadurez pulmonar en fetos

en desarrollo (Material y Métodos, 3.3.3.2.2).

Tanto Ex4 como Liraglutide recuperaron la expresión de SP-A y SP-B en los pulmones de fetos

tratados con NTF y restablecieron la estructura del epitelio alveolar. Sin embargo, el efecto reparador de

Liraglutide parece ser mayor al de Ex4 ya que, además, mejora el crecimiento del tejido reduciendo el

grado de hipoplasia, hecho no reproducido por Ex4. Por ello, se testó la capacidad de Liraglutide de

mejorar la tasa de supervivencia neonatal en un modelo de hipoplasia pulmonar inducida durante el

desarrollo. Asimismo, se analizaron los efectos de la Dexametasona en la supervivencia neonatal tras

haber inducido hipoplasia en los pulmones durante el desarrollo.

De esta manera, se comprobó si los efectos de Liraglutide y Dexametasona sobre los pulmones

inmaduros son suficientes como para permitir una función respiratoria apropiada.

En el grupo NTF+VEH menos del 25% de las crías nacieron vivas y sobrevivieron las primeras

24 horas (Figura 34). La tasa de supervivencia se redujo a la mitad en el segundo día del estudio (P2) y

todas las crías murieron transcurridas 72 horas.

La administración de Dexametasona a ratas gestantes no modificó la tasa de supervivencia

neonatal siendo ésta similar a la del grupo NTF+VEH. Por el contrario, la administración de Liraglutide

produjo una mejora importante de la tasa de superviviencia neonatal con respecto a NTF+VEH. Así, el

48% de las crías tratadas con Liraglutide durante su desarrollo sobrevivieron las primeras 24 horas, el

11.5% sobrevivió hasta P2, el 4% hasta P3 y P4, e incluso permaneció una cría viva hasta el día 8 de

desarrollo postnatal (P8).


100

4.3.3. Influencia de la ingesta durante la gestación sobre el desarrollo del pulmón.

La restricción calórica durante la gestación produce un crecimiento intrauterino retardado que

incrementa el riesgo de compromiso respiratorio durante el desarrollo postnatal (Rehan VK y cols.,

2012). Por ello, y una vez definidas las acciones de Liraglutide sobre la maduración del pulmón en un

modelo teratogénico de hipoplasia pulmonar, nos planteamos estudiar sus efectos en un modelo de

crecimiento fetal retardado mediante modificaciones en el patrón de ingesta durante la gestación.

La administración central o periférica de Liraglutide regula el patrón de ingesta (Kanoski SE y

cols., 2011). Puesto que el tratamiento prenatal con Liraglutide puede modificar el desarrollo fetal como

consecuencia de variaciones en el consumo de alimentos a lo largo de la gestación, nos propusimos

determinar los efectos de Liraglutide sobre la ingesta al ser administrada de forma periférica desde el día

14 de gestación, así como su influencia en el desarrollo fetal y pulmonar. Para ello se desarrolló un grupo

experimental pair-fed que se alimentó con la misma cantidad de comida que el grupo tratado con

Liraglutide (con libre acceso al alimento) con el fin de diferenciar entre la influencia de las alteraciones

en la ingesta de alimentos y el efecto propio del Liraglutide sobre el desarrollo del pulmón.

Una vez definido el patrón de ingesta a lo largo de la gestación durante la administración

crónica de Liraglutide, se procedió a desarrollar un modelo animal de subnutrición durante la gestación,

reduciendo un 30% el consumo de alimentos con respecto a ratas gestantes alimentadas ad-libitum.

En nuestro modelo experimental de subnutrición, se caracterizó el grado de desarrollo

pulmonar fetal en el día previo al nacimiento (E21).

Considerando que la subnutrición produce cambios hormonales, tanto en el feto como en la

madre, que pueden repercutir en el desarrollo fetal y maduración pulmonar (Hales CN, 1992), se analizó

DÍA DE VIDA POSTNATAL (P)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7

% S

UP

ER

VIV

EN

CIA

0

20

40

60

100

C+VEHNTF+VEH NTF+LIR NTF+DEX

Figura_34: Porcentaje de Supervivencia

Neonatal en un modelo de inmadurez

pulmonar, efectos del tratamiento prenatal

con Liraglutide o bien Dexametasona.

C+VEH, n=41; NTF+VEH, n=58; NTF+LIR,

n=44; NTF+DEX, n=36.


101

la respuesta secretora de glucocorticoides, factor hormonal crítico en la maduración pulmonar, en los

pulmones de fetos sometidos a las distintas condiciones experimentales y tratamientos.

4.3.3.1. Caracterización de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta durante la gestación.

• Parámetros basales: Ingesta y peso corporal.

� Registro diario de la ingesta entre los días 14 y 21 de gestación.

La administración subcutánea de Liraglutide, dos veces al día desde GD14 (LIR_GD14), reduce

la ingesta de ratas gestantes desde el inicio del tratamiento hasta GD17 (Figura 35A), comparado con el

grupo control (VEH). Este efecto no se observó a partir de GD18.

A pesar de que el efecto reductor de la ingesta de alimentos no se mantuvo a lo largo de todo el

tratamiento, si se considera la ingesta acumulada desde GD14 hasta GD20, ésta fue estadísticamente

inferior con respecto al grupo no tratado (VEH). Los animales pertenecientes al grupo pair-fed comieron

la misma cantidad de comida que el grupo LIR_GD14, tal y como se aprecia en la figura 35A.

Considerando que el efecto anorexigénico de Liraglutide se pierde en GD18, cuando es

administrado desde GD14, nos plateamos incluir un grupo experimental tratado con Liraglutide desde

GD18 y analizar sus efectos sobre la ingesta de alimentos. Este nuevo grupo sirvió para determinar si este

efecto se debe a una desensibilización de la respuesta debido a la exposición prolongada de Liraglutide, o

bien, a la ausencia de efecto durante ese periodo de gestación de forma específica (LIR_GD18) (Figura

35B). No se observaron variaciones en el patrón de ingesta cuando el tratamiento se inicia en GD18 con

respecto al grupo control, por lo que no fue necesario incluir un grupo pair-fed para este grupo.


102

Figura_35: Análisis de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta durante la gestación. (A) Perfil de ingesta e

ingesta acumulada desde el día 14 de gestación (GD14) hasta el día 20 (GD20). La ingesta fue registrada a lo largo

del periodo de administración del tratamiento. (B) Perfil de ingesta e ingesta acumulada desde el día 18 de

gestación (GD18) hasta el día 20 (GD20). Los valores fueron representados como la media ± error estándar (n=4 por

grupo). *P<0.05, **P<0.01 vs VEH. Las diferencias significativas entre más de dos grupo independientes se

determinaron mediante el test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones mientras que se aplicó Mann-

Whitney para comparaciones entre dos grupos independientes. VEH, grupo control alimentado ad-libitum; LIR_GD14,

grupo tratado con Liraglutide desde GD14 alimentado ad-libitum; Pair-fed (LIR_GD14), grupo que consumió la

misma cantidad de alimentos que LIR_GD14 al que se le administró vehículo; LIR_GD18, grupo tratado con

Liraglutide desde GD18 alimentado ad-libitum.

GD14GD15

GD16

GD17GD18

GD19

GD20

Inge

sta

(g)/

100g

de

P.C

0

2

4

6

8

10

Día de Gestación

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

Pair-Fed (LIR_GD14)

LIR_GD18 Ad-libitum

Día de Gestación

GD18

GD19

GD20

Inge

sta

(g)/

100

g P

.C

0

2

4

6

8

10

A.

B.

**

* ***

*

**

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

Inge

sta

acum

ulad

a d

esde

GD

14-G

D20

(g/

100g

P.C

)

0

10

20

30

40

50

Ad-lib

itum

Ad-lib

itum

** **

VEH

LIR_GD18

Inge

sta

acum

ulad

a d

esde

GD

18-G

D20

(g/

100g

P.C

)

0

10

20

30

40

50


103

� Registro diario del peso corporal de ratas gestantes.

Se monitorizó el peso corporal diario de ratas gestantes alimentadas ad-libitum tratadas con

Liraglutide (LIR_GD14 y LIR_GD18) y tratadas con el correspondiente vehículo (VEH), así como el

grupo pair-fed de LIR_GD14 (Figura 36). A pesar de la reducción de ingesta producida en los primeros

cuatro días del tratamiento, cuando se inicia en GD14, esta reducción no supuso un cambio significativo

en el peso corporal (Figura 36A) ni del incremento de peso a lo largo del periodo estudiado (Figura 36B).

De igual forma, no se observaron cambios, ni en el peso corporal (Figura 36A) ni en el incremento de

peso (Figura 36B), cuando Liraglutide es administrado desde GD18.

4.3.3.2 Caracterización del modelo de subnutrición.

� Perfil del peso corporal e ingesta.

El modelo de subnutrición se desarrolló reduciendo la ingesta un 30% con respecto al consumo

normal de alimentos desde GD14 hasta GD21. Se caracterizaron los efectos de la subnutrición sobre el

desarrollo pulmonar de fetos, así como las acciones de la administración de Liraglutide desde GD18, ya

que durante este periodo de la gestación el patrón de ingesta no se ve afectado por el tratamiento.

La ingesta diaria y la acumulada de los animales sometidos a restricción calórica (RC+VEH y

RC+LIR_GD18) fue un 30% menor que la ingesta del grupo control alimentado ad-libitum (VEH)

Día de Gestación

GD14GD15

GD16

GD17

GD18

GD19GD20

GD21

P.C

(g)

240

260

280

300

320

340

360

380 VEH Ad-libitum LIR_GD14 Ad-libitumPair-Fed (LIR_GD14)

A.

B.

VEH

LIR_G

D18

∆∆ ∆∆P.C

(g)

GD

18-G

D21

0

20

40

60

80

100

Ad-libitum

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

∆∆ ∆∆P.C

(g)

GD

14-G

D21

0

20

40

60

80

100Ad-libitum

GD18GD19

GD20GD21

P.C

(g)

280

300

320

340

360

380VEH Ad-libitum LIR_GD18 Ad-libitum

Figura_36: Análisis del peso corporal de hembras

gestantes. (A) Perfil del peso corporal a lo largo de

la gestación de ratas alimentadas ad-libitum y

tratadas con Liraglutide desde GD14 (LIR_GD14),

con su correspondiente grupo control de la ingesta

tratado con vehículo [Pair-Fed (LIR_GD14)] y ratas

alimentadas ad-libitum tratadas con Liraglutide desde

GD18 (LIR_GD18) así como el grupo control

alimentado ad-libitum (VEH) (B) Incremento de

peso desde GD14 hasta GD21. Los datos fueron

representados como la media ± error estándar de 4

determinaciones independientes. Test de Kruskal-

Wallis seguido por múltiples comparaciones.


104

(Figura 37A). A pesar de la restricción calórica, no se observaron diferencias en el peso corporal ni en el

grupo tratado con Liraglutide (RC+LIR_GD18) ni en el que recibió su correspondiente vehículo

(RC+VEH) (Figura 37B).

Figura_37: Análisis de los efectos de Liraglutide sobre la ingesta en un modelo de subnutrición. (A) Perfil de

ingesta diaria e ingesta acumulada de ratas gestantes alimentadas ad-libitum y ratas sometidas a restricción calórica

diaria del 30% (RC) tratadas con Liraglutide desde GD18 (RC+LIR_GD18) o con vehículo (RC+VEH) desde GD14

hasta GD20. (B) Evolución diaria del peso corporal desde GD14 hasta GD21 y variación del peso corporal (∆PC)

durante el periodo en el que se desarrolló el estudio. Los valores fueron representados como la media ± error estándar

(n=4 animales por grupo) *P<0.05, **P<0.01 vs VEH. Test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones.

4.3.3.3. Efecto de las variaciones en el patrón de ingesta durante la gestación sobre el desarrollo

fetal y pulmonar.

La administración de Liraglutide desde GD14 produjo cambios variables de la ingesta a lo largo

del periodo estudiado. El tratamiento causó una reducción en la ingesta de alimentos de aproximadamente

el 30% en GD14 y GD15 (Figura 38) con respecto al grupo control, mientras que en GD16 la reducción

fue de un 20%. En GD17 la ingesta se redujo en menor grado (~13%) y el efecto se fue diluyendo

VEH

RC+VEH

RC+LIR_G

D18

∆∆ ∆∆P.C

(g)

GD

14-G

D21

0

20

40

60

80

Ad-lib

itum

A.

*

Día de Gestación

GD14GD15

GD16

GD17GD18

GD19

GD20

Inge

sta

(g)/

100g

P.C

0

2

4

6

8

10

Ad-libitumVEH RC+VEHRC+LIR_GD18

*** *

*** ** ** **** ****

Día de Gestación

GD14GD15

GD16GD17

GD18

GD19

GD20

GD21

P.C

(g)

240

260

280

300

320

340

360

380VEH

RC+VEH

RC+LIR

Ad-libitum

B.

VEH

RC+VEH

RC+LIR_G

D18

Inge

sta

acum

ulad

a d

esde

GD

14-G

D20

(g/1

00g

P.C

)

0

10

20

30

40

50

60

** **


105

sucesivamente entre GD18 y GD20. Durante este último período, el porcentaje de reducción de ingesta

alcanzó valores de entre el 5% y el 10%. Los grupos a los que se les limitó el acceso a la comida

presentaron, tal y como se pretendía, una reducción de la ingesta de un 30% a lo largo de todo el periodo

estudiado con respecto al VEH ad-libitum.

� Número de fetos por camada.

El recuento del número de fetos por camada tras la restricción calórica o el tratamiento con

Liraglutide no mostró modificaciones significativas (Tabla 8) respecto a los correspondientes grupos

control.

� Evaluación del grado de desarrollo pulmonar.

Se determinó la relación entre el peso de los pulmones de E21 (P.P), tanto en machos como en

hembras, con respecto a su peso corporal (P.C) (Figura 39A). Además, se calculó el porcentaje de

disminución de desarrollo pulmonar con respecto al grupo control (VEH) en animales que fueron

sometidos a restricción calórica diaria del 30% desde GD14 y en aquellos tratados con Liraglutide desde

GD18 (RC+LIR_GD18) o bien con vehículo (RC+VEH) (Figura 39B).

La administración de Liraglutide a ratas gestantes alimentadas ad-libitum (LIR_GD14) no causó

variaciones significativas en el valor de la ratio P.P/P.C de fetos macho o hembra (E21) con respecto a

fetos procedentes del grupo no tratado y con libre acceso al alimento (VEH) (Figura 39A).

GD14GD15

GD16GD17

GD18

GD19GD20

VEH

% R

educ

ción

de

Inge

sta

resp

ecto

a V

EH

-40

-30

-20

-10

0

LIR_GD14 Pair-Fed (LIR_GD14) R.C+VEH R.C+LIR_GD18

# # # # ##

# # ###

#

Ad-libitum

Ad-libitum

Grupo Nº de fetos

VEH 13.33 (±1.20)

LIR_GD14 15.00 (±1.53)

Pair-Fed (LIR_GD14) 12.00 (±0.58)

RC+VEH 12.25 (±1.80)

RC+LIR_GD18 14.33 (±0.33)

Figura_38: Porcentaje de variación de la ingesta

durante la gestación con respecto al grupo control

(VEH ad-libitum). LIR_GD14, ratas gestantes tratadas

con Liraglutide desde GD14 alimentadas ad-libitum y

el correspondiente grupo pair-fed [(Pair-

Fed(LIR_GD14)]. RC, ratas gestantes sometidas a

30% restricción calórica desde GD14 tratadas con

Liraglutide a partir de GD18 (RC+LIR_GD18) o con

vehículo (RC+VEH). #P<0.05, ##P<0.01 vs

LIR_GD14 (n=4 animales por grupo). Test de

Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones.

Tabla_8: Número de fetos por camada

en los diferentes grupos experimentales.

Test de Kruskal-Wallis seguido por

múltiples comparaciones.


106

Los fetos del grupo pair-fed, que fueron sometidos al mismo régimen de comida que el grupo

LIR_GD14 y no recibieron tratamiento a lo largo de la gestación, mostraron la misma ratio que aquellos

pertenecientes al grupo LIR_GD14 y VEH. Este hecho indica que la reducción del patrón de ingesta entre

GD14 y GD17 no interfiere en el grado de desarrollo pulmonar (Figura 39A).

Las ratas gestantes sometidas a restricción calórica del 30% (RC+VEH) entre GD14 y GD21

engendraron fetos macho y hembra (E21) con una ratio significativamente menor que la de fetos del

grupo control (VEH). La administración de Liraglutide a ratas gestantes sometidas a 4 días de

subnutrición (GD14-GD17) permitió recuperar los valores de la ratio de fetos macho hasta alcanzar los

valores calculados en el grupo control (VEH). Sin embargo, este efecto reparador del Liraglutide no fue

observado en el caso de fetos hembra (Figura 39A).

