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CAPITULO I:

INTRODUCCION A LOS FUNDAMENTOS

1.1 Introducción Genera

La primera parte de este libro trata de la producción y utilización de lasenzimas, mientras que la segunda es una recopilación de datos para usoindustrial y de una serie de aplicaciones de las enzimas. En este libro semenciona muchos temas, aunque solo unos pocos fueran objeto de análisisdetallado.

Desde que se publicó la primera edición de este libro M!"L DE#$%&E'!%L%() E!*$M+&$' hace ya - aos muchas de las posibilidadesteóricas se han cumplido. /in embrago, un gran n0mero de ellas a0n no se haaplicado a ni1el industrial, debido quizás a que fala la información cient23careal necesaria para su 45ito. %tro factor a tener en cuenta es el costo

económico de un proceso en un momento dado.

"na 1ez más el M!"L DE #$%&E'!%L%() E!*$M+&$' resume de formaconcisa los principios y practicas asociadas a las enzimas industriales en elmás amplio sentido, e5tendiendo su alcance al campo de las enzimas utilizadasen los laboratorios cl2nicos, donde el uso reiterado de estos procedimientosorigina una parte de la demanda industrial global de enzimas.

1.! Introducción a a "arte A de Manua de#iotecnoo$%a En&i'(tica II. Funda'ento) de Ai)a'iento *utii&ación indu)tria de a) en&i'a)

Los fundamentos más importantes implicados en la utilización de enzimas se

han ido aclarando cada 1ez más a medida que se ha a1anzado en el uso deenzimas inmo1ilizados en distintas formas. (ran parte de los mecanismos de lacin4tica enzimática clásica han tenido que readaptarse ante las e5igenciasparticulares de la formación de productos y en cada proceso han debidore1isarse alguna cla1es de la enzimolog2a.

Las enzimas se compran y se 1enden en función de su acti1idad más que de supeso. !o hace falta utilizar una enzima muy puri3cada, o modi3cada, más que



cuando la e5ija un proceso particular. /in embargo, la presencia de inhibidorespodr2a di3cultar la predicción del efecto de la enzima, especialmente ent4rminos de la cin4tica enzimática. Decidir si el proceso puede lle1arse a caborealmente a gran escala puede depender de esto.

Muchos de los principios importantes están asociados con el uso de reactorescon enzimas inmo1ilizadas. Esta parte de la ingenier2a enzimática tiene granimportancia a la hora de poner en práctica una aplicación particular de lasenzimas o las c4lulas inmo1ilizadas, pero en primer lugar la enzima tiene queser aislada e inmo1ilizada. lgunas de las aplicaciones más so3sticadas de lasenzimas se encuentran en bioqu2mica cl2nica, donde el uso de anticuerpos hapermitido el desarrollo de una gran 1ariedad de t4cnicas singulares, como elinmunoanalisis enzimático.

CAPITULO II:

E+TRACCION , PURIFICACION DE EN-IMAS , OTRAS PROTEINAS AGRAN ESCALA

!.1 INTRODUCCIN

Este cap2tulo está dedicadofundamentalmente al aislamiento ypuri3cación de prote2nas a partir de fuentesmicrobianas, aunque las t4cnicas descritaspueden utilizarse tambi4n a la e5tracción de

materiales a partir de tejidos 1egetales yanimales.

Las prote2nas bacterianas pueden clasi3carse en prote2nas e5tracelulares yprote2nas intracelulares, pudiendo ser las segundas a su 1ez ligadas o libres. Lapuri3cación de la prote2nas intracelulares requiere un proceso de ruptura de lac4lula, pero una 1ez que este se ha realizado, no e5isten diferenciasfundamentales en los procedimientos de puri3cación de estos grupos deprote2nas, e5cepto en que en el caso de las prote2nas e5tracelulares los1ol0menes implicados son mucho menores.

ntes de describir en detalle los m4todos indi1iduales utilizados en elaislamiento y puri3cación de prote2nas, merece la pena considerar lasrelaciones entre los procesos a pequea y gran escala. De las muchas t4cnicasdisponibles, no todas son adecuadas para trabajar a gran escala, debido arestricciones inherentes a las t4cnicas o a los aparatos disponibles al aumentodel tiempo que usualmente acompaa la transición a un proceso a gran escala.



En muchos casos el aumento de escala de estas t4cnicas no es práctico, y enotros el resultado no es el adecuado. De forma similar la ultracentrifugación esuna t4cnica de laboratorio 0til, pero no puede utilizarse con1enientemente enlos procesos a gran escala.

La de3nición de gran escala es un tema opinable, pero en el conte5to de estecap2tulo se referirá a los procesos que utilicen uno o más 6g de pasta dec4lulas h0meda. El termino e5tracción se utilizara para de3nir los m4todos deruptura de los microorganismos y los t4rminos aislamiento y puri3cación sereferirán a las otras t4cnicas implicadas en la obtención de un producto puro oespeci3co.

!.! E+TRACCIN POR M/TODOS 0UMICOS

!.!.1. 2cai)

Este m4todo se ha utilizado con considerable 45ito en las e5tracciones tanto a

gran escala como a pequea escala de di1ersas bacterias. El 45ito deltratamiento alcalino depende de la estabilidad del enzima en cuestión a p7ele1ado, este m4todo inacti1a las proteasas que pudieran e5istir, a la 1ezreduce la posibilidad de contaminación por pirógenos de las preparaciones deenzimas para usos terap4uticos. &ales m4todos tienen posibles aplicacionespara la inacti1ación y lisis rápida de los microorganismos por ingenier2agen4tica.

