CARACTERIZACIÓN DE ESPECIES DE MALASSEZIA COMO MICROBIOTA

COMENSAL EN LA PIEL DE EQUINOS

DIANA MILENA RODRÍGUEZ SANDOVAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ

2014

CARACTERIZACIÓN DE ESPECIES DE MALASSEZIA COMO MICROBIOTA

COMENSAL EN LA PIEL DE EQUINOS

DIANA MILENA RODRÍGUEZ SANDOVAL

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito

Para optar al título de

BACTERIÓLOGA

DIRECTOR:

Dra. RUBIELA CASTAÑEDA SALAZAR M.V., MSc.

CO-DIRECTOR:

Dra. MELVA YOMARY LINARES LINARES BACT., MSc.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ

2014

NOTA DE ADVERTENCIA

Resolución No 13 de Julio de 1946.

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,

antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”

DEDICATORIA

La dedico profundamente a Dios y a la Virgen por darme fortaleza, e iluminar cada día de mi vida

A mi Madre por su dedicación, amor, comprensión y esfuerzo por brindarme un buen futuro

A mi Primo Hermano Carlos Alberto por su dedicación, apoyo, y compañía,

A mis Abuelitos Bárbara, Rita y Leonardo por su amor, ejemplo y apoyo incondicional

A mi Novio Juan Pablo Ramírez por su colaboración, amor y paciencia

A mi Padre, Tíos y Primos por ser parte fundamental en mi crecimiento

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis profesores que a lo largo de mi carrera han dejado su huella plasmada y me han inculcado grandes valores, convirtiéndome en una persona perseverante y triunfadora

A la Universidad Javeriana y al grupo de investigación UNIDIA los cuales me permitieron la realización de este trabajo

A la Dra. Rubiela Castañeda Salazar por sus conocimientos, por creer en mí, por su apoyo, su paciencia,

dedicación y cariño

A la Dra. Melva Yomary Linares Linares por su apoyo, su valiosa orientación, por sus conocimientos, su paciencia y cariño

A mis amigos Sabine Damme y Juan Camilo Galvis por su compañía, consejos, amistad y por todos los

momentos que compartimos para lograr juntos nuestro objetivo

TABLA DE CONTENIDO

PAGINA

RESUMEN 1

1. INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, JUSTIFICACIÓN 2

2. MARCO TEORICO 3

2.1 Características del genero Malassezia 3

2.2 Identificación Macroscópica y Microscópica del genero Malassezia 4

2.3. Identificación de especies del genero Malassezia 4

2.3.1 Pruebas bioquímicas 5

2.3.2 Otras pruebas complementarias 7

2.4 Malassezia en Equinos 8

3. OBJETIVOS 10

3.1 Objetivo General 10

3.2 Objetivos Específicos 10

4. METODOLOGÍA 11

4.1 Población de estudio 11

4.2 Muestreo, transporte y procesamiento de las muestras 11

4.3

4.4

Control de calidad y Mantenimiento de las cepas

Análisis de la información

13

13

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 13

5.1 Examen directo 13

5.2 Descripción macroscópica 14

5.3 Descripción microscópica 15

5.4 Identificación de especies del genero Malassezia mediante pruebas

bioquímicas

16

6. CONCLUSIONES 23

7. RECOMENDACIONES 23

8. REFERENCIAS 24

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1. Identificación de las especies del genero Malassezia 8

Tabla 2. Descripción macroscópica de las colonias identificadas como

Malassezia

14

Tabla 3. Mediciones microscópicas de las especies identificadas como

Malassezia a partir de los aislamientos obtenidos.

16

Tabla 4. Identificación de los aislamientos obtenidos de acuerdo con las

pruebas bioquímicas.

19

Tabla 5. Especies aisladas según variables como raza, género y edad. 22

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

.

Figura 1. Clasificación de las especies del Género Malassezia según el requerimiento de lípidos para su crecimiento.

4

Figura 2. Identificación bioquímica de especies de Malassezia

6

Figura 3. Distribución de las especies de Malassezia en diferentes

localizaciones de la piel en equinos.

9

Figura 4.

Medidas microscopicas identificadas como Malassezia Tinción de Gram 100x

15

Figura 5. Resultados pruebas bioquímicas aislamientos identificados como Malassezia

17

1

CARACTERIZACIÓN DE ESPECIES DE MALASSEZIA COMO MICROBIOTA

COMENSAL EN LA PIEL DE EQUINOS

RESUMEN

Objetivo. Caracterizar las especies del género Malassezia en la piel y canal auditivo

externo de equinos remitidos a la Clínica de Grandes Animales de la Facultad de

Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. Materiales

y métodos. Se obtuvieron 82 muestras de hisopados de canal auditivo externo (izquierdo

y derecho), así como de diferentes regiones de la piel que incluyeron: prepucio, glándula

mamaria e ingle, a partir de 22 equinos remitidos a la Clínica de Grandes Animales de la

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia,

durante el periodo comprendido entre Diciembre de 2013 y Abril de 2014. Las muestras

fueron procesadas mediante examen directo, y cultivo en agar Dixon modificado. A partir

de los crecimientos en los que se observaron colonias morfológicamente compatibles con

Malassezia spp. se evaluaron características macroscópicas y microscópicas como

tamaño, textura, color, forma, borde y superficie de la colonia, se realizaron pruebas

bioquímicas como catalasa, ureasa, asimilación de Tweenes, producción de β-

glucosidasa, cremophor-EL y pruebas complementarias como crecimiento en agar

Sabouraud, producción de fosfolipasa en agar Sabouraud con yema de huevo al 10% y

crecimiento a 37°C y a 40°C. Cepas de referencia. Se utilizaron las cepas de referencia

M. furfur CBS 7019, M. pachydermatis CBS 1879,M. sympodialis CBS 7222, M. slooffiae

CBS 7956 pertenecientes a la colección de microorganismos del Grupo de Micología y

Fitopatología de la Universidad de Los Andes. Resultados. De las 82 muestras

procesadas, el examen directo fue positivo en 17,07% (n=14), observando estructuras

levaduriformes de formas y tamaños diferentes. Al evaluar las características del cultivo y

realizar las pruebas bioquímicas y complementarias, 8,53% (n=7) fueron identificadas

como Malassezia, de las cuales 6,09% (n=5) se pudieron caracterizar a nivel de especie

como M, sympodialis, M. pachydermatis, M, slooffiae, M. obtusa, M globosa y 2,44%(n=2)

como Malassezia spp. Adicionalmente, se identificaron otras levaduras como Candida

spp. en 6,10% (n=5) y Cryptococcus spp en 2,44% (n=2) de las muestras. Conclusión.