En el modelo de subnutrición se observó que la restricción calórica de un 30% durante la

gestación indujo hipoplasia pulmonar con una reducción de la ratio del 19.9%±2.27 en el caso de E21

machos (Figura 39B) con respecto al grupo control alimentado ad-libitum (VEH). En aquellas hembras

gestantes tratadas con Liraglutide desde GD18 aumentó el valor de la ratio en un 12.7 %, mejorando el

grado de hipoplasia pulmonar de E21 machos. A pesar de que la ratio P.P/P.C de E21 hembras

procedentes de ratas gestantes con un régimen de comida reducido en un 30% fue significativamente

menor que el grupo control alimentado ad-libitum, el grado de hipoplasia pulmonar fue menor que en el

caso de macho, reduciéndose en un 6.7%±2.79 (Figura 39B). La administración de Liraglutide en GD18

tras un régimen restringido de comida no causó efectos en el grado de hipoplasia pulmonar de E21

hembras, ya que el porcentaje de reducción de la ratio resultó ser similar (9.63%±1.26) al del grupo que

recibió vehículo (Figura 39B).


107

Figura_39: Evaluación del grado de desarrollo pulmonar debido a variaciones de la ingesta durante la gestación.

(A) Ratio entre el peso del pulmón (P.P) y el peso corporal (P.C), P.P/P.C. (B) Porcentaje de hipoplasia pulmonar (%

reducción de la ratio con respecto al grupo control). Los valores fueron representados como media ± error estándar

(n=20 fetos por grupo). *P<0.05, ***P<0.001 vs VEH; $$$ P<0.001 vs RC+VEH. Se aplicó el test de Mann-Whitney

para determinar las diferencias significativas entre dos grupos independientes y el test de Kruskal-Wallis para

comparaciones entre más de dos grupos independientes.

� Niveles de expresión de las proteínas surfactantes SP-A & SP-B.

A lo largo del desarrollo pulmonar se suceden una serie de interacciones moleculares que

permiten tanto el crecimiento del tejido, como la diferenciación celular. Por ello, cuanto mayor es el

grado de desarrollo, mayor es la diferenciación. Los neumocitos tipo 2 se diferencian en la fase

canalicular (E18-E20), momento en el que comienzan a expresarse los genes que codifican las proteínas

surfactantes. Por este motivo, el nivel de expresión de estas proteínas a menudo correlaciona con el grado

de maduración pulmonar.

La administración de Liraglutide desde GD14 no modificó la ratio P.P/P.C (Figura 39A) de E21

y, de igual forma, no causó efectos significativos sobre los niveles de mRNA o proteicos de SP-A ni SP-B

(Figura 40 A y 40B) en esta etapa de desarrollo.

VEH

LIR_G

D14

P-F (L

IR_G

D14)

R.C+V

EH

R.C+L

I R_G

D180

10

20

30

40 ♂

VEH

LIR_G

D14

P-F (L

IR_G

D14)

R.C+V

EH

R.C+L

I R_G

D180

10

20

30

40 ♀*

***

% R

educ

ción

de

P.P

/P.C

(con

res

pect

o a

VE

H)

-25

-20

-15

-10

-5

0 VEHRC+VEH RC+LIR_GD18

♀

B.

% R

educ

ción

de

P.P

/P.C

(con

res

pect

o a

VE

H)

-25

-20

-15

-10

-5

0 VEHRC+VEH RC+LIR_GD18

♂

***

∆12.7%

A.

$$$

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18

***P

.P/P

.C (m

g/g

)

P.P

/P.C

(mg

/g)


108

Los fetos que ingirieron la misma cantidad de alimento que el grupo LIR_GD14, pero que no

recibieron tratamiento a lo largo de su desarrollo [(pair-fed(LIR_GD14)], mostraron niveles de mRNA de

SP-A (Figura 40A) y SP-B (Figura 40B) con una tendencia a la reducción, aunque no significativa,

respecto al grupo control alimentado ad-libitum (VEH). Esta tendencia también se observó en el análisis

de los niveles proteicos de SP-A (Figura 40A), sin embargo, dicha tendencia no se manifestó en los

niveles proteicos de SP-B (Figura 40B) que se mantuvieron invariables respecto al grupo control.

A pesar de que los niveles pulmonares de mRNA de SP-B en fetos del grupo pair-fed

(LIR_GD14) no fueron significativamente menores que los niveles del grupo VEH, sí se observó una

reducción significativa con respecto a los niveles de mRNA de SP-B del grupo LIR_GD14 (Figura 40B).

Por tanto, la administración de Liraglutide desde GD14 revierte las acciones inhibidoras sobre la

expresión de SP-B asociadas a la variación del patrón de ingesta desde GD14-GD17.

A pesar de que los fetos procedentes de ratas gestantes sometidas a un 30% de restricción

calórica mostraron una ratio P.P/P.C inferior a la ratio de fetos obtenidos de ratas gestantes alimentadas

ad-libitum (Figura 39A), las variaciones del patrón de expresión de las proteínas surfactantes no fueron

tan relevantes como cabría esperar, teniendo en cuenta el grado de hipoplasia desarrollado en fetos macho

(Figura 39B).

La reducción de la ingesta de ratas gestantes en un 30% desde GD14 hasta GD21 no modificó

de forma significativa los niveles pulmonares de mRNA de SP-A (Figura 40A), aunque estos, mostraron

una tendencia a la reducción si los comparamos con los niveles presentes en fetos desarrollados bajo

condiciones ad-libitum (VEH). A pesar de no existir una disminución significativa de los niveles de

mRNA de SP-A, cuando se analizaron sus niveles proteicos la reducción observada fue significativa

(Figura 40A).

En lo referente a los niveles de mRNA de SP-B, estos permanecieron invariables respecto a los

niveles observados en fetos del grupo control (VEH), mientras que sus niveles proteicos revelaron un

aumento respecto al grupo tratado con el vehiculo (Figura 40B).

Por tanto, la reducción en un 30% de la ingesta durante la gestación, condiciona el grado de

crecimiento pulmonar, pero influye de forma limitada en el grado de diferenciación y maduración del

pulmón puesto que no reduce los niveles de mRNA ni proteicos de SP-B aunque sí los de SP-A.

La administración de Liraglutide en GD18 a ratas gestantes sometidas a subnutrición

(RC+LIR_GD18), no restauró las deficiencias de expresión de SP-A, ya que no se observaron diferencias

significativas con respecto a los niveles de mRNA o proteicos presentes en pulmones de fetos

desarrollados bajo condiciones de subnutrición y que recibieron vehículo (RC+VEH) (Figura 40A).

Además, estos niveles permanecieron reducidos respecto a los niveles cuantificados en el grupo control

(VEH).

Por otra parte, el tratamiento con Liraglutide aumentó, aproximadamente 6 veces, los niveles de

mRNA de SP-B (Figura 40B) con respecto a los niveles detectados en fetos desarrollados bajo

condiciones de subnutrición no tratados (RC+VEH) y también, con respecto a los niveles presentes en el


109

grupo control (VEH). El análisis de los niveles proteicos de SP-B mostró un incremento significativo con

respecto a los del grupo VEH, pero no con respecto a los niveles presentes en el grupo RC+VEH (Figura

40B).

Figura_40: Efectos de la variación de ingesta durante la gestación en el patrón de expresión de las proteínas

surfactantes SP-A (A) y SP-B (B). Los valores se representaron como media ± error estándar de 5 determinaciones

independientes. *P<0.05, **P<0.01 vs VEH; #P<0.05 vs LIR_GD14; $ P<0.05 vs RC+VEH. Las diferencias

significativas se determinaron tras aplicar el test de Kruskal-Wallis seguido de múltiples comparaciones.

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

R.C+VEH

R.C+LIR

_GD18

SP

-B/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0

2

4

6

8

10

#

*, $

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-A/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

20

40

60

80

100

120

140

VEH

LIR_GD14

P-F (L

IR_GD14

)

RC+VEH

RC+LIR_G

D18VEH

LIR_G

D14

P-F (L

I R_G

D14)

RC+VEH

RC+LIR_GD18

32kDa 36kDa

***

*

**

VEH

LIR_G

D14

P-F (L

IR_G

D14)

RC+VEH

RC+LIR_G

D18

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-B/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

50

100

150

200

250

***

SP-A

β-ACTINA

36kDa32kDa

43kDa

6kDa

43kDa

SP-B

β-ACTINA

A.

B.

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

R.C+VEH

R.C+LI

R_GD18

SP

-A/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

*

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18


110

La subnutrición mantiene los niveles de SP-B próximos a los niveles normales, mientras que

reduce la expresión de SP-A. La administración de Liraglutide en GD18, en combinación con la

subnutrición, modifica la respuesta de SP-B al tratamiento, ya que cuando ambas condiciones se

simultanean, sus niveles se incrementan hasta 6 veces.

Con el fin de elucidar los posibles mecanismos que definen el patrón de expresión de las

proteínas surfactantes en función de las condiciones experimentales, se evaluó el perfil de mRNA de

GLP-1R en pulmones de E21 para caracterizar las posibles acciones directas de Liraglutide sobre el

pulmón. Por otro lado, se analizó la expresión del factor de transcripción Nkx2.1, ya que este factor

modula la transcripción de las proteínas del surfactante. Finalmente, se estudió la respuesta celular de los

glucocorticoides en los pulmones de E21 puesto que representan los principales factores hormonales

reguladores de la expresión de las proteínas surfactantes.

� Niveles de expresión de GLP-1R.

La administración de Liraglutide desde GD14 no modificó de forma significativa los niveles

relativos de mRNA de GLP-1R en los pulmones de fetos de 21 días (Figura 41). Sin embargo, los fetos

sometidos al mismo régimen de comida pero sin recibir tratamiento [(pair-fed (LIR_GD14)], mostraron

niveles relativos de mRNA de GLP-1R en sus pulmones con una tendencia, aunque no significativa, a la

reducción (0.76 ± 0.17) con respecto a los niveles presentes en los pulmones de fetos del grupo

LIR_GD14 (1,19 ± 0.31) y a los existentes en pulmones de fetos del grupo control (VEH, 1.01 ± 0.19)

(Figura 41).

Los pulmones de fetos desarrollados bajo condiciones de restricción calórica del 30% desde

GD14 hasta GD21 mostraron niveles de mRNA de GLP-1R similares a los del grupo control alimentado

ad-libitum (VEH). Estos niveles se incrementaron, 6.16 veces con respecto a los valores presentes en

fetos sometidos a subnutrición durante su desarrollo (RC+VEH) y 4.15 veces con respecto a fetos del

grupo control (VEH), tras el tratamiento con Liraglutide desde GD18 (Figura 41). Esta observación se

correlaciona con el incremento de los niveles de SP-B descritos anteriormente (Figura 40).

La administración de Liraglutide cuando los niveles endógenos de GLP-1 están reducidos

debido a la subnutrición produce un incremento muy acusado de la expresión de GLP-1R. Este hecho

sugiere que, cuando existen deficiencias de GLP-1 endógeno, Liraglutide administrado de forma exógena

es capaz de estimular la expresión de GLP-1R.


111

� Análisis de los niveles de mRNA de Nkx2.1.

El factor de transcripción Nkx2.1, además de definir el patrón espacio temporal de la

morfogénesis pulmonar, induce la transcripción de las SPs mediante su unión al promotor de SP-A

(Bruno MD y cols., 1995), SP-B (Bohinski RJ y cols., 1994) y SP-C (Kelly SE y cols., 1996).

Se analizaron los niveles de mRNA de Nkx2.1 para determinar si los cambios observados en la

expresión de SP-A y SP-B podrían deberse a variaciones en los niveles de expresión de dicho factor de

transcripción. Tal y como se observa en la figura 42, ninguno de los grupos experimentales estudiados

presentó variaciones en los niveles de mRNA de Nkx2.1 con respecto al grupo control alimentado ad-

libitum (VEH).

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

R.C+V

EH

R.C+LI

R_GD18G

LP-1

R/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0

2

4

6

8

10

*, $

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

R.C+VEH

R.C+L

I R_G

D18

% D

O m

RN

A N

kx2.

1/18

S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

120pb

178pb

Nkx2.1

18s

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18

Figura_41: Efectos de la variación de ingesta

durante la gestación en el patrón de

expresión de GLP-1R. Los valores se

representaron como la media ± error estándar de 5

determinaciones independientes. *P<0.05 vs VEH; $

P<0.05 vs RC+VEH. Test de Kruskal-Wallis seguido

Figura_42: Efectos de la variación de ingesta

durante la gestación en el patrón de

expresión de Nkx2.1. Los valores se

representaron como la media ± error estándar

de 5 determinaciones independientes. Test de

Kruskal-Wallis.


112

� Análisis de la activación del receptor de glucocorticoides en pulmones de E21.

La restricción calórica durante la gestación genera cambios metabólicos que pueden influir en el

desarrollo del feto. La hipoglucemia ocasionada por la reducción de la ingesta, incrementa los niveles de

glucocorticoides maternos en rata hacia el final de la gestación (Fowden AL, 1995, review). Este efecto

también se origina en fetos desarrollados bajo condiciones de restricción calórica. Asimismo, se produce

una reducción de la expresión de la enzima 11-ß hidroxiesteroide deshidrogenasa placentaria que inactiva

los glucorticorticoides cuando están presentes en exceso (Lesage J y cols., 2001).

Los glucocorticoides son factores hormonales críticos en la maduración pulmonar. Algunas de

sus acciones incluyen la regulación de la transcripción tanto de SP-A (Ballard PL y cols., 1986) como de

SP-B. En general, los glucocorticoides son factores estimuladores de la transcripción, aunque presentan

efectos inhibidores sobre la transcripción de SP-A cuando se encuentran en altas concentraciones

(Boggaram V y cols., 1989). Este efecto inhibidor no ocurre en el caso de la regulación de la expresión de

SP-B (Liley HG y cols., 1989).

El modelo de retardo del crecimiento fetal por restricción calórica desarrollado muestra una

disminución en los niveles de expresión de SP-A (Figura 40A) pero no mostró cambios en SP-B (Figura

40B), por ello, nos propusimos analizar la actividad de los glucocorticoides en pulmones de E21 de cada

grupo experimental (Figura 43) mediante la cuantificación relativa de GR activados por ligando. Puesto

que la localización de los GR activados sería nuclear, se aislaron las proteínas nucleares y se procedió a la

determinación de los niveles del receptor.

El análisis de los niveles proteicos de GR en los extractos nucleares no mostró diferencias

significativas en ninguno de los grupos experimentales estudiados con respecto al grupo control

alimentado ad-libitum (Figura 43). A pesar de no existir diferencias estadísticamente significativas, los

pulmones procedentes de fetos desarrollados bajo condiciones de restricción calórica mostraron una clara

tendencia al incremento en los niveles de GR en el núcleo respecto a los encontrados en el grupo control

(VEH). Dicha tendencia también se observó en pulmones de fetos tratados con Liraglutide sometidos a

restricción calórica durante su desarrollo (RC+LIR_GD18) o bien alimentados ad-libitum (LIR_GD14)

(Figura 43).


113

� Niveles de expresión de AT1-R y AT2-R.

Recientes estudios demuestran que la actividad local del sistema renina-angiotensina en el

pulmón está implicada en el desarrollo pulmonar. Así, la angiotensina II estimula la formación de

conductos aéreos en explantes de pulmones fetales mediante su unión a AT1-R. Por otro lado, el

tratamiento con antagonistas de AT2-R mejora la función pulmonar y la tasa de supervivencia neonatal en

un modelo de hipoplasia pulmonar inducida por NTF (Nogueira-Silva C y cols., 2012).

Puesto que angiotensina II posee un papel importante en la morfogénesis pulmonar, analizamos

los niveles de expresión de AT1-R y AT2-R en el modelo de desarrollo fetal bajo condiciones de

restricción calórica, así como los efectos de Liraglutide sobre dichos receptores. Asimismo, se evaluaron

los niveles de expresión de ambos receptores en los pulmones de fetos desarrollados bajo condiciones de

libre acceso a la comida y tratados con Liraglutide. Se consideró, además, la posible influencia del efecto

anorexigénico de Liraglutide mediante el estudio del grupo pair-fed.

Los pulmones de los fetos obtenidos tras la administración de Liraglutide a ratas desde GD14

hasta GD17 alimentadas ad-libitum no mostraron cambios en los niveles de mRNA de AT1-R (Figura 44)

con respecto a los valores basales del grupo control (VEH). La reducción de ingesta provocada por

Liraglutide no modificó los niveles de expresión de AT1-R, ya que los pulmones de fetos del grupo pair-

fed mostraron niveles de expresión similares a los cuantificados en el grupo tratado con vehículo (Figura

44).

Los fetos sometidos a un 30% de restricción calórica durante su desarrollo mostraron niveles de

mRNA de AT1-R similares a los del grupo control (VEH). Sin embargo, dichos niveles se incrementaron

VEH

LIR_G

D14

P-F (L

I R_G

D14)

RC+VEH

RC+LIR_G

D18

% n

ivel

es p

rote

icos

GR

/TB

P

0

50

100

150

200

250

GR

TBP

110kDa

43kDa

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18

Figura_43: Efectos de la variación de la

ingesta durante la gestación en los niveles

proteicos del GR (glucocorticoid receptor) en

los extractos nucleares del tejido pulmonar

de E21♂. Los valores se representaron como la

media ± error estándar de 4 determinaciones

independientes. Test de Kruskal-Wallis.