!.!.!. Li)o&i'a * EDTA

La lisozima es una enzima producida comercialmente a partir de la clara de

hue1o de gallina que cataliza espec23camente la hidrolisis de los enlaces 8999glocosidicos de los mucop4ptidos de las paredes de las c4lulas bacterianas. Lasbacterias (ram positi1as, en las que el mucop4ptido está más e5tendido por lapared dándole más rigidez que a las bacterias (ram negati1as, son mássusceptibles a la lisozima que estas 0ltimas. /in embargo la ruptura 3nal de laen1oltura celular depende de la presión osmótica del medio de suspensión una1ez rota la pared celular. En las (ram negati1as la ruptura de la pared celularrara 1ez se logra con la lisozima, sino que hace falta aadir ED& para producirla liberación de lipopolisacáridos de la en1oltura de la pared. El ED& act0aquelando los cationes di1alentes esenciales para la estabilidad de la pared lo

que hace que la lisozima pueda acceder y actuar en la capa del mucop4ptido.Esta t4cnica rara 1ez se utiliza para la e5tracción a gran escala de las enzimasbacterianas, dado el costo relati1amente ele1ado de la lisozima, aunque estesea comparati1amente pequeo frente al calor de una enzima puri3cada. Lalisis de la c4lula con lisozima es un m4todo sua1e, y puede ser el mejor cuandola enzima a puri3car es sensible a las ele1aciones de temperatura que seproducen durante los procedimientos f2sicos de lisis.



!.!.3. Deter$ente)

Los detergentes pueden ser compuestos iónicos, se combinan con laslipoprote2nas formando micelas. :or tanto, los constituyentes lipoproteicos delas membranas biológicas pueden solubilizarse o las membranas hacersepermeables. un no se conoce el mecanismo del complejodetergente;lipoprote2nas pero se cree que en el inter1ienen fuerzaselectrostáticas y fuerzas de 1an der <aals. La formación de estos se debe a sup7 y a la temperatura.

Los detergentes iónicos son más reacti1os que los no iónicos y puedes darlugar a la disociación de las lipoprote2nas, lo que a su 1ez conduceposteriormente a las desnaturalización, precipitación y a la hidrolisis de losenlaces pept2dicos de la prote2nas. :or esta razón los detergentes no sonideales para la e5tracción de enzimas.

'on todo, los detergentes se utilizan considerablemente en algunos procesosde e5tracción. Morris y Darlo= indicaron su utilidad en el fraccionamiento depart2culas 12ricas> el &ritón9? -- que es para la liberación a gran escala delcolesterol o5idas a partir de !ocardia /p.

!.!.4. S5oc6 "or En7ria'iento

El efecto del shoc@ por enfriamiento Auna reducción rápida de temperaturasdesde la normal de crecimiento a -B'C. La bibliograf2a al respecto indica que lasbacterias (ram negati1as son más sensibles a este proceso que las (rampositi1as. El efecto que tiene lugar solamente en condiciones especiales dalugar a una p4rdida de 1iabilidad y libera al medio ambiente un material queadsorbe a - nm, aminoácidos y &:.

/in embargo para la ruptura celular a gran escala el shoc@ por enfriamiento esuna t4cnica dif2cil de emplear. Los dos limitaciones son en primer lugar elchoque frio tiene un efecto muy pequeo o nulo en las suspensiones celularescon una densidad superior a -F;ml, y en segundo lugar que las bacterias sonconsiderablemente más susceptibles al shoc@ por enfriamiento cuando seencuentran en la fase de crecimiento e5ponencial. En el proceso a gran escala,el tamao del recipiente y los so3sticados equipos necesarios para asegurar el45ito de este tamao lo hacen in1iable.

!.!.8. S5oc6 O)'ótico

El shoc@ osmótico se ha utilizado en la e5tracción de enzimas hidroliticas yprote2na ligadoras a partir de bacterias (ran negati1as entre las que seincluyen la salmonella typhimurium y E. col, y en la liberación del D! debacteriófagos & mediante la ruptura de la capa proteica.El m4todo incluye el la1ado de las bacterias con una solución tamponada, para



liberarlas de medio de culti1o y posteriormente su introducción en una solucióntamponada de sacarosa al -G en la que se deja las c4lulas alcance elequilibrio, perdiendo parte de su agua interna, que se elimina de la suspensiónpor centrifugación. La pasta de c4lulas obtenida se dispersa rápidamente en aagua a unos HB'apro5imandenete. El s0bito aumento de la presión osmótica

del interior de las c4lulas hace que se produzca la liberación de algunosconstituyentes celulares. Este m4todo en algunos aspectos similar al del shoc@por enfriamiento.

Mediante el shoc@ osmótico solo se liberan de un H a un IG de las prote2nasbacterianas totales, aunque en muchos casos se 1e drásticamente reducida la1iabilidad. /i la enzima que se requiere obtener se localiza en la regiónperiplasmica, el shoc@ osmótico y el shoc@ por enfriamiento son equi1alentes,teniendo en cuenta que se puede obtener un aumento en la puri3cación de Ha - 1eces, comparado con otras t4cnicas de ruptura.

