19) REPUBLICA DE CUBAOficina Cubana de laPropiedad Industrial

(11)

No de publicación:

CU 22515 A1(21)

No.de solicitud :

1995/86(51)

Int. Cl:

C12N 9/50(12)

Certificado de Autor de Invención

(22)

Fecha de presentación

: 1995.09.29

(30)

Prioridad :

(45)

Fecha de publicación :

1998.12.30

(71)

Solicitantes:

Centro de Bioplantas, UNICA; (CU)

(72)

Inventor/es:

Chávez Planes, María de los Angeles(CU) ; Márquez Preto, Margarita (CU) ; Hernández de laTorre, Martha de la Caridad (CU) ; Rodríguez Alarcón,Graciela (CU) ; Santos Bermúdez, Ramón (CU) ; GonzálezOlmedo, Justo Lorenzo (CU) ; Carvajal Ortiz, Carol Cristina(CU)

(73) Titular:

Centro de Bioplantas, UNICA; (CU)

(74) Agente:

Fajardo Cepero, Nuvia (CU)

(54) Titulo: PROCESO DE OBTENCIÓN DE BROMELINA A PARTIR DE TALLOS DE PIÑA.(57)

Resumen:

La presente invención se relaciona con la rama de la Bioquímica y en particular con lo referente a la obtención de enzimas conactividad proteolítica como la Bromelina.El objetivo principal de esta invención es desarrollar un proceso práctico y económico para extraer Bromelina a partir de tallos depiña que permita obtener altos redimientos y un preparado enzimático activo y estable, con un gasto mínimo de reactivos.Se desarrolló un procedimiento para obtener bromelina simple y rápido. Para la extracción se utilizaron restos de cosechas (tallos depiña), los que son triturados y homogeneizados en presencia de un buffer de extracción que contiene ácido sulfúrico y sulfura desodio en pequeñas cantidades. El homogenado se filtra, se centrifuga y se seca. Se logran altos rendimientos y muy buenarecuperación de la actividad de la enzima.El producto obtenido puede ser utilizado en la industria biotecnológica, alimenticia y médico farmacéutica.

MEMORIA DESCRIPTIVA

1995/86

PROCESO DE OBTENCION DE BRIMELINA A PARTIR DETALLOS DE PIÑA

La presente invención se relaciona con la rama de la bioquímica y en particularcon lo referente a la obtención de enzimas con actividad proteolítica y en suaplicación, además, con la Biotecnología, la Industria Alimenticia y la Medicina.Las proteasas tienen una potencial aplicación en la Biotecnología, empleándose deforma general para hidrolizar proteínas y específicamente, por ejemplo, para laelaboración de medios de cultivo y la obtención de hidrolizados proteicos; en laalimentación en el ablandamiento de carnes, la hidrólisis de gelatina, laclarificación de la cerveza, hidrólisis del grano de soya y otros, mientras que en laMedicina son empleadas como antinflamatorio, digestivo, para facilitar eltransporte de antibióticos en el organismo, en la lisis de células tumorales, paraeliminar tejidos necrosados; asumiendo además una creciente significación enestudios relacionados con la regulación biológica (Apte y col. 1979).La Bromelina (EC 3.4.3.24) (Murachi, 1964) es una proteasa que se haencontrado en tejidos de plantas de la familia Bromeliaceae, de las cuales lapiña(Ananas comosus L.) es la más conocida. Esta enzima juega un

papelfisiológico muy importante, al intervenir en reacciones metabólicas y proteger elvegetal del ataque de plagas y enfermedades (Claus, 1985).También influye de manera especial en el metabolismo nitrogenado durante laetapa germinativa. Es conocido que durante ese ciclo las reservas de proteínas sonrápidamente hidrolizadas a pequeños péptidos y aminoácidos, los cuales sonusados por la planta en estado embrionario para la síntesis de proteías (Fruton,1963).Ha sido aislada y estudiada por varios investigadores y actualmente se utiliza enla medicina para el tratamiento de casos de inflamación asociado con edemas,causados por daños traumáticos, edemas post-operatorios o inflamación oinflamación del tracto respiratorio, por trastornos circulatorios (tromboflebitis,úlceras venosas) y para realizar la actividad (Stauder, 1989), en proceso depreparación de derivados de la penicilina (Cole y Edmondson, 1982), induccióndel factor de necrosis de tumores (INF) como terapéutico para el cáncer,atacando selectivamente células cancerígenas sin dañar las células estables(Ransberger y Staudder, 1993), tratamiento y prevención de infecciones virales(NSO E89309061), vacunas contra la gripe (contiene un liposoma, un antígeno ala gripe y un fragmento de Bromelina (NSO E89402343).Los más importantes efectos de Bromelina observados en experimentos conanimales sin: efectos antiedemáticos inducidos experimentalmente enextremidades de ratas (Winter, 1990), reducción de la permeabilidad capilarcausada por tejidos kininógenos (Uhig y Seifert, 1981), reducción del tiempo deabsorción de hematoma (Winter, 1990), inhibición de edema de pulmón causado