114

5 veces tras la administración de Liraglutide desde GD18 (RC+LIR_GD18) con respecto al grupo control

(VEH) y al grupo RC+VEH (Figura 44).

En cuanto a los niveles de expresión de AT2-R, éstos no mostraron variaciones significativas en

los diferentes grupos experimentales estudiados con respecto al grupo control (VEH) (Figura 44).

Figura_44: Análisis de los niveles de mRNA de los receptores de angiotensina (AT1-R y AT2-R). Los valores se

representaron como la media ± error estándar de 5 determinaciones independientes. * P<0.05 vs VEH; $ P<0.05 vs

RC+VEH. Test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones.

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_GD14

)

R.C+VEH

R.C+LIR

_GD18A

T2-

R/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct

)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

VEH

LIR_G

D14

P-F(L

IR_G

D14)

R.C+VEH

R.C+LIR

_GD18A

T1-

R/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0

2

4

6

8

10

*, $

VEH Ad-libitum

LIR_GD14 Ad-libitum

RC+VEH

Pair-Fed (LIR_GD14)

RC+LIR_GD18


115

4.4. Análisis del papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa adulta: Diabetes y Obesidad.

4.4.1. Modelo de diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina.

A pesar de que las complicaciones más frecuentes de la diabetes son causadas por daños

vasculares, las anomalías de la circulación pulmonar asociadas a esta patología normalmente se

manifiestan de forma subclínica puesto que la red de capilares es muy extensa. Sin embargo, la

exposición prolongada y continua a elevados niveles de glucemia puede dar lugar a alteraciones en la

función respiratoria, como cambios en la elasticidad pulmonar y en la permeabilidad entre los alveolos y

la red de capilares lo que dificulta el intercambio gaseoso (Pitocco D. y cols. 2012, review).

La hormona vasoconstrictora Angiotensina II es la principal responsable de la regulación de la

presión sanguínea. Alteraciones en sus niveles suelen estar asociadas a patologías cardiovasculares, ya

que induce vasoconstricción e hipertrofia de las células de músculo liso vasculares, disfunción endotelial

y alteración de la composición de la matriz extracelular (Mehta PK y cols., 2007, review).

Puesto que las principales disfunciones respiratorias relacionadas con diabetes están asociadas

anomalías cardiovasculares y el endotelio vascular pulmonar es el principal órgano de síntesis de AngII,

se desarrollo un modelo animal de diabetes tipo 1 inducido por STZ en el que se evaluaron los niveles

de expresión de los componentes del sistema renina-angiotensina en el pulmón y el grado desarrollo de

hipertrofia del ventrículo derecho. Asimismo, se evaluó la composición del surfactante pulmonar en un

modelo de diabetes experimental, ya que la deficiencia o modificaciones en su composición se asocian

con el colapso alveolar.

Se han descrito efectos de GLP-1 como factor cardioprotector y estimulador de la síntesis de los

componentes surfactantes, por ello, se caracterizaron las acciones de Liraglutide tanto en el sistema

renina-angiotensina como en la composición del surfactante pulmonar en un modelo de diabetes tipo 1.

4.4.1.1. Seguimiento del cuadro diabético.

� Monitorización del peso corporal.

Se realizó un seguimiento del peso corporal de las ratas macho desde el día en el que se administró

la STZ (D1) hasta el día 14, momento en el que finalizó el tratamiento (Figura 45).

Tal y como era de esperar, la inducción de diabetes mediante STZ causó una reducción

significativa del peso corporal a lo largo del periodo estudiado (D2-D14), puesto que la ausencia de

insulina genera un déficit energético. La administración de Liraglutide, desde D7 hasta D14, no modificó

el peso corporal de aquellas ratas que recibieron STZ ni tampoco de aquellas a las que se les administró el

correspondiente vehículo (grupo control) (Figura 45).


116

Figura_45: Perfil y variación del peso corporal de ratas diabéticas (STZ) y no diabéticas (Control), tratadas con

Liraglutide (LIR) o bien vehículo (VEH). P.C, peso corporal; D1, día de inducción de la diabetes; D7, inicio del tratamiento.

Los valores se representaron como la media ±error estándar (n=6-8 animales por grupo). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs

Control+VEH. Las diferencias significativas entre dos grupos independientes se determinaron mediante el test de Mann-

Whitney, mientras que las comparaciones entre más de dos grupos independientes se realizaron con el test de Kruskal-Wallis.

� Perfil de los niveles plasmáticos de péptido C y glucosa.

Una vez inducida la diabetes experimental se determinaron los niveles de péptido C y de glucosa

con objeto de validar el modelo. Los resultados del análisis se muestran en la figura 46.

La administración de STZ redujo los niveles de péptido C aproximadamente unas 10 veces con

respecto a los animales no diabéticos (Figura 46A), hecho que confirmó el cuadro diabético del grupo de

animales utilizado. La administración de Liraglutide no modificó los niveles de péptido C en plasma en

animales tratados con STZ, sin embargo, cuando Liraglutide se administró a animales no diabéticos, se

produjo un incremento significativo de los niveles de péptido C en el día 10 del protocolo experimental.

Este incremento no se observó en los días 8 y 14, en los que los niveles fueron similares a los de animales

no diabéticos que recibieron vehículo (Figura 46A).

Control+VEH

Control+LIR

STZ+VEH

STZ+LIR

∆∆ ∆∆P

.C (

g) d

esde

D7

hast

a D

14

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

** ***

D1 D2 D3 D4 D5 D6

P.C

(g)

220

240

260

280

300

320

340

360

DÍAInducción de Diabetes

******

****** ***

Control STZ

D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14220

240

260

280

300

320

340

360Control+VEH Control+LIR STZ+VEH STZ+LIR

**

***

**

***

**

***

*

****

* *

***

**

**

***

**

DÍA

∆∆ ∆∆P

.C (

g) d

esde

D1

hast

a D

6

-40

-20

0

20

40

***


117

Los animales que recibieron STZ presentaron niveles de glucosa en plasma de entre 450-500

mg/dL a lo largo del periodo estudiado, mientras que la glucemia de los animales control mostraron

valores que oscilaron entre 125-190mg/dL. La administración de Liraglutide no alteró dichos niveles en el

grupo control ni en el grupo de animales diabéticos (Figura 46B).

Los resultados anteriores revelaron que el modelo animal empleado para el estudio, debido a la

destrucción de las células ß-pancreáticas, carece de insulina y presenta niveles de glucosa circulantes muy

elevados. Por tanto, las acciones de Liraglutide son independientes de su efecto insulinotrópico.

Figura_46: Validación del modelo de diabetes experimental. (A) Niveles de péptido C

en plasma de ratas no diabéticas (Control) y diabéticas (STZ) tras 8, 10 y 14 días (D8, D10

y D14) de la administración de STZ. (B) Determinación de la glucemia en D2, D6, D8 D10

y D14. Los valores se representaron como la media ± error estándar (n=6-8 animales por

grupo). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs Control+VEH. Test de Mann Whitney para

comparaciones entre dos grupos independientes. Test de Kruskal-Wallis seguido por

múltiples comparaciones entre más de dos grupos independientes.

4.4.1.2. Evaluación de anomalías cardiovasculares.

Puesto que los cuadros diabéticos a menudo se relacionan con patologías cardiovasculares, se

analizó el posible desarrollo de hipertrofia del ventrículo derecho y la sobreproducción de BNP-32 (B-

type natriuretic peptide-32) en el modelo experimental de diabetes tipo 1. Ambos parámetros se asocian

con hipertensión pulmonar.

A. B.

Glu

cosa

(m

g/m

L)

0

100

200

300

400

500

600

D2 D6 D8 D10 D14

*** ******

**** **

****

DÍADÍA

D8 D10 D14

Pép

tido

C (

pM)

0

500

1000

1500

2000

2500

** ** ** * *****

**

Control+VEH Control+LIR

STZ+VEH STZ+LIR


118

� Evidencias anatómicas. Estudio del desarrollo de hipertrofia del ventrículo derecho.

Los animales que mantuvieron un cuadro diabético durante 2 semanas (STZ+VEH), presentaron un

incremento en el peso del ventrículo derecho con respecto al grupo control (Figura 47A).

La administración de Liraglutide durante 7 días, tras 1 semana de la inducción de la diabetes,

recuperó el peso del ventrículo derecho alcanzando los valores presentes en animales no diabéticos

(Control+VEH) (Figura 47A). No se observaron efectos significativos en el peso de los ventrículos tras la

administración de Liraglutide a animales no diabéticos (Control+LIR) (Figura 47A).

El peso del ventrículo izquierdo permaneció invariable en todos los grupos experimentales

estudiados, tal y como se representa en la parte inferior de la figura 47A.

La figura 47B muestra la ratio entre el peso del ventrículo derecho con respecto al ventrículo

izquierdo más el septum. Se observó un incremento significativo del valor de la ratio en ratas diabéticas

(STZ+VEH) (Figura 47B), que fue debido a un aumento del tamaño del ventrículo derecho, y no a una

variación del tamaño del ventrículo izquierdo (Figura 47A). Así, la administración de Liraglutide

recuperó los valores de la ratio tras 1 semana de tratamiento.

� Evidencias moleculares. Estudio de la concentración de BNP-32.

Puesto que la ratio entre los pesos de los ventrículos sugiere hipertrofia ventricular, también se

determinó la concentración de BNP-32 para evaluar la función cardiaca en un modelo de diabetes

experimental.

BNP-32 se sintetiza en los ventrículos y es secretado en respuesta a un aumento de la volemia y de

presión al final de la diástole. Tras su secreción, el BNP-32 ejerce acciones vasodilatadoras, diuréticas,

natriuréticas e inhibidoras del sistema renina-angiotensina (de Lemos JA y cols., 2003).

Control STZ

VI+

S/P

.C (

mg/

g)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0VEH LIR

A.

Control STZ

VD

/P.C

(m

g/g)

0,0

0,5

3,0

*

VEH LIR

##

B.

Control STZ

VD

/VI+

S

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

*VEH LIR

##

Figura_47: Evaluación del grado de

hipertrofia del ventrículo derecho en un

modelo de diabetes tipo 1 inducida por

STZ. (A) Peso del ventrículo derecho

(VD) e izquierdo más el septum (VI+S) de

animales diabéticos (STZ) y no diabéticos

(Control) tratados con Liraglutide (LIR) o

bien con Vehículo (VEH). (B) Estimación

de la ratio entre los pesos del ventrículo

derecho y el ventrículo izquierdo más el

septum de cada grupo experimental. Los

valores se representaron como la media ±

error estándar (n=6-8 animales por grupo).

*P<0.05 vs Control+VEH; ##P<0.01 vs

STZ+VEH. Test de Kruskal-Wallis

seguido por múltiples comparaciones.


119

El estudio de la concentración de BNP-32 en animales diabéticos mostró un incremento de dicho

péptido en el ventrículo derecho con respecto al grupo control (Figura 48). Esta observación está en

concordancia con la hipertrofia ventricular descrita previamente (Figura 47B). Los animales diabéticos

tratados con Liraglutide durante 1 semana recuperaron los valores normales de BNP-32 (Figura 48)

paralelamente a la restauración del tamaño ventricular (Figura 47B). Por el contrario, la administración de

Liraglutide a animales no diabéticos (Control) no alteró los valores de BNP-32 en ventrículo derecho.

4.4.1.3. Estudio del sistema renina-angiotensina en el pulmón.

El desarrollo de hipertrofia del ventrículo derecho, así como la sobreproducción de BNP-32, en un

modelo de diabetes experimental podría estar asociado a patologías cardiovasculares como hipertensión

pulmonar.

Considerando la importancia del sistema renina-angiotensina en el control de la homeostasis y de

la presión sanguínea, se analizó la acción local de angiotensina II (AII) en el pulmón. Para ello, se

determinó el patrón de expresión de las enzimas responsables de los niveles circulantes de AII, así como

de los receptores que median sus acciones.

Como aproximación a la determinación de los niveles de AII se determinó la expresión relativa de

ACE, enzima que sintetiza AII a partir de AI, y ACE2, una caroboxipeptidasa que libera un aminoácido

de AII dando lugar a A(1-7) que presenta propiedades vasodilatadoras. Por tanto, el balance entre ACE y

ACE2 definiría los niveles circulantes de AII.

Por otro lado, se analizó la expresión de los receptores AT1-R y AT2-R en pulmón, puesto que

suponen un punto crítico en el control de las acciones locales de AII. La activación de AT1-R

desencadena una ruta de señalización que induce vasoconstricción y proliferación celular, mientras que la

unión de AII a AT2-R provoca vasodilatación y apoptosis. Se ha demostrado que la administración aguda

de AII incrementa los niveles de AT1-R, sin embargo la exposición crónica los reduce (Mehta PK y cols.,

2007, review).

Control STZ

BN

P-3

2 v

entr

ícul

o de

rech

o (

ng/m

g P

rote

ína

tota

l)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6VEH LIR

**

##

Figura_48: Evaluación de la función cardiaca

mediante la determinación de BNP-32 en ventrículo

derecho en un modelo de diabetes tipo 1 inducida por

STZ. Se midió la concentración de BNP-32 en el

ventrículo derecho de ratas no diabéticas (Control) y

diabéticas (STZ), tratadas con Liraglutide (LIR) o bien

con Vehículo (VEH). Los valores se representaron como

la media ± error estándar (n=6-8 animales por grupo).

**P<0.01 vs Control+VEH; ##P<0.01 vs STZ+VEH.

Test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples

comparaciones.


120

� ACE y ACE2 (angiotensin coverting enzymes).

Los animales diabéticos no mostraron cambios en la expresión de ACE. Cuando se administró

Liraglutide, tanto al el grupo control como en al grupo STZ, se incrementó hasta 3 veces la expresión de

ACE (Figura 49A).

El cuadro diabético provocó una reducción de la expresión de ACE2 en pulmón, recuperándose

hasta alcanzar los valores presentes en el grupo control tras la administración de Liraglutide. De igual

forma, Liraglutide aumentó 2.5 veces la expresión de ACE2 en pulmones de animales no diabéticos

(Figura 49A).

El balance entre los niveles de expresión de ambas enzimas (ACE2/ACE) se determinó mediante el

cálculo de la ratio entre los cambios de expresión relativa de cada enzima con respecto al grupo

Control+VEH. La ratio indica la acción predominante del sistema renina-angiotensina, vasodilatación a

través de ACE2 cuando alcanza valores superiores a 1, o bien vasoconstricción mediante ACE cuando la

ratio es menor que 1.

Los animales diabéticos mostraron una ratio ACE2/ACE inferior al valor del grupo control

(0.37±0.062), indicando el predominio de las acciones vasoconstrictoras en el pulmón causado por

reducción de los niveles de mRNA de ACE2 (Figura 49B). Los animales diabéticos tratados con

Liraglutide presentaron un valor de la ratio similar al del grupo Control+VEH, recuperándose el

equilibrio entre ambas enzimas. Por otro lado, Liraglutide no provocó alteraciones en la ratio ACE2/ACE

de animales no diabéticos puesto que incrementó los niveles de mRNA de ambas enzimas de manera

proporcional (Figura 49B).

A.

B.

C+VEH

C+LIR

STZ+VEH

STZ+LIR

AC

E2/

AC

E

cam

bios

rel

ativ

os d

e m

RN

A (

C+

VE

H)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0VEHLIR

**

Control STZ

AC

E/1

8S n

ive

les

rela

tivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0

1

2

3

4VEHLIR**

#

Control STZ

AC

E2/

18S

niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0

1

2

3

4

#

*

*

VEHLIR

Figura_49: Análisis del patrón de expresión de los componentes del

sistema renina-angiotensina en pulmón en un modelo de diabtetes tipo 1

inducida por STZ. (A) Efectos de la administración de Liraglutide sobre los

niveles relativos de mRNA de ACE y ACE2 en pulmones de animales

diabéticos y no diabéticos. (B) Análisis del balance entre ACE2 y ACE

expresado como la ratio ACE2/ACE de los cambios relativos de expresión

con respecto a Control+VEH. Los valores se representaron como la media ±

error estándar (n=6-8 animales por grupo). *P<0.05 vs Control+VEH;

#P<0.05 vs STZ+VEH. Test de Kruskal-Wallis seguido por múltiples

comparaciones.


121

� AT1-R y AT2-R (angitensin type-1 and type 2 receptors).

Las acciones de AII están mediadas por dos tipos de receptores de membrana acoplados a proteínas

G, cuyas acciones son antagónicas. AT1-R está ampliamente distribuido en diversos tejidos del

organismo y su unión al ligando induce vasoconstricción y proliferación celular. La expresión de AT2-R

se encuentra más limitada, y se reduce considerablemente en la etapa adulta con respecto a la etapa fetal.

La activación de AT2-R por AngII desencadena la respuesta opuesta a la mediada por AT1-R, es decir,

vasodilatación y apoptosis.

Puesto que AII ejerce sus acciones mediante la unión a sus receptores, se analizó la expresión de

cada receptor en el tejido pulmonar de animales diabéticos y no diabéticos. Ambos grupos fueron tratados

con Liraglutide o bien con vehículo.

