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INTRODUCCIÓN

Desde finales de la década 1981-1990 se havenido investigando a propósito del desarrollode técnicas de cultivo de nuevas especies con el

objetivo de diversificar los cultivos marinos tradi-cionales, como los de dorada Sparus aurata L.,1758, lubina Dicentrarchus labrax (L., 1758) orodaballo Psetta maxima (L., 1758). El lenguadosenegalés Solea senegalensis Kaup, 1858 es una de

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Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 21 (1-4). 2005: 95-104 BOLETÍN. INSTITUTO ESPAÑOL DE OCEANOGRAFÍAISSN: 0074-0195

© Instituto Español de Oceanografía, 2005

Caracterización de las proteasas digestivasdel lenguado senegalés Solea senegalensisKaup, 1858

M. Sáenz de Rodrigáñez 1, F. J. Alarcón 1, M. I. Martínez 2, F. Ruiz 2,M. Díaz 1 y F. J. Moyano 1

1 Departamento de Biología Aplicada. CITE II-B. Universidad de Almería. Carretera Sacramento, s/n.E-04120 La Cañada de San Urbano (Almería), España. Correo electrónico: [email protected]

2 Predomar, S.L. Carretera Faro Mesa Roldán, s/n. E-04140 Carboneras (Almería), España.

Recibido en octubre de 2005. Aceptado en noviembre de 2005.

RESUMEN

Se caracterizan las proteasas digestivas de Solea senegalensis Kaup, 1858. El óptimo de actividadpara el extracto estomacal se situó en valores de pH entre 2,0 y 2,5 y para los intestinales entre pH:9,5y pH:10,0. El extracto de estómago se mostró muy estable a distintos valores de pH, excepto apH:12,0. Los extractos intestinales mostraron ser inestables a pH ácido. Los óptimos de temperatu-ra se localizaron entre 37 y 40 oC. Las proteasas fueron termolábiles por encima de 50 oC. El uso desustratos e inhibidores específicos evidenció la presencia mayoritaria de pepsina en el estómago y deserina proteasas de tipo tripsina y quimotripsina en el intestino. Los zimogramas confirmaron la exis-tencia de una sola proteasa en el extracto de estómago y de siete fracciones activas en el intestino.

Palabras clave: Proteasas digestivas, tripsina, quimotripsina, inhibidores de proteasas, zimo-gramas, lenguado senegalés.

ABSTRACT

Characterization of digestive proteases in the Senegal sole Solea senegalensis Kaup, 1858

The digestive proteases of Senegal sole Solea senegalensis Kaup, 1858 were studied. Acid proteases sho-wed their peak of activity between pH:2.0 and pH:2.5. Optimum activity for intestinal proteases was foundin the range of pH:9.5-10.0. The results of acid protease stability under different pH indicated that only pH12.0 affect these enzymes. Alkaline proteases were highly sensitive to acidic pH. Temperature optimums werefound at 37-40 oC. Thermal stability analysis showed that proteases kept up their activities until 50 oC. Theuse of specific proteases inhibitors showed the presence of aspartic proteases in stomach and serine proteases(trypsin and chymotrypsin-like) in the intestine. Zymograms confirm the existence of a single protease in sto-mach extract, and seven active fractions in the intestine extracts.

Keywords: Digestive proteases, trypsin, chymotrypsin, protease inhibitors, zymograms, Senegal sole.

las denominadas nuevas especies que ha desper-tado el interés del sector acuícola en los últimosaños (Dinis et al., 1999). Su valor comercial esconsiderable, la tasa de crecimiento elevada yvarias empresas están comenzando a acometer suengorde a escala industrial; por todo ello se le haconsiderado como un posible candidato parasustituir el exceso de producción de dorada quehay en Europa. Además de presentar las ventajasenumeradas, es bastante tolerante a distintascondiciones ambientales de cultivo (oxígeno,salinidad, temperatura, etc.). No obstante, aún esnecesario mejorar varios aspectos relacionadoscon el destete y las condiciones del preengorde(Ribeiro et al., 2002), ya que estos dos factoreslimitan el desarrollo de su cultivo a una escalasimilar a la que ya existe para el rodaballo. Entrelas distintas facetas de estudio que es necesarioabordar, la nutrición es un aspecto cuya evalua-ción es obligada de cara al cultivo de cualquierorganismo, lo que significa establecer sus reque-rimientos nutritivos y sus capacidades digestivas yde transformación de los alimentos. Además, sesabe que las características de las enzimas pre-sentes en el aparato digestivo son un reflejo delhábito alimentario de cada especie (Jonas et al.,1983). El conocimiento generado a través de estetipo de estudios tiene una aplicación directa enla fase de destete de esta especie, ya que, utili-zando como referencia el patrón de los indivi-duos juveniles, se podrá determinar en qué

