Búsqueda de las moléculas del complejo inflamosoma en el queratinocito humano.

Proyecto SIP: 20080977

Director: Dr. Mario Eugenio Cancino Diaz

RESUMEN

El complejo inflamosoma está formado por múltiples proteínas citosólicas,

donde la función de estas tiene como resultado final la liberación de la citosina IL-1beta. El complejo ha sido descrito principalmente en macrófagos y en este trabajo se buscó en el queratinocito activado con diferentes PAMP´s. En la psoriasis la inflamación de la piel es la principal característica de esta enfermedad.

Con las técnicas de ELISA, RT-PCR e inmunohistoquimica se encontró que el queratinocito es capaz de producir IL-1beta biológicamente activa vía complejo inflamosoma y nuestros resultados sugieren que la molécula central del ensamble de este complejo, cuando los queratinocitos se estimulan con Poly I:C es NALP3. El Poly I:C es un análogo del dsRNA el cual señaliza vía TLR3. Otros PAMP´s como LPS y PGN no inducen la activación de IL-1beta en los queratinocitos; sin embargo si se detectó por inmunofluorescencia e inmunocitoquimica ésta citosina en su fase inactiva. Los resultados muestran que CASP-1, NALP3 y ASC aumentan en los queratinocitos de manera evidente con Poly I:C y no se nota con LPS y PGN. Estos resultados sugieren que el queratinocito secreta IL-1beta y puede contribuir en el proceso inflamatorio bajo ciertos estimulos.

INTRODUCCIÓN

La psoriasis es la alteración inflamatoria de la piel, muy frecuente, caracterizada por brotes de erupción en placas rojas escamosas, de predominio sobre codos, rodillas, tronco, manos/uñas y cuero cabelludo.

La alteración principal y más evidente en la psoriasis es la hiperproliferación celular epidérmica. En condiciones normales, las células del estrato basal de la epidermis se dividen por mitosis dando lugar a dos nuevas células, las cuales van madurando y ascendiendo a estratos superiores hasta llegar al estrato corneo en donde su queratinización se ha completado y, después de aproximadamente 28 días a partir de su nacimiento en el estrato basal, mueren y se desprenden de la piel. La piel psoriática se caracteriza porque este ciclo se completa en tan solo 4 días; así, los queratinocitos se van acumulando y la piel se va haciendo hiperplásica lo cual clínicamente se manifiesta por placas gruesas y con abundantes escamas. Cual o cuales factores son los que inducen ésta respuesta epidérmica es motivo de investigación constante. Aunque existe una compleja interrelación entre células epidérmicas y dérmicas con la liberación de múltiples citocinas, neuropéptidos y otras sustancias que participan en el proceso de inflamación, parece ser que la célula más importante y quizá el gatillo que active la hiperproliferación de los queratinocitos sea el linfocito T.

Las células de Langerhans, residentes en la epidermis, reconocen, procesan, y presentan los antígenos a los linfocitos T Como parte del proceso normal1

Algunos haplotipos del sistema principal de histocompatibilidad (HLA) han sido relacionados con la psoriasis, principalmente el HLA-Cw6. Recientemente se reportó el hallazgo de un gen de susceptibilidad para psoriasis familiar localizado en el extremo distal del brazo largo del cromosoma 17. Se han estudiado grupos grandes de gemelos en que por lo menos uno de ellos tiene psoriasis, encontrándose que en las parejas dizigotas la concordancia de la enfermedad es de 23% mientras que en los monozigotos es del 70%; como la concordancia en monozigotos no es del 100% como sería esperado en una enfermedad de origen genético, es evidente que existe una importante contribución de factores ambientales. En el caso de la psoriasis en gotas se ha demostrado la importante participación del Streptococcus pyogenes. Muchos otros enfermos expresan lo que se llama "fenomeno de Köebner" que consiste en que después de un trauma a la piel (p.ej. un rasguño o una abrasión), desarrollan una placa de psoriasis sobre y con la morfología del área dañada. Múltiples fármacos se han asociado a

, los queratinocitos inician el proceso de la diferenciación terminal para restaurar la barrera epidérmica. Sin embargo, si el proceso de la recuperación o de la barrera se deteriora, en la piel puede presentarse un estado inflamatorio

exacerbación de la psoriasis; de ellos el más relacionado es el litio, pero también los beta-bloqueadores, antipalúdicos o la supresión corticosteroidea. El tabaquismo, alcoholismo y estrés también pudieran modificar la severidad de la enfermedad aunque ésto no está totalmente demostrado.