Los animales diabéticos presentaron niveles de mRNA de AT1-R y AT2-R significativamente

inferiores a los del grupo control (Figura 50A). La administración de Liraglutide incrementó 4 veces los

niveles de mRNA de AT1-R en animales no diabéticos y hasta 12 veces en el caso de animales diabéticos

(STZ). El tratamiento con Liraglutide permitió que los animales diabéticos recuperasen los niveles de

AT1-R, alcanzando los valores presentes en animales no diabéticos tratados del grupo VEH (Figura 50A).

Sin embargo, la administración de Liraglutide no produjo efectos significativos sobre la expresión de

AT2-R en el grupo control ni en el grupo STZ (Figura 50A).

El balance entre ambos receptores (AT2-R/AT1-R) se determinó mediante el cálculo de la ratio de

los cambios relativos de expresión de cada receptor con respecto a su correspondiente grupo

Control+VEH. La ratio indica la acción predominante del sistema, vasodilatadora a través de AT2-R con

valores superiores a 1, o bien vasoconstrictora mediante AT1-R cuando alcanza valores menores que 1.

Los animales con diabetes inducida por STZ no mostraron un desequilibrio en los niveles de

expresión de ambos receptores, tal y como muestra la figura 50B. Así, la ratio (1.48±0.34) fue similar a la

del grupo Control+VEH (0.95±0.11) por reducción de la expresión tanto de AT1-R como de AT2-R. La

administración de Liraglutide redujo la ratio en animales diabéticos (0.09±0.01) y en no diabéticos

(0.3±0.06) con respecto al grupo Control+VEH (0.95±0.11) (Figura 50B). Por tanto, Liraglutide induce

un desequilibrio entre ambos receptores con predominancia de las acciones vasoconstrictoras debido al

incremento de la transcripción de AT1-R y sin cambios en los niveles de expresión de AT2-R.


122

4.4.1.4. Análisis de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B.

Se ha descrito que la hiperglucemia asociada a diabetes incrementa los depósitos de colágeno en el

tejido conectivo del pulmón reduciendo su elasticidad. De igual forma, incrementa el espesor de la

lámina basal de los vasos sanguíneos así como el espesor del epitelio alveolar reduciendo el espacio

aéreo de los alveolos. Estas alteraciones se traducen en un intercambio gaseoso deficiente y colapso de

los conductos aéreos pequeños (Pitocco D. y cols., 2012).

Considerando la importancia del surfactante pulmonar en la reducción de la tensión superficial

evitando el colapso de los alveolos al final de la espiración, estudiamos los niveles de expresión de las

principales proteínas surfactantes en un modelo de diabetes experimental para caracterizar su posible

implicación en la disfunción respiratoria. Además se evaluaron los efectos de Liraglutide sobre la

expresión de las SPs en dicho modelo.

Los niveles de mRNA de SP-A y SP-B se redujeron en los pulmones de los animales del grupo

STZ+VEH con respecto al grupo Control+VEH (Figura 51A y 51B), recuperándose hasta alcanzar los

valores normales tras la administración de Liraglutide. El tratamiento en animales no diabéticos

(Control+LIR) no alteró el patrón de expresión de mRNA de ninguna de las proteínas surfactantes

estudiadas (Figura 51).

Los cambios en el perfil de mRNA de SP-A no se reprodujeron en el estudio de los niveles

proteicos, tal y como se aprecia en panel derecho de la figura 51A. Si bien es cierto, que se produce una

Control STZAT

1-R

/18S

niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A(2

- ∆∆

∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0

1

2

3

4

5 VEH LIR

**

**

Control STZAT

2-R

/18S

niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A(2

- ∆∆

∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0

1

2

3

4

5VEH LIR

* *

A.

C+VEH

C+LI R

STZ+VEH

STZ+LIR

AT

2-R

/AT

1-R

cam

bios

rel

ativ

os d

e m

RN

A (

C+

VE

H)

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

VEH LIR

**###

#

B. Figura_50: Niveles de mRNA de AT1-R y AT2-R. (A) Patrón

de expresión de AT1-R y AT2-R en animales diabéticos y no

diabéticos tratados con Liraglutide o Vehículo. (B) Análisis del

balance entre AT2-R y AT1-R expresado como la ratio AT2-

R/AT1-R de los cambios relativos de expresión con respecto a

Control+VEH. Los valores se representaron como la media ±

error estándar (n=6-8 animales por grupo). *P<0.05, **P<0.01

vs Control+VEH. #P<0.05, ##P<0.01 vs STZ+VEH. Test de

Kruskal-Wallis seguido por múltiples comparaciones.


123

tendencia a la reducción de los niveles proteicos de ambas isoformas de SP-A (32 y 36kDa) en animales

del grupo STZ+VEH, dicho efecto no fue estadísticamente significativo.

En relación a los niveles proteicos de SP-B, no se observaron cambios significativos en el modelo

patológico de diabetes experimental. Sin embargo, la administración de Liraglutide a animales diabéticos

incrementó de forma significativa los niveles de SP-B con respecto al grupo control (Figura 51B). Por

otra parte, la administración de Liraglutide a animales no diabéticos no causó efectos sobre la expresión

de la proteína SP-B (Figura 51B).

Figura_51. Análisis del patrón de expresión de las proteínas surfactantes SP-A & SP-B en un modelo experimental de

diabetes tipo 1. Niveles de mRNA y proteicos de SP-A (A) y SP-B (B) en pulmones de animales diabéticos (STZ) y no

diabéticos (Control) tras el tratamiento de Liraglutide (LIR) o Vehículo (VEH). Los valores se expresaron como media ± error

estándar, n=6-8 animales por grupo. *P<0.05 vs Control+VEH. Test Kruskal-Wallis, seguido por múltiples comparaciones.

4.4.1.5. Análisis de expresión de GLP-1R en pulmón.

Los niveles de GLP-1R se caracterizaron en cada grupo experimental para determinar si las

deficiencias en las proteínas surfactantes podrían estar relacionadas con variaciones en los niveles de

expresión del receptor de GLP-1, así como la influencia de Liraglutide en dichos niveles de mRNA.

Los resultados mostrados en la figura 52 no revelaron cambios significativos en los niveles de

mRNA de GLP-1R en ninguno de los grupos estudiados.

Control STZ

SP

-B/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

*

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-A/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Contro

l

32kDa

STZ

36kDaCon

trol

STZ

Control STZ

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-B/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180 *

32kDa

43kDa

36kDaSP-A

β-ACTINA

43kDa

SP-B

β-ACTIN6kDa

Control STZ

SP

-A/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

**

VEHLIR

VEHLIR

A.

B.


124

4.4.1.6. Análisis de expresión del factor de transcripción Nkx2.1.

Puesto que el modelo de diabetes experimental mostró alteraciones en el patrón de expresión de las

proteínas surfactantes, pero no mostró alteraciones en el patrón de expresión de GLP-1R, se determinaron

los niveles del factor de transcripción Nkx2.1 en los pulmones de animales del grupo STZ y Control.

Dicho factor de transcripción está implicado en la regulación de la expresión de SP-A y SP-B. La

expresión de Nkx2.1 mostró niveles reducidos en pulmones de animales diabéticos no tratados

(STZ+VEH, Figura 53). La administración de Liraglutide a animales diabéticos incrementó los niveles de

mRNA de Nkx2.1 hasta alcanzar valores normales, sin embargo, no produjo cambios cuando fue

administrado a animales del grupo Control (Figura 53).

4.4.1.7. Análisis de los niveles circulantes de corticosterona.

Considerando que los glucocorticoides estimulan la síntesis de las proteínas surfactantes y que

GLP-1 es un potente agente estimulador del eje HPA, se determinaron los niveles circulantes de

corticosterona. Esta hormona podría mediar en las acciones de Liraglutide sobre la expresión de las

proteínas surfactantes en pulmón.

Control STZGLP

-1R

/18S

niv

eles

rel

ativ

os d

e m

RN

A

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8VEH LIR

Control STZ

% D

O m

RN

A N

kx 2

.1/1

8S

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

*

*

Nkx 2.1

120bp18S

178bp

M500bp

100bp500bp100bp

Figura_52: Patrón de expresión de GLP-1R

en un modelo experimental de diabetes tipo

1 tratados con Liraglutide o Vehículo. Los

valores se representaron como media ± error

estándar, n=6-8 animales por grupo. Test de

Kruskal-Wallis.

Figura_53: Patrón de expresión del factor de

transcripción Nkx2.1 en un modelo

experimental de diabetes tipo 1. Los valores se

representaron como media ± error estándar, n=6-8

animales por grupo. Test de Kruskal-Wallis.


125

Los animales diabéticos mostraron niveles plasmáticos de corticosterona superiores a los animales

no diabéticos en el día 2 y 6 (D2 y D6) tras la inducción del cuadro diabético. Sin embargo, dicho efecto

no se observó en los sucesivos días del protocolo experimental (D8, D10 y D14) (Figura 54).

La administración de 100µg/kg de Liraglutide cada 12 horas por vía subcutánea no modificó los

niveles de corticosterona en animales del grupo control (Control+LIR) ni en animales del grupo STZ

(STZ+LIR) con respecto al grupo Control+VEH (Figura 54).

4.4.2. Modelo de obesidad.

La obesidad es considerada un factor de riesgo para el desarrollo de patologías respiratorias tales

como asma, apnea obstructiva del sueño, hipertensión pulmonar y enfermedad obstructiva crónica.

Teniendo en cuenta la importancia del surfactante pulmonar en la fisiología respiratoria, y las

alteraciones de la función pulmonar asociadas a obesidad, nos planteamos caracterizar el patrón de

expresión de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B así como GLP-1R en un modelo de obesidad animal.

Como modelo animal de obesidad se emplearon ratas Zucker, portadoras de una mutación en el

dominio extracelular del receptor de leptina que genera resistencia a la leptina en los órganos diana,

(Phillips MS y cols., 1996) ocasionando hiperleptinemia, hiperfagia y obesidad.

La determinación de los niveles expresión de SP-A mostró un incremento en los pulmones de

animales obesos (fa/fa) con respecto a los pulmones de animales no obesos (fa/+) (Figura 55A). Los niveles

de mRNA de SP-A aumentaron dos veces con respecto a los valores del grupo control, mientras que los

niveles proteicos de la isoforma madura (36kDa) se incrementaron hasta 5 veces. (Figura 55A).

En relación a SP-B, los niveles de mRNA fueron 3 veces superiores en pulmones de animales obesos

con respecto a los niveles observados en animales no obesos (fa/+), sin embargo, no se mostraron

diferencias en los niveles proteicos (Figura 55B).

DÍAS

D2 D6 D8 D10 D14

nive

les

plas

mát

icos

de

cort

icos

tero

na (

ng/m

L)

0

100

200

300

400

500

600

Control STZ

***

**

Control+VEH Control+LIR STZ+VEH STZ+LIR

Figura_54: Niveles circulantes de

corticosterona en un modelo de diabetes

inducida por estreptozotocina. Los

valores se representaron como la media ±

error estándar, n=6-8 animales por grupo.

Test de Mann Whitney para comparaciones

netre dos grupos independientes. Test de

Kruskal-Wallis seguido por múltiples

comparaciones entre más de dos grupos

independientes. **P<0.01, ***P<0.001 vs

Control+VEH. (D2, D6, D8, D10 y D14:

día 2,6, 8, 10 y 14 tras la inducción de la

diabetes con STZ).


126

El análisis de expresión de GLP-1R en pulmón se muestra en la figura 56. A pesar de que no se

observaron diferencias significativas en los niveles de mRNA de GLP-1R en pulmones de animales

obesos con respecto a animales no obesos, se observaron niveles proteicos 7 veces superiores de GLP-1R

en el modelo de obesidad con respecto a los valores presentes en el grupo de animales fa/+.

Figura_56. Análisis de los niveles de GLP-1R en pulmones de animales obesos (fa/fa) y pulmones de animales no obesos

(fa/+). Los valores se representaron como la media ± error estándar de 5 determinaciones independientes. Test de Mann-

Whitney. *P<0.05 vs fa/+.

fa/+ fa/faSP

-B/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0

1

2

3

4*

fa/+ fa/faSP

-A/1

8S n

ivel

es r

elat

ivos

de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆∆C

t )

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5*

A.

B.

fa/+ fa/fa

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-B/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

20

40

60

80

100

120

SP

-Bβ-A

CTI

NA

43kDa

6kDa

fa/+ fa/fa

Peso Molecular

32kDa 36kDa

% n

ivel

es p

rote

icos

SP

-A/ ββ ββ-

AC

TIN

A

0

200

400

600

800fa/+ fa/fa

*

36kDa

32kDa

43kDa

SP

-Aβ-A

CTI

NA

fa/+ fa/fa

fa/+ fa/fa

GLP

-1R

/18S

niv

eles

rea

ltivo

s de

mR

NA

(2- ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆Ct )

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

fa/+ fa/fa% n

ivel

es p

rote

icos

GLP

-1R

/ ββ ββ-A

CT

INA

0

200

400

600

800

1000fa/+ fa/fa *

43kDa

53kDa

fa/+ fa/fa

GLP

-1R

β-A

CTI

NA

Figura_55: Caracterización de los

niveles de expresión de SP-A (A) y

SP-B (B) en pulmones de ratas

Zucker homocigotas con fenotipo

obeso (fa/fa) con respecto a ratas

heterocigotas no obesas (fa/+). Los

valores se representaron como media

± error estándar de 5 determinaciones

independientes. *P<0.05 vs fa/+. Test

de Mann-Whitney.

5. DISCUSIÓN.

5. Dis]usiòn.5. Dis]usiòn.5. Dis]usiòn.5. Dis]usiòn.

129

Hasta la fecha existen pocos estudios sobre las acciones de GLP-1 en la fisiología respiratoria. La

identificación de GLP-1R en el tejido pulmonar por Richter G y colaboradores a principios de los noventa

sugería la posible implicación de la hormona incretina en la función pulmonar. En concreto, se asoció

esta hormona con la secreción del mucus por las glándulas mucosas de la tráquea, la relajación de las

arterias pulmonares y la secreción del principal componente tensoactivo del surfactante pulmonar (PC)

por los neumocitos tipo II (Richter G y cols., 1993; Benito E y cols., 1998).

Dada la importancia del surfactante en la fisiología respiratoria y la capacidad de GLP-1de

inducir su secreción in vitro, consideramos que dicha hormona podría tener un papel fundamental en el

mantenimiento de la estabilidad alveolar. Por ello, en la presente tesis doctoral se caracterizaron los

efectos de los análogos de GLP-1 en la función pulmonar en el periodo fetal e inicio de la vida postnatal.

Asimismo, se analizaron sus acciones en modelos patológicos con deficiencias en la función respiratoria

tanto en etapas tempranas de vida postnatal como en la etapa adulta.

Papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa fetal y neonatal.

El surfactante pulmonar es imprescindible en el mantenimiento de la estabilidad alveolar al final

de la espiración, y muy especialmente para la adaptación del recién nacido a la respiración en el ambiente

aéreo. En este estudio no solo analizamos las posibles implicaciones de GLP-1 en la síntesis del

surfactante pulmonar, sino también en la maduración del pulmón

Inicialmente, se caracterizó la expresión de GLP-1R en sucesivas fases del desarrollo pulmonar

hasta la etapa adulta (Figura 20), y se confirmó la presencia de GLP-1R en los neumocitos tipo II (Figura

21), lo que nos permitió relacionar la acción de GLP-1R y la producción del surfactante pulmonar a lo

largo del desarrollo.

El patrón de expresión temporal de GLP-1R en el pulmón en desarrollo, tanto en machos como

en hembras, se correlacionó con el perfil de síntesis de los componentes del surfactante a lo largo de la

maduración pulmonar. En el primer día de vida postnatal se produjo un incremento muy acusado de los


130

niveles de mRNA de GLP-1R respecto a etapas fetales previas en el pulmón. Este aumento de la

expresión de GLP-1R se produce justo el día anterior al nacimiento, periodo de mayor demanda de

síntesis y secreción de los componentes del surfactante (Kresch MJ y cols., 1987, review, Schellhase DE

y cols., 1989). Este debe ocurrir como consecuencia del aumento de los estímulos que actúan sobre los

neumocitos tipo II para facilitar la adaptación de los pulmones al ambiente aéreo, permitiendo una

función pulmonar adecuada en la etapa postnatal.

Como se ha mencionado con anterioridad, se describió que la administración de GLP-1 estimula

la secreción de fosfatidilcolina (PC) por los neumocitos tipo II in vivo e in vitro, (Benito E y cols., 1998a

y Vara E y cols., 2001) pero, sus efectos sobre las proteínas del surfactante (SPs) se desconocen hasta la

fecha.

El análisis de la expresión de SP-A y SP-B en los animales de nuestras camadas (Figuras 22 y 23;

Figuras 25 y 26) reveló un incremento progresivo de la síntesis de ambas proteínas a lo largo del

desarrollo pulmonar. Lo que concuerda con otros estudios previos (Schellhase DE y cols., 1989).