Este shoc@ es 0til en la e5tracción de enzimas que inacti1an losaminoglicosidicos periplasmicos, tambi4n es una t4cnica 1álida para laliberación de enzimas a partir de bacterias que 1i1en en aguas marinas, solo esnecesario resuspender las c4lulas en una disolución tamponada hasta alcanzarla lisis ya que el medio de culti1o contiene J- g;l de !a'l. El shoc@ osmótico noes apropiado para la liberación de enzimas de las bacterias (ram positi1asdebido a que los coco puedan tener presiones osmóticas internas del orden de- atm, mientras que en las (ram negati1as no ocurre esto.

!.3 E+TRACCIN POR M/TODOS FISICOS

!.3.1. SonicaciónEl t4rmino ultrasónico se utiliza para designar a los sonidos con frecuenciassituadas por encima del ni1el del o2do humano, es decir, a partir de - @7z,que e5presado en longitudes de onda, en los l2quidos los sit0a en una rango de a .H 5 -9H cm, órdenes de magnitud similares a los de la luz 1isible.

El choque de ondas sónicas o ultrasónicas pro1oca cambios de presión de milesde atmósferas, que rompen la pared celular. /e usa generalmente parabacterias y le1aduras y a 1eces, para determinados tejidos animales como elbazo, rión o eritrocitos. La sonicación puede causar efectos en la estabilidad

enzimática cuando las c4lulas se rompen por este m4todo, dicho cambio 1ar2adependiendo de factores asociados como el p7, temperatura, la fuerza iónicadel medio de suspensión y el tiempo de e5posición. La selección de una seriede condiciones es esencialmente emp2rica, 1ariando en función del organismoen particular y del producto a obtener.

unque se ha demostrado que el tratamiento con ultrasonidos es un m4todo0til y 1ersátil para trabajar a gran escala de laboratorio, su aplicación para la



disrupción de cantidades ele1adas de bacterias se 1e limitada por la di3cultadde transmitir su3ciente potencia a grandes 1ol0menes de suspensión.

!.3.!. Con$eación * De)con$eación

La congelación y descongelación pro1oca un 1alor menor al -G de liberación

de prote2nas solubles totales en una operación, incluso en las bacterias (ramnegati1as. Esta t4cnica se utiliza generalmente con otros m4todos ya que laspastas bacterianas son guardadas a K -B' antes de la e5tracción ypuri3cación de las enzimas. La congelación y descongelación puede dar lugar auna p4rdida de la acti1idad enzimática. equiere de periodos prolongados detiempo Ahasta J horasC para el congelamiento y descongelamiento.

!.3.3. Ci&aa Sóida

:aso de c4lulas congeladas A9- 'C a tra14s de ori3cio, en cuyo casos loscristales de hielo formados act0an como abrasi1os, se coloca la pasta en el

hueco cil2ndrico de un bloque metálico y se inserta un embolo de metal muyajustado, aplicándose unas -9N toneladas por pulgada cuadrada en ele5tremos del embolo. 'on este m4todo se rompe un gran porcentaje de lasc4lulas contenidas en una suspensión.

!.3.4. Trituración o A$itación con a9ra)io)

:ara la trituración se puede utilizar un molino para conseguir la disrupción delas bacterias pero requiere dos horas de funcionamiento. :ara esta t4cnicatambi4n se puede utilizar agitación con perlas de 1idrio las cuales son de -,Ja -, mm, a una 1elocidad de J-- a N-- sacudidas por minuto y cm de

amplitud. /e emplea la prensa francesa, consiste en el paso de las c4lulas agran presión por un pequeo ori3cio a una cámara con presión baja, lo cualocasiona la ruptura de las c4lulas por descompresión. La 3ltración al pasar lasc4lulas a tra14s de ori3cios a presión de diámetros reducidos que pro1ocan larotura de las membranas celulares.

!.3.8. Ci&aa Li;uida

"tilizaron un sistema de cizalla liquida para la disrupción de los cloroplastos, enel que la suspensión se hace pasar a tra14s de una 1ál1ula de aguja apresiones de hasta -.--- psi con un Oujo de unos - ml;min

Más recientemente se ha utilizado el homogenizador :P Manton (aulin parala disrupción de bacterias en continuo. Este aparato consiste en una bomba dedesplazamiento positi1o y una 1ál1ula ajustable con ori3cio muy pequeo. Lasc4lulas se hacen pasar a tra14s del homogenizador en suspensión en un l2quidoy a presiones de hasta NN M:a. :arece que son tres los mecanismos por losque se produce la ruptura de las c4lulas en estos aparatos. Las c4lulas sebombean a tra14s de una 1ál1ula sin retorno produciendo en la 1ál1ula



homogenizante la presión seleccionada. /eguidamente pasa a tra14s de unestrecho canal limitado por una 1ál1ula homogenizante y un anillo de impacto,momento en que la fuerza de cizalla ejercida es má5ima. Despu4s se reduce lapresión hasta la atmosf4rica cuando la suspensión alcanza la salida. Estasubida de reducción de presión es la tercera fuerza ejercida en la suspensión y

tiene un efecto disruptor. 'harm y Matteo indicaron que los homogenizadorespodr2an utilizarse en distintas formas, de paso simple, con recirculacióndiscontinua, etc. &ambi4n obtu1ieron ecuaciones para determinar el n0mero dec4lulas que quedan, y la 1elocidad global del procesoQ