momento el equipo de proteasas digestivas de laslarvas está plenamente desarrollado. Dentro deeste contexto, el presente trabajo pretende apor-tar conocimiento sobre las capacidades digestivasde los juveniles de lenguado senegalés, en parti-cular de las proteasas, enzimas responsables de lahidrólisis de la proteína alimentaria.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los ejemplares de S. senegalensis, de 40 g depeso, fueron proporcionados por la empresaPredomar S.L. (en Carboneras, Almería, sures-te de la península Ibérica). Los peces fueronalimentados dos veces al día, desde el destetehasta el momento de su sacrificio, con piensocomercial Gemma (55 % proteína y 12 % lípi-dos) (Skretting, España). Los animales fueronsacrificados en baño de hielo e inmediatamen-te disecados con objeto de extraer su sistemadigestivo. En el tracto digestivo se diferencia-ron las siguientes regiones; estómago (E), intes-tino proximal (I-1) e intestino distal (I-2). Elcriterio de separación entre las distintas regio-nes digestivas se basó en las diferencias histoló-gicas que existían entre ellas (estudios previos)con el objetivo de comprobar si estas diferen-cias reflejaban cambios en las características delas proteasas que actúan en cada porción deldigestivo (figura 1).

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M. Sáenz de Rodrigáñez et al. Proteasas digestivas de Solea senegalensis

Figura 1. Sistema digestivo de S. senegalensis e histología de las tres secciones estudiadas. (E): estómago; (I-1):intestino proximal; (I-2): intestino distal.

La longitud intestinal relativa (LIR) es uníndice que relaciona la longitud del intestinorespecto a la longitud total del pez y que se utili-za como indicador del hábito alimentario delpez. Para la determinación del índice LIR seanalizaron 50 individuos al azar y se calculó elvalor medio de este índice. Los extractos enzi-máticos fueron preparados tras homogeneizarlas porciones digestivas en agua y centrifugar a12 500 G a 4 oC durante 15 min. El sobrenadan-te se almacenó a –20 oC hasta su posterior uso(Moyano et al., 1996). La concentración de pro-teína soluble en los extractos se determinó porel método de Bradford usando albúmina bovina(1 mg/ml) como estándar (Bradford, 1976). Laactividad proteasa ácida se determinó mediantela técnica de Anson (1938) modificada, utilizan-do como sustrato hemoglobina al 0,5 %. La acti-vidad proteasa alcalina se evaluó usando el méto-do de Kunitz (1947), modificado por Walter(1984), usando caseína como sustrato (0,5 %)en tampón Tris-HCl 50 mM pH:9,0. En amboscasos, la mezcla de reacción (20 µl de enzima y500 µl de sustrato) se incubó durante 45 minutosa 25 oC y la reacción enzimática se detuvo tras laadición de 500 μl de ácido tricloroacético al 20 %.La liberación de péptidos se cuantificó deter-minando a 280 nm la absorbancia del sobrena-dante. También se determinó en los extractosintestinales, I-1 e I-2, la actividad tripsina usandocomo sustrato BAPNA (Nα-benzoil-DL-arginina-P-nitroanilida) según el método de Erlanger,Kokowsky y Cohen (1961) y la actividad quimo-tripsina con SAPNA (succinil-(Ala)2-Pro-Phe-p-nitroanilida) según la metodología descrita porÁsgeirsson y Bjarnason (1991).