La prevalencia de Malassezia establecida para la población evaluada fue del 18,2%

(n=4), logrando caracterizar hasta especie M. sympodialis, M. pachydermatis, M. slooffiae

M. obtusa, M. globosa como microbiota normal de la piel en los equinos evaluados.

2

1. INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El género Malassezia comprende un grupo de levaduras unicelulares que forman parte de

la microbiota fúngica normal de la piel de humanos y animales de sangre caliente

(Kaneko, 2007). Fisiológicamente tienen afinidad por los lípidos, los cuales utilizan como

única fuente de carbono, a excepción de Malassezia pachydermatis, la cual es no

lipodependiente (Hernández, 2005).

Se han descrito casos en los que esta microbiota comensal puede ocasionar patologías

en humanos como: pitiriasis versicolor (PV), dermatitis seborreica (DS) y dermatitis

atópica (DA), comportándose como patógeno oportunista si se presenta alteración en la

piel u otros factores que puedan favorecer el paso de flora comensal a patógena como

humedad, desórdenes en la queratinización e inmunosupresión, entre otros (Hernández,

2005).

En los animales, Malassezia ha adquirido importancia por su asociación a procesos

patológicos como patógeno oportunista emergente (Hernández,2005), siendo M.

pachydermatis el agente etiológico aislado con mayor frecuencia en diferentes patologías

como otitis externa en los caninos y dermatitis en los felinos (Garau,2005 ;Castellá et al.

2005) recientemente, dos nuevas especies han sido descritas como flora comensal en la

piel de animales sanos, M. caprae (caprinos) y M. equina (equinos).(Cabañes et al. 2007).

En Colombia no existen reportes sobre la presencia de Malassezia spp como flora

comensal en la piel de los equinos, motivo por el cual en este estudio se propone realizar

una caracterización preliminar de las especies de Malassezia presentes en la piel de los

equinos remitidos a la Clínica de Grandes animales de la Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia durante el período

comprendido entre Diciembre de 2013 a Abril de 2014.

3

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Características del género Malassezia

Las levaduras del género Malassezia se clasifican dentro del phylum Basidiomicota,

subphylum Ustilaginomycotina, clase Exobasidiomycetes, orden Malasseziales, (Erchiga

et al. 2008), familia Malasseziaceae (Gaitanis et al. 2012). Estas levaduras hacen parte de

la microbiota comensal cutánea de humanos y animales (Hernández, 2005) y se

reproducen por gemación unipolar dejando una prominente y característica cicatriz en la

célula madre (Giusiano, 2006).

Fisiológicamente, Malassezia se caracteriza por ser lipidodependiente, debido a que tiene

un defecto en la capacidad de sintetizar ácidos grasos saturados C12–C16, lo que se

manifiesta en el requerimiento de una fuente exógena de estos ácidos para su desarrollo,

a excepción de M. pachydermatis que es la única especie del género que no requiere de

sustancias lipídicas para su crecimiento (Giusiano, 2006). Por lo anterior, los medios

comúnmente utilizados son Agar Dixon y Agar Leeming y Notman, medios selectivos que

son efectivos para la recuperación y aislamiento de las levaduras del genero Malassezia

(Hernández 2005; Kaneko et al. 2007).

Hasta el momento se han descrito 14 especies, de las cuales 13 son lipodependientes y

una no lipodependiente (Figura 1). En animales se han reportado diferentes especies

lipodependientes, como M. sloofiae, M. globosa, M. sympodialis y la especie no

lipodependiente M. pachydermatis en el conducto auditivo externo de caninos y felinos;

(Salah et al 2010); M. nana en bovinos con o sin otitis externa (Hirai et al. 2004) y M.

sympodialis, M. slooffiae, M. furfur y M. pachydermatis en el conducto auditivo externo de

porcinos (Nardoni et al. 2010). Adicionalmente, en la piel de equinos, en la región

intermamaria en las yeguas, así como en la fosa prepucial en machos, se ha reportado la

presencia de Malassezia equina (White et al. 2006). Otros reportes de literatura describen

la presencia de diferentes especies de Malassezia asociadas a varios sitios anatómicos:

M. pachydermatis, en ingle, dorso, ano; M. furfur en axila ingle dorso ano, M. restricta en

axila, ingle, M. sympodialis en axila, M. slooffiae en ingle, ano, M .obtusa en ano y canal

auditivo externo, M. globosa en axila, ingle y ano. (White 2006; Crespo et al. 2002).

4

Figura 1. Clasificación de las especies del género Malassezia según el requerimiento de

lípidos para su crecimiento.

2.2 Identificación Macroscópica y Microscópica del genero Malassezia

La morfología macroscópica es variable, observándose colonias pequeñas, de aspecto

cremoso a amarillo, algunas veces lisas o ligeramente rugosas umbilicadas; brillantes u

opacas, planas, con borde liso, textura cremosa, esféricas, ovales o cilíndricas y de

tamaños diferentes de acuerdo con la especie evaluada (Hernández , 2005).

Al microscopio se aprecian Blastoconidias que pueden ser ligeramente alargadas, u

ovales de 2-4 μm de largo por 1-2 μm de ancho aproximadamente, con gemas pequeñas.