El tratamiento prenatal con los agonistas del receptor GLP-1R (Ex4 o Liraglutide) incrementó los niveles

de mRNA de ambas proteínas, SPA y SPB (Figuras 22A y 23A; Figuras 25A y 26A), a lo largo del

desarrollo pulmonar, pero con efectos diferentes. Liraglutide aumentó los niveles de ambas SPs en fetos

de 20 días de desarrollo sin causar variaciones en el primer día de vida postnatal (Figura 25A y 26A). Por

su parte, Ex4 incrementó los niveles de mRNA de SP-A, pero no los de SP-B en fetos de 20 días de vida

intrauterina. Igualmente, aumentó la expresión de SP-A y SP-B en el primer día de vida postnatal (Figura

22A y 23A). En este sentido, Ex4 parece tener un efecto más potente y prolongado sobre SP-A que

Liraglutide, mientras que sus acciones sobre SP-B son más retardadas y de menor magnitud.

Los efectos de los agonistas de GLP-1R sobre los niveles de proteína de las SPs fueron sin

embargo limitados, puesto que no se observaron efectos significativos sobre las niveles proteicos tras el

tratamiento con Liraglutide respecto al grupo control (Figura 25B y 26B), aunque la administración

prenatal de Ex4 si incrementó significativamente los niveles proteicos de SP-A en los neonatos (Figura

22B). Teniendo en cuenta que estos animales presentan una función respiratoria normal, resulta lógico

pensar que el incremento en los niveles de mRNA por Liraglutide o Ex4 no vaya acompañado de un

aumento en los niveles proteicos, ya que en los pulmones de estos animales no existen deficiencias que

sea necesario suplir y sus variaciones están sometidas a controles homeostáticos.

Así encontramos un incremento no significativo, de los niveles de SP-A en el líquido amniótico

de fetos de 18 días con respecto a fetos de 20 días, mientras que los niveles de SP-B fueron similares en

ambos periodos del desarrollo (Figuras 22C y 23C; Figuras 25C y 26C). Los cambios observados en SP-

A en nuestro modelo animal están en concordancia con los observados en humanos, en los que los niveles

de SP-A en el líquido amniótico se incrementan hasta 6 veces desde la etapa sacular (30 semanas) hasta

el parto (Snyder JM y cols., 1988). Sin embargo, nuevamente encontramos que el tratamiento con Ex4 en

ratas hembra gestantes incrementó significativamente los niveles de SP-A (Figura 22C), pero no los de

SP-B (Figura 23C), en el líquido amniótico de fetos de 18 días, alcanzando los niveles equiparables a los


131

de fetos de 20 días no tratados. El incremento de la secreción de SP-A al líquido amniótico se ha

relacionado con señales inductoras del parto (Condon JC y cols., 2004). Este aumento es un indicador del

grado de maduración del pulmón, que es la principal fuente de SP-A (Takahashi H y cols., 2006). De

acuerdo con este hecho, los niveles de SP-A en el líquido amniótico de fetos de 18 días tratados con Ex4

estarían indicando un mayor grado de maduración pulmonar con respecto a fetos pertenecientes al grupo

tratado con solución salina.

Por otro lado, Ex4 podría estar estimulando la secreción de las SPs. Las proteínas surfactantes

hidrofílicas (SP-A y SP-D) se secretan de forma independiente a los cuerpos laminares (LBs; Rooney SA

y cols., 1993) mientras que las hidrofóbicas (SP-B y SP-C) son secretadas por exocitosis de los LBs

(Oosterlaken-Dijksterhuis MA y cols., 1991). El incremento de SP-A en el líquido amniótico podría

deberse a un aumento de la secreción, en respuesta a Ex4, de manera independiente al mecanismo que

induce la exocitosis de los cuerpos laminares ya que no se observaron cambios en los niveles de SP-B.

Los efectos de Liraglutide fueron más moderados que los inducidos por Ex4, ya que los niveles

de SP-A en el líquido amniótico mostraron una tendencia, aunque no significativa, a incrementarse tras el

tratamiento prenatal con Liraglutide en las etapas de desarrollo estudiadas (E18 y E20) (Figura 25C y

26C).

Los efectos de la administración prenatal de los agonistas de GLP-1R sobre SP-A y SP-B en

neonatos, se compararon con los desencadenados por el glucocorticoide sintético Dexametasona. La

administración prenatal de glucocorticoides se emplea en la práctica clínica para inducir la maduración

pulmonar en niños con riesgo de nacimiento prematuro. Mediante este tratamiento se consigue la

reducción de la incidencia del RDS (Respiratory Distress Syndrome; Crowley PA, 1995). Los

glucocorticoides regulan de forma directa la transcripción de SP-A y SP-B tras la unión de su receptor,

GR, al elemento respuesta a glucocorticoides (GRE) localizado en la región promotora de ambos genes

(White RT y cols., 1985; Pilot-Matias TJ y cols., 1989). En nuestro modelo animal, los efectos de

Dexametasona sobre los niveles de mRNA de SP-A y SP-B en pulmones de neonatos fueron equiparables

a los inducidos por Ex4 (Figura 22A y 23A). Por otro lado, el tratamiento con Liraglutide presentó

efectos estimuladores de la síntesis de SPs durante el periodo de desarrollo fetal, pero no en el postnatal.

Ex4 es un potente estimulador del eje hipotálamo hipofisario adrenal (HPA) (Gil-Lozano M y

cols., 2010), por lo que los efectos de Ex4 y Liraglutide en el pulmón en desarrollo, podrían estar

mediados por un incremento de los glucocorticoides circulantes. Con el fin de evaluar esta posibilidad, se

cuantificaron los niveles de corticosterona en plasma de ratas gestantes, desde el día 16 de gestación,

tratadas con Ex4 (Figura 27B). Además, se determinaron los niveles de corticosterona en neonatos

procedentes de hembras tratadas con Ex4 o Liraglutide (Figura 27A).

La administración prolongada de Ex4 a ratas gestantes no modificó los niveles circulantes de

corticosterona a lo largo de la gestación. En neonatos tampoco se observaron cambios significativos tras

el tratamiento con Ex4 o Liraglutide, por lo que se puede descartar que el incremento de expresión de SP-


132

A y SP-B en pulmones en desarrollo tras la administración de los agonistas de GLP-1R sea debido a un

efecto indirecto por aumento de glucocorticoides. Sin embargo, mediante esta aproximación, no se puede

excluir el incremento local de los niveles de glucocorticoides en los pulmones de los fetos. En este

sentido, es bien conocido que la maduración pulmonar está regulada por los glucocorticoides de

procedencia materna, placentaria y fetal. Recientes estudios ponen de manifiesto la acción local de

glucocorticoides en el pulmón en desarrollo la cual está regulada por la actividad de 11ß-HSD tipo 1 y

11ß-HSD tipo 2 (type 1 and type 2 11ß- hydroxysteroid dehydrogenase) (Garbrecht MR y cols., 2006). En

roedores, la 11ß-HSD tipo 1 sintetiza corticosterona y en humanos cortisol. Por otra parte, la 11ß-HSD

tipo 2 inactiva la corticosterona en roedores o el cortisol en humanos (Garbrecht MR y cols., 2006). El

tratamiento prenatal con los agonistas de GLP-1 podrían estar modulando la acción local de los

glucocorticoides en los pulmones de fetos a través de estas enzimas.

Los estrógenos son hormonas estimuladoras de la maduración pulmonar, ya que aumentan la

síntesis de los componentes del surfactante (Seaborn T y cols., 2010, review). Dada la importancia de

estas hormonas sobre la maduración pulmonar, se determinaron los niveles circulantes de 17ß-estradiol

en ratas gestantes tratadas con Ex4 (Figura 27C). Al igual que ocurrió con los niveles de corticosterona,

Ex4 no modificó los niveles de 17ß-estradiol en ninguno de los días de gestación estudiado, por lo que

puede ser descartado que los efectos de los agonistas de GLP-1R sobre la secreción de las SPs sean

consecuencia de un incremento en los niveles circulantes de estrógenos en las ratas gestantes.

El factor de transcripción Nkx2.1 regula la expresión de SP-A y SP-B (Bruno MD y cols., 1995; Bohinski

RJ y cols., 1994). La fosforilación de Nkx2.1 incrementa su actividad sobre las regiones promotoras de

los genes que codifican las proteínas surfactantes (DeFelice M y cols., 2003). Puesto que Nkx2.1 es

fosforilado por PKA (Li J y cols., 1998) y la activación de GLP-1R activa PKA, sus agonistas podrían

estar induciendo la fosforilación de Nkx2.1 incrementando así su actividad sobre la transcripción de SP-A

y SP-B.

Para confirmar esta hipótesis, se determinó la actividad de Nkx2.1 sobre la región promotora del

gen SP-B de rata en respuesta al tratamiento con Ex4 (Figura 24). Ex4 incrementó la unión de Nkx2.1 a

la región promotora de SP-B en los pulmones de fetos de 18 y 20, pero no mostró efectos en los

pulmones de animales de 1 día de vida.

Con todo esto, nuestros estudios demuestran la contribución de GLP-1 y sus análogos,

Liraglutide y Ex4, en la síntesis de las proteínas surfactantes a lo largo del desarrollo fetal. Los efectos de

Ex4 sobre las proteínas del surfactante son más completos y de mayor magnitud que los de Liraglutide, y

sus acciones implican la activación de la vía de Nkx2.1, y no son mediadas por aumentos de

glucocorticoides o estrógenos. Las variaciones naturales en los niveles de expresión del receptor de GLP-

1 en el pulmón suponen un incremento de hasta 5 veces en el primer día de vida con respecto a etapas


133

fetales, lo que coincide en el tiempo con el incremento en la producción pulmonar de SP-A y SP-B. De

ello se infiere que GLP-1 tiene un papel directo y relevante en la maduración pulmonar y la producción

de proteínas del surfactante, que resulta fundamental para conseguir un pulmón funcional inmediatamente

antes del nacimiento.

Considerando que las deficiencias en la síntesis del surfactante pulmonar en recién nacidos son la

principal causa de muerte neonatal, resulta de especial interés el análisis de nuevos estímulos del sistema

surfactante que reviertan dichas deficiencias. La principal causa del RDS en neonatos es la síntesis

deficiente de los componentes del surfactante pulmonar debido a inmadurez de los neumocitos tipo II de

niños prematuros, junto con el desarrollo incompleto de otras estructuras pulmonares. La mayor parte de

los tratamientos están enfocados a acelerar la maduración de los neumocitos tipo II y por tanto al

incremento de la síntesis del surfactante pulmonar.

Estudios previos revelan que NTF produce efectos teratogénicos en el desarrollo pulmonar por

reducción de la actividad de la enzima de síntesis del ácido retinoico (Noble BR y cols., 2007), factor

regulador de la morfogénesis pulmonar y en concreto estimulador de la formación de alveolos (Massaro

GD y cols., 1996). El modelo animal de desarrollo pulmonar incompleto generado por exposición a NTF

durante la gestación, mostró hipoplasia del pulmón así como deficiencias en la síntesis de las proteínas

surfactantes.

Los animales expuestos a NTF durante el desarrollo presentaron una reducción del tamaño

pulmonar del 50% (Figura 29B) y una disminución del peso corporal del 30% (Figura 29A) con respecto

a fetos con desarrollo completo. En concreto, los fetos macho mostraron mayor grado de hipoplasia

pulmonar (34.87%) que los fetos hembra (23.42%) tras haber sido expuestos a NTF (Figura 29D). Este

hecho sugiere mayor susceptibilidad a los efectos de NTF de los fetos macho debido al retardo en el

desarrollo pulmonar inducido por los niveles circulantes de andrógenos (Nielsen HC y cols., 1981). Los

andrógenos inhiben las acciones de estimuladoras sobre la maduración pulmonar de EGF, mientras que

promueven las acciones inhibidoras de TGF-ß1 (Dammann CE y cols., 2000).

De igual modo, los cortes histológicos de los pulmones de fetos expuestos a NTF durante el

desarrollo mostraron una morfología alterada (Figura 31). En la etapa sacular (E21), el epitelio alveolar

está compuesto por dos tipos de células, cuboidales (neumocitos tipo II) y aplanadas (neumocitos tipo I).

El epitelio limita la luz de los sáculos terminales que continúan ramificándose para incrementar la

superficie de intercambio gaseoso.

En el modelo experimental de subdesarrollo pulmonar (NTF), además de mostrar un crecimiento

reducido del tejido pulmonar, presentó menor superficie de intercambio gaseoso debido a una

disminución del diámetro de los sacos terminales con mayor contenido de tejido parenquimatoso. Por otra

parte, las células epiteliales no parecen estar diferenciadas y los espacios saculares muestran una

considerable desorganización en comparación con la estructura alveolar mostrada en pulmones con

desarrollo completo. Los resultados obtenidos fueron concordantes con estudios previos en los que se

analizó el tejido pulmonar de fetos expuestos a NTF durante su desarrollo (Nogueira-Silva C y cols.,


134

2011). Asimismo, el modelo animal de hipoplasia pulmonar inducida mostró insuficiencias en la síntesis

de SP-A y SP-B como consecuencia de la inmadurez pulmonar (Figura 32). Los fetos expuestos a NTF

durante el período intrauterino presentaron una reducción en los niveles de mRNA de SP-A y SP-B, con

menores niveles proteicos de SP-A pero no de SP-B. Ambas proteínas contribuyen a las propiedades

tensoactivas del surfactante. SP-A no parece ser imprescindible en la estabilidad alveolar durante la

respiración puesto que ratones deficientes en SP-A muestran una función respiratoria normal; (Korfhagen

TR y cols., 1996) sin embargo, presentan una mayor susceptibilidad a infecciones debido a la implicación

de la SPA en las respuestas del sistema inmune (LeVine AM y cols., 1997). Por el contrario, SP-B es

esencial para la estabilidad fisicoquímica del surfactante y por tanto para la función respiratoria; y su

ausencia provoca fallo respiratorio y muerte pocas horas después del nacimiento (Clark JC y cols., 1995).

En el modelo experimental de hipoplasia pulmonar por NTF, los niveles proteicos de SP-B fueron

similares a los mostrados por fetos con desarrollo completo. A pesar de producirse una reducción de los

niveles de mRNA, parece haber mecanismos compensatorios celulares que permiten mantener los niveles

proteicos basales de SP-B, ya que es una proteína esencial para la función respiratoria. En este modelo

también se observaron cambios en el patrón de expresión de GLP-1R (Figura 33). Los pulmones

inmaduros de fetos expuestos a NTF presentaron una reducción de los niveles de mRNA de GLP-1R con

respecto a fetos con desarrollo completo, lo cual es coherente con el perfil temporal de expresión de GLP-

1R en el pulmón, que resulta menor en etapas tempranas de desarrollo y se incrementa a medida que

avanza la gestación.

Una vez caracterizado el modelo de hipoplasia pulmonar inducida, se evaluaron los efectos de los

agonistas de GLP-1R, Ex4 y Liraglutide sobre la función pulmonar. A estos grupos experimentales se

añadió un grupo adicional de hembras gestantes tratadas con Dexametasona.

La administración de Liraglutide desde GD14 redujo el grado de hipoplasia pulmonar de fetos

que fueron expuestos a NTF durante su desarrollo (Figura 29D). Dicho efecto fue de mayor magnitud en

el caso de machos (23.7%) que en hembras (16.4%), ya que los machos parecen ser más susceptibles a

los efectos deletéreos de NTF. Los esteroides gonadales modulan las acciones de TGF-β1 y EGF en el

pulmón en desarrollo, por lo que las diferencias observadas entre machos y hembras podrían deberse a

variaciones en los niveles circulantes de dichas hormonas. En este sentido, serán necesarios más estudios

que aborden este hecho.

La administración prenatal de Liraglutide atenuó la reducción del tamaño del pulmón causada por

NTF sin afectar al peso corporal tanto en machos como en hembras (Figura 29A y 29B). Además, el

tratamiento no sólo recuperó el crecimiento del pulmón, sino que también mejoró la estructura alveolar

tal, como muestra el análisis histológico (Figura 31). A pesar de que la superficie de intercambio gaseoso

no parece incrementarse en respuesta a Liraglutide, se observó una mayor organización del epitelio

alveolar, con espacios alveolares más regulares que en el caso de fetos con retardo en el desarrollo

pulmonar tratados con solución salina. Adicionalmente, el epitelio alveolar mostró células aplanadas


135

similares a las del epitelio de los pulmones de fetos con desarrollo completo. En concordancia con los

resultados histológicos, Liraglutide restauró los niveles de mRNA de SP-A y SP-B en pulmones de fetos

expuestos a NTF durante el desarrollo, alcanzando niveles de expresión similares a los observados en

fetos con desarrollo completo (Figura 32). Todos estos datos en conjunto acreditan una mejor disposición

morfo-funcional del pulmón para el intercambio respiratorio tras el tratamiento con Liraglutide.

En el modelo de hipoplasia pulmonar inducida también se observó un aumento de la expresión de

GLP-1R tras la administración de Liraglutide, en un fenómeno característico de primación (up-

regulation) del receptor por activación con su ligando (Figura 33). El incremento de la expresión del

receptor de GLP-1 podría ser la causa del incremento de la expresión de las proteínas surfactantes, ya

que, según se ha descrito previamente, la activación de GLP-1R incrementa la síntesis de AMPc,

estimulando a su vez, la transcripción de SP-A y SP-B (Mendelson CR y cols., 1986; Liley HG y cols.,

1989).