RESPUESTA INMUNE INNATA

El sistema inmune permite al organismo discriminar entre lo propio y lo extraño y reaccionar contra lo no-propio. La respuesta inmune es inducible, tiene memoria; además es especifica, y posee la habilidad de reconocer un número prácticamente ilimitado de antígenos debido a que es diversa, esta propiedad es producida por el re-arreglo de los genes de las inmunoglobulinas y por el re-arreglo de TCR, otro mecanismo de diversidad las mutaciones somáticas de los genes de respuesta inmune. Existen mecanismos constitutivos de resistencia conservados que se les conoce como inmunidad innata, donde intervienen fagocitos y células NK que participan en la inmunidad innata. Entre las moléculas responsables de la inmunidad innata destacan las proteínas del complemento, los péptidos antimicrobianos como las defensinas, BPI, colectinas, el surfactante pulmonar y la proteína de unión de manosa (MBP). El concepto de inmunidad innata fue propuesto por Janeway, y tiene como base el patrón de reconocimiento de receptores de agentes infecciosos, que producen una respuesta inmune llamada patrones moleculares asociados a patógenos. El descubrimiento de los receptores parecidos a Toll (TLR) demostró la existencia de estos patrones de reconocimiento; los TLR se expresan en células dendríticas y contribuyen a la maduración funcional para la respuesta inmune adquirida.

Los TLR´s son una familia de receptores transmembranales que se caracterizan por poseer un dominio extracelular rico en leucinas, al que se le conoce en inglés como leucine-rich repeat (LRR), y un dominio intracelular llamado Toll/IL-1 (TIR) por sus siglas en inglés. La mayoría de los TLR funcionan como homodímeros, pero también pueden formarse heterodímeros funcionales TLR1/TLR2 y TLR2/TLR6.

El reconocimiento de los PAMPs por los TLR´s provocan la activación de diferentes cascadas de señalización intracelular que, a su vez, conducen a la expresión de varias moléculas efectoras como: péptidos antimicrobianos, citocinas proinflamatorias, etc.

Entre las citocinas proinflamatorias tenemos la interleucina-1β(IL-1 β), que junto con el factor de necrosis tumoral (TNF- β) son definidas como citocinas de alarma. La IL- β es secretada por macrófagos principalmente. La IL-1 β puede causar la inflamación y, también induce la expresión de otros genes proinflamatorios como la oxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), la interleucina 6 y otras citocinas o quimiocinas. Más aún, la IL-1 β incrementa la expresión de moléculas de adhesión que promueven la infiltración de leucocitos de la sangre hacia los tejidos2

Los macrófagos y los neutrófilos contienen el inflamasoma, un complejo de proteínas que tienen diferentes funciones en el sistema de defensa natural. Los

.

La IL- 1 β es sintetizada inicialmente como una molécula precursora inactiva (proIL-1 β), dentro de la célula. La proIL -1 β debe ser primero activada para entonces ser secretada. La caspasa 1, también conocida como ICE (IL-1 β - converting enzyme), es la responsable de procesar la IL-1 β para su activación. La Caspasa1 rompe la proIL-1 β intracelularmente produciendo una IL-1 β madura, que es secretada al espacio extracelular.

EL COMPLEJO INFLAMASOMA.

El inflamasoma es una estructura conformada por proteínas intracelulares implicadas en el inicio de la respuesta inflamatoria por estímulo intracelular. Se destacan las NALP3 (también conocidas como criopirinas) por ser partícipes en las fiebres periódicas hereditarias, grupo de trastornos caracterizados por episodios recurrentes de fiebre e inflamación localizada severa, a veces con erupción (y no estar relacionados con un agente infeccioso o tumoral), duración variable (de días a semanas, separados por intervalos libres de síntomas de amplitud variable y periodicidad más o menos regular), de base hereditaria (casi todos) y por trastornos relacionados con la reacción inflamatoria de la inmunidad innata o natural.