(Bonifaz, 2012)

2.3 Identificación de especies del género Malassezia

Para la identificación de aislamientos del género Malassezia spp, se realizan diferentes

pruebas de laboratorio que permiten llegar a identificar la especie entre ellas se citan las

siguientes:

Especies de Malassezia

Lipodepedientes

M.furfur (Baillon,1889)

M.globosa,M.obtusa,M.restricta,M.sloofiae

(Guého,Midgley & Guillot ,1.996)

M.sympodialis ( Simmons & Guého, 1990)

M.dermatis, M.japónica,M.yamatoensis

( Sugita et al.2003)

M.nana ( Hirai A, et al.2004)

M.caprae,M.equina(Cabañes FJ, et al.2007)

M.cuniculi ( Cabañes et al.2011)

No Lipodependiente

M.pachydermatis

(Dodge, 1935)

5

2.3.1 Pruebas bioquímicas

- Catalasa: Esta prueba permite evaluar si el microorganismo posee o no la enzima

catalasa que descompone el peróxido de hidrogeno en oxígeno y agua. La prueba se

considera positiva, si se observa formación de burbujas (Khosravi et al. 2008), siendo M.

restricta la única especie de este género que es catalasa negativa (Guého et al. 1996,

Hernández, 2005; Kaneko et al. 2007; Cabañes 2011), aunque la reacción de M.

pachydermatis para esta prueba es variable (Khosravi et al. 2008)

- Ureasa: Por medio de esta prueba se evalúa la capacidad del microorganismo para

hidrolizar la úrea formando dos moléculas de amoniaco por medio de la reacción

enzimática de la ureasa. La prueba se considera positiva si el medio vira a color fucsia

debido al indicador rojo de fenol (Pérez et al. 2002).

- β- glucosidasa: Prueba que se utiliza para evidenciar si el microorganismo produce o

no la enzima β- glucosidasa, que hidroliza la beta esculina en glucosa y esculetina, por

reacción con una sal de hierro formando un complejo de color castaño oscuro o negro

(Mayzer et al. 1997). Para esta prueba se considera una reacción positiva el viraje a color

negro en el medio de cultivo (Khosravi et al. 2008).

- Asimilación del Cremophor-EL: Esta prueba determina la capacidad del

microorganismo para asimilar el Cremophor-EL (Aceite de castor). Se considera una

reacción positiva si luego de 5 días de incubación a 32°C se observa alrededor del pozo

un halo de asimilación y una reacción negativa si hay ausencia del mismo (Figura 2)

(Kaneko et al. 2007). Siendo M. furfur la única especie reportada como positiva (Mayzer,

1997; Hernández, 2005; Giusianio, 2006), aunque últimamente para M.pachydermatis se

ha reportado una reacción variable para asimilar el Cremophor (Ashbee, 2007).

- Asimilación del Tween: Esta prueba evalúa la capacidad del microorganismo para

asimilar suplementos nutricionales lipídicos como Tween 20, 40, 60, 80 (Khosravi, 2008).

La lectura se realiza evidenciando la asimilación de cada tween por parte del

microorganismo después de 7 días de incubación a 32°C (Figura 2) (Hernández, 2005;

Kaneko et al. 2007), cada especie presenta distinta afinidad por los Tweenes: M. furfur y

M. dermatis asimilan todos los Tweens, M. sympodialis y M. pachydermatis no asimilan el

Tween 20, M. obtusa, M. globosa y M. restricta no asimilan ningún Tween (Guého et al.

1996; Giusianio, 2006; Cabañes et al. 2007; Crespo et al. 2008; Nardoni et al. 2010; Salah

et al. 2010).

6

Esculina (+) M. obtusa

M.sympodialis

Esculina (-) M.furfur M. slooffiae

M. restricta, M. globosa

MALASSEZIA

Cultivos en Agar Sabouraud Glucosa

Tween test

M.sympodialis,M.caprae M.furfur M.slooffiae, M.nana M.obtusa, M.restricta,

M.globosa,

M.japonica,M.cuniculi

M. yamatoensis, M.dermatis,

M.equina

M.pachydermatis

80

0

20

0

60

0

40

0

Crecimiento

No crecimiento Cremophor- EL

Interpretación:

Figura2. Identificación bioquímica de especies de Malassezia Tomada y adaptada : (Hernández, 2005)

Positivo M.pachydermatis Reacción catalasa (-)

M.restricta

7

2.3.2 Otras pruebas complementarias

- Crecimiento en Agar Sabouraud: Por medio de esta prueba se evalúa la capacidad del

microorganismo para crecer en agar Sabouraud sin suplementos lipídicos (Guého et al.

1996), siendo M. pachydermatis la única especie de este género que crece en agar

Sabouraud (Guého et al. 1996; Sugita et al. 2003; Hirai et al. 2004; Hernádez ,2005;

Kaneko, 2007; Cabañes &Castellá, 2011).

- Producción de fosfolipasa en agar Sabouraud con yema de huevo: Permite

determinar si el microorganismo produce la enzima fosfolipasa (Pini et al. 2011). La

lectura de la prueba se realiza mediante la medición del halo formado alrededor de la

colonia (Ortiz, 2012). Los resultados de la actividad enzimática se expresan como una

razón (Pz) que se determina midiendo el diámetro de la colonia y el diámetro de la colonia

más el halo de hidrólisis que se generó alrededor de ella (Price et al. 1982; Pini et al.

2011). Se han establecido rangos que permiten clasificar la actividad fosfolipasa así:

PZ<0.64: muy alta, PZ ≥ 0.64 y <1: alta y PZ=1: nula (Cafarchia & Otranto, 2004). La

actividad fosfolipasa juega un papel importante como factor de virulencia, una alta

actividad fosfolipasa puede estar involucrada en el mecanismo por el cual estas levaduras

pueden generar procesos inflamatorios (Ortiz, 2013).