Contrariamente a los resultados obtenidos tras la administración de Liraglutide, Ex4 no mejoró el

desarrollo y maduración pulmonar en el modelo de hipoplasia experimental en este tejido (Figura 29). Sin

embargo, el tratamiento con Ex4 recuperó los niveles basales de mRNA de SP-A y SP-B (Figura 32),

aunque no los niveles proteicos, y mejoró la organización de los sáculos alveolares (Figura 31). En lo

referente a la expresión de GLP-1R, Ex4 no mostró un efecto estimulador sobre este receptor (Figura 33).

A pesar de que Liraglutide y Ex4 son considerados agonistas de GLP-1R, sus acciones sobre el

pulmón en desarrollo no fueron reproducidos de igual forma. Ambos péptidos recuperaron los niveles de

mRNA de las proteínas surfactantes y mejoraron la estructura de los sáculos alveolares pero únicamente

Liraglutide fue capaz de restablecer el tamaño y grado de maduración del pulmón, mientras que la

administración de Ex4 no recuperó el tamaño corporal de los fetos ni el tamaño del pulmón de fetos que

recibieron NTF. Estas discrepancias pueden ser consecuencia de la diferente naturaleza de ambos

péptidos. Así, Liraglutide presenta un 97% de homología con GLP-1 y una vida media en circulación de

12 a 13 horas (Agersø H y cols., 2000), mientras que Ex4 comparte un 53% de homología con el péptido

endógeno y permanece en circulación entre 60 y 90 minutos (Kolterman OG y cols., 2005). En este

sentido, los efectos de Liraglutide sobre el crecimiento pulmonar pueden tener mayor magnitud debido a

su vida media más larga en la circulación.

En relación con esta hipótesis, se observó que Liraglutide incrementó los niveles de GLP-1R en

los pulmones de fetos, hecho que no se reprodujo tras la administración prenatal de Ex4, lo que se

justifica por la vida media más larga de Liraglutide. La mayor disponibilidad de GLP-1R en la membrana

plasmática incrementaría la respuesta celular tras la unión de Liraglutide, mostrando algunos efectos no

reproducidos por Ex4, como el crecimiento pulmonar, que presentaría un menor tiempo de activación de

GLP-1R. En este sentido, actualmente no se descarta que Ex4 pueda ejercer sus efectos por la activación

de un receptor alternativo todavía no identificado. Son numerosos los estudios previos que describen

efectos no superponibles de GLP-1 y Ex4 en los tejidos diana. Así, se ha demostrado que la


136

administración central y periférica de Ex4 inhibe la secreción de grelina en ratas en ayuno lo que no es

reproducido por GLP-1 (7-36)NH2 o por el antagonista de su receptor (Ex9-39) (Pérez-Tilve D y cols.,

2007). Se ha sugerido la existencia de un segundo receptor cuya activación permitiría explicar algunas de

las discrepancias (Montrose-Rafizadeh C y cols. 1997; Yang H y cols., 1998; Villanueva-Peñacarrillo ML

y cols., 2001).

Una posible causa del crecimiento fetal retardado que se observó en los grupos tratados con Ex4

podría deberse a su efecto anorexigénico (Edwards CM y cols., 2001). Así, el perfil del peso corporal a lo

largo de la gestación desde el inicio del tratamiento con Ex4 reveló una reducción del peso de ratas

gestantes (Figura 28). Este efecto se observó tanto en las ratas que recibieron NTF como en las que

recibieron vehículo (C). La pérdida de peso observada en las hembras gestantes tratadas con Ex4 podría

deberse a la reducción del tamaño de la camada, del peso de los fetos o a la reducción directa de la masa

corporal del animal considerando que Ex4 reduce la ingesta de comida. Sin embargo, la administración

prenatal de Ex4 no modificó el tamaño de la camada (C+Ex4 o NTF+Ex4) ya que fue similar al del grupo

control (Tabla 7). En este estudio se pudo comprobar que existe una reducción significativa en el peso de

los fetos de madres tratadas con Ex4, pero no en magnitud suficiente para explicar la reducción global de

peso de dichas madres. De ello se infiere que el efecto anorexigénico de Ex4 afecta directamente a la

masa corporal de las gestantes, con una pérdida significativa. (Figuras 28)

Al contrario de lo observado en los grupos tratados con Ex4, la administración de Liraglutide

durante la gestación no modificó el peso corporal de las hembras gestantes ni afectó al crecimiento fetal.

Los efectos del tratamiento con Liraglutide en la función pulmonar durante el desarrollo no se

limitaron a un incremento de la expresión de las proteínas surfactantes, sino que también normalizó el

peso pulmonar relativo en un modelo experimental de inmadurez pulmonar por administración de

nitrofen (NTF). Estos efectos pueden deberse a un aumento de la proliferación celular, inhibición de la

apoptosis o bien a un improbable aumento del tamaño celular (hipertrofia). Estudios previos han

demostrado que Liraglutide aumenta la tasa de proliferación celular de las células ß pancreáticas en

ratones db/db de manera más potente que Ex4 (Rolin B y cols., 2002) e inhibe la apoptosis en islotes

pancreáticos (Bregenholt S y cols., 2005). La activación de GLP-1R en los neumocitos tipo II o en los

conductos respiratorios por acción del Liraglutide, podría estar promoviendo efectos proliferativos y

antiapoptóticos similares a los observados en el islote pancreático. La mejoría en la estructura morfo-

funcional del pulmón en animales tratados con Liraglutide, sugiere que la activación del receptor de

GLP-1 tiene efectos plásticos y madurativos en el conjunto del órgano, en los que necesariamente deben

producirse procesos proliferativos y antiapoptóticos (Figura 31)

En los experimentos con NTF se generó un grupo experimental tratado con Dexametasona, como

control positivo de maduración pulmonar inducida. El tratamiento prenatal con Dexametasona,

incrementó los niveles de mRNA de SP-A y SP-B en fetos con crecimiento pulmonar retardado (NTF).


137

Este incremento también se observó en los niveles proteicos de SP-A pero no de SP-B, ya que el modelo

NTF no presentó deficiencias en los niveles proteicos de SP-B (Figura 32). Debe ser enfatizado que la

administración de Liraglutide a animales NTF tuvo efectos similares, e incluso superiores a los de

Dexametasona, en algunos parámetros pulmonares estudiados, como la formación de sacos alveolares y

desarrollo del epitelio alveolar .

En relación al crecimiento pulmonar, Dexametasona solamente mostró efectos reparadores en los

fetos hembras, reduciendo el grado de hipoplasia pulmonar en un 15.2%. Este efecto fue reproducido de

manera similar por Liraglutide (16.4%). Sin embargo, Dexametasona no fue capaz de revertir el grado de

hipoplasia pulmonar de los fetos macho, que presentó características similares al grupo con inmadurez

pulmonar tratado con solución salina (Figura 29D). La ineficacia del tratamiento con Dexametasona en la

morfogénesis pulmonar también se hizo evidente en el análisis histológico de los pulmones ya que se

observó una estructura alveolar similar a la mostrada en el modelo de hipoplasia pulmonar (Figura 31).

A pesar de que los glucocorticoides aceleran la maduración pulmonar (Avery ME y cols., 1959),

la exposición a concentraciones elevadas de glucocorticoides puede retardar el crecimiento del feto

(Bloom SL y cols., 2001) y reducir el número de alveolos por fallo en la formación de los tabiques

alveolares, disminuyendo la superficie de intercambio gaseoso (Massaro D y cols., 1975). En condiciones

fisiológicas, el feto está protegido frente a altos niveles de glucocorticoides por la enzima 11ß-HSD tipo 2

localizada en la placenta y que metaboliza los glucocorticoides activos a productos inactivos. Estudios

previos han evidenciado que la administración prenatal de Dexametasona, retrasa el crecimiento del feto

al no poder ser metabolizada por la 11ß-HSD tipo 2 (Benedicktsson R y cols., 1993). En base a estos

estudios, el exceso de corticoides durante el desarrollo en el modelo de hipoplasia experimental podría

estar inhibiendo el crecimiento del pulmón. Los corticoides actuarían disminuyendo la formación de los

sáculos alveolares, aunque manteniendo su capacidad estimuladora de la transcripción de las SPs (White

RT y cols., 1985; Pilot-Matias TJ y cols., 1989), o bien incrementando la estabilidad de las moléculas de

mRNA (Weaver TE y cols., 1991, review). Por tanto, los efectos deletéreos de la Dexametasona, al

menos en cuanto al tamaño del pulmón, se manifestaron en fetos macho debido a que el crecimiento de

sus pulmones está retardado respecto a los pulmones de hembras. Este hecho debe ser tenido en

consideración, y es por ello que crece cada vez más la reserva sobre la utilización de glucocorticoides

como inductores de la maduración pulmonar.

La administración de Dexametasona incrementó los niveles de mRNA de GLP-1R en fetos de

madres tratadas con NTF (Figura 33). Sin embargo, este aumento resulta insuficiente para recuperar el

crecimiento normal del pulmón, y nuestros estudios sugieren que es necesaria una activación más potente

del receptor de GLP-1R, que la desencadenada por los niveles fisiológicos de GLP-1, tal y como

demuestran los resultados obtenidos tras la administración de Liraglutide.

Teniendo en cuenta los efectos reparadores de Liraglutide en el desarrollo del pulmón en un

modelo de hipoplasia pulmonar inducida, el siguiente paso fue estudiar la repercusión fisiológica de estos


138

cambios, y si se traducen en una mejora de la supervivencia neonatal en este modelo experimental. En

concordancia con los efectos descritos previamente, el tratamiento prenatal con Liraglutide mejoró la

supervivencia neonatal (Figura 34). Por el contrario, la dosis de Dexametasona administrada

prenatalmente, produjo un porcentaje de supervivencia similar a la observada en neonatos con desarrollo

pulmonar retardado y que no recibieron tratamiento. El análisis de la supervivencia neonatal demostró

que el modelo experimental NTF provoca dificultades respiratorias incompatibles con la vida. En este

modelo, los efectos reparadores de Liraglutide sobre la morfología pulmonar y la síntesis de las proteínas

surfactantes mejora destacable y significativamente la supervivencia neonatal. Resultado que no pudo ser

reproducido por Dexametasona, a la dosis empleada, que se encuentra en el rango de la utilizada con

finalidad terapéutica para inducir la maduración pulmonar en humanos.

Además del retardo en el crecimiento fetal, la administración de Dexametasona durante la

gestación causa graves efectos adversos en el feto como desarrollo de hipertensión (Benedicktsson R y

cols., 1993), intolerancia a la glucosa (Barker DJ, 1993, review) o alteraciones en el desarrollo del

cerebro (Uno H y cols., 1994) y del eje hipotálamo-hipofisario adrenal (Lesage J y cols., 2001) en la vida

adulta. Por tal motivo, los resultados obtenidos tras el tratamiento con Liraglutide durante la gestación

resultan de especial interés y abren la posibilidad de incluir el sistema incretina como agente inductor, e

incluso acelerador, de la maduración del pulmón en condiciones de inmadurez pulmonar, ya sea como

complemento o incluso como alternativa al tratamiento con glucocorticoides.

El bajo peso al nacer se ha correlacionado con un incremento del riesgo de desarrollar patologías

metabólicas en la etapa postnatal (Barker DJ y cols., 1990; Hales CN y cols., 1991; Jimenez-Chillaron JC

y cols., 2005). El retardo en el crecimiento fetal puede producirse como consecuencia de deficiencias en

el aporte calórico durante la gestación. De igual forma que la prematuridad es un factor de riesgo en el

desarrollo de patologías respiratorias, el crecimiento fetal retardado por restricción calórica induce

inmadurez pulmonar en la etapa fetal (Curle DC y cols., 1978), con los consiguientes problemas

respiratorios en la etapa neonatal. Se generó un modelo animal en el que se indujo un retardo del

crecimiento fetal, mediante restricción calórica en la gestación para estudiar el grado de afectación

pulmonar. Este modelo experimental se utilizó con el fin de caracterizar los efectos de Liraglutide sobre

la maduración pulmonar en condiciones de déficit calórico.

Debido a los efectos anorexigénicos de Liraglutide, se analizó el patrón de ingesta de ratas gestantes en

respuesta a la administración del péptido (Figura 35). El seguimiento de estos animales reveló una

reducción de la ingesta de aproximadamente el 30% en los cuatro primero días del tratamiento (GD14-

GD17), perdiéndose dicho efecto en los días sucesivos (GD18-GD20) (Figura 35A). Aunque la

administración de Liraglutide, produjo una reducción parcial de la ingesta al inicio del tratamiento, esto

no afectó al crecimiento del pulmón de los fetos (E21) (Figura 39A). Es decir, la ratio entre el peso del

pulmón con respecto a peso corporal (P.P/P.C) fue similar a la del grupo control y del grupo pair-fed.


139

Además, Liraglutide no modificó los niveles de expresión de SP-A y SP-B en este caso (Figura 40). Estos

resultados son concordantes con los previamente discutidos, ya que se produce un incremento de los

niveles de mRNA de SP-A y SP-B en los pulmones de fetos correspondientes a la etapa canalicular tras la

administración de Liraglutide, pero dicho efecto se pierde en etapas posteriores de desarrollo pulmonar

(E21 y P1).

Como se ha mencionado con anterioridad, cuando el Liraglutide es administrado desde GD14 se

produce una pérdida del efecto anorexigénico a partir de GD18. Este hecho podría ser explicado por una

desensibilización de GLP-1R en respuesta a la exposición crónica a Liraglutide. Así, estudios previos

demuestran una ausencia de respuesta de GLP-1R en líneas de células ß tras una exposición prolongada a

Ex4, siendo el efecto más potente que en el caso de GLP-1. Sin embargo, la desensibilización de GLP-1R

no se ha podido observar en estudios in vivo (Baggio LL y cols., 2004). La administración de Liraglutide

a ratas gestantes desde GD18, demostró la ausencia del efecto anorexigénico de Liraglutide en este

periodo, al igual que se observó cuando el tratamiento se inició en GD14 (Figura 35B). Por tanto, no

podemos hablar de una desensibilización de GLP-1R a Liraglutide, sino que probablemente el sistema

obvia el efecto anorexigénico de este péptido, debido al alto gasto energético requerido para el desarrollo

del feto durante el último tramo de la gestación (Brunton PJ y cols., 2008).

Con el fin de excluir el efecto anorexigénico de Liraglutide en la evaluación de la maduración

pulmonar bajo condiciones de restricción calórica, el tratamiento se inició en GD18, 4 días después del

inicio de la restricción calórica del 30%. De acuerdo con estudios previos (Lin Y y cols., 1991), la

restricción calórica durante la gestación causó un menor crecimiento del pulmón en fetos con respecto a

la condición de libre acceso a la comida. Además este efecto fue más potente en el caso de fetos macho

(E21), con un 20% de reducción de la ratio P.P/P.C que en el caso de hembras que mostraron un 6.7% de

reducción la ratio (Figura 39B). Una vez más, la mayor susceptibilidad de los pulmones de fetos macho a

las acciones de los andrógenos circulantes podrían ser la explicación del mayor grado de hipoplasia

pulmonar mostrado en machos en este modelo experimental.

El grado de hipoplasia pulmonar debido a la restricción calórica desde el momento de la

gestación en el que se inicia el desarrollo pulmonar (GD14, etapa pseudoglandular) sugiere la existencia

de inmadurez de los pulmones, hecho que concuerda con otros estudios publicados (Curle DC y cols.,

1978). Los pulmones inmaduros presentan deficiencias en la diferenciación de los neumocitos tipo II

(Farrell PM y cols., 1975) que podrían dar lugar a alteraciones en la síntesis de las proteínas surfactantes.

El déficit en la síntesis de las proteínas surfactantes afectó únicamente a los niveles de expresión de SP-

A, no así a los de SP-B, que sufrió un incremento en su expresión (Figura 40). Los resultados observados

indican que el déficit calórico parece modular la acción de algún factor no identificado con efectos

opuestos sobre SP-A y SP-B.

Ya se ha mencionado anteriormente, que los glucocorticoides son un potente estímulo de la

síntesis de las proteínas surfactantes y que en general inducen la expresión de SP-A y SP-B con aumento

tanto de los niveles de mRNA como proteicos. Sin embargo, el efecto se vuelve inhibitorio sobre SP-A


140

cuando los niveles de glucocorticoides son muy altos (Boggaram V y cols., 1989), mientras que continúa

siendo positivo sobre SP-B (Liley HG y cols., 1989). La hipoglucemia relativa debida a la restricción de

la ingesta produce un incremento en los niveles de glucocorticoides fetales por reducción de la expresión

de la enzima placentaria 11ßHSD tipo 2 (Lesage J y cols., 2001). Por tanto, la acción local de los

glucocorticoides sobre las proteínas surfactantes en los pulmones de fetos podría estar incrementada

cuando se reduce la ingesta calórica. Si los niveles de glucocorticoides fueran muy altos se inhibiría la

síntesis de SP-A mientras que se estimularía la de SP-B, hecho que explicaría los resultados obtenidos.