El ensamblaje y la activación del inflamasoma es un proceso esencial en los mecanismos naturales de defensa inmune. El inflamasoma es una plataforma de multiproteínas citosólicas que permite la activación de las caspasas proinflamatorias, las cuales transforman el precursor de la interleucina-1beta (pro-IL-1beta) a la forma activa, lo que conduce a una poderosa respuesta inflamatoria. Por otra parte, se ha demostrado que algunas patologías autoinmunes están provocadas por la proteína criopirina, producida por el gen CIAS1, y que pertenece a la familia de proteínas NALP´s, las cuales en principio, protegen a las células contra las infecciones microbiológicas.

miembros de la familia de proteínas "NALP" (que incluye a la criopirina) son los principales bloques del inflamasoma. Dos tipos se han descrito detalladamente: el inflamasoma NALP1 y el inflamasoma NALP3 o criopirina, pero probablemente hay muchas más variantes. La estimulación de la criopirina da lugar a una serie de reacciones internas que provocan en última instancia la activación de la citocina proinflamatoria interleucina-1 beta (IL-1 B).

Esta interleucina, alternadamente, es secretada por el macrófago y los desencadenadores del ciclo de acontecimientos moleculares que dan lugar a la inflamación. Se presume que el inflamasoma actúa como un sensor temprano capaz de detectar las señales de peligro que amenazan a la célula y fijar los mecanismos de defensa de las personas. Aunque esta hipótesis es atractiva, se desconocen los acontecimientos críticos del montaje, y por lo tanto, la activación del inflamasoma.

La criopirina, o NALP3, es el principal componente central del inflamasoma. La proteína contiene tres dominios: un dominio pirina (PYD), un dominio de oligomerización del nucleósido (NOD) y un dominio de repeticiones ricas en leucina (LRR). Otros componentes del inflamasoma son el ASC (proteína que contiene un dominio de reclutamiento y activación de caspasas: CARD), cardenal y procaspasa-1.

Recientemente, tres artículos publicados en la revista Nature sugieren, que a través del descubriendo y el estudio de la criopirina, señalan haber tropezado con la piedra angular de la inmunidad innata: un sistema altamente conservado y específico que detecta la presencia de microorganismos. Los grupos de Kanneganti y Mariathasan se centraron en el papel del inflamasoma criopirina para la detección de agentes infecciosos. Kanneganti y colaboradores demostraron que los macrófagos que carecen de criopirina jamás producen interleucina-1 beta activa en respuesta al ARN bacteriano o en respuesta a dos coadyuvantes vaccíneos.

A su vez, Mariathasan y colegas demostraron que los macrófagos criopirina-deficientes no responden eficientemente a los desafíos con Staphylococcus aureus o Listeria monocytogenes.

Ambos grupos demostraron la especificidad del inflamasoma criopirina. Por ejemplo, el grupo de Mariathasan concluyó que el reconocimiento de la bacterias gram-negativas Salmonella typhimurium y Francisella tularensis por los macrófagos no depende de la presencia de criopirina pero requiere de otros

componentes propios del inflamasoma Por otra parte, El grupo de trabajo de Martinon estudió el papel de la criopirina en la detección de cristales de urato. Se sabe hace más de 200 años que la deposición de tales cristales causa inflamación en las articulaciones de los pacientes con gota, pero el cómo sucede aún es algo desconocido.

Estos investigadores han demostrado que el urato monosódico (el cristal en la gota) y el pirofosfato de calcio dihidratado (el cristal en la pseudogota) son detectados por el inflamasoma criopirina, el cual entonces inicia la cascada inflamatoria por la activación de la interleukina-1 beta. El inflamasoma parece ser un factor clave en la iniciación: macrófagos peritoneales de ratones deficientes en otros componentes del inflamasoma criopirina, por ejemplo procaspasa-1, no producen interleucina-1 beta en respuesta a la inyección de cristales de urato.

El estudio también indica que la criopirina es un elemento algo selectivo, partículas inofensivas tales como los cristales de diamante o el polvo de aluminio no actúan como activadores.