En los tres extractos preparados se determinóel nivel de actividad proteolítica, el óptimo depH y temperatura y la estabilidad de las protea-sas a diferentes valores de pH y distintas tempe-raturas. Para determinar el efecto del pH sobrela actividad proteasa se empleó tampón univer-sal (Stauffer, 1989) en el rango de pH de 1,0 a7,0 para los extractos de estómago y pH de 5,0 a12,0 para los extractos intestinales. La estabili-dad al pH de la actividad proteasa en los prepa-rados enzimáticos se determinó preincubandolos extractos enzimáticos a distintos valores depH, desde 2,0 hasta 12,0, durante 120 min antesde realizar el ensayo de actividad proteasa. A

continuación se determinó la actividad residualy se comparó con un control preincubado conagua destilada. La actividad residual se expresóen porcentaje de actividad con respecto al con-trol. La temperatura óptima de las proteasas deestómago e intestino se determinó en el rangode temperatura de 5 oC a 70 oC. Para determinarla termoestabilidad de las proteasas se incuba-ron los extractos enzimáticos a diferentes tem-peraturas durante 120 min y, seguidamente, sedeterminó la actividad residual con respecto aun control mantenido a 25 oC.

Para evaluar el tipo de proteasas presentes encada extracto se utilizó la batería de inhibidoresde proteasas que usualmente se emplea en losestudios de caracterización enzimática (Alarcónet al., 1998). Los inhibidores de proteasas fue-ron: PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo);SBTI (inhibidor trípsico de la soja) y ovomucoi-de como inhibidores de serina proteasas; TLCK(cetona de tosil-lisina-clorometilo) como inhibi-dor de tripsina; ZPCK (cetona de carboxibenzo-xi-alanina-glicina-fenilalanina-clorometilo) yTPCK (cetona de tosil-fenilalanina-clorometilo)como inhibidores de quimotripsina; EDTA(ácido etilendiaminotetraacético) como inacti-vador de metal proteasas y pepstatina A comoinhibidor de proteasas ácidas.

Finalmente la actividad proteolítica de losextractos de estómago se visualizó utilizando lametodología propuesta por Díaz et al. (1998) ylos zimogramas de las proteasas alcalinas de losextractos intestinales se realizaron según la téc-nica descrita en García-Carreño, Dimes y Haard(1993). Adicionalmente, como controles se utili-zaron dos extractos enzimáticos de peces mari-nos que previamente han sido caracterizados enel laboratorio –dorada S. aurata L., 1758 (Predo-mar, S.L., en Carboneras, Almería) y dentónDentex dentex (L., 1758) (Centro Oceanográficode Murcia del Instituto Español de Oceanogra-fía, en Mazarrón)– y que fueron alimentadoscon los piensos comerciales que se usan habi-tualmente para el engorde de estas especies.

Todas las determinaciones enzimáticas serealizaron por triplicado, y las comparacionesentre los valores medios de inhibición de losextractos intestinales se llevaron a cabo tras unanálisis de varianza seguido de un test de Tukey(p < 0,05).

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En general, la morfología del tracto digestivode los peces es muy variable, lo que ilustra ladiversidad de regímenes alimentarios y modosde vida de los mismos. En S. senegalensis el estó-mago se presenta como una pequeña bolsasituada después del esófago. Cerca del estóma-go se sitúa el hígado y, a continuación, un intes-tino muy largo (figura 1). La relación entre lalongitud del tubo digestivo y la longitud corpo-ral es un índice indicativo del hábito alimenti-cio de una especie (Elliot y Bellwood, 2003).Generalmente, los peces omnívoros poseeníndices mayores que los peces carnívoros, yaque es habitual que éstos últimos muestren valo-res de este índice inferiores a 1. La longitudintestinal relativa (LIR) en S. senegalensis essuperior a 1 (2,81 + 0,38, n = 30), y se encuentramucho más próximo al de peces omnívoros queal de carnívoros.