- Crecimiento en agar Dixon a temperaturas de 37 y 40 oC: Otra forma para poder

identificar las especies del genero Malassezia es por la capacidad del microorganismo

para crecer a diferentes temperaturas (Guého et al. 1996; Hernández, 2005) a 37°c se ha

reportado crecimiento débil para las especies M. globosa, M. obtusa, M.restricta, M.

equina y M.nana; buen crecimiento para: M.pachydermatis, M.furfur M. sympodialis, M.

slooffiae, M. dermatis, M, japónica, M. yamatoensis y M. cuniculi. Mientras que a 40°C se

ha reportado crecimiento para todas las especies excepto M. globosa, M. obtusa, M.

restricta, M. japonica, M. equina y M. caprae. Para las dos temperaturas se ha reportado

crecimiento para las especies M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. slooffiae, M.

dermatis, M. yamatoensis y M. cuniculi (Guého et al. 1996; Sugita et al. 2003; Hirai et al.

2004; Hernández, 2005; Kaneko, 2007; Cabañes, 2011).

En la tabla 1 se resumen los resultados de las pruebas bioquímicas y complementarias

para la identificación de las especies de Malassezia.

8

Tabla 1. Identificación de las especies del genero Malassezia

(+) Crecimiento, (-) no crecimiento, +/- Crece débilmente

Tomada y adaptada de (Guého et al. 1996; Sugita et al.2003; Hirai et al.2004;Hernández, 2005; Cabañes, 2011)

2.4 Malassezia en Equinos

Las infecciones de tipo micótico son de rara ocurrencia en equinos, a excepción de las

ocasionadas por Dermatofitos (Pérez et al. 2000); sin embargo actualmente existen

reportes sobre la participación de levaduras del género Malassezia que han ido

adquiriendo importancia debido a que aunque se pueden encontrar como microbiota

comensal en diferentes áreas del cuerpo, pueden causar o estar asociadas a

determinados desórdenes dermatológicos (Cafarchia, 2013), siendo las levaduras

lipodependientes las más comúnmente reportadas como flora normal (Crespo et al. 2002).

Aunque existen pocos estudios sobre la presencia de Malassezia spp como microbiota

comensal en diferentes regiones anatómicas de la piel de los equinos, algunos reportes

evidencian la presencia de especies de Malassezia en diferentes localizaciones de la

siguiente forma: M. pachydermatis, en ingle, dorso, ano, canal auditivo externo; M.furfur

Especie

Catalasa

Urea

β- glucosidasa

Sabouraud

40ºC

37ºC

Tween Cremophor 20 40 60 80

M. slooffiae +++ + - - + + + + + - -

M. sympodialis +++ + + - + + - + + + -

M. obtusa +++ + + - - + - - - - -

M. furfur +++ + - - + + + + + + +

M. pachydermatis +++ + - + + + - + + + +/-

M.globosa +++ + - - - - - - - - -

M.restricta - + - - - - - - - - -

M.equina +++ + - - - - - + + + -

M.dermatis +++ + - - + + + + + + -

M.nana +++ + - - +/- +/- +o- + + +/- -

M.japonica +++ + v - - + - +/- + - -

M.yamatoensis +++ + v - + + + + + + -

M.caprae +++ + - - +/- - - +/- +/- +/- -

M.cuniculi +++ + + - + + - - - - -

9

en axila, ingle, dorso, ano y canal auditivo externo; M. restricta en axila, ingle y canal

auditivo externo, M.sympodialis en axila; M. slooffiae en ingle, ano, canal auditivo externo;

M .obtusa en ano y canal auditivo externo y M. globosa en axila, ingle y ano (White 2006;

Crespo et al. 2002). Adicionalmente, Cabañes & Boekhout en el año 2007, reportaron el

aislamiento de una nueva especie de Malassezia a partir de muestras del ano de un

equino sano, la cual fue clasificada como M. equina, que se caracteriza

macroscópicamente por presentar colonias rugosas color crema de 2-3 mm, con células

elipsoidales u ovales, de 3-4.5 x 2.2-3.5 μm , catalasa positiva, β- glucosidasa negativa,

asimila los Tweenes 40, 60 y 80, no asimila el cremophor EL, presenta un crecimiento

débil a 37°C; se considera que guarda una relación con M. sympodialis ya que se ha

demostrado un grado de similitud en sus nucleótidos al realizarles análisis moleculares en

la secuencia D1/D2 en los dominios del gen 26S rRNA en la región ITS 1 (Cabañes et al.

2007). La distribución de las diferentes especies según el sito anatómico se detalla en la

figura 3.

Tomada de: http://www.howrse.co.uk/

Adaptada de: (Crespo et al. 2002)

Figura 3. Distribución de las especies de Malassezia en diferentes localizaciones de la

piel en equinos.

Ano M. pachydermatis, M.slooffiae, M.globosa. M obtusa, M.furfur, M.equina

Dorso M. pachydermatis, M.furfur

Axila M.furfur, M.sympodialis

M.globosa, M.restricta

Ingle

M. pachydermatis

M.furfur

M.slooffiae, M.globosa,

M.restricta

Canal auditivo externo

M. pachydermatis, M.furfur M.slooffiae, M.obtusa,

M.restricta

10

En cuanto a la participación de Malassezia en procesos patológicos en equinos, existen

dos reportes de caso. En el primero de ellos, un macho presentaba lesiones dérmicas

en la cara, el cual tenía una condición pre existente de Alopecia areata, sin embargo, al

realizar examen directo y crecimiento en agar sabouraud se identificaron levaduras del

genero Malassezia spp, las cuales fueron consideradas como un patógeno oportunista,

por lo cual se enfatizó sobre la necesidad de estudiar el papel de Malassezia spp como

microbiota normal en la piel de los equinos o si está relacionada como patógeno en un

proceso de enfermedad como el reportado en este caso. (Paterson ,2002)