Los componentes pueden ser ensamblados sólo después que la criopirina se activa con la interacción de su dominio LRR con un cristal (urato o pirofosfato de calcio dihidratado) o una especie microbiana. El ensamblaje de los dominios conduce en última instancia a la liberación de la caspasa-1 funcional, que alternadamente activa a la interleucina-1beta a través de la pro-interleucina-1beta. En su secreción en el entorno extracelular, la interleucina-1beta dispara una serie de acontecimientos que dan lugar a la inflamación.

Mariathasan en 2006 demostró que el complejo inflamasoma también puede ensamblarse cuando se estimulan macrófagos con ATP y algunas otras toxinas.3

La criopirina inflamasoma parece ser un versátil centinela del sistema inmune natural de los individuos, y es fácil especular sobre las futuras implicaciones terapéuticas de estos resultados. De hecho, el tratamiento clínico basado en el mecanismo de la enfermedad ya se ha proyectado para las tres enfermedades raras que condujeron al descubrimiento de la criopirina. La mayoría de las mutaciones que causan el síndrome de fiebre periódica hereditaria dan lugar a una criopirina hiperactiva, generando así la creciente secreción de

En este articulo se hace una comparación del esamble del inflamasoma en macrófagos murinos estimulados con LPS y con una segunda señal de estimulación que fue el ATP. en el cual se demuestra que cuando se da una segunda señal con ATP incrementan los niveles de IL1 beta secretada al medio.

interleucina-1 beta. Los ensayos clínicos han demostrado que la anacinra, un antagonista del receptor de la interleucina 1, mejora con eficacia los síntomas clínicos en los tres síndromes. Al modificar el inflamasoma criopirina, pudiese ser que las personas puedan protegerse contra diversos microorganismos, aumentar la eficacia de las vacunas y facilitar el manejo de la artritis inflamatoria característica de la gota y de pseudogota.

HIPÓTESIS

Si en la Psoriasis ocurre un proceso inflamatorio, por lo tanto el complejo inflamasoma (compuesto por NALP´s, ASC, Caspasa 1 e IL-1beta puede estar presente en el queratinocito.

OBJETIVO GENERAL Estudiar la expresión de moléculas NALP 3, NALP 5, ASC, Caspasa 1 e IL-1beta en queratinocitos humanos tratados con diversos PAMP´s.

OBJETIVOS PARTICULARES

• Analizar la expresión de las moléculas NALPs, ASC, caspasa 1 e IL-1beta por RT-PCR en los queratinocitos humanos tratados con los diferentes estimulos en cineticas de dosis-respuesta y tiempo-respuesta.

• Detección de IL-1beta por medio de la técnica de ELISA en sobrenadantes del cultivo de queratinocitos humanos estimulados con Los diversos PAMP´s.

• Detectar la Pro IL-1beta en el citoplasma de HaCaT estimuladas con PAMP´s

MATERIAL Y METODOS

CULTIVO DE QUERATINOCITOS HUMANOS, LINEA CELULAR HaCaT.

Las células HaCaT serán cultivadas en medio DMEM (Gibco, rockwille, MD, USA), con suplemento de 5% de suero fetal bovino (BSF)(Gibco), 4 µl ml-1 de gentamicina (Gibco) y 0.25U de Fungizona (Gibco). Las condiciones de crecimiento serán una atmosfera humeda con 5% de CO2 y una temperatura de 37°C.

ESTIMULACIÓN DE LOS QUERATINOCITOS CON PAMP´s

Una vez estandarizado el cultivo de esta línea celular, se procederá a estimular con LPS/ATP, Peptidoglicana/ATP y Poly I:C/ATP, SDS, DAP, LTA. cultivos de queratinocitos con igual número de células; se realizaran 6 tiempos de evaluación.

Se partirá de un cultivo de queratinocitos humanos HaCaT los cuales serán despegados y lavados con DMEM, las células se resuspenderán en DMEM (15 000 cells/ml) que contenga 5% BSF, gentamicina y fungizona y se pasaran a placas de seis pozos. Los cultivos se incubarán toda una noche en una atmosfera húmeda con 5% de CO2 y una temperatura de 37°C.