por inyección i.v. de epinefrina (Shigei, 1967), protección de edema bronquialcausado por agentes irritantes (Di Rosa y col., 1971), efectos en síntesis deprostaglandina (Winter, 1990), degradación de bradikinina (Uhig y Seifert, 1981;Shigei, 1967), efectos en la coagulación de la sangre (Smyth y col., 1962; Livio ycol., 1978), incremento de niveles de antibióticos en fluidos corporales (Giller,1962; Kida y Kano, 1976; Sekule y col., 1969), disminución de lesionesprecancerosas (Taussing y col., 1976; Taussing y col., 1985 y Goldstein y col.,1975).Además se utiliza en la industria Alimenticia como tenderizador de carnes(Connick y Bernhold, 1975), preparación de postres, gelatinas de bajo contenidocalórico (Faber y Berry, 1975) y en el proceso de fabricación de cerveza (Horiuchiy col., 1978) entre otros.Son muy numerosas las proteasas aisladas, purificadas y caracterizadas, todasellas se distinguen por actuar escindiendo los enlaces peptídicos de las proteínascon diferente especificidad. Se agrupan por los residuos de aminoácidos presentesen el centro activo y por tanto por su mecanismo de acción, según Barret (1986)en: Serino, Cisteino, Aspártico, Metalo proteasas.La Bromelina es una enzima proteolítica que pertenece al grupo de las cisteino-proteasas y según Murachi (1964), entre sus propiedades más importantes seencuentran:

-

pH óptimo aproximadamente 7

-

Estabilidad: La enzima mantiene su actividad sobre caseína a 5

0

C por 24horas en un rango de pH de 4-10. Es estable en 25% de metanol (v/v) a 25

0

Cpor 20 min., pierde un50% de actividad al calentarse la solución enzimática a55

0

C por 20 min a pH 6. La liofilización causa un 27% de pérdida de laactividad.

-

Pureza: Ha sido purificada cromatográficamente y la homogeneidad de laenzima verificada por ultracentrifugación, sedimentación, electroforesis dedisco en gel de acrilamida y análisis difusional. La Bromelina de tallo puedeser fraccionada en 5 componentes activos proteolíticamente.PROPIEDADES QUIMICAS

-

El principal residuo amino terminal es la valina y el carboxilo terminal esglicina.

-

La enzima es una glicoproteina que tiene un oligosacárido por molécula, elcual está covalentemente unido a la cadena pectídica.

-

La Bromelina de tallo tiene un grupo sulfidrilo reactivo por molécula, el cuales esencial para la catálisis enzimática. De acuerdo a varios investigadores, lasecuencia de aminoácidos en el sitio activo propuestas es :

Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Chao y Liever, 1967)Asn-Gin-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Husain y Lowe, 1968)Composición aminoacídica de Bromelina del tallo.Aminoácidos1234Lisina20231220.2Histidina1211.34Arginina1012610.2Acido Aspartico27291628.9Treonina1214812.4Serina24281624.9Acido Glutámico20231223.0Prolina1314813.1Glicina29351930.5Alanina30352032.4Cisteina Media111057.4Valina19221220.7Metionina4525.0Isoleucina20211218.4Leucina91059.0Tirosina19211118.2Fenilalanina9958.0Triptófano885-Total(285)(321)(179)-Amonio254219-Glucosamina264-Carbohidratos2.11.462.0-Columna 1: Murachi (1964) Columna 3: Feinstein y Whitaker (1964)Columna 2: Ota y Stein (1964) Columna 4: Husain y Lowe (1968)**Activadores e Inhibidores**Activadores:Puede ser activada en presencia de 0.005 M Cisteina, 2-Mercaptoethanol, oDithiothreitol.Inhibidores:Inhibición reversible: Iones mercurio inorgánico, compuestos mercurialesorgánicos y tetrationato.La Inhibición irreversible ocurre cuando reacciona con N-etilmaleimida, N-(-4-dimetil-3,9-dinitrofenil maleimida (DDPM), ácido monoiodoacético y 1,3dibromoacetona).