La actividad proteasa total de los extractos seresume en la tabla I. Tanto al expresar la activi-dad enzimática en unidades (u) por mg de pro-teína (u/mg proteína) como en u/mg de diges-tivo, se comprobó que la región del digestivocorrespondiente al estómago contiene menoractividad proteolítica que las otras dos porcionesintestinales. Los niveles de actividad proteasaalcalina de los extractos I-1 e I-2 superaron enmás de dos órdenes de magnitud a la activi-dad proteasa ácida presente en el extracto E(p < 0,05). Por otra parte, los dos tipos de extrac-tos intestinales mostraron valores similares, aun-que con mayor variabilidad en el caso del extrac-to I-1 (P > 0,05).

La relación entre los valores de actividad pro-teasa ácida y los de actividad proteasa alcalinano se asemeja a la descrita en otras especies car-nívoras (Alarcón et al., 1998; Essed et al., 2002),

en las que se observa un mayor nivel de activi-dad proteasa ácida estomacal en comparacióncon la actividad proteasa alcalina detectada enel intestino. Este hecho indica que en S. sene-galensis la fase de digestión ácida que ocurre enel estómago podría tener menor importanciarelativa que en otros peces provistos de estó-mago. Así, se ha descrito que las especies fun-damentalmente carnívoras poseen niveles muyaltos de proteasas ácidas en comparación conlas especies omnívoras o herbívoras (Jonas etal., 1983).

La respuesta de las proteasas digestivas de S.senegalensis al pH se muestra en la figura 2. Lasproteasas ácidas presentes en el extracto esto-macal mostraron un óptimo de actividad situa-do entre pH:2,0 y pH:3,0. Por su parte, las pro-teasas de los extractos intestinales tuvieron lamisma respuesta al pH. En los dos casos secomprobó que el óptimo de actividad se locali-zaba en el rango de pH de 9,0 a 10,0, con unmáximo bien definido para este último regis-tro. La estabilidad a diferentes valores de pHde las proteasas en la especie estudiada se deta-lla en la figura 3. Se evidenció que las proteasasestomacales de S. senegalensis mantienen suactividad enzimática después de someterlas aun rango amplio de valores de pH, ya que sólose vieron afectadas por un registro de éste muyalcalino (figura 3A). Por el contrario, para lasproteasas intestinales se comprobó que a medi-da que el pH se hacía más ácido, éstas mostra-ron ser cada vez menos estables (figura 3B,C).Este efecto fue similar en los dos tipos deextractos intestinales.

El efecto del pH sobre las proteasas ácidas nodifiere de los resultados observados en otrasespecies de peces marinos (Alarcón, 1997; Gui-llaume y Choubert, 1999; Essed et al., 2002). Así,



Tabla I. Actividad proteasa de los tres tipos de extractos enzimáticos de S. senegalensis. Los resultados son la media± d.e. de tres determinaciones. Dentro de una misma columna, los valores medios con distinto superíndice (a, b)

muestran diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05).

la actividad máxima de las proteasas estomaca-les del lenguado senegalés se sitúa en un rangode pH de 2,0 a 2,5. La existencia de un óptimobien definido en lenguado senegalés pone demanifiesto la presencia en el estómago de unaúnica enzima con actividad proteolítica, hechoque es confirmado posteriormente en el zimo-grama de extractos estomacales (figura 4A). Porel contrario, en otras especies se ha comproba-do que la presencia de un máximo menos acen-tuado y (o) de varias puntas de actividad en lascurvas de pH indica la existencia de varias iso-formas de pepsinas con diferentes óptimos depH (De Oña et al., 2005). Por otra parte, las pro-teasas estomacales mostraron ser estables a pHrelativamente alcalinos. Esto constituye una ven-taja adaptativa de los animales marinos, que tra-gan habitualmente importantes cantidades deagua salada (cuyo pH supera la neutralidad), yaque después de ingerirla, las proteasas estoma-cales no se inactivarían mientras no se alcanzael pH ácido en el interior del estómago. Las pro-teasas intestinales presentaron un óptimo biendefinido en torno a pH:9,5-10,0 y mostraron seractivas en un rango de pH mucho más amplioque las proteasas estomacales (desde pH:5 hastapH:12), fenómeno habitual en los extractosintestinales y que demuestra la contribución devarios tipos de proteasas (Alarcón et al., 1998).En este caso, el zimograma reveló la existenciade siete fracciones activas en los extractos I-1 eI-2 (figura 4B).