El medio con células no adheridas se desechara y se les pondrá nuevo medio DMEM. Se continuara con la incubación (el medio deberá de cambiarse cada 3 días), hasta que se alcance un 85% de confluencia.

EXTRACCIÓN DE mRNA TOTAL.

De cada uno de los tiempos de trabajo post-estimulación y de las biopsias de pacientes con psoriasis se realizará la extracción de mRNA total con reactivo de TRIzol (Invitrogen). La integridad del RNA se analizara por electroforesis en geles de agarosa.

TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT)

Se hará la transcripción reversa de las muestras de mRNA de cada tiempo así como de las biopsias de pacientes con psoriasis para la obtención de cDNA. Para la reacción de la transciptasa reversa el RNA total (3µg) 0.5 µg con los oligos-dT (Invitrogen) se incuba a 70°C por 10 minutos. La mezcla de reacción para la RT será hecha con buffer 1X, 0.5 nM DTT, dNTPs (500 µM de cada uno) (Invitrogen)

y 200U de transcriptasa reversa MMLV (Invitrogen). Las condiciones de incubación de la reacción de RT serán 1 hora a 42°C.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

A partir de las muestras obtenidas de cDNA del paso anterior, se harán PCRs para amplificar los genes de interés de -ACTINA, NALP 3, NALP 5, ASC, CASPASA1 e IL-1 ve r ta bla 2). La s re a ccione s de P CR s e ha rán us a ndo 1U

de Taq polimeraza (Invitrogen), 1 µl de cDNA, buffer 1X, MgCl2 1mM, 200 µM de cada uno de los dNTP´s y 0.2 µM de cada uno de los correspondientes iniciadores (ver tabla 2). Las reacciones de PCR serán montadas bajo las siguientes condiciones: 30 ciclos de 30 s a 92°C, 30 s a 60°C y 30s a 72°C.

Tabla 2. Iniciadores Fwd y Rev para cada uno de los genes a amplificar

GEN PRIMER TAMAÑO β-ACTINA8 5’-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG-AAA C-3’ Fwd

5’-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3’ Rev 90 pb

NALP 3 5’-CTG TGT GTG GGA CTG AAG CAC-3’ Fwd 5’-CCA GCC CTG CTG TTT CAG CAC-3’ Rev

90 pb

NALP 5 5’-GGC CCA TGT GAT TGC TAA GTT-3’ Fwd 5’-GGG CTG TTC ATC CTT CCA GTG-3 Rev

90 pb

ASC 5’-AGA CAT GGG CTT ACA GGA GC-3’ Fwd 5’-CTC CCT CAT CTT GTC TTG GC-3’ Rev

90 pb

CASPASA 1 5’-TGA AAG AGG TGA AAG AAT TTG C-3’ Fwd 5’-TCT CCA AGA CAC ATT ATC TGG TG-3’ Rev

90 pb

IL-1β 5’-TGG GCC TCA AAG GAA AGA ATC-3’ Fwd 5’-GGT GCT GAT GTA CCA GTT GGG-3’ Rev

90 pb

ANALISIS SEMICUANTITATIVO DE LA EXPRESION DE LOS GENES.

Los productos de PCR de cada gen serán corridos en un gel de agarosa, y a partir de la captura de su imagen, se cuantificara el área de intensidad de cada una de las bandas en pixeles. Se hará una relación de la intensidad de cada gen con la intensidad de banda del gen de la b-actina.

ANALISIS DE LA IL-1beta EN LOS SOBRENADANTES DE LOS CULTIVOS CELULARES.

A cada uno de los sobrenadantes de los cultivos celulares de los diferentes tiempos post-estimulación, se les cuantificara la cantidad IL-1beta de por medio de la técnica de ELISA con un kit comercial.

INMUNOHISTOQUIMICA PARA LA DETECCION DE PRO-IL 1 BETA EN CELULAS HaCaT ESTIMULADAS CON PAMP´S

Las células HaCaT fueron estimuladas con PGN, LPS y PI:C para la búsqueda por inmunohistoquimica de Pro IL 1 beta intracitoplasmatica.