Lo$ <R'=R' >R? @ NP!.B

DóndeQ R la cantidad de prote2na soluble liberada en g por gm de c4lulas.m R la cantidad má5ima de prote2na soluble liberada6 R la constante de 1elocidad dependiente de la temperatura

! R El n0mero de 1eces que la suspensión pasa a tra14s del aparato: R presión.S R Es el coe3ciente de e3cacia

La liberación de prote2na coincide con la disrupción celular, aunque algunasenzimas se liberen más lentamente y otras más rápidamente que la 1elocidadmedia de liberación de prote2nas. unque estas ecuaciones puedan usarsepara describir la liberación de prote2nas en condiciones muy determinadas, enla práctica su 1alor es limitado y las condiciones necesarias para un caso dadodeben ser determinadas emp2ricamente.

En general, las bacterias (ram negati1as se rompen más fácilmente que las(ram positi1as, y las condiciones de crecimiento, congelación y descongelacióninOuyen en la 1elocidad de liberación de la prote2na.

!.4 AISLAMIENTO , PURIFICACION

!.4.1. Se"aración de o) (cido) nuceico)

Los ácidos nucleicos se consideran como contaminantes, por lo que interesaeliminarlos del e5tracto manteniendo intactos las enzimas. La fuerza de cizalla,el p7 ele1ado, la fuerza iónica baja y la presencia de nucleasas dan lugar a ladesnaturalización de los ácidos nucleicos, y aunque en su puri3cación debene1itarse estas condiciones, en la puri3cación de enzimas tales factores puedenrepresentar una ayuda.

%tra forma para eliminar ácidos nucleicos se basa en la precipitación formandocomplejos entre los residuos fosfato con carga negati1a de las mol4culas deácido nucleico y los grupos cargados positi1amente del agente precipitante. Elcomplejo resultante puede eliminarse mediante centrifugación.



La precipitación de los ácidos nucleicos depende de la concentración de sal, delp7.

#romuro de cetiltrimetil amonio separación de ácidos nucleicos deMycobacterium tuberculosis, Mycobacterium phlei y /arcina.

/ulfato de estreptomicina separación de ácidos nucleicos en e5tractosde bacterias.

:olietilenoimina pol2mero catiónico de cadena larga agente precipitantede ácidos nucleicos muy e3caz como e5tracto de E. coli EM --J y deMicrococcus lysodie@ticus AcatalasaC.

&ratamiento con nucleasas elimina ácidos nucleicos de las suspensionesbacterianas como la ribonucleasa y la deso5irribonucleasa.

!.4.!. Concentración "or "reci"itación

Sulfato de amonio, durante muchos aos se ha utilizado el m4todo de saladode las prote2nas con objeto de lograr el doble propósito de puri3car y

concentrar algunas prote2nas espec23cas. La sal utilizada con frecuencia es elsulfato de amonio, por su gran solubilidad, ausencia de efectos perjudicialespara la mayor2a de las enzimas, no ser cara y, en algunos casos, por du efectoestabilizante de ciertas enzimas.

La teor2a del fraccionamiento enzimático mediante salado ha sido discutida por(reen y 7ughes y Di5on y <ebb. En soluciones concentradas los electrolitos ellogaritmo de la solubilidad de las prote2nas es una función lineal del aumentode concentración de sal. La ecuación que describe el proceso de salado esQ

log s=

B

1−

k

−1

s

r

2

DóndeQ/ R la solubilidad de la prote2na en g;l de solución.# R es una constante@9s R pendiente de la l2nea es la constante de salador R la fuerza iónica en moles;litro.

El 1alor de # depende de la sal usada, y puede 1ariar con el p7, latemperatura y la naturaleza de la prote2na en solución. :or otro lado @9 esindependiente al p7 y la temperatura pero 1aria con la prote2na y la sal usada.

"na solución proteica de concentración usada puede precipitar a una fuerzaiónica seg0n la ecuaciónQ

r

2=

B1−log s

k −1

s



'omo apuntan 'harm y Matteo solo se puede obtener resultados cuando el p7,la temperatura y la concentración de prote2na son constantes y estascondiciones la concentración de sal requerida para precipitar una enzima 1ariacon la concentración del enzima.

El uso de sulfato de amonio en la puri3cación de enzimas ha sido descrito pormuchos autores por ejemplo la e5tracción de penicilinasa de E. coli. Laprecipitación de sulfato de amonio de prote2nas no deseadas mejora laacti1idad espec23ca cuatro 1eces y el aumento de la concentración de sulfatode amonio hasta el NG para precipitar la penicilinasa da lugar a la puri3caciónglobal cinco 1eces superior, a la 1ez que reduce el 1olumen desde unos -litros a un peso de pasta de .H 6g.

Solventes orgánicos la adición en soluciones acuosas de prote2nas reduce lasolubilidad de estas al reducir la constante diel4ctrica del medio. :araprecipitar las prote2nas se pueden usar 1arios sol1entes orgánicos, como el

metanol, etanol y 9propanol, que son los más usados, aunque tambi4n seutiliza la acetona o el 4ter et2lico estos tienen la gra1e des1entaja de su graninOamabilidad.