PROPIEDADES FISICAS DE BROMELINA DE TALLOConstante de Sedimentación S

020,w

2.73 seg.Constante de Difusión D

020.w

7.77 x 10

-7

cm

2

x seg

-1

Volumen específico parcial V0.743 mL/gViscosidad intrínseca (n)0.039 m/gRadio friccional f/fo1.26Punto Isoeléctrico pl9.55Absorbancia A

1%

cm a 280 nm20.1Peso molecular33.200

ª

32.100

b

33.500

ca

Por Sedimentación-Difusión

b

Por constante de Sedimentación y Viscosidad intrínseca

c

Por método de ArchibaldPROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN:Los procedimientos de obtención de la enzima han sido objeto de patente pordiferentes autores:1. Proceso de extracción de Bromelina: (Pat. # 3,425,787, Julio 1969).Extracción a partir de tallo de piña que incluye molida del tallo, extracción dellíquido por presión y centrifugación para precipitar cristales finos de hielo, ellíquido remanente es centrifugado. Preferentemente durante el enfriamiento seutilizan para la precipitación solventes orgánicos y sales, así como detergentessolubles.2. Preparación de Bromelina a partir de tallos de piña: (Pat. # 699,001 Oct.1972).Consiste en extraer el jugo, sometiendo los tallos a un tratamiento a bajastemperaturas, la precipitación fraccionada a partir del jugo clarificado concompuestos orgánicos y liberación de Bromelina precipitada con compuestosorgánicos fríos.3. Proceso de purificación de Bromelína: (Pat. # 3,442,764)Soluciones que contienen Bromelina son purificadas ajustando a pH 3-6, tratandocon óxido o hidróxido de magnesio.4. Tratamiento de intercambio iónico de Bromelina: (Pat. # 3,658,651)Extractos de jugo que contienen Bromelina de tallos son purificados pasando el jugo por una resina de ión cambiable en relación con un intercambiador aniónicoen forma de bicarbonato, un intercambiador catiónico que tiene un grupo degrupos funcionales ácidos, en forma de H

+

ó NH

4+

y un segundo intercambiadoraniónico en forma de bicarbonato.

5. Método para la preparación de una solución de Bromelina para inyección“anti-mortem”: (Pat. # 3,446,626).La Bromelina es tratada para producir una inyección “antimortem”que sesuministra a animales a fin de tenderizar la carne.6. Polisacárido con actividad antiflamatoria y anti-agregación: (Pat. # 4,507,286US (Pat. # 0,089,532 Par. Europea).A partir de extractos de Bromelina se separa un principio activo de naturaleza noproteica, desprovisto de actividad enzimática y que presenta actividadantinflamatoria y efecto antiagregativo, mucho más marcado que la Bromelina oel precipitado obtenido con acetonas, metanol o sulfato de amonio.Además, varios autores hacen referencia a la obtención de Bromelina a partir delos diferentes órganos de la planta de piña y demuestran que los extractos detallos presentan mayor actividad enzimática.Murachi (1964) reportó una técnica de aislamiento y purificación de Bromelina apartir del jugo de frutas verdes o maduras, en la cual el jugo extraído a presióncon una prensa hidráulica, se enfría de 0-4

0

C, añadiéndole un volumen deacetona fría y colectando posteriormente la enzima precipitada porcentrifugación. El producto es reducido a polvo en un mortero, el polvo deacetona se purifica por CII en DEAE-celulosa empleando buffer citrato de sodio0.02 M a pH 6, obteniéndose varias fracciones con alta actividad proteolítica.En 1963, Murachi y col. reportaron un procedimiento de purificación a partir delextracto crudo de tallo, el cual es suspendido en buffer fosfato de potasio pH 6.1por 30 min, la suspensión se centrifuga a 5000 rpm por 20 min, el precipitado sedesecha y el sobrenadante se divide en diferentes fracciones que se aplican a:

-

Una primera fracción a resina de intercambio aniónico (Duolite A-2)

-

Una segunda fracción se aplicó en una columna de Amberlite CG-50 (Tipo 1)equilibrada con buffer Fosfato de potasio, pH 6.1.