En el otro caso reportado, se examinaron yeguas que presentaban prurito intenso en la

glándula mamaria a las cuales les fue realizado un examen citológico que reveló

numerosas levaduras las cuales no pudieron ser identificadas hasta especie, lo cual

sugeriría su posible papel como patógeno oportunista en estos animales; sin embargo se

examinaron también las yeguas sanas, a las cuales se les identificó un gran número de

levaduras en la glándula mamaria las cuales sí pudieron ser identificadas hasta especie

encontrándose M. slooffiae y M equina (White, 2005). Posteriormente, en otro estudio

realizado en 11 equinos (5 hembras y 6 machos castrados) se aisló a partir de la piel, en

particular en la región intermamaria de las yeguas y la fosa prepucial de los machos, 7

levaduras pertenecientes al género Malassezia, dentro de las cuales predominó la

especie M. equina con lo cual corroboraron que las levaduras de este género hacían parte

de la microbiota normal de los equinos evaluados (White et al. 2006).

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL: Caracterizar las especies del género Malassezia en el canal

auditivo externo y la piel de equinos remitidos a la Clínica de Grandes Animales de la

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Identificar aislamientos de Malassezia spp en muestras de canal auditivo externo y

piel de equinos sanos.

Determinar la prevalencia de Malassezia spp. en piel de equinos remitidos a la

Clínica de Grandes animales de la Facultad de Medicina Veterinaria y de

Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia durante el periodo comprendido

entre Diciembre de 2013 a Abril de 2014.

Relacionar la presencia de Malassezia spp.frente a variables de edad, sexo y raza.

11

4. METODOLOGÍA

4.1 Población de estudio: Para este estudio se evaluaron 22 Equinos remitidos a la

Clínica de Grandes Animales (CGA) de la Facultad de Medicina Veterinaria y de

Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, durante los meses de Diciembre de

2013 a Abril de 2014.

4.2 Muestreo, Transporte y Procesamiento de las muestras: Se realizaron hisopados

de la piel del prepucio, glándula mamaria, ingle e hisopados de canal auditivo externo,

obteniéndose 82 muestras en total, las cuales fueron transportadas al laboratorio de la

PUJ, en tubo estéril, a temperatura ambiente y en el menor tiempo posible. A cada

muestra se le realizó examen directo mediante la elaboración de un frotis en lámina

portaobjetos, se fijó y se coloreó con tinción de Gram para ser observado al microscopio e

identificar la presencia de estructuras levaduriformes o blastoconidias redondas u ovales

de tamaño variado, estructuras filamentosas y/o bacterias. Posterior a esto cada muestra

fue sembrada en Agar Dixon modificado (Extracto de malta 36 g, Peptona 6 g, Ox bile 20

g, Tween 40 10 ml, Glicerol 2 ml, Ácido oleico 2 ml, Agar 12 g, Agua desionizada 1.000

ml) (López ,2007) y se incubó a 320C durante 5 días.

De las siembras en las que se observaron colonias compatibles con Malassezia se hizo

un nuevo aislamiento para obtener colonias puras y de esta forma poder realizar la

descripción macroscópica del crecimiento observado, evaluando las diferentes

características de los aislamientos obtenidos como tamaño, textura, color; forma; así

como el borde y la superficie de la colonia. Para la descripción microscópica se utilizó el

microscopio Leica DM 100 LED versión 2.1.0 el cual permitió medir el ancho y el largo de

las células en micrómetros, por medio de un extendido teñido con coloración de Gram; por

último, para la identificación de especies del género Malassezia se realizaron las

siguientes pruebas bioquímicas:

- Catalasa: La prueba se realizó extendiendo una colonia sobre la superficie de una

lámina portaobjetos a la cual se adicionó una gota de peróxido de hidrógeno al 30%. La

prueba se consideró positiva, si se observaba formación de burbujas, y positivo débil, si

la formación de burbujas se observaba entre 5 y 10 segundos (Khosravi et al.2008)

12

- Ureasa: La prueba se realizó inoculando la levadura en la superficie del medio de cultivo

(agar úrea), posteriormente se incubó a 32oC, durante 7 días. La prueba se consideró

positiva si el medio viraba a color fucsia debido al indicador rojo de fenol (Pérez et al.

2002)

-β- glucosidasa: La prueba se realizó inoculando el microorganismo por punción en el

medio, se incubo a 32oC durante 7 días. Para esta prueba se consideró una reacción

positiva el viraje a color negro en el medio de cultivo. (Khosravi et al.2008)

-Asimilación del Cremophor-EL: La prueba se realizó a partir de una suspensión

concentrada del microorganismo, de la cual se adicionaron 400µl a 10 ml de agar

mycosel esta mezcla se depositó en una caja de Petri pequeña hasta que se solidificó,

posteriormente se realizó un pozo en el centro, donde se agregaron 50µl de Cremophor.

Para esta prueba se consideró una reacción positiva si luego de 7 días de incubación a

32°C se observaba alrededor del pozo un halo de asimilación (Kaneko, 2007).

-Asimilación del Tween: A partir de una suspensión del microorganismo en una

concentración de 0,5 en la escala de MacFarland, se adicionaron 2 ml a un tubo con 16ml

de agar sabouraud adicionado con 0,05% de cloranfenicol y 0.05% cycloheximida

(Mayzer, 1997; Khosravi et al. 2008). Esta preparación se depositó en una caja de Petri

grande hasta su solidificación. Posteriormente, se hicieron 4 pozos de (2mm) a los que se

adicionaron 7µl de cada Tween. La lectura se realizó evidenciando el crecimiento o

asimilación del microorganismo frente a cada Tween después de 7 días de incubación a

32°C (Kaneko, 2007; Hernández, 2005).