Las células HaCaT son colocadas en cajas para cultivo celular conteniendo un cubreobjetos estéril, se dejan crecer hasta que alcancen la confluencia deseada y se estimulan con los diferentes PAMP´s, para cada PAMP existe un testigo de HaCaT que no han sido estimuladas. Una vez pasado el tiempo de estimulación se sacan los cubreobjetos, se fijan con metanol 10 minutos y se hidratan con PBS. La peroxidasa inherente a las células es bloqueada con una solución de peróxido de hidrogeno al 3%.

Posteriormente se les pone el anticuerpo especifico para la detección de IL 1 beta y se incuba en cámara húmeda 1 hora a temperatura ambiente, después de ese tiempo se lavan y se hidratan con PBS, se coloca un conjugado peroxidado que reconoce al primer Ab por una hora, pasado este tiempo se adiciona una solución de Diamino Bencidina. La reacción enzimática de detiene cuando los cortes comienzan a tomar un color café, lavando con abundante PBS. Se hace una coloración de contraste con Hematoxilina de Gill por siete minutos para contrastar núcleo y se deshidrata en un tren de etanol al 50% hasta etanol Absoluto, se dejan secar las laminillas y se montan en resina para su observación al microscopio.

RESULTADOS

DETECCION DE IL 1 BETA POR ELISA

Se probaron varios estimulos de PAMP´s y ATP para inducir la producción de IL-1beta en la línea celular HaCaT, tanto en cinetecas de Dosis-Respuesta como Tiempo-Respuesta, sin embargo la producción de IL-1 fue muy pobre .

Los PAMP´s utilizados fueron: Lipopolisacarido (LPS), Peptidoglicana (PGN), Acido Diaminopimelico (DAP), Acido Lipoteicoico (LTA), RNA bacteriano, Dodecil sulfato de sodio (SDS) y un análogo de RNA de doble cadena (Poly I:C). El único PAMP´que dio una mayor producción de IL 1 beta fue el análogo de RNA de doble cadena el cual señaliza vía TLR 3.

Figura 1. Detección de IL 1 beta en sobrenadantes de células HaCaT estimuladas con diversos PAMP´s y ATP después de 24 hrs de estimulación.

Para descartar que los estímulos que se estaban probando estaban activando de manera adecuada, se decidió montar una cinética de Tiempo-respuesta usando Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) estimuladas con LPS. En esta cinética se demostró que las PBMC son capaces de producir IL 1 beta con un estimulo de LPS de una manera Tiempo dependiente, la concentración de LPS utilizada fue de 10 ug/ml.

Figura 2. Detección de IL 1 beta en sobrenadantes de PBMC estimuladas con LPS.

Con los resultados anteriores se demuestra que el sistema de estimulación es el adecuado sin embargo que solo el Poly I:C induce una mayor producción de IL 1 beta en sobrenadantes de HaCaT en comparación con los demás PAMP´s.

Figura 3. Detección de IL 1 beta en sobrenadantes de HaCaT estimuladas con diversos PAMP´s y ATP. En la grafica se muestra también el control positivo que fue PBMC tratadas con LPS.

Con base en los resultados anteriores se decidió montar cinéticas de Dosis-Respuesta y Tiempo-respuesta para determinar la concentración y el tiempo optimo para la detección de IL 1 beta en los sobrenadantes de HaCaT.

Para la Cinética de Tiempo respuesta estimulamos las HaCaT con 5 ug/ml de poly I: C (concentración recomendada por el proveedor) y usamos cinco tiempos de estimulación y un control sin estimulo. Para la cinética Dosis respuesta usamos diluciones de una concentración inicial de 50 ug/ml hasta una concentración de 1.5 ug/ml con 24 horas de estimulación.

Figura 4. Cinéticas Tiempo Respuesta y Dosis respuesta para la detección de IL 1 beta en sobrenadantes de HaCaT estimuladas con Poly I:C.

DETECCION DE LAS MOLECULAS DEL COMPLEJO INFLAMASOMA POR RT-PCR.

