Biotecnologías ReproductivasBiotecnologías Reproductivasen el ganado bovino. en el ganado bovino.

Dr. Reinaldo de Armas PhD.Dr. Reinaldo de Armas PhD.Prof. Reproducción y Biotecnología Animal.

Escuela de Ciencias Pecuarias.

Centro de Investigaciones en Biotecnologías Agropecuarias

Facultad de Ciencias Agropecuarias - UP

BIOTECNOLOGÍASBIOTECNOLOGÍAS

Biotecnologías Reproductivas:• Sincronización e inducción de la ovulación• Inseminación artificial y congelación de semen• Producción de embriones por superovulación• Producción in vitro de embriones• Congelación de ovocitos y embriones• Micromanipulación de embriones para producir

gemelos idénticos y quimeras• Determinación y selección del sexo de embriones y

espermatozoides• Clonado de animales por medio de transferencia

nuclear• Transgénesis.

Sincronización e inducción de la Sincronización e inducción de la ovulación:ovulación:

La necesidad de los sistemas de explotación intensivos de implementar la IA, han sido el motor impulsor de las investigaciones desarrolladas en cuanto al desarrollo de técnicas de sincronización e inducción del celo.

Entre los sistemas de sincronización del celo Entre los sistemas de sincronización del celo los más conocidos son:los más conocidos son:

• Empleo de las Prostaglandinas: Para que este medicamento ejerza su acción resulta necesario la presencia de un cuerpo lúteo (CL) activo en uno de los ovarios de la hembra. Una de las desventajas de este tratamiento es la dispersión de la presentación de los celos, pero sus resultados de gestación son altos (~60%).

Empleo de Progestágenos y Estradiol: Los sistemas más conocidos que emplean estos principios hormonales son los implantes subcutáneos (Crestar y Sinchromate B), espirales y las Y intravaginales (CIDR). Hay otros tratamientos que solo emplean progestágenos, como las inyecciones seriadas de progesterona (P4) o suministro en la dieta. Los resultados de gestación está alrededor del 50%.

Ovsynch (GnRH, PGF2α, GnRH): Se pueden lograr resultados de preñez que oscilan entre 33 y 55%.

IATF: En muchos fincas se ha estado ensayando la IATF (inseminación artificial a tiempo fijo) como práctica rutinaria, por la disminución de costos de personal, al eliminar la de detección del celo, no obstante los resultados son ligeramente más bajos que los que son logrados sobre celos detectados. Co-Synch+CIDR: Aquí se citan resultados de preñez alrededor de 45%. 5-d Co-Synch+CIDR: Se han alcanzado resultados de hasta 50%.

A pesar de disponerse en la actualidad de un gran número de esquemas de sincronización siguen existiendo limitantes que no podemos gobernar, tales como: la respuesta individual, el efecto raza, estado reproductivo, nutricional y productivo.

Por otra parte hay regulaciones en diferentes países sobre el empleo de determinadas hormonas, lo que puede limitar el uso de los diferentes tratamientos descritos.

Esta técnica que no es más que la introducción del semen (material fecundante del macho o semilla), por medio de instrumentos, desarrollados en dependencia de las características del tracto reproductivo de las hembras cada especie. Las primeras investigaciones se deben al monje italiano Lázaro Spallanzani (1780), posteriormentye fueron los Rusos quienes llevaron esta técnica a objetivos productivos (Elias Ivanov 1890) y en 1942, Salisbury, de la escuela americana, idea un diluyente a base de citrato de sodio y yema de huevo, al que se debe la extensión de la IA. El gran paso de la inseminación artificial lo logran los norteamericanos Polge y Smith (1952) con el descubrimiento de que el semen de toros, podía conservarse congelado por largo tiempo En la actualidad el procedimiento de IA en bovinos ha cambiado muy poco desde que Cassou (1964), diseñó su sistema de IA con pajuelas.

Inseminación artificial y congelación de semenInseminación artificial y congelación de semen

CERTIFICADO DE EXAMEN ANDROLÓGICO

Datos de la Finca: Datos del Animal: Finca: Identificación: Propietario: Especie: Localidad: Raza: Provincia: Edad: Peso: Fecha: Color: Resultados del Examen General y Especial:Aplomos: Visión: Condición Corporal: (en escala de 1 a 5). Temperamento: Escroto: Testículos: Circunferencia escrotal: Adherencias: Epidídímos: Prepucio: Pene: Vesículas Seminales: Próstata: Respuesta al Electroeyaculador:

Resultado del Espermiograma:Cantidad del eyaculado: Color: Vigor de los Espermatozoides: Motilidad por campo bajo microscopio: % V/M: %Concentración de Espermatozoides: x 106 espermios / ml Anormalidades Espermáticas: % Patologías: Células de Descamación: Calificación Final del Semen Según Morfología:

Observaciones y Recomendaciones:

Requisitos para la selección Requisitos para la selección de un Reproductorde un Reproductor:

• Salud General• Valor Genético• Examen Reproductivo• Capacidad de Servicio

Congelación de Semen:Congelación de Semen:

Diluentes crioprotectores: Citrato yema Glicerina leche Biladyl Triladyl Andromed

Métodos de congelación: Ámpulas Pastillas Pajuelas

Producción de embriones por superovulaciónProducción de embriones por superovulación

A pesar de que la técnica de transferencia de embriones data de los trabajos realizados por Walter Heape a finales del siglo XIX y de la creciente popularidad de esta técnica, en la mejora genética. En Panamá se han desarrollado numerosos trabajos, pero sin seguir programas estratégicos de mejoramiento genético y hasta el momento hay muy pocos resultados publicados de los mismos.

En sentido general la técnica se basa seleccionar vacas altamente valiosas genéticamente, como donadoras de embriones para la inducción hormonal de ovulaciones múltiples y así obtener un número considerable de embriones. Una vez realizada la estimulación, se procede a la fecundación de los óvulos liberados. Luego de 7 días se realizará un lavado del útero, para colectar los embriones y clasificarlos morfológicamente. Los embriones aptos pueden ser transferidos a otras vacas previamente sincronizadas o conservados por congelación para su posterior transferencia. Generalmente los resultados son entre 4 y 6 embriones por donante superovulada y resultados de preñez de 50 y 70% para embriones congelados o transferidos en fresco, respectivamente.

SUPEROVULACIÓN y TESUPEROVULACIÓN y TE

Existen numerosos esquemas de superovulación entre Existen numerosos esquemas de superovulación entre los cuales podemos citar:los cuales podemos citar:

Inicio en fase media luteal o tratamiento convencional : Sobre la base del diagnóstico transrectal de un CL, ya sea con una sola dosis de PMSG o dosis múltiples de FSH (4 días a intervalos de 12h), con la aplicación de PGF2α, 48h después de la aplicación de PMSG o en la 6ta y 7ma aplicación en el tratamiento con FSH.

Manipulación de la onda folicular (sin la Manipulación de la onda folicular (sin la necesidad de detección del celo):necesidad de detección del celo):

Con estradiol y progesterona

Por punción folicular

Aplicación de GnRH o LH

Estimulación de la 1ra onda folicular

Estimulación de los folículos subordinados

Superovulaciones repetidas

Utilización de PMSG al final del tratamiento superovulatorio

Una o dos aplicaciones de FSH

Formula de FSH de liberación lenta

Dos inyecciones de FSH en concentraciones reducidas de hialuronato

No obstante a todo el desarrollo alcanzado en las investigación es sobre superovulación, los resultados de la misma son impredecibles y poco repetibles. De forma tal que la misma es afectada por múltiples factores dentro de los que podemos citar: nutrición, edad, raza, categoría, estado lactacional, manejo, tipo de hormona empleada, entre otros.

Estos factores son difíciles de controlar por el técnico, frente al interés genético que pueda presentar el productor por reproducir un animal en particular.

Producción de embriones in vitro.Producción de embriones in vitro.

Para poder producir embriones in vitro, primero tenemos que conseguir la maduración de los ovocitos, la capacitación del semen que vamos a utilizar para fecundar y después el cultivo de los embriones obtenidos hasta estadios preimplantatorios.

•Medio de maduración (TCM 199 + FSH)

•TALP hepes o gradientes de Percol (medios

para procesamiento del semen)

•Medio de fertilización (TCM 199 + heparina)

•Medio de desarrollo (TCM 199 + IGF1 y otros aditivos o OSF)

Medios empleados en la FIV

La metodología para conseguir la fecundación in vitro es la siguiente:

-Obtención de los ovocitos post mortem (ovarios de animales sacrificados) o in vivo (aspiración folicular guiada por ecografía).

Maduración de los ovocitos in vitro

Separación de fracción espermática motil (swim up o gradientes de percol) y capacitación in vitro de los espermatozoides, bien procedentes de semen fresco o de semen congelado.

Inseminación in vitro de los ovocitos madurados en el laboratorio con el semen capacitado. El tiempo de inseminación varía dependiendo de la especie animal de que se trate.

Cultivo in vitro, con una duración variable y dependiendo de dónde se realice la transferencia de embriones: en el oviducto (hasta el estadio de mórula), y en cuerno uterino (mórula o blastocisto).

Dependiendo de la especie animal, los resultados son muy variables, si bien en ovejas y vacas la fecundación in vitro funciona bien, en la cerda, durante muchos años ha presentado un gran problema como ha sido la polispermia en la fecundación.

En contraste con la FIV de ovocitos colectados post mortem, la FIV de ovocitos colectados in vivo por aspiración folicular permite realizar colectas hasta tres veces por semana (cuatro embriones por colecta 16 mensuales) y los costos de producción son bajos y estables (solo la inversión inicial es relativamente alta).