La figura 5 muestra la influencia de la tempe-ratura en la actividad de las proteasas digestivasde lenguado senegalés. El óptimo de actividadse encontró entre 35 y 40 oC en todos los extrac-tos, seguido de una pérdida progresiva de laactividad enzimática a temperaturas superioresa 50 oC.

Estos resultados concuerdan con los descritospara otras especies de peces marinos, ya que escomún que las enzimas de especies poiquiloter-mas alcancen sus óptimos de actividad a tempe-raturas inferiores que sus homólogas de anima-les homeotermos (Haard, 1992). De este modo,un óptimo de actividad a baja temperaturadetermina que las proteasas funcionen a plenorendimiento a las temperaturas habituales delmedio acuático. Por lo que respecta a la ter-moestabilidad de estas proteasas, en la figura 6se ilustran los resultados obtenidos. En este caso,tanto las proteasas ácidas como las alcalinas mos-traron una respuesta similar frente a esta varia-ble. En los tres casos la actividad se mantiene en60-90 % a temperaturas inferiores a 50 oC, lle-gando a perderse hasta 70-85 % de la mismacuando los extractos se mantienen durante doshoras a 50 oC. Con una perspectiva nutricional,la determinación de la termoestabilidad notiene una aplicación directa en la acuicultura,pero esta peculiar característica de las enzimasde peces determina que sean buenas candidataspara su utilización en procesos biotecnológicos(Simpson y Haard, 1987).



Figura 2. Efecto del pH sobrela actividad proteasa ácida(E) y alcalina (I-1 e I-2) delos extractos enzimáticos de

S. senegalensis.

Para determinar el tipo de proteasas que com-ponían los extractos enzimáticos se usó unabatería de inhibidores comerciales (tabla II). Lainhibición total de los extractos estomacales sólose produjo por la pepstatina A, un inhibidorespecífico de pepsina, mientras que el resto delos inhibidores no afectaron a su actividad. Paralos extractos intestinales I-1 e I-2 se encontraronpatrones de inhibición muy similares. Así, SBTIy ovomucoide, dos inhibidores naturales, redu-jeron en el 74 y el 68 % la actividad proteasa deI-1 y en el 77 y el 65 % la actividad de I-2, res-pectivamente. El TLCK, específico de tripsina,redujo la actividad en 35-41 %; el efecto de losinhibidores específicos de quimotripsina fuemás variable: para el TPCK entre 4-6 % y para el

ZPCK un 29 % de inhibición. Por otra parte, laincubación con quelantes (EDTA) redujo enmenos del 20 % la actividad de los extractos,mientras que la pepstatina A no ejerció ningúnefecto sobre los mismos. En la tabla III se mues-tran los resultados del mismo ensayo pero reali-zado con sustratos específicos de tripsina y qui-motripsina, en lugar de hemoglobina o caseína.Los datos de inhibición confirman que la hidró-lisis de BAPNA es producida fundamentalmentepor enzimas de tipo tripsina (88 % de la activi-dad), mientras que la hidrólisis de SAPNA esocasionada en el 81 % por quimotripsina (inhi-bidas por el ZPCK).

La incubación del extracto estomacal con losinhibidores de proteasa confirmó la presencia



Figura 3. Efecto del pH sobre la estabilidad de la actividad proteasa ácida del extracto enzimático E (A) y de laactividad proteasa alcalina de los extractos I-1 (B) e I-2 (C) de S. senegalensis.

mayoritaria de proteasas aspárticas en éste, yaque su inhibición total con pesptatina A permi-tió identificar a las mismas como pepsinas. Encuanto a las proteasas intestinales, se identifica-ron como serina proteasas, tanto de tipo tripsina

como quimotripsina, que son las enzimas pro-teolíticas mayoritarias que actúan en el digesti-vo de los peces marinos (Essed et al., 2002).