Los fetos desarrollados bajo un déficit calórico no mostraron una mayor activación del receptor

de glucocorticoides (GR) en los pulmones, tal y como se puede apreciar en la evaluación del contenido

nuclear de GR, descartando así el incremento de la acción de los glucocorticoides sobre las SPs en este

modelo (Figura 43).

La restricción calórica conlleva otros cambios metabólicos en las ratas gestantes que pueden

repercutir en el desarrollo fetal. Así, los niveles de grelina estarían aumentados mientras que los de

insulina presentarían una reducción. Ambas hormonas tienen efectos opuestos sobre el desarrollo

pulmonar, mientras que grelina estimula la maduración del pulmón (Santos M y cols., 2006), la insulina

inhibe la síntesis de las proteínas surfactantes (Miakotina OL y cols., 1998). El incremento de grelina y la

reducción concomitante de los niveles de insulina podrían estar estimulando la síntesis de las proteínas

surfactantes a pesar de la hipoplasia pulmonar observada.

Los cambios observados en el patrón de expresión de las proteínas surfactantes no parecen ser

debidos a variaciones en los niveles de mRNA de GLP-1R ni de Nkx2.1, puesto que no se observaron

variaciones en ninguno de los dos parámetros estudiados en pulmones desarrollados bajo condiciones de

restricción calórica, en comparación con el grupo control (Figura 41 y Figura 42).

Asimismo, bajo condiciones de restricción calórica los niveles de GLP-1 se encuentran reducidos,

con niveles circulantes prácticamente indetectables (Hermann C y cols., 1995). Por tanto, la ausencia de

ligando implicaría una menor activación de GLP-1R contribuyendo a un menor grado de desarrollo del

pulmón de fetos. La administración de Liraglutide tras la restricción de la ingesta, restauró el grado de

hipoplasia pulmonar tanto en fetos macho como en hembras (Figura 39) y además provocó un acusado

aumento de la expresión de SP-B, sin producir cambios en SP-A (Figura 40) y de GLP-1R (Figura 41).

En este caso, Liraglutide actuaría incrementando el reclutamiento de receptores GLP-1R. El

reclutamiento y activación de GLP-1R podría actuar estimulando la expresión de SP-B.

Los efectos descritos de Liraglutide solo se manifestaron cuando la secreción de GLP-1 está

reducida debido a la menor ingesta de alimentos, mientras que no fueron evidentes en fetos procedentes

de ratas gestantes alimentadas ad-libitum con secreción normal de GLP-1. Esto sugiere la existencia de

algún mecanismo que evite la sobreestimulación del receptor en los pulmones de fetos en respuesta a un

exceso de su ligando.

Las acciones de Liraglutide parecen ser independientes de la acción local de los glucocorticoides.

Prueba de ello es el hecho de que la activación de su receptor (GR) en los pulmones de fetos expuestos a


141

Liraglutide y sometidos a restricción calórica durante su desarrollo, fue similar a la mostrada en los

pulmones de fetos con desarrollo normal y a la de fetos con déficit en el aporte calórico durante la

gestación (Figura 43).

Por otro lado, Liraglutide estimuló la expresión del receptor de AII (AT1-R), factor que ha sido

descrito como un inductor de la formación de los conductos respiratorios (Nogueira-Silva C y cols.,

2012) (Figura 44). No se observaron deficiencias en los niveles de expresión de AT1-R en los pulmones

de fetos con déficit de aporte calórico durante su desarrollo. Aunque las alteraciones de AT1-R no

contribuyen en el desarrollo de hipoplasia pulmonar, el incremento de su expresión por Liraglutide podría

ser una de las vías por las que el péptido estimula el desarrollo del pulmón.

Por tanto, el tratamiento prenatal con Liraglutide mejora el desarrollo pulmonar e incrementa la

expresión de SP-B, esencial para la función respiratoria, justo antes del nacimiento (E21), en fetos con

crecimiento retardado por subnutrición. Este hecho sugiere que Liraglutide podría reducir las deficiencias

respiratorias postnatales presentes en niños con bajo peso al nacer.

Papel de GLP-1 en la función pulmonar en etapa adulta. Implicación de los componentes del sistema renina-angiotensina pulmonar.

La función pulmonar en la etapa adulta puede estar disminuida como consecuencia de patologías

como la diabetes y la obesidad. La mayor parte de las complicaciones asociadas a la diabetes son

derivadas de micro- y macro-angiopatías, por lo que resulta lógico pensar que la vasculatura pulmonar se

ve igualmente afectada en función de la progresión de la patología. Sin embargo, debido a la gran reserva

vascular de este tejido, las alteraciones en la circulación pulmonar no suelen mostrar manifestaciones

clínicas. A pesar de ello, estudios previos han demostrado un incremento de la resistencia vascular en los

pulmones de animales diabéticos causada por una reducción del diámetro de los vasos sanguíneos

(Vracko R y cols., 1979) y resistencia a agentes vasodilatadores de las arterias pulmonares como

consecuencia de disfunción endotelial (Lopez-Lopez JG y cols., 2008; Gurney AM y cols., 2009). La

resistencia vascular pulmonar aumentada de manera persistente deriva en la sobrecarga del ventrículo

derecho para compensar el flujo sanguíneo de la circulación pulmonar y mantener la correcta

oxigenación de la sangre. La diabetes se ha relacionado con el desarrollo de este tipo de complicaciones

cardiovasculares, tal y como muestran estudios con animales resistentes a insulina, que desarrollan

hipertrofia del ventrículo derecho e hipertensión pulmonar (Hansmann G y cols., 2007).

El ventrículo derecho hipertrofiado se caracteriza por una mayor producción del péptido

vasodilatador BNP (B-Natriuretic Peptide) que es sintetizado por los cardiomiocitos de los ventrículos.

La forma biológicamente activa de 32 aminoácidos (BNP-32) se obtiene por proteólisis de un precursor

de 132 aa. El aumento de producción de este péptido se emplea como marcador de fallo cardiaco

(Mukoyama M y cols., 1991). Asimismo, los niveles de BNP-32 se encuentran elevados en pacientes con

hipertensión pulmonar, indicando una hipertrofia ventricular derecha (Ishii J y cols., 2000; Nagaya N y

cols., 2000). La secreción de este péptido ocurre en respuesta a la sobrecarga ventricular y muestra


142

efectos compensatorios puesto que inhibe la proliferación de los fibroblastos cardiacos (Cao L y cols.,

1995).

En un modelo animal de diabetes tipo 1 inducido por STZ se evaluó el grado de hipertrofia

ventricular derecha así como los niveles de BNP-32 en el ventrículo derecho. La progresión de la diabetes

produjo sobrecarga del ventrículo derecho, ya que la ratio de los pesos del ventrículo derecho con

respecto al ventrículo izquierdo, incluyendo el septum, se incrementó con respecto a los animales no

diabéticos (Figura 47B). Además, los niveles de BNP-32 se encontraron elevados (Figura 48), indicando

hipertrofia del ventrículo y fallo cardiaco progresivo (Ishii J y cols., 2000; Mukoyama M y cols., 1991).

Ambos parámetros sugieren un incremento de la resistencia de la vasculatura pulmonar.

En el presente estudio, Liraglutide mostró efectos protectores frente a la sobrecarga ventricular ya

que revirtió las acciones deletéreas ocasionadas por la diabetes inducida por STZ en ratas adultas. Por

otro lado, la administración de Liraglutide a animales no diabéticos no alteró la ratio entre los pesos de

los ventrículos, ni los niveles de BNP-32, preservando la función cardiaca normal. Lo que resulta más

interesante es el hecho de que dichos efectos cardioprotectores son independientes del control de la

homeostasis de la glucosa, ya que este modelo experimental de diabetes mellitus tipo 1 no recuperó los

niveles basales de glucemia en respuesta a Liraglutide, puesto que carece de insulina (Figura 46B).

El tratamiento con Liraglutide puede actuar de forma directa sobre los cardiomiocitos o bien

sobre la circulación pulmonar. Se ha demostrado el efecto cardioprotector de Liraglutide en un modelo

animal de fallo cardiaco (Noyan-Ashraf y cols., 2009b), así como en células endoteliales donde el

Liraglutide regula la síntesis de agentes vasoactivos (Dai Y y cols., 2013). En las arterias induce

relajación vascular de forma independiente al endotelio (Kim M y cols., 2013). Además, Liraglutide

previene la adhesión celular y la acumulación de fibrinógeno en el endotelio en respuesta a la

hiperglucemia (Shiraki A y cols., 2012). En conjunto, todo indica que el Liraglutide mejora la función

vascular y previene el desarrollo de cardiopatías.

Por ello, se evaluaron las posibles alteraciones en la circulación pulmonar tras la progresión del cuadro

diabético, así como los posibles efectos preventivos de Liraglutide. En los procesos de regulación de la

circulación pulmonar tienen especial protagonismo los componentes del sistema renina-angiotensina.

Este sistema incluye componentes vasoconstrictores (ACE/AII/AT1-R) pero también vasodilatadores

(ACE2/A(1-7)/Mas-R o bien ACE/AII/AT2-R), en ambos cabos muy efectivos para modular los flujos

sanguíneos regionales en el territorio pulmonar. Además este conjunto de moléculas tienen enorme

relevancia en los procesos fisiopatogénicos que se relacionan con la disfunción endotelial, el

desequilibrio vasomotor hacia la vasoconstricción e hipertensión pulmonar, y la hipertrofia ventricular

derecha (Orfanos SE y cols., 2000; Mehta PK y cols., 2007, review).

En el modelo de diabetes experimental tipo 1 se observó que los niveles de expresión de ACE no

presentaban modificaciones, siendo éstos similares a los niveles de expresión basales, sin embargo, se

observó una reducción en la expresión de ACE2 (Figura 49). El desequilibrio entre ACE2:ACE

manifestado en los pulmones de los animales diabéticos sugiere una menor síntesis local de A(1-7) por


143

reducción de la enzima que la sintetiza (ACE2) y por tanto, una mayor acumulación de AII en los

pulmones de ratas diabéticas. Además, A(1-7) tiene efecto antagónico competitivo sobre AT1-R

(Gironacci MM y cols., 1999; Zhu Z y cols., 2002), principal receptor implicado en los procesos de

vasoconstricción pulmonar al que se une AII, por lo que la reducción de A(1-7) todavía contribuiría a

promover las acciones vasoconstrictoras de AII. Resultados similares en estudios en ratas diabéticas

muestran un incremento de la síntesis de AII en riñón (Zimpelmann J y cols., 2000), hecho que se

relaciona con la hiperglucemia (Zhang SL y cols., 1999).

En nuestro modelo, el análisis de los niveles de expresión de los receptores de AII, AT1-R y

AT2-R, reveló que la progresión de la diabetes reduce los niveles de mRNA de ambos receptores (Figura

50). Consecuentemente, la ratio AT2-R/AT1-R de los animales diabéticos fue similar a la del grupo

control.

Estudios publicados previamente han determinado que el incremento agudo de AII estimula la

expresión de AT1-R, mientras que la exposición crónica la reduce (Lassègue B y cols., 1995; Mehta PK y

cols., 2007, review). Ratas con diabetes inducida por administración de STZ muestran una reducción de

la expresión de AT2-R en el tejido renal asociado a la hiperglucemia (Wehbi GJ y cols., 2001). Además

la expresión de AT2-R se reduce por la activación de AT1-R (Saito M y cols., 2008) y glucocorticoides

(Kijima K y cols., 1995).

Teniendo en cuenta la regulación de los receptores por AII y los resultados obtenidos, la

progresión de la diabetes redujo la expresión de AT1-R en el pulmón lo que podría deberse a una

exposición crónica a altos niveles de AII. Las altas concentraciones de AII en el pulmón podrían haber

incrementado la expresión de AT1-R al inicio de la progresión de la diabetes, lo que produciría una

reducción de la expresión de AT2-R. Mientras que la exposición prolongada de AII a lo largo del proceso

diabético, finalmente produciría una reducción de la expresión de AT1-R como mecanismo

compensatorio. Nuestros resultados están en concordancia con otros publicados, en los que se han

observado cambios en el patrón de expresión de los componentes del sistema renina-angiotensia en

función del estado de progresión de la diabetes (Ocaranza MP y cols., 2006). Otros factores, como los

glucocorticoides, podrían también contribuir en este proceso. Se ha observado que los glucocorticoides

reducen la expresión de AT2-R, por lo que los altos niveles circulantes de glucocorticoides presentes en

ratas diabéticas (Figura 54) podrían ser también la causa de la reducción de los niveles de expresión de

mRNA de AT2-R (Kijima K y cols., 1995; Saito M y cols., 2008).

El descubrimiento de componentes facilitadores de la vasodilatación dentro del sistema renina-

angiotensina, como ACE2 y el metabolito que sintetiza, A(1-7), ha suscitado enorme interés en las

últimas décadas. Esto es debido al potencial uso de estos componentes como agentes terapéuticos en

diversas complicaciones cardiovasculares (Ferreira AJ y cols., 2012, review), y en concreto en la

hipertensión pulmonar (Ferreira AJ y cols., 2009). Por ello, trabajos recientes en este campo se han

enfocado hacia el estudio de nuevos fármacos capaces de potenciar las acciones de A(1-7) y así mantener

el equilibrio local del sistema renina-angiotensina en patologías cardiopulmonares, evitando la deriva


144

hacia la vasoconstricción. Hay que recordar en este punto, que los procesos vasomotores en el pulmón

corren en sentido contrario a lo que ocurre en otros tejidos. Y así, mientras en el resto de tejidos orgánicos

la hipoxia tisular relativa es el más potente estímulo vasodilatador, en el territorio pulmonar la hipoxia

induce vasoconstricción muy intensa, como mecanismo que permite mantener los ratios ventilación-

perfusión en los valores homeostáticos fisiológicos. Es decir, aquellas zonas menos ventiladas (menor

presión parcial de O2 local) serán menos perfundidas, por vasoconstricción local intensa.

Podría decirse que Liraglutide presenta efectos preventivos del deterioro de la función cardiaca

derecha, en parte debido a su papel restaurador de la ratio entre ACE2:ACE, lo que reduciría los

desequilibrios vasculares en el pulmón. En este sentido, estudios previos han evidenciado las propiedades

cardioprotectoras de ACE2 y A(1-7) porque previenen el desarrollo de hipertrofia cardiaca (Huentelman

MJ y cols., 2005).

En nuestro estudio, Liraglutide incrementó los niveles de mRNA de las enzimas ACE y ACE2,

recuperando el equilibrio entre ambas a medida que progresaba la diabetes, tal y como muestran los

cambios de la ratio de expresión relativa, sin perturbar el equilibrio de la expresión entre las enzimas en

animales no diabéticos (Figura 49B).

En relación a los niveles de expresión de los receptores de AII, Liraglutide incrementó los niveles

de mRNA de AT1-R pero no causó efectos sobre los niveles de expresión de AT2-R (Figura 50A).

Consecuentemente, y a pesar de que Liraglutide recuperó los niveles de expresión de AT1-R en animales

diabéticos, éstos fueron superiores a los niveles de mRNA de AT2-R, en respuesta al tratamiento ya que

la expresión de AT2-R permaneció reducida. Si bien es cierto, el papel de AT2-R en la etapa adulta es

limitado y parece ser más importante en el desarrollo fetal (Shanmugam S y cols., 1996). En adultos AT2-

R se ha localizado en células epiteliales de la región bronquial, en las glándulas mucosas y de forma poco

frecuente en las células endoteliales (Bullock GR y cols., 2001). Existe cierta controversia sobre los

efectos desencadenados por AT2-R. A pesar de que sus efectos anti-fibróticos, anti-proliferativos y pro-

apoptóticos son ampliamente conocidos, algunos estudios demuestran que su activación induce los

mismos efectos que los descritos para AT1-R. Levy B y colaboradores (Levy B. y cols., 1996)

demostraron que el bloqueo de AT2-R previene la hipertrofia vascular en un modelo animal de

hipertensión inducida por AII, hecho que no ocurre cuando se bloquea AT1-R .

En base a su localización, es probable que las acciones de AII por medio de AT2-R sean

independientes de los cambios vasculares relacionados con la progresión de la diabetes. En este sentido,

la reducción de su expresión podría estar en la base de fenómenos de hiperplasia del epitelio bronquial

que no serían modulados por Liraglutide, puesto que no afecta la expresión de AT2-R.

En resumen (Figura 57), el modelo de diabetes experimental tipo 1 por administración de STZ

sufrió una acumulación de AII en el pulmón y una menor síntesis de A(1-7), potenciando las acciones de

AII y reduciendo las de A(1-7). Consecuentemente se produciría una deriva hacia la vasoconstricción

local, con aumento de la resistencia vascular pulmonar e incremento de la presión sanguínea, y


145

consecuentemente hipertrofia ventricular derecha compensadora. Además, también localmente se podría

producir aumento de la proliferación celular, acumulación de los componentes de la matriz extracelular

intersticial y daño de la función endotelial vascular pulmonar (Giacchetti G y cols., 2005, review;

Watanabe T y cols., 2005, review). A pesar de no observarse un desequilibrio entre AT2-R y AT1-R, la

expresión de ambos receptores se redujo tras tratamiento con Liraglutide y no puede descartarse la

posibilidad de que la expresión de AT1-R al inicio del establecimiento del cuadro diabético se encontrase

incrementada.