:ara trabajar a gran escala la precipitación, y concentración de enzimas consol1entes orgánicos no se utiliza ampliamente porque aunque el grado deprecipitación sea alto, la naturaleza inOamable de los materiales junto con sucosto ele1ado hacen de este m4todo menos atracti1o que otros.

:ol2meros de peso molecular ele1ado para el fraccionamiento de las prote2naspueden usarse otros precipitantes orgánicos, como los pol2meros solubles en

agua entre los que destaca el polietilenglicol por ser más usado, que tiene las1entaja de no ser tó5icos, ni inOamable y que no desnaturaliza a las prote2nas.

!.4.3. Concentración "or utratración

/e considera como un sistema 1alido de puri3cación de algunas prote2nasusando diferentes e5istentes entre los pesos moleculares de la prote2nadeseada y de las no deseada.

/e puede considerar como una de las t4cnicas de 3ltración que incluyenosmosis in1ersa, ultra3ltración, 3ltración de micropart2culas y 3ltración depart2culas, con un cierto solapamiento entre la ultra3ltración y la 3ltración demicropart2culas.

7ay dos tipos de membranas una de ultra3ltro microporoso de membranar2gida con una serie de ori3cios al azar pequeo, debido a que la part2culaspequeas atra1iesan la membrana mientras que las grandes quedan retenidas,las part2culas de tamao medio pueden quedar bloqueados siendo el resultado3nal el bloqueo del 3ltro para la mayor2a de mol4culas e5cepto las muy



pequeas formándose un 3ltro de poro más 3no. :ara minimizar el bloqueo del3ltro se puede usar una membrana con tamao de poro medio claramenteinferior al tamao de las part2culas de soluto a retener.

El ultra3ltro de difusión es una esencia de membrana de gel hidró3lohomog4nea a tra14s de la cual los sol1entes y solutos son transportados pordifusión molecular bajo la acción de un gradiente de concentración o deacti1idad.

Las membranas de ultra3ltración se han con1ertido en una herramienta muy0til para aislar y puri3car enzimas a gran escala debido en gran mediad a esosa1ances.

La membrana anisótropa consiste en una capa muy 3na, muy compacta,soportada por una subestructura porosa relati1amente gruesa que act0a comosoporte. La 1entaja de este tipo de membrana es que no tiene poros en elsentido tradicional por lo que la permeabilidad del sol1ente a presión constanteno se reduce.

El transporte de soluto dentro de la membrana está controlado por la ley de3c@, lo que signi3ca que al aumentar el Oujo del sol1ente por un incremento dela presión el Oujo se soluto solo 1aria poco, de forma que la e3cacia de lasmembranas aumenta.

El diseo del equipo de ultra3ltración se hace de tal forma que la capa depolarización sea m2nima, en equipos de gran escala se emplean 1elocidades deOujo altas a tra14s de 3bras huecas. Las caracter2sticas de ultra3ltración deuna prote2na pueden 1ariar en función de ciertos factores.

La concentración de sal, su naturaleza, el p7 inOuyen en la retención deenzimas, manipulando estos factores se puede incrementar considerablementela puri3cación por ejemplo I 1eces la penicilinasa de la E. coli. En 1ista de estoy teniendo en cuenta la relati1a facilidad para aumentar la escala a partir deprocesos de laboratorio, la ultra3ltración parece ser una potente para trabajara gran escala en la puri3cación y concentración de enzimas

!.4.4. Concentración "or ioi&ación

La lio3lización se puede utilizar para la concentración de prote2nas, su empleo

es limitado, ya que al menos la concentración de sal sea baja, se puedenformar mezclas eut4cticas, lo que dar2a lugar a un secado incompleto o laformación de gran cantidad de espuma y desnaturalización de las prote2nas.Estos problemas pueden e1itarse controlando cuidadosamente la temperaturade la masa congelada para mantener una temperatura por debajo de más bajode los puntos eut4cticos. &ambi4n puede ser necesario reducir la concentraciónde sal antes de la lio3lización.



:uesto que se dispone de otro m4todo de concentración de prote2nas, esteprocedimiento se reser1a para la preparación que deben ser almacenados otransportados.

/e han lio3lizado muchas prote2nas diferentes sin que se haya obser1adodesnaturalización o p4rdida de acti1idad.

/in embargo no es raro encontrar que algunas prote2nas se desnaturalizan ypierden totalmente su acti1idad biológica. Esto parece especialmente cierto enaquellas prote2nas compuestas por subunidades, y los estudios con catalasa ymiosina proporciona información 0til.

!.4.8. Cro'ato$ra7%a en $e

/u inter4s radica en su capacidad para fraccionar y puri3car enzimas y desdeeste punto de 1ista se hará las consideraciones oportunas acerca de las

estructuras de geles, y sobre la teor2a general que controla la separación de loscompuestos biológicamente acti1os en función de su peso molecular y suforma.

En SNS :orath y Tlodin lograron separar prote2nas utilizando de5tranoentrecruzado en un proceso cromatogra3co.