Pruebas complementarias

-Crecimiento en agar sabouraud: Se realizó siembra superficial de cada uno de los

aislamientos en tubo inclinado con agar sabouraud, se incubaron a 32°C por 7 días, para

observar si hubo crecimiento (Kaneko, 2007; Hernández, 2005)

-Crecimiento en agar Dixon a temperaturas de 37 y 40oC: Se sembró el

microorganismo en agar Dixon y se incubó a 37°C y a 40°C. Se observó si hubo

crecimiento del microorganismo después de 7 días (Guého et al. 1996; Kaneko, 2007).

13

-Producción de fosfolipasa en agar Sabouraud con yema de huevo: La prueba se

realizó en agar Sabouraud adicionado con 10% de yema de huevo, para esto se

realizaron cuatro inoculaciones del microorganismo en puntos equidistantes, se incubó a

32oC por 7 días, después de los cuales se hizo la medición de los halos y se calcularon

los índices Pz (Countinho, 2005)

- Características microscópicas: Se realizó la medición del largo y ancho de las células

en micrómetros en un extendido de los aislamientos obtenidos teñido con coloración de

Gram, para lo cual se utilizó el microscopio Leica DM 100 LED versión 2.1.0

4.3 Control de calidad y Mantenimiento de las cepas: Como control de calidad se

utilizaron las cepas de referencia M. furfur CBS 7019, M. pachydermatis CBS 1879, M.

sympodialis CBS 7222, M. slooffiae CBS 7956 pertenecientes a la colección de

microorganismos del Grupo de Micología y Fitopatología de la Universidad de Los Andes,

las cuales se conservaron en el medio Skim milk a -20°C, al igual que los aislamientos

obtenidos.

4.4 Análisis de la información: Los datos obtenidos fueron registrados utilizando tablas

de Excel y se determinó la prevalencia general de Malassezia en la población evaluada

utilizando la formula:

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De las 82 muestras procesadas, 12,2% (n=10) correspondieron a hisopados de prepucio,

14,6% (n=12) de glándula mamaria, 19,5% (n=16) de ingle y 53,6% (n=44) de canal

auditivo externo izquierdo y derecho.

5.1 Examen directo: Al examen directo con tinción de Gram se observaron levaduras de

formas y tamaños diferentes en el 17,07% (n=14) del total de las muestras de las cuales

el 8,53% (n=7) fueron identificadas como Malassezia, el 6,09%(n=5) como Cándidas y el

2,43%(n=2) como Cryptococcus spp, a las cuales se les realizó la descripción

macroscópica, microscópica y las pruebas bioquímicas para su identificación.

Adicionalmente, en el 40,24% (n=33) de las muestras se observaron en el directo

bacterias y en el 42,68% (n=35) se observaron hifas.

Numero de eventos P= Número de individuos totales

14

5.2 Descripción macroscópica: A las colonias morfológicamente compatibles con

Malassezia se les realizó descripción macroscópica evaluando diferentes parámetros

como: Tamaño, borde, superficie, apariencia, elevación, color textura (Tabla 2) donde

predominaron las colonias planas pequeñas, de bordes lisos, aisladas en su mayoría de

oído izquierdo (n=5) y de glándula mamaria (n=2).

Tabla 2. Descripción macroscópica de las colonias identificadas como Malassezia

ID PUJ

Descripción macroscópica de las colonias en Agar

Dixon

Imagen

300-1-1

M.slooffiae

Colonias irregulares , rugosas elevadas, blancas, opacas (1mm de diámetro

en promedio)

300-5-13 M.obtusa

Colonias pequeñas, planas, bordes lisos, puntiformes,

opacas (1,3mm de diámetro en promedio)

300-5-13A Malassezia spp

Colonias planas pequeñas, bordes lisos, opacas(2mm de diámetro en promedio)

300-5-13B Malassezia spp

Colonias umbilicadas pequeñas, bordes lisos,

opacas (1mm de diámetro en promedio)

300-14-47

M. globosa

Colonias puntiformes, elevadas, medianas,

brillantes, cremosas, bordes lisos (1,4mm de diámetro en

promedio)

300-14-49

M.pachydermatis

Colonias medianas, umbilicadas, borde irregular, elevadas, brillantes, blancas

(2,1mm de diámetro en promedio)

300-15-53

M.sympodialis

Colonias lisas, elevadas, blancas, puntiformes, pequeñas brillantes.

(1,7mm de diámetro en promedio)

15

Al comparar los resultados obtenidos en la descripción macroscópica de los aislamientos

identificados como Malassezia spp. con lo reportado por diferentes autores los cuales

mencionan unas características propias para cada especie de Malassezia, se encontró

que hubo coincidencia en cuanto a la descripción de las colonias y los parámetros

evaluados como: forma, bordes, elevación y textura, sin embargo se observaron

diferencias en cuanto al tamaño de las colonias, esto debido probablemente a

imprecisiones en la medición ocasionadas por la distribución de las colonias (Gueho et

al.1996; Sugita et al. 2003; Hirai et al. 2004; Hernández, 2005; Cabañes et al. 2007;

Arenas, 2008; Crespo et al. 2008).

6.3 Descripción microscópica: Las medidas microscópicas para los aislamientos

identificados como Malassezia (Figura 4) mostraron que M. pachydermatis presenta el

tamaño más grande 2,4 μm de ancho x 3,2 μm de largo, y M. obtusa el tamaño más

pequeño 1,5 μm de ancho x 2,2 μm de largo (Tabla 3).