-

A una tercera fracción se le añadieron 100 g de sulfato de amonio, elprecipitado formado se colectó por centrifugación y se disuelto en 50 ml debuffer acetato de sodio pH 5.2 (0.05 M), se aplicó a una columna de SephadexG-100; recogiéndose un pico con actividad proteolítica.

-

Una cuarta fracción se trató con sulfato de amonio hasta una saturación de0.42.La Bromelina precipitada se colectó por centrifugación; se disolvió en agua y sedializó, comparando el grado de pureza de cada uno de los extractos. (Murachi ycol., 1964).

Heinicke y Gurtner (1957) reportaron un método cetónico para extraer Bromelinaen el que el jugo de tallo se enfrió de 0-4

0

C, se adicionó acetona pura a -2-

0

C,centrifugando a 6000 rpm, 4

0

C durante 15 min; el sobrenadante se colectó,repitiéndose dos veces la extracción y posteriormente se secó a vacío y se maceróreduciéndose a polvo de acetona, obteniéndose 2-5 g de extracto por cadakilogramo de muestra fresca. (citado por Tisseau, 1976).Tisseau (1977) publicó una técnica simplificada de extracción de Bromelina apartir de desechos de la industria conservera; en la cual el jugo extraído a presiónse clarifica añadiendo CaCl

2

PVP en solución tampón de Tris-hidroximetil-aminometano. Se centrífuga a 6000 rpm, el sobrenadante es tratado con Sulfato deAmonio (70% de saturación), 472 g/L de jugo clarificado, se centrífuga a 6000rpm obteniéndose un precipitado enzimático; se resalta como ventaja de estatécnica el interés industrial por la posibilidad de trabajar a temperaturaambiente; aunque tiene la desventaja de que los reactivos no se recuperar.Otro procedimiento de extracción y purificación de Bromelina a partir de tejidosde hojas de plantulas obtenidas por cultivo de tejidos fue descrito por Daley yVines (1978); en el cual la extracción se realiza empleando tres buffer; Buffer Adenominado PEP carboxiquinasa (0.1 M imidazol HCl, 10 mol DTT, 10 molMgCl

2

1% PVP-360 a pH7). Buffer B-PEP carboxilasa (0.1 M HEPES 10 mMDTT, 10 mM MgCl

2

, 10 mM MnCl

2

y 1% PVP-40 a pH7). Buffer C proteinasa(0.6 M glycine-HCl, 2.0 M KCl y 10 mol mercaptoetanol a pH 9.7). La extracciónse realizó con cuatro volúmenes de Buffer A y B por gramo de peso fresco

detejidos de hojas, el que fue finalmente dividido con una cuchilla, lavando la masacon arena acidulada y PVP insoluble en un mortero. Se pasó por gasa ycentrifugó a 10 000.g por 10 min a 0

0

C. Con buffer proteinasa C se hizo elprocedimiento similar al descrito usando 2 ml de buffer por gramo de pesofresco. Los extractos obtenidos fueron purificados empleando Sephadex G-150.Se publicó por Apte y col. (1979) un método de obtención de Bromelina a partirde cultivo de tejidos, en el cual tejidos frescos (callos u hojas) son homogenizadoscon buffer fosfato pH 6.1, seguido por una segunda homogeneización para lograrla completa destrucción de las células, posteriormente a ello se filtra la suspensiónobtenida para eliminar la fibra. El homogenado se centrifuga a 10 000 rpm por15 min (0-5

0

C) tomando el sobrenadante para la purificación. Se realizó unfraccionamiento del extracto utilizando un grandiente de acetona, el precipitadoobtenido se secó a vacío (polvo de acetona) y luego se redisolvió en buffer acetatode sodio 0.05 M a pH 5.2 y se pasó a través de una columna de sephadex G-100.TODOS LOS PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCION DESCRITOS SECARACTERIZAN EN GENERAL POR:

-

Realizar la extracción a bajas temperaturas.

-

Precipitar la enzima empleando solventes orgánicos.

-

Precipitar la enzima empleando sales (sulfato de amonio preferentemente); ydetergentes solubles.