En la figura 4A se muestra el zimograma delextracto estomacal E y se compara con el perfil



Figura 4. Visualización de las proteasas estomacales (A) e intestinales (B) de los extractos enzimáticos deS. senegalensis. Carriles: (A1 y A2): E; (A3): dorada; (B1): marcador de pesos moleculares; (B2): I-1; (B3): I-2; (B4): dentón.

Figura 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad proteasa ácida (E) y alcalina (I-1 e I-2) de los extractosenzimáticos de S. senegalensis.



Tabla II. Inhibición de la actividad proteolítica de los extractos de S. senegalensis por inhibidores comercialesde proteasas. Enzimas dianas: serina proteasa (1), tripsina (1a), quimotripsina (1b), metal proteasa (2)y proteasa ácida (3). Sólo se realizó la comparación de los valores medios de inhibición entre los extractosde intestino I-1 e I-2, y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas para ningún inhibidor

ensayado (p > 0,05).

Figura 6. Termoestabilidad de la actividad proteasa ácida del extracto enzimático E (A) y de la actividad proteasaalcalina de los extractos I-1 (B) e I-2 (C) de S. senegalensis

obtenido para la dorada (S. aurata). Los resul-tados indican que S. senegalensis presenta en suestómago una única fracción proteica con acti-vidad proteolítica. Los zimogramas de lasextractos intestinales, I-1 e I-2 (se incluye tam-bién el perfil del dentón como control), revela-ron que esta especie posee un equipamiento deproteasas alcalinas constituido por tres gruposbien diferenciados; un grupo formado por dosproteasas mayores de 60 kDa, un segundogrupo de tres enzimas de unos 45 kDa y un últi-mo grupo de dos proteasas de peso molecularcercano a 30 kDa. Igualmente, los resultadosobtenidos ponen de manifiesto que el patrónde proteasas es similar en las dos regiones ana-lizadas.

Considerando los datos obtenidos se puedeconcluir que el lenguado senegalés presenta unequipo de proteasas digestivas compuesto tantopor proteasas estomacales como intestinales, sibien estas últimas presentan una actividad másintensa y superior número de isoformas. Estehecho constata la mayor importancia relativa dela fase de digestión intestinal en el proceso dehidrólisis global de la proteína alimentaria.Finalmente, tanto el análisis morfométricocomo el estudio de las proteasas digestivas apun-tan a que S. senegalensis es un pez con hábitos ali-mentarios más característicos de un pez omnívo-ro que de un carnívoro estricto.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido financiado por los pro-yectos ACU03-022-C1 y C2 INIA, del Ministeriode Educación y Ciencia (España) y el FondoEuropeo de Desarrollo Regional.

BIBLIOGRAFÍA

Alarcón, F. J. 1997. Procesos Digestivos en Peces Marinos.Caracterización y Aplicaciones Prácticas. Tesis doctoral.Universidad de Almería. Almería, España: 325 pp.

Alarcón, F. J., M. Díaz, F. J. Moyano y E. Abellán. 1998.Characterization and properties of digestive protea-ses in two sparids; gilthead seabream (Sparus aurata)and common dentex (Dentex dentex). Fish Physiologyand Biochemistry 19: 257-267.

Anson, M. L. 1938. The estimation of pepsin, trypsin,papain, and catepsin with hemoglobin. J. Gen. Physiol.22: 248-254.

Ásgeirsson, B. y B. Bjarnason. 1991. Structural and kine-tic properties of chymotrypsin from atlantic cod(Gadus morhua). Comparison with bovine chymotryp-sin. Comp. Biochem. Physiol. 99B: 327-335.

Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72: 248-254.

Díaz, M., F. J. Moyano, F. J. Alarcón, F. L. García-Carre-ño y M. A. Navarrete del Toro. 1998. Characterizationof fish proteases by substrate-gel electrophoresis.Comp. Biochem. Physiol. 121: 349-377.

Dinis, M. T., L. Ribeiro, F. Soares y C. Sarasquete.1999. A review on the cultivation potencial of Soleasenegalensis in Spain and Portugal. Aquaculture 176:27-38.