El grado de entrecruzamiento está controlado por la cantidad de epiclorhidrinautilizada, que a su 1ez controla el grado de hidratación Aagua atrapada dentrode la matriz del gelC y por tanto la porosidad. 'uanto mayor sea la cantidad deagua atrapada por unidad de peso del gel seco, mayores serán las especies

moleculares fraccionadas e in1ersamente, cuanto mayor cantidad de matriz dede5trano haya por unidad de peso de gel seco, más pequeas serán lasmol4culas que se fraccionaran.

s2, si se coloca en la cabeza de la columna de un gel con poca agua atrapada,es decir, con alto grado de entrecruzamiento, una mezcla de sustancias de altoy bajo peso molecular, las especies con peso molecular alto pasaran por lacolumna en la fase mó1il, y serán las primeras en salir, mientras que las



especies con peso molecular menor se retardaran debido a su paso a tra14sde su fase estacionaria situada dentro del gel.

El proceso de cromatograf2a en gel consiste en el reparto de las mol4culas desoluto entre la fase mó1il de sol1ente y la fase estacionaria, construida por losespacios e5istentes entre las part2culas porosas del gel. El mecanismo de estat4cnica es más fácil de comprender si se considera que el gel tiene unaestructura porosa similar a la del pan. La fase mó1il es el l2quido que circula porel interior de las part2culas del interior de las part2culas del gel, y se conocecomo 1olumen 1ac2o APoC, mientras que la fase estacionaria es el l2quido queocupa el interior de las part2culas de gel APiC. El soluto se distribuye por difusiónentre la fase estacionaria y la mó1il. El 1olumen ocupado por la matriz del gelAPgC tambi4n contribuye al 1olumen total de la columna APtC, que esQ

Vt = Vo + Vi + Vg

!.4.. Cro'ato$ra7%a de interca'9io iónico

E5isten tres tipos de intercambiadores de iones, las resinas, las celulosas y losgeles de agarosa y de5trano cambiadores de iones> los 0ltimos son los másutilizados, aunque las resinas son 1álidas en una escala más limitada.

Resinas cambiadoras de iones: (eneralmente se pueden describir comopol2meros insolubles en agua que contienes grupos catiónicos o aniónicos. Lanaturaleza del grupo funcional 1aria, aunque en general son , en el caso de loscambiadores catiónicos, 7U y en los cambiadores aniónicos %79 , donde representa la resina pol2mero. El cambio de los iones 7U u %79 puedeproducirse por iones combinados por un ácido o base más d4biles, en este casolas prote2nas, y por tanto las mol4culas de prote2na se unirán re1ersiblementea la resina.

Las resinas tienen la 1entaja de ser estables a los esfuerzos mecánicosencontrados usualmente, además tienen una gran capacidad para adsorber



prote2nas y sedimentan rápidamente y cuando estánempaquetadas en columnas permiten altas1elocidades de Oujo.

La gran capacidad de estos materiales esfrecuentemente una des1entaja cuando se utilizadapara la puri3cación de prote2nas, puesto que laprote2na no puede resistir las duras condicionesnecesarias para la elución de estas resinas. !oobstante, las resinas cambiadoras de iones se hanusado con 45ito en la puri3cación de algunasprote2nas.

Celulosas cambiadoras de iones: dentro de lacelulosa pueden introducirse una gran 1ariedad degrupos cargados, bien catiónicos o aniónicos, por

1arios procedimientos qu2micos ./in embargo, el ni1el de sustitución esusualmente muy bajo, y la capacidad de estas celulosas es la d4cima parte delas resinas. Esto hace que la elución de los poli electrolitos se pueda lle1ar acabo en condiciones sua1es. demás sustituciones de meq;g pueden lle1ar ala solubilización de la celulosa, claramente indeseable.

Otros geles cambiadores de iones: la celulosa ha sido el medio tradicionalde lle1ar a cabo la cromatograf2a de cambio de iones para las prote2nas. /inembargo, en los 0ltimos aos se han introducido otros intercambiadores deiones, que generalmente tienen unas propiedades de Oujo superiores.

La cromatograf2a de intercambio iónico puede diferenciar entre loscomponentes de una mezcla polielectrol2tica en base a la carga transportadapor cada electrolito indi1idual. /in embargo, la carga neta, densidad de carga ytamao molecular de una prote2na as2 como el p7 y la fuerza iónica de lasolución son parámetros que inOuyen en el proceso. El coe3ciente de particiónes una e5presión que relaciona el n0mero de mol4culas e5istente de unelectrolito particular con el sol1ente unidas a la fase estacionaria en equilibrio.

:or tanto cuanto mayor sea el n0mero de equilibrios al que se 1e sometida unamezcla polielectrol2tica, mayor será la resolución. La e3cacia de la resolucióntambi4n está relacionada con la capacidad de los cambiadores> cuanto mayor

sea la capacidad mayor será el n0mero de equilibrios, lo que a su 1ez reducelas diferencias en el coe3ciente de reparto requeridas para separar diferenteselectrolitos.