-

Extraer prensando a presión, utilizando método de congelación-descongelación.La presente invención consiste en el diseño de un proceso simple y rápido deobtención de Bromelina, empleando restos de cosechas (tallos); que incluye lahomogeneización durante 30-60 minutos de los tallos triturados en presencia desulfuro de sodio (1-3 mM) y ácido sulfúrico (0.05-0.2 mol.L

-1

), a pH 2.5-5, en lasecuencia siguiente:1. Trituración de los tallos.2. Homogeneización en presencia de sulfuro de sodio y ácido sulfúrico.3. Filtración4. Centrifugación (10 000-15 000 . g)5. Liofilización.Este procedimiento permite la obtención de un preparado enzimático deBromelina con un alto rendimiento, un grado de pureza satisfactorio para serempleado en las industrias

biotecnológica y alimenticia, estabilidad aceptable, así como una buena recuperación de la actividad de la enzima.La extracción en presencia de H

2

SO

4

garantiza que el procedimiento se realice aun pH alejado del pH óptimo, para disminuir la autoproteólisis y el sulfuro desodio permite la protección de los grupos -SH que se encuentran en el centroactivo de la enzima y que son causas de la pérdidas de actividad de la misma.El preparado enzimático así obtenido presenta un valor de actividad específica de1.54 U.mg

-1

de proteínas con un rendimiento en masa de 23.7 g de extractocrudo.kg

-1

de tallos y en proteínas de 6.6 g de proteínas . kg

-1

de tallos.Actividad Enzimática del extracto crudo (U.mL

-1

)7.50Concentración de proteínas (mg.mL

-1

)4.85Actividad Específica (U.mg

-1

)1.54Rendimientos:g de extracto crudo . kg

-1

de tallo23.70g de proteínas . kg

-1

de tallo 6.66Actividad (U.kg

-1

de tallo) 11 000Definiéndose una unidad, como la cantidad de enzima que cataliza la formaciónde 1

µ

mol de tirosina en 1 min.

El estudio funcional del extracto de Bromelina confirmó la presencia de unpreparado muy activo y estable; que tiene entre sus características principales:

-

Contenido de carbohidratos: 7,86 mg . mL de extracto

-1

-

Contenido de compuestos fenólicos: 0,42 mg . mL

-1

-

Actividad peroxidasa: 2,3 U.mL de extracto

-1

-

Estabilidad térmica: Al incubar el extracto enzimático a diferentestemperaturas y estudiar la variación de la actividad enzimática en el tiempo,quedó demostrado que la enzima es más estable hasta temperatura de 50

0

C,mientras que a 70

0

C en el transcurso de 1 hora de incubada pierdeaproximadamente el 50% de actividad. Al chequear la variación de laactividad hasta las 40 h de incubado el extracto se comprobó que: A 70

0

Cpierde actividad entre 30 min-1 hora. A 60

0

C es activa hasta las 4 horas. A50

0

es activa hasta las 40 horas. A 40 horas.

-

Temperatura óptima: 40

0

C

-

Energía de activación: 35.957 kJ.mol

-1

Estabilidad en función del pH: El extracto enzimático es más estable en el rangode pH 3-8, perdiendo la actividad en el tiempo a pH 2 y más ligeramente a pH 9 y10. Al incubar la encima a pH 2 pierde el 92% de la actividad transcurridas 24h,mientras a pH 3, pH 4 y pH 5 la actividad se mantiene constante en este período.

-

pH óptimo: 7

-

Masa molar: 26 450 Da por el método de Andrew

-

26 930 Da por SDS-PAGEEn todos los casos se trabajó utilizando diferentes concentraciones de enzima paraun mismo ensayo y al menos tres réplicas de cada concentración.La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry (1957),expresándose en mg de proteínas . mL de

extracto.La actividad enzimática se determinó por el método de Anson (1938),empleándose como sustrato hemoglobina humana a pH 6.8 y expresada en U.mLde extracto, mientras que la actividad específica se determinó como el cociente dela actividad enzimática/concentración de proteínas, expresándose en U.mg

-1

.Se estudió la estabilidad de los extractos congelados y liofilizados en el tiempodurante un año, con el objetivo de determinar la forma de conservación delextracto, lo que corroboró que la estabilidad del preparado es aceptable.

Para una mayor purificación del extracto, tiendo en cuenta el fin con el que se vaa utilizar la enzima, puede emplearse cromatografía de exclusión en gel,empleando Sephadex G-100 y/o cromatografía de intercambio iónico utilizandoCarboximetil Celulosa, equilibrada con acetato de sodio. Los resultadosobtenidos por Cromatografía por exclusión de gel se muestran en la figura 1.