Figura 4. Medidas microscopicas identificadas como Malassezia Tinción de Gram 100X

Al comparar estos resultados con los reportes de literatura se evidenció que los valores

obtenidos coinciden parcialmente con los rangos descritos para las diferentes especies

identificadas, las principales diferencias se observaron en el largo de las células, lo que

posiblemente se debe a imprecisiones en la medición ocasionadas por la distribución de

las mismas en el frotis; esto evidencia que este único parámetro no es confiable para

establecer una clasificación adecuada de estas levaduras (Guého et al, 1996; Sugita et

al. 2003; Hirai et al. 2004;Hernández , 2005; Cabañes et al, 2007; Arenas, 2008; Crespo

et al, 2008)

16

Tabla 3. Mediciones microscópicas de las especies identificadas como Malassezia a partir

de los aislamientos obtenidos

ID PUJ Promedio Especie

identificada

Promedio reportado en la literatura

Ancho μm Largo μm Ancho μm Largo μm

300-1-1 2,3 2 M.slooffiae 2,5 8

300-5-13 1,5 2,2 M.obtusa 1,5-2 4-6

300-5-13A 2 3,2 Malassezia spp 1,2 10

300-5-13B 2 3,01 Malassezia spp 1,2 10

300-14-47 2 2,7 M.globosa 2,5 8

300-14-49 2,4 3,2 M.pachydermatis 2-2,5 4-5

300-15-53 2,3 3,1 M.sympodialis 1,5-2,5 2.5-6

5.4 Identificación de especies del género Malassezia mediante pruebas bioquímicas

Por medio de las pruebas bioquímicas se realizó la identificación hasta especie evaluando

en cada una de éstas los diferentes requerimientos para su crecimiento y desarrollo. Las

principales características que permitieron la identificación de uno de los aislamientos

como M. pachydermatis incluyeron su capacidad para crecer a una temperatura de 32°C

en agar sabourad y la asimiliación de todos los Tweenes, al igual que su crecimiento en

Cremophor (Tabla 4). Aunque M. globosa y M. obtusa comparten ciertas características

como su incapacidad tanto para crecer a 40°C como para la asimilación de los Tweenes,

la prueba de β- glucosidasa permitió su diferenciación pues M. globosa no presenta la

enzima lo que la diferencia de M. obtusa que si la presenta.( Hernández, 2005; Giusiano,

2006) Por su parte, M. slooffiae solamente asimila los Tweenes 20, 40 y 60 y no presenta

la enzima β- glucosidasa, a diferencia de M. sympodialis que si presenta la enzima β-

glucosidasa y adicionalmente asimila los Tweenes 40, 60 y 80; estos hallazgos coinciden

con los diferentes reportes de literatura descritos para la identificación de las diferentes

especies de Malassezia de acuerdo con los resultados de las pruebas bioquímicas

reportadas por varios autores (Guého et al. 1996; Sugita et al. 2003; Harai et al. 2004;

Giusiano, 2006; Kaneko et al. 200; Salah et al. 2010).

17

ID PUJ Urea ,Esculina, Sabouraud Cremophor Tween Actividad Fosfolipasa

300-1-1 M.slooffiae

300-5-13 M.obtusa

300-5-13A Malassezia spp

300-5-13B Malassezia spp

300-14-47 M. globosa

18

ID PUJ Urea, Esculina ,Sabouraud Cremophor Tween Actividad Fosfolipasa

300-14-49 M.pachydermatis

300-15-53 M.sympodialis

Figura 5. Resultados pruebas Bioquímicas aislamientos identificados como Malassezia

19

Tabla 4. Identificación de los aislamientos obtenidos de acuerdo con las pruebas bioquímicas

ID PUJ Sitio Toma de la

muestra

Catalasa

Urea

β-

glucosidasa

Agar

Sabouraud

37ºC

Tween

Cremophor

Actividad

Fosfolipasa

Especie de Malassezia

40ºC 20 40 60 80

300-1-1 Canal auditivo

izquierdo

+++ +++ - - + +++ - + + - - + Pz=0,66

M. slooffiae

300-5-13 Canal auditivo

izquierdo

+++ +++ + - - + - - - - - - M.obtusa

300-5-13A Canal auditivo

izquierdo

+++ +++ - - + + - - - - - - Malassezia spp

300-5-13B Canal auditivo

izquierdo

+++ +++ + débil - + + + - - - - - Malassezia spp

300-14-47 Canal auditivo

izquierdo

+++ +++ - - - + - - - - - + Pz=0,40

M.globosa

300-14-49 Glándula mamaria

+++ ++ + +++ + + + + + + + + Pz=0,75

M. pachydermatis

300-15-53 Glándula mamaria

+++ +++ + - + + - + + - - - M. sympodialis

20

De acuerdo con los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas se pudo determinar

que de los aislamientos obtenidos el 2,43% (n=2) correspondió a Malassezia spp, las

cuales no pudieron identificarse hasta especie debido a que los perfiles bioquímicos no

coincidieron con lo reportado por literatura para las diferentes especies. Los demás

aislamientos si pudieron ser identificados hasta especie: M. pachydermatis, M. globosa,

M. obtusa, M slooffiae y M. sympodialis con un porcentaje del 1,22% (n=1) para cada una

de ellas. Estos datos concuerdan con reportes de literatura en los que se menciona que

estas especies son las más comúnmente aisladas en la piel de equinos sanos. (White,

2006; Crespo et al. 2002).

Las especies identificadas en el presente estudio fueron M. slooffiae, M. obtusa, M.

globosa, M. pachydermatis, M. sympodialis y Malassezia spp, aisladas de Oído Izquierdo

y Glándula mamaria de equinos sanos. De acuerdo con los resultados obtenidos en este

estudio y con lo reportado por White 2005 y Crespo et al. 2010 se aislaron en los equinos

las mismas especies exceptuando M. furfur y M. restricta que no fueron identificadas,

encontrando una concordancia en cuanto al sitio anatómico como lo es el canal auditivo

externo tanto para M. obtusa, como para M. slooffiae. Mientras que las especies M.

pachydermatis y M. sympodialis fueron aisladas de glándula mamaria, lo cual no coincide

con lo reportado por White, 2005 y White et al. 2006, quienes aislaron M. slooffiae y

M.equina en el primer estudio y M.equina en el segundo a partir de la glándula mamaria

de yeguas sanas.