En el aislamiento a gran escala de enzimas, la cromatograf2a en columna sereser1a a las etapas 3nales de puri3cación, debido a los grandes 1ol0menesque hay que manejar en las iniciales. /in embargo, los cambiadores de iones seusan ya en las primeras etapas de la separación cuando se emplean t4cnicas



discontinuas Ven baoW. En este caso el polielectrolito se une al cambiador detal forma que en cualquier momento la mayor parte este asociado a la matriz,pudi4ndose hablar de que esta inmo1ilizado. (eneralmente las condicionesrequeridas para que se produzca la inmo1ilización de enzimas se obtienecuando los enlaces electrostáticos formados son fuertes, lo que e5ige que la

carga del polielectrolito sea alta y opuesta al cambiador. !ormalmente lospolielectrolitos básicos Apunto isoel4ctrico por encima de p7R I,-C sonadsorbidos por cambiadores catiónicos Apor ejemplo, 'M celulosaC a un p7inferior a la del punto isoel4ctrico, y los polielectrolitos ácidos Apuntoisoel4ctrico por debajo del p7 R I,-C son absorbidos por cambiadores aniónicosApor ejemplo, DED celulosaC a un p7 por encima del punto isoel4ctrico. :ortanto, es importante conocer el punto isoel4ctrico del polielectrolito particular.Despu4s de haber elegido el cambiador a usar, son importantes la elección delp7 y la fuerza iónica.

El p7 debe ser tal que las cargas del cambiador y del polielectrólito sean altas,

mientras que la fuerza iónica debe elegirse de tal forma que la sal ayude apreser1ar la acti1idad y solubilidad del enzima, pero sin que seasu3cientemente alta para que compita selecti1amente con el enzima por lospuntos acti1os del cambiador. /i las condiciones se eligen correctamente, elenzima se adsorbe en el cambiador, se la1a con una solución para liberarlo detodas las prote2nas no unidas y despu4s se eluye del cambiador.

Los m4todos de elución usados com0nmente son el cambio del p7, el aumentode la fuerza iónica o una combinación de ambos. 'ambiando el p7 de unasuspensión de un cambiador catiónico de ácido a alcalino, con un enzimabásico adsorbido, se reduce la carga tanto del cambiador como del enzima, porlo que los enlaces electrostáticos se rompen y el enzima se libera. 'uandoaumenta la fuerza iónica, aumenta la competición por los sitios ocupados por elenzima, hasta que se alcanza un punto en el que el enzima es liberado. 'uandoel enzima es especialmente sensible a los cambios de fuerza iónica o de p7 secombinan ambos procesos. La desorción fraccionada puede ser 1entajosacuando se hayan adsorbido 1arios polielectrólitos en un mismo cambiador,proceso controlado a menudo 1ariando tanto el p7 como la fuerza iónica. Losenzimas de punto isoel4ctrico alejado de la neutralidad se pueden puri3car engeneral más fácilmente utilizando la cromatograf2a de cambiadores de iones enun proceso discontinuo. En el caso de la L9asparraginasa, que tiene un punto

isoel4ctrico de F,, se puede obtener una puri3cación -- 1eces mayor usando'M celulosa en un proceso discontinuo.

&ambi4n se utilizan las t4cnicas discontinuas para eliminar contaminantes talescomo los ácidos nucleicos. El aumento en la puri3cación de la prote2na puedeser marginal, pero las etapas posteriores con frecuencia mejoran por laeliminación de estos electrólitos, grandes y con carga alta.



La adsorción discontinua y subsecuenteelución puede parecer algo burda por noe5plotar la capacidad de fraccionamiento dela t4cnica de cambiadores de iones en sutotalidad> sin embargo, ha demostrado ser

una t4cnica 0til que permitesimultáneamente una puri3cación yconcentración pre1ias a la utilización dem4todos más so3sticados.

!.4.. Cro'ato$ra7%a de anidad

La cromatograf2a de a3nidad quizás sea laforma más elegante de puri3car, prote2nasindi1iduales a partir de una mezcla compleja./in embargo, aunque se emplea con

frecuencia a escala de laboratorio rara 1ez seutiliza en la puri3cación de prote2nas a granescala. La cromatograf2a de a3nidad se basa en la interacción más o menosespec23ca entre una prote2na y un ligando inmo1ilizado, que está incluido enuno de estos dos grupos principalesQ

AaC quellos que sean espec23cos para la prote2na deseada, en cuyo caso elligando es generalmente un anticuerpo, un substrato, un substrato análogo oun inhibidor.

AbC quellos que interaccionan con 1arias prote2nas, y que pueden ser

espec23cos para las diferentes clases de enzimas, como el NX M:, X,NX D: o!DU, o que interaccionan con un amplio rango de prote2nas tales corno lascadenas hidrocarbonadas o algunos colorantes. Es esencial que la interacciónsea re1ersible. /e pueden emplear una gran 1ariedad de eluyentes paradesorber una prote2na de un ligando de a3nidad, que 1an desde m4todos noespec23cos como el incremento de la fuerza iónica o la alteración del p7 hastam4todos espec23cos que usan el cofactor o ligando libre. La matriz a la que elligando se una debe tener las siguientes propiedadesQ AaC #aja reacti1idad conlas prote2nas en general, para e1itar las adsorciones no espec23cas.

AbC #uenas 1elocidades de Oujo de sol1ente despu4s de acoplarse el ligando.

AcC Debe tener grupos qu2micos que puedan modi3carse de tal forma que lamatriz no se dae.

AdC Estos grupos qu2micos deben ser abundantes, permitiendo lograr una grancapacidad despu4s del acoplamiento.



AeC Deben ser estables mecánica y qu2micamente dentro de las di1ersascondiciones requeridas para el acoplamiento y la elución.