El tratamiento con Liraglutide previno las alteraciones de las enzimas de síntesis de AII (ACE) y

A(1-7) (ACE2) en nuestro estudio, por lo que cabría pensar que sus niveles locales permanecieron dentro

de la normalidad. Hecho concordante con la reversión de la hipertrofia ventricular inducida por

Liraglutide. Por otro lado, Liraglutide no fue capaz de restaurar la expresión de AT2-R en animales

diabéticos, aunque sí los de AT1-R. Considerando que AT2-R parece tener más relevancia en el

desarrollo fetal, sería interesante determinar si Liraglutide tiene efectos sobre el descrito como receptor

específico para A(1-7), Mas-R, como hecho complementario a la capacidad de Liraglutide de restaurar la

síntesis de A(1-7) por aumento de la expresión de ACE2.

Por otro lado, la administración de Liraglutide no alteró el equilibrio entre ACE2 y ACE cuando

es administrado a animales no diabéticos y aunque incrementó la expresión de AT1-R frente a AT2-R,

esto no parece tener consecuencias en los procesos estudiados.

Figura_57: Esquema representativo del efecto local de Liraglutide en el pulmón sobre el balance del sistema

renina-angiotensina en un modelo patológico de diabetes tipo 1.

El mecanismo por el que se produce la alteración del balance entre los componentes del sistema

renina-angiotensina en el modelo experimental de diabetes tipo 1 por administración de STZ no se

conoce, aunque podría ser la respuesta a una situación de hipoxia local relativa. Así el incremento de la

acumulación de colágeno en el tejido pulmonar en respuesta a la hiperglucemia disminuye la luz de los

AT2-RAT1-R

Mas-R

AngII

AngI

Angiotensinógeno

ACE ACE2

Ang (1-7)

Vasoconstricción.Proliferación.

Vasodilatación.Apoptosis.

-

--

+ +

+

STZ+VEH

AngIIAng (1-7)

STZ+LIR

AngII Ang (1-7)

¿?


146

alveolos e incrementa el grosor de la membrana respiratoria alveolo-capilar, reduciendo la velocidad de

intercambio gaseoso (Kida K y cols., 1983; Ofulue AF y cols., 1988; Vracko R y cols., 1979) según la ley

de Fick. De ser así, en nuestro modelo la oxigenación de la sangre no estaría ocurriendo de forma eficaz,

lo que se compensaría reduciendo la perfusión de las regiones menos oxigenadas por vasoconstricción.

Aunque la relación entre AII e hipoxia no se ha estudiado en profundidad, sí existen algunos estudios que

evidencian el incremento de la secreción de AII en respuesta a hipoxemia (McMurtry IF, 1984; Alexander

JM y cols., 1974; Cargill RI y cols., 1994). La administración de Liraglutide, en nuestro modelo, recuperó

el balance del sistema renina-angiotensina de forma independiente al control de la glucosa, efecto que

puede ser consecuencia de la mejora de la función endotelial o bien de la recuperación de la estructura

alveolar. Los resultados obtenidos en la primera parte de este trabajo en animales con hipoplasia

pulmonar por NTF, que recuperan parcialmente la estructura morfo-funcional pulmonar, apunta hacia la

segunda posibilidad (Figura 31).

Considerando los efectos previamente descritos de Liraglutide en la producción del surfactante

pulmonar en el desarrollo fetal y la importancia del surfactante en la estabilidad alveolar, nos propusimos

evaluar los efectos del tratamiento en la síntesis de las principales proteínas surfactantes, SP-A y SP-B en

el modelo de diabetes experimental por STZ (Figura 51). El análisis de los niveles de expresión de SP-A

y SP-B en los pulmones de las ratas diabéticas reveló deficiencias en los niveles de mRNA de SP-A y SP-

B pero no en los niveles proteicos. Dichas deficiencias fueron recuperadas por Liraglutide.

Investigaciones previas describen alteraciones morfológicas de los neumocitos tipo II (Plopper

CG y cols., 1978) y de la síntesis y secreción de PC en animales diabéticos (Uhal BD y cols., 1986;

Brown LA y cols., 1986) debido a disminución de la actividad de la adenilato ciclasa (Brown LA y cols.,

1991). Considerando que el AMPc incrementa la expresión de SP-A y SP-B, estas alteraciones podrían

influir de igual forma en los niveles de mRNA de ambas proteínas. La activación de GLP-1R supone en

todos los tipos celulares estudiados anteriormente la activación de la adenilato ciclasa, por lo que

Liraglutide podría estar incrementando los niveles intracelulares de AMPc o recuperando la actividad de

la AC en el neumocito tipo II, y por tanto, restaurando la expresión de SP-A y SP-B. Igualmente, podría

estar influyendo en la actividad de Nkx2.1 sobre la región promotora de estas proteínas, ya que según

nuestros datos, parece que Liraglutide incrementa los niveles de mRNA de Nkx2.1 en ratas diabéticas

mientras que las no tratadas mantuvieron niveles reducidos (Figura 53).

Los altos niveles circulantes de corticosterona en ratas diabéticas podrían estar contribuyendo

junto con el Liraglutide en la restauración del patrón de expresión de SP-A y SP-B en un modelo de

diabetes (Figura 54). Así, la diabetes se asocia con una alteración del eje hipotálamo-hipofisario adrenal

(Chan O y cols., 2003) como consecuencia de la reducción de la sensibilidad al feedback negativo por

glucocorticoides (Chan O y cols., 2002) y de la desregulación de la su secreción por las glándulas

adrenales (Repetto EM y cols., 2010). En concordancia con estos estudios, nuestros resultados mostraron

un incremento de los niveles de corticosterona tras 2 y 6 días de la administración de STZ, aunque dichos


147

niveles se normalizaron 8 días después de la inducción de la diabetes. Como se ha mencionado con

anterioridad, los glucocorticoides son un potente estímulo de la síntesis de los componentes surfactantes

tanto lipídicos como proteicos, por lo que el incremento observado de los niveles circulantes podría estar

regulando la expresión de SP-A y SP-B. Sin embargo, el aumento de los glucocorticoides circulantes no

implica un mayor efecto de los mismos en el pulmón, por lo que sería necesaria la evaluación de sus

acciones locales. Además, si los glucocorticoides fueran los responsables de la restauración de los niveles

de proteínas del surfactante en la diabetes mellitus, los animales no tratados no deberían presentar

cambios en los niveles de SPA y SPB respecto a los animales no diabéticos, y tampoco Liraglutide

tendrían los efectos descritos.

En su conjunto, los resultados aquí mostrados revelan las acciones reparadoras de Liraglutide en

las disfunciones cardiopulmonares sufridas en la diabetes tipo 1 así como las alteraciones del patrón de

expresión de las proteínas surfactantes.

Al igual que la diabetes, la obesidad reduce la capacidad pulmonar. Se han descrito numerosas

alteraciones morfológicas en los pulmones de individuos obesos debidas al incremento de la acumulación

de grasa en este tejido. Estas alteraciones causan un engrosamiento de los capilares, lo que puede derivar

en enfermedades cardiopulmonares, y una acumulación de colágeno en el tejido parenquimatoso (Foster

DJ y cols., 2010), que modifica los procesos de difusión alveolo-capilar de los gases respiratorios. La

lipotoxicidad debida a la obesidad se relaciona con daños en la función pulmonar, de igual forma que lo

hace la hiperglucemia en la diabetes.

La evaluación de las proteínas surfactantes SP-A y SP-B en los pulmones de ratas obesas (fa/fa)

demostró que la síntesis de dichas proteínas se encuentra incrementada con respecto a ratas fa/+ (Figura

55). Los altos niveles circulantes o locales de leptina de los animales obesos frente a los no obesos (fa/+)

podría estar estimulando la expresión de las principales proteínas del surfactante (SP-A y SP-B) tal y

como demuestran estudios previos (Kirwin SM y cols., 2006). En pulmón se ha determinado la presencia

de al menos dos tipos del receptor de la leptina, el receptor Ob-Rb y Ob-Ra (Kirwin SM y cols., 2006).

Considerando que este modelo de obesidad presenta una mutación en Ob-Rb, la leptina podría estar

estimulando la expresión de las SPs a través de Ob-Rba. Además encontramos que en los animales obesos

(fa/fa) se produce un gran incremento de la expresión en los niveles proteicos de GLP-1R en el pulmón

(Figura 56), lo que se correlaciona con el aumento de proteínas surfactantes. La mayor activación de

GLP-1R en el pulmón podría también ser responsable de la sobreestimulación de la expresión de las SPs.

En este modelo de obesidad genética es necesario desarrollar investigaciones complementarias para

analizar con más detalle las causas implicadas en el desequilibrio del sistema surfactante, pero nuestros

resultados indican que leptina podría mejorar la función pulmonar y la expresión de proteínas del

surfactante induciendo un aumento local en la expresión del receptor de GLP-1R, a través de un receptor

distinto de Ob-Rb. Que algunos de los efectos de leptina puedan ser mediados por GLP-1 no es una


148

hipótesis nueva, y ya Goldstone y colbs. describieron que el efecto anorexigénico de leptina podría ser

ejercido a nivel hipotalámico a través de neuronas secretoras de GLP-1 (Goldstone AP y cols., 1997).

Esta es una hipótesis de enorme interés que merece ser explorada en futuros estudios.

Considerando que GLP-1 se secreta en respuesta a la ingesta de alimentos (Roberge JN y cols.,

1991), parece poco probable que los efectos sobre la función respiratoria aquí descritos sean dependientes

de sus niveles fisiológicos postprandiales, aunque esta hipótesis no puede ser completamente descartada.

Además, futuros estudios deberían abordar la posible síntesis local de GLP-1 en el tejido pulmonar, tanto

en la etapa adulta como en la fetal, permitiendo ampliar el conocimiento de las acciones del sistema

incretina en el pulmón.

6. CONCLUSIONES.

6. Con]lusion_s.6. Con]lusion_s.6. Con]lusion_s.6. Con]lusion_s.

151

Nuestros resultados permiten concluir que:

1. La administración prenatal de los agonistas de GLP-1R, Liraglutide y Ex4 modulan la síntesis de

las principales proteínas surfactantes (SP-A y SP-B) en el pulmón de forma independiente a su

efecto estimulador sobre el eje Hipotálamo-hipofisario adrenal y por un mecanismo que podría

implicar la mayor activación del factor de transcripción Nkx2.1.

2. Liraglutide y Ex4 recuperan las deficiencias en la síntesis de SP-A y SP-B en un modelo de

hipoplasia pulmonar inducida por NTF durante la etapa fetal, así como la estructura de los

alveolos. Liraglutide es capaz de revertir el crecimiento pulmonar retardado en este modelo de

forma más potente que Dexametasona. Los efectos reparadores de Liraglutide se traducen en un

incremento de la supervivencia neonatal.

3. El tratamiento prenatal con Liraglutide recupera la hipoplasia pulmonar de fetos con crecimiento

retardado debido a subnutrición durante la gestación aunque no restaura los niveles basales de

expresión de SP-A sí incrementa los de SP-B.

4. La administración de Liraglutide tras la progresión de la diabetes tipo 1 en etapa adulta recupera

las deficiencias en los niveles de expresión de SP-A y SP-B mostradas en este modelo y previene

la hipertrofia ventricular derecha mediante la recuperación del balance entre las enzimas

conversoras de angiotensina, ACE y ACE2, en el pulmón.

5. Existen alteraciones en la composición del surfactante pulmonar en un modelo animal de

obesidad que pueden estar relacionadas con modificaciones de la expresión de GLP-1R.

7. BIBLIOGR@FÍ@.

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5α-DHT: 5α-dehydrotestosterone.

A(1-7): angiotensina (1-7).

Aa: aminoácidos.

ABC: ATP binding cassette transporter

AC: adenylate cyclase.

ACE: angiotensin coverting enzyme.

ACE2: angiotensin coverting enzyme 2.

AI: angiotensina I.

AII: angiotensina II.

Akt: proteín kinase B.

AMPc: cyclic adenosine monophosphate.

AMPK: 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase.

ANP: atrial natriuretic peptide.

ARC: arcuate nucleus.

ARDSacute respiratory distress syndrome.

AT1-R: angitensin type 1 receptor.

AT2-R: angitensin type 2 receptor.

ATP: adenosine triphosphosphate.

BNP-32: B-type natriuretic peptide-32.

CCSP: Clara cell secretory protein.

cDNA: complementary deoxyribonucleic acid.

COS: cell line derived from CV-1 cell line.

CRE: cAMP response element.

CREB: cAMP response element binding protein.

Ct: threshold cycle.

CV: coeficiente de variación.

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole.

DEX: dexametasona.

DHT: dehydrotestosterone.

DMEM: Dubelco´s modified eagle´s medium.

dNTPs: deoxinucleotide triphosphate.

DO: densidad óptica.

DPPC : dipalmitoylphosphatidylcholine.

DPPIV: dipeptidyl peptidase IV.

DTT: ditiotreitol.

E: embrionyc day.

ED: effective dose.

EGF: epidermal growth factor.

EGF-R: epidermal growth factor receptor.

EMSA: electrophoretic mobility assay.

ENaC: epithelial sodium channel.

eNOS: endothelial nitric oxide synthase..

Ex(9-39): exendin (9-39).

Ex4: exendin-4.

FBS: fetal bovine serum.

FRET: fluorescence resonance energy transfer.

GD: gestational day.

GIP: glucose dependent insulinotropic peptide.

GLP-1: glucagon like peptide-1.

GLP-1R: glucagon like peptide-1 receptor.

GLP-2: glucagon like peptide-2.

GLUT-2: glucose transporter-2.

GR: glucocorticoid recepetor

GRE: glucocorticoid response element.

GRP: gastrin releasing peptide.

GRPP glicentin related pancreatic polypeptide.

GSK3ß: Glycogen synthase kinase 3.

H&E: hematoxilina-eosina.

HCAECs: human coronary arterial endothelial cells.

HNF-3ß/Foxa-2: factor nuclear de hepatocitos -3ß.


194

HO-1: heme-oxygenase 1.

HPA: Hypothalamic pituitary adrenal axis.

HSD: hydroxysteroid dehydrogenase.

HRP: horseradish peroxidase.

HUVECs: Human umbilical vein endothelial cells.

i.c.v: intracerebroventricular.

INS-1: línea celular β .

i.g.: intrasgástrico.

i.p: intraperitoneal.

IUGR: intrauterine growth restriction.

LBs: lamellar bodies.

LH: luteinizing hormone.

LIR: liraglutide.

MAPK:mitogen-activated protein kinase.

Mas-R: receptor de angiotensina (1-7).

M-MLV: Moloney Murine Leukemia Virus Reverse.Transcriotase.

MPF: major proglucagon fragment.

mRNA: messenger ribonucleic acid.

NEBs: neuroendocrine bodies).

NFk-B: nuclear factor kappa-B.

Nrf-2: Nuclear factor erythroid 2.

NTF: nitrofen.

NTS: nucleus of the solitary tract.

Ob-Rb : receptor de leptina.

pb: base pair.

P.C: peso corporal.

P.P: peso del pulmón.

P: postnatal day.

PAI-1: plasminogen activator inhibitor-1.

PC: phosphatidylcholine.

PC: prohormone convertase.

P.C: peso corporal.

PNEC: pulmonary neuroendocrine cells.

Pdx-1: pancreatic and duodenal homeobox 1.

P-F: pair-fed.

PI3K: phosphatidylinositol 3 kinase.

PKA: protein kinase A.

PKC: protein kinase C.

PLC: phospholipase C.

PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo.

P.P: peso del pulmón.

PPARß: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor β.

PVDF: polyvinylidene difluoride.

PVN: paraventricular nucleus.

RC: restricción calórica.

RDS: repsiratory distress syndrome.

RIPA: radio immunoprecipitation assay buffer.

RNA: Ribonucleic acid.

RNasa: ribonucleasa.

ROS: Reactive oxigen species.

s.c: subcutáneo.

SDS: sodium dodecyl sulfate.

SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel .

SP-A: surfactant protein A.

SP-B: surfactant protein B.

SP-C: surfactant protein C.

SP-D: surfactant protein D.

SPs: surfactant proteins.


195

STZ: estreptozotocina.

TBE: TTF-1 binding element.

TBP: TATA binding protein.

TGF-ß1: transforming growth factor ß1.

TGF-ß-R: transforming growth factor ß1 receptor.

TNT: sistema de lisado de reticulocitos.

TSH: thyroid stimulating hormone.

TTF-1/Nkx2.1: thyroid trasncription factor 1 o NK2 homeobox 1.

UI: international unit.

VCAM-1: vascular cell adhesión molecule-1.

VEH: vehiculo.

W: diestro.

ZDF: Zucker diabetic fatty rats.

CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS DE GLP-1 Y SUS … · pulmonar durante la etapa fetal, neonatal y...

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