En el presente estudio se evidenciò que 42,8% (n=3) de las especies presentó actividad

fosfolipasa positiva entre ellas: M.slooffiae con un Pz=0,66, M.globosa con un Pz=0,40 y

M.pachydermatis con un Pz=0,70, lo cual reveló que M. pachydermatis fue la única

especie que presentó actividad fosfolipasa intensa, mientras que un 57,1% (n=4) de las

especies no tuvieron actividad fosfolipasa. Estos resultados coinciden con lo reportado en

la literatura donde se evidencia que M. pachydermatis es una de las especies que

presenta alta actividad fosfolipasa tanto en animales sanos como en animales con lesión

(Cafarchia & Otranto, 2004; Pini, 2011; Ortiz, 2013), por otro lado M. sympodialis muestra

una buena actividad fosfolipasa cuando es aislado de piel sana lo cual también se pudo

corroborar a través de este estudio. M. obtusa M. slooffiae, M. globosa, M. restricta no

presentan actividad fosfolipasa en animales sanos según lo reportado por Pini, 2013, lo

cual difiere con los resultados obtenidos ya que para este estudio M. slooffiae y M.

globosa si presentaron actividad fosfolipasa positiva (rango Pz= <1.0 y ≥0,64)

21

La prevalencia general para la población evaluada fue de 18,2%, identificando las

especies M. slooffiae, M. obtusa, M.globosa, M. pachydermatis, M. sympodialis

coincidiendo con lo reportado por diferentes autores Crespo et al.2002; Giusiano,2006;

White,2006 quienes reportan la presencia de estas levaduras como las especies más

aisladas en la microbiota normal de la piel de equinos.

De acuerdo con lo observado en este estudio (Tabla 5) no fue posible establecer una

relación entre los aislamientos y las variables edad, sexo y raza debido al bajo número de

aislamientos obtenidos ya que el 71,42% (n=5) de ellos se obtuvieron de dos equinos 3 de

un equino de raza criolla y 2 de un animal de raza cruce belga, 1 aislamiento se obtuvo de

un equino de raza paso fino y 1 de un equino de raza cuarto de milla, lo que sesgaría el

análisis no solamente en cuanto a la variable raza sino también a las variables sexo y

edad.

Para la variable raza el 14,2% (n=1) de los animales correspondieron a Paso Fino

Colombiano, el 42,8% (n=3) fueron Criollos, el 28,5% (n=2) cruce Belga y el 14,2% (n=1)

Cuarto de Milla, en los animales evaluados en este estudio el mayor número de

aislamientos se hizo en un animal de la raza Criolla; sin embargo debido al escaso

número de aislamientos no es posible inferir que esta raza tenga una mayor presentación

de Malassezia como microbiota normal en la piel. En cuanto a la variable sexo en este

estudio se observó una mayor tendencia de presentación de Malassezia en las hembras

42,8% (n=3) y solo 1 macho (14.2%), sin embargo con estos resultados no es posible

inferir que en las hembras haya una mayor predisposición a la presentación de

Malassezia dados los escasos aislamientos obtenidos; para la variable edad estas

oscilaron entre 26 meses y 12 años, lo que indica una amplia variabilidad en las edades

de presentación, al igual que para las otras dos variables no es posible hacer inferencia

alguna dados los escasos aislamientos del microorganismo.

22

Tabla 5. Especies aisladas según variables como raza, género y edad.

ID PUJ

Edad

Raza

Sexo

Especie de Malassezia

300-1-1

26 meses

Paso fino

Colombiano

♂

M. slooffiae

300-5-13

12 años

Criollo

♀

M.obtusa

300-5-13A

12 años

Criollo

♀

Malassezia spp

300-5-13B

12 años

Criollo

♀

Malassezia spp

300-14-47

31 meses

Cruce Belga

♀

M.globosa

300-14-49

31 meses

Cruce Belga

♀

M. pachydermatis

300-15-53

5 años

Cuarto de

milla

♀

M. sympodialis

Adicionalmente a estos aislamientos, en el 6,10% (n=5) de las muestras se obtuvieron

otras levaduras como Cándida, las cuales fueron identificadas mediante pruebas como la

ureasa (negativa), crecimiento en sabouraud (positivo), adicionalmente se sembraron en

Medio CHROMagar Candida BD Becton-Dickinson®, que es un medio selectivo que se

utiliza para aislar e identificar la presencia de Cándida, por medio de cromógenos que

permiten identificar la especie (López, 2007), el 80% (n=4) de estos aislamientos fueron

identificados como Candida glabrata y el 20%( n=1) como Candida tropicalis. Finalmente,

en el 2,44% (n=2) de las muestras analizadas se aisló Cryptococcus sp el cual fue

identificado utilizando pruebas como la ureasa (positiva), crecimiento en agar sabouraud

presentando colonias blanquecinas de apariencia mucoide, que corresponden a lo

reportado en la literatura por Arenas, 2008 y de la tinta china en la cual al observarla al

microscopio se evidenciaron levaduras con cápsula.

23

6. CONCLUSIONES

La prevalencia de Malassezia para los animales evaluados en este estudio fue de

18,2%.

Se determinó la presencia de M. sympodialis, M. pachydermatis, M. slooffiae, M.

obtusa y M. globosa como microbiota normal en la piel de los equinos evaluados.

Los sitios anatómicos con mayor presencia de Malassezia en los animales

evaluados fueron glándula mamaria y canal auditivo.

Se evidenció una tendencia de mayor presencia de Malassezia en las hembras

No se estableció una relación entre la presencia de Malassezia spp y las

variables edad, sexo y raza.

7. RECOMENDACIONES

Para futuros estudios se recomienda realizar otras pruebas adicionales como

técnicas moleculares que permitan la identificación de los aislamientos que no

pudieron ser identificados hasta especie.

Por otro lado continuar con el estudio muestreando más equinos y en más zonas

de la piel como se ha reportado en la literatura como ano, dorso con el fin de

seguir caracterizando especies de Malassezia como microbiota normal en nuestro

país.

24

8. REFERENCIAS

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