AfC Deben ser porosos y formar redes hidro3licas que permitan el paso libre delas mol4culas grandes, y preferiblemente deben ser part2culas uniformes,esf4ricas y r2gidas.

unque se han introducido otros agentes acoplantes, el m4todo del bromuro decianógeno es el más usado, a pesar de la to5icidad de este producto, ya que esrelati1amente simple y da un buen rendimiento, Este m4todo puede tambi4nutilizarse para introducir grupos espaciadores hidrofóbicos en la matrizacoplando ,9diamino he5ano o ácido 9amino he5anoico a una matrizacti1ada con bromuro de cianógeno.

Estas t4cnicas de acoplamiento se pueden usar para unir pequeas mol4culas,como cofactores o substratos, o mol4culas grandes como anticuerpos, a unsoporte sólido. Las condiciones necesarias para la absorción y elución de unaprote2na de una matriz de a3nidad son e5tremadamente 1ariables y han sidoe5tensamente re1isadas.

En t4rminos generales la absorción tiene lugar en un medio de fuerza iónicabaja y p7 neutro. La elución no espec23ca puede lle1arse a cabo por un cambiodel p7, la fuerza iónica o la temperatura. La elución bioespec23ca, que confrecuencia permite obtener un alto grado de puri3cación, se puede lle1ar acabo mediante el substrato o un análogo del substrato.

pesar de la gran cantidad de bibliograf2a e5istente respecto a lacromatograf2a de a3nidad y su indudable impacto en la puri3cación deenzimas, es raro su uso a gran escala. /e pueden encontrar referencias delempleo de la cromatograf2a de a3nidad a gran escala para puri3car enzimas.Las principales razones para esta falta de aceptación son quizás el ele1adoprecio de la matriz, la inestabilidad de muchos ligandos biológicos, lacomplejidad de la qu2mica implicada en el acoplamiento a la matriz y la bajacapacidad de muchos ligandos. /in embargo, en determinadas circunstanciasla cromatograf2a de a3nidad puede dar e5celentes resultados. obinson et al.ASIHC han descrito la puri3cación automática a gran escala de la beta9galactosidasa del E. coli utilizando como ligando el p9aminofenil9beta9galactopiranósido.

"n tipo de cromatograf2a de a3nidad que no tiene las des1entajas comentadasantes es la cromatograf2a de a3nidad con colorantes, que utiliza colorantesreacti1os inmo1ilizados. El uso de estos colorantes ha sido re1isado por Dean y<atson ASSC. La cromatograf2a de a3nidad con colorantes ha sido empleadarecientemente para puri3caciones a gran escala de enzimas tan di1ersos comoel alcohol deshidrogenasa del h2gado de caballo.



Los colorantes act0an corno ligandos de pseudoa3nidad y se unen a un ampliorango de prote2nas, frecuentemente con un grado de especi3cidadsorprendente. Las prote2nas unidas pueden eluirse no espec23camenteincrementando la fuerza iónica o bioespec23camente utilizando un substrato ocofactor. Desde el punto de 1ista práctico los colorantes reacti1os tienen

numerosas 1entajas, ya que se pueden conseguir fácilmente y en grancantidad, no son caros, y pueden acoplarse a un soporte en condicionesalcalinas sua1es, sin necesidad de emplear compuestos tó5icos. "na 1ezacoplados, el enlace resultante es estable y la capacidad del conjugado es alta.demás la capacidad de un colorante puede ser unas - 1eces mayor que lade un ligando nucleótido en el caso, por ejemplo, de la malato deshidrogenasabacteriana.

!.4.. Ad)or9ente) no e)"ec%co)

7idro5ilapatito. El hidro5ilapatito A7C se ha usado durante mucho tiempo en

t4cnicas discontinuas para la puri3cación de enzimas, se desarrollaron unacolumna cromatogra3ca de 7. El m4todo ha ido ganando aceptaciónlentamente entre los qu2micos de las prote2nas, debido seg0n ernardi ASIC alas razones siguientesQ

AaC La laboriosa preparación del hidro5ilapatito.

AbC El desconocimiento de los mecanismos de interacción entre las prote2nas yesta substancia.

AcC La introducción en SN por :etersen y /aber de intercambiadores iónicosbasados en la celulosa.

La preparación a escala de laboratorio del hidro5ilapatito cristalino ha sidodescrita por 1arios

t@inson et al. ASIJC publicaron un m4todo sencillo y barato para producirhidro5ilapatito a gran escala, con un tamao de cristal uniforme y que ten2abuenas 1elocidades de Oujo y gran capacidad de adsorción. Estos 0ltimosautores han comentado que el hidro5ilapatito comercial es caro yfrecuentemente poco 3able en lo que respecta a la estructura de sus cristales,la 1elocidad de Oujo y la capacidad de adsorción.

#ernardi y 6a=asa@i propusieron un mecanismo de interacción entre lasprote2nas y el hidro5ilapatito en SF, en el que se relaciona la inOuencia de lasestructuras secundaria y terciaria de las prote2nas con su comportamientocromatográ3co. En 6a=asa@i y #ernardi ASI-a,bC y 6a=asa@i ASI-a,bC sediscuten los parámetros que determinan la resolución de las columnas dehidro5ilapatito y las bases teóricas de la cromatograf2a de macromol4culas conestructura r2gida. #ernardi ASIC considera que la cromatograf2a en



hidro5ilapatito deber2a usarse como una herramienta en la puri3cación deprote2nas, puesto que la base de la separación es diferente de la de loscambiadores de iones o de la la 3ltración en gel.

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