Elliot, J. P. y D. R. Bellwood, 2003. Alimentary tract mor-phology and diet in three coral reef fish families. J.Fish Biol. 63: 1598-1609.

Erlanger, B., N. Kokowsky y W. Cohen. 1961. The pre-paration and properties of two new chromogenicsubstrates of trypsin. Arch. Biochem. Biophys. 95:271-278.

Essed, Z., I. Fernández, F. J. Alarcón y F. J. Moyano.2002. Caracterización de la actividad proteasadigestiva de atún rojo Thunnus thynnus (Linnaeus,1758). En: VIII Congreso nacional de acuicultura:Acuicultura y desarrollo sostenible (22-25 de mayo,2001. Santander, Cantabria, España). I. Arnal Ata-rés, C. Fernández-Pato, C. Martínez-Tapia y C. Mos-quera de Arancibia (eds.). Boletín. Instituto Españolde Oceanografía 18 (1-4): 99-107.

García-Carreño, F. L., L. E. Dimes y N. F. Haard. 1993.Substrate-gel electrophoresis for composition andmolecular weight of proteinases or proteinaceus pro-teinase inhibitors. Anal. Biochem. 214: 65-69.

Guillaume, J. y G. Choubert. 1999. Physiologie diges-tive et digestibilite des nutriments chez les poi-sons. En: Nutrition et Alimentation des Poissons etCrustacees. J. Guillaume, S. Kaushik, P. Bergot y R.Métailler (eds.): 489 pp. INRA-Ifremer. Versalles,Francia.

Haard, N. F. 1992. A review of proteolityc enzymes frommarine organisms and their application in the foodindustry. Journal of Aquatic Food Product Technology 1:17-35.



Tabla III. Inhibición de la actividad de tipo tripsina yquimotripsina de los extractos intestinales de S. senega-lensis por inhibidores específicos para tripsina (TLCK)

y quimotripsina (ZPCK y TPCK).

Jonas, E., M. Ragyanski, J. Olah y L. Borros. 1983. Prote-olytic digestive enzymes of carnivorous (Silurus glanis,L.) herbivorous (Hypophthalmichthys molitrix, VAL)and omnivorous (Cyprinus carpio, L.) fishes. Aquacul-ture 30: 145-154.

Kunitz, M. 1947. Crystalline soybean trypsin inhibitor II.General properties. J. Gen. Physiol. 30: 291-310.

Moyano, F. J., M. Díaz, F. J. Alarcón y M. C. Sarasque-te. 1996. Characterization of digestive enzyme acti-vity during larval development of gilthead seabream(Sparus aurata). Fish Physiology and Biochemistry 15:121-130.

Oña, C. de, F. J. Alarcón, M. D. Gaviño, T. F. Martínez,M. Díaz y E. Abellán. 2005. Caracterización de lasproteasas ácidas digestivas del dentón (Dentex den-tex), pargo (Pagrus pagrus) y del híbrido Dentex xPagrus. En: IX Congreso Nacional de Acuicultura(Cádiz, mayo 2003). La acuicultura como actividad eco-

nómica en las zonas costeras: Libro de Actas (12-16 demayo, 2003. Cádiz, España): 101-105. Consejería deAgricultura y Pesca, Junta de Andalucía. Sevilla,España.

Ribeiro, L., J. L. Zambonino-Infante, C. Cahu y M. T.Dinis. 2002. Digestive enzymes profile of Solea senega-lensis post larvae fed Artemia and a compound diet.Fish Physiology and Biochemistry 27: 61-69.

Simpson, B. K y N. F. Haard. 1987. Cold adapted enzy-mes from fish. En: Food Biotechnology. D. Knorr (eds.):495-527. Marcell Dekker, Inc. Nueva York.

Stauffer, C. 1989. Enzyme Assays for Food Scientists. VanNostand Reinhold/AVI. Nueva York: 317 pp.

Walter, H. E. 1984. Proteinases: methods with hae-moglobin, casein and azocoll as substrates. En:Methods of Enzymatic Analysis. H. J. Bergmeyer(eds.) V: 270-277. Verlag Chemie. Weinheim, Ale-mania.



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