A pesar de que por ELISA no pudimos detectar concentraciones de mas de 15 pg/ml de IL 1 beta en sobrenadantes de HacaT estimulados nos pareció interesante hacer un análisis de la expresión de las moléculas del complejo inflamasoma por RT-PCR, usando LPS/ATP, PGN/ATP y Poly I:C.

Figura 5. Detécción de las moléculas del complejo inflamasoma por RT-PCR en células HaCaT estimuladas con diversos PAMP´s. a) LPS, cinética tiempo-respuesta, b) PGN cinética tiempo-respuesta. c) Poly I:C cinética tiempo-respuesta y d) Poly I:C cinética dosis-respuesta.

De manera general se puede observar en todos los casos una tendencia de aumento en la expresión del mensajero de Caspasa 1 e Interleucina 1 beta, respecto al gen constitutivo que usamos para normalizar que fue Beta actina.

Sin embargo hicimos un análisis relativo de la expresión de los genes detectados por RT- PCR. Se realizó la medición de pixeles de cada una de las bandas y se hizo una relación con el gen constitutivo. Estos resultados se presentan en los siguientes paneles.

Figura 6.- Expresión relativa de las moléculas del complejo inflamosoma NALP3 en células HaCaT estimuladas con LPS, PGN y Poly I:C, ensayos de tiempo respuesta.

Figura 7.- Expresión relativa de otras moléculas centrales del complejo inflamosoma en células HaCaT estimuladas con LPS, PGN y Poly I:C, en ensayos tiempo respuesta.

INMUNOHISTOQUIMICA

Debido a que no pudimos detectar cantidades de Il 1 beta mayores a los 15 pg/ml de IL-1beta en HaCaT tratados con diversos PAMP´s (a excepción de Poly I:C) decidimos realizar inmunohistoquimica para buscar Pro IL-1beta en el citoplasma de las células estimuladas con PGN/ATP y LPS/ATP. Encontramos que a pesar de que por ELISA no pudimos detectar gran cantidad de IL 1 beta activa, por inmunohistoquimica observamos que si hay producción de la molécula en su fase inactiva (pro IL 1 beta).

(a) (b)

(c) (d)

Figura 8. Detección de la pro IL 1 beta en células HaCaT. (a) HaCaT sin estimulo, (b) HaCaT estimuladas con PGN/ATP, (c) HaCaT sin estimulo, (d) HaCaT estimuladas con LPS/ATP

IMPACTO

De los PAMP´s usados solamente el Poly I:C fue capaz de inducir la expresión y la liberación de la IL-1beta. El Poly I:C es un análogo de RNA de doble cadena viral y su ligando es el TLR3. Existen reportes de que la mayoría de los TLRs están expresados en el queratinocito.

Con respecto a la búsqueda de las moléculas de inflamosoma se observó que el PGN y el LPS inducen la expresión de IL-1beta, NALP3, CASP-1 y ASC se mantiene constante. Sin embargo estas moléculas no inducen la liberación de IL-1beta. En contraste el Poly I:C también induce la expresión de las moléculas del inflamasoma pero de una forma mas intensa y este si induce la liberación de la IL-1beta.

Cuando se buscó por inmunohistoquimica la producción de IL-1beta en los queratinocitos tratados con PGN, LPS y Poly I:C se observo que los queratinocitos estaban produciendo la IL-1beta por todos los compuestos ensayados, sin embargo los resultaos de ELISA sugieren que solamente el Poly I:C es capaza de activar fuertemente el complejo inflamosoma y liberar la IL-1beta.

Estos resultados tienen un beneficio social debido a que ayudan a entender mas sobre el proceso patológico de la psoriasis. Estos resultados sugieren que el queratinocito puede contribuir en la producción de IL-1beta, que es muy importante en el proceso de inflamación de la piel psoriasica. Sin embargo esta producción es dependiente de los ligandos de TLR3, los cuales son moléculas virales como el RNA de doble cadena. Estos resultados apoyan el posible papel psoriasico que puede tener el papiloma virus tipo V, el cual ha sido detectado en el 90% de las biopsias psoriasicas.

El beneficio educativo del proyecto fue que dos alumnos se formaron como investigadores en el programa de PIFI y uno de ellos obtuvo con estos resultados el grado de maestro en ciencias.