-

Cantidad de muestra aplicada: 3mL

-

Conc. De proteínas: 12. 62 mg/mL

-

Actividad enzimática: 9.67 mmol/min/mL de enzima.

-

Actividad específica : 0,766 mmol/min/mg de proteínas.

-

Tamaño de la columna: h = 90 cmd = 1.6 cmVolumen efectivo: 173 cm

3

-

Velocidad de flujo: 20 mL/h

-

Tamaño de las fracciones colectadas: 2mL

-

Número de fracciones: 62

-

Buffer de elución: Acetato de sodio: 0.05 mol/h pH 5Se realizaron más de 10 corridas cromatográficas obteniéndose picos simétricoscon alta actividad enzimática.Con el objetivo de purificar mayores volúmenes de extracto se empleócromatografía de intercambio iónico (fig. 2), con CM-Celulosa como soporte,obteniéndose los mejores resultados de las variantes empleadas con un sistemasemibatch. Se fijó la enzima en batch a CM Celulosa equilibrada con bufferacetato de sodio 0.005 mol/L y una vez fijada se montó una columnacromatográfica que fue eluida por pasos, empleando buffer acetato 0.1 mol/L y0.5 mol/L a pH 5.0.

-

Cantidad de muestras aplicadas: 10mL

-

Concentración de proteínas: 5.3 mg/mL

-

Actividad enzimática: 2.9 U/mL

-

Actividad específica: 0.6 U/mg

-

Tamaño de la columna: h = 6 cm, d = 14 cm

-

Tamaño de las fracciones colectadas: 3 mLEl extracto crudo puede emplearse directamente en la industria biotecnología yalimenticia. Purificar la enzima es de gran utilidad porque posibilita su aplicaciónen la medicina. La cromatografía de exclusión en gel permite obtener unproducto con mayor pureza, y al emplear C.I.I puede procesarse volúmenes

mayores; siendo una alternativa emplear ambos métodos para obtener máscantidad de enzima con mayor pureza.En la siguiente tabla se muestra la eficiencia de la tecnología a diferentes escalas.LaboratorioPrueba 1Planta pilotoIndustrialPeso material fresco (kg)0.6251.13028.000197.000Volumen de sobrenadante (L)1.0331.10032.600223.600Actividad enzimática (U.mL

-1

)2.8592.8401.9742.640Actividad enzimática total (U) 2953.30031.24064352.400590304.000Concentración de proteínas(mg.mL

-1

)3.4112.9802.8573.500Proteínas totales (mg) 3523.56032.78093138.200782600.000Actividad específica (U.mg

-1

)0.8380.9530.6110.754Rendimientos (g proteínas..Kg tallo

-1

)5.6382.9003.3263.395EJEMPLO DE REALIZACIONA tallos de piña se les elimina la superficie, se lavan con un cepillo y se cortan enpequeños trozos con una cuchilla afilada. Luego de pesar 450 g, se muelen en unabatidora durante 5 min, empleando 600 mL de buffer de extracción (Sulfuro desodio acidulado con ácido sulfúrico), pH 4.5. La pulpa fría se agita en un baño dehielo durante 40 min, se filtra recuperando el mayor volumen de líquidos posibley el filtrado se centrifuga a 10 000.g a 4

0

C durante 15 min. Se colecta elsobrenadante y el precipitado se desecha. Se obtienen aproximadamente 660 mLde extracto crudo con alta actividad específica (1.2 U.mg

-1

); pH 4.6.LAS VENTAJAS QUE SE DERIVAN DE LA PRESENTE INVENCION SON:

-

El desarrollo de un proceso simple que sólo requiere de la adición de dosreactivos en pequeñisimas cantidades.

-

La combinación de sulfuro de sodio y ácido sulfúrico durante la extracciónpermite obtener una enzima con los grupos -SH del centro activo protegidos ya un pH en que el extracto es estable, disminuyendo la proteólisis.

-

Los gastos de material fresco son mínimos, al emplearse como fuente para laextracción tallos de campos a demoler que actualmente se desechan, medianteesta tecnología puede recuperarse un producto de alta actividad enzimática einnumerables usos en la medicina, la biotecnología y la alimentación.