En general los resultados de maduración, fecundación y cultivo in vitro de embriones, dejan mucho que desear, porque no se superan unas cifras de nacimientos de animales superiores al 40%

Congelación de ovocitos y embriones.Congelación de ovocitos y embriones. En el caso de los bovinos, constituye una herramienta útil para la industria de la transferencia de embriones, ya que el número de embriones puede ser fácilmente correlacionado con el número de receptoras disponibles en un momento apropiado del ciclo estral. También posibilita la transferencia de algunos embriones y la conservación del resto en bancos de germoplasma, hasta poder analizar los registros de producción de la descendencia. Por otra parte permite el intercambio comercial a largas distancias con un material libre de enfermedades contagiosas si estos son tratados adecuadamente. En la actualidad ya se han logrado estabilizar protocolos que emplean congeladores programables que ejecutan todo el procedimiento de congelación lenta y permiten obtener resultados alrededor del 50% de preñez después de la descongelación y transferencia directa sin remoción del crioprotector., empleando como crioprotector etilenglicol al 20% en PBS.

- 7 0C

- 32 0C

- 196 0C

t 0C

min.

3 6

seeding

0. 3 0C / min.

5 min.

Equipo de congelación programable

- 7 0C

- 32 0C

- 196 0C

t 0C

min.

3 6

seeding

0. 3 0C / min.

5 min.

La vitrificación: La vitrificación: Es otro procedimiento de criopreservación, en el cual el embrión es sometido a una solución crioprotectora altamente concentrada, que provoca una deshidratación drástica y extrema. Esta solución con el embrión pasa de un estado líquido a otro casi sólido, sin llegar a congelarse al ser introducida en N2 líquido. La descongelación se realiza de igual forma pero si es imprescindible retirar el crioprotector del embrión, antes de su transferencia, lo cual ha determinado el poco uso práctico de la misma.

Es necesario acotar que los resultados de gestación logrados con embriones producidos in vitro son menores que los obtenidos por superovulación (25 a 30%. vs 40 a 50%), por tales razones se ensayan actualmente nuevos protocolos que salven esta dificultad dado el vertiginoso auge que está alcanzando la producción de embriones por FIV.

Determinación y selección del sexo de embriones y Determinación y selección del sexo de embriones y espermatozoidesespermatozoides Con las modernas técnicas de biología molecular y la identificación de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en varias especies de animales, se han logrado grandes avances para el diagnóstico del sexo en embriones, logrando así, mantener la viabilidad y un alto grado de precisión en embriones preimplantatorios. Uno de los requisitos para el diagnóstico, es obtener una pequeña biopsia del embrión, sin que este afecte su desarrollo posterior. No obstante en su aplicación práctica, nos enfrenta a un proceso ya consumado y que no podemos gobernar.

Sexado de espermatozoides Sexado de espermatozoides

Varios son los métodos de separación de espermatozoides y podríamos resumirlos en dos: aquellos que intentan separar espermatozoides sobre la base de sus características físicas o cinéticas y aquellos que actúan sobre las diferencias nucleares de los espermatozoides que transportan el cromosoma X o el Y. Para separar espermatozoides es necesario conocer que el núcleo del espermatozoide que transporta el cromosoma X es más grande y contiene por tanto una mayor cantidad de ADN que el que transporta el cromosoma Y. Para el proceso en cuestión (citometría), el semen tiene que ser teñido con un colorante fluorescente, el cual se unirá a cada espermatozoide individual según su contenido de ADN. Se hacen pasar luego a manera de una corriente o flujo muy delgado a través de la máquina separadora, la misma utiliza un rayo láser, que ilumina el colorante. Como el espermatozoide "X" contiene 3.8 % más de ADN, éste atrapa más colorante y hace que resplandezca más brillantemente.

Posteriormente una computadora clasifica los espermatozoides en tres grupos:

1) los que llevan cromosoma "X", 2) los que portan "Y", y 3) una población mixta de portadores de "x" e "y" que no pudieron ser clasificados con absoluta claridad. Aquél flujo fino de espermatozoides se fracciona entonces en gotitas conteniendo un espermatozoide cada una, pasando por un dispositivo que les asigna una carga eléctrica + o - , según la clasificación efectuada por la computadora - . Se les hace pasar luego por un campo magnético donde aquéllas con carga + son atraídas hacia el lado - , y las que poseen carga - lo son hacia el lado + . Una vez que han sido separadas las fracciones, el semen puede usarse en fresco (24 horas) o ser congelado.

La citometría, desarrollada por el Dr. Lawrence Johnson en el año de 1992, consigna un 90 % de seguridad en el sexado del semen.

Pero aún los resultados alcanzados en la IA, con semen sexado son más bajos que los que se logran semen convencional (se disminuye la tasa de preñez a la IA, entre un 15 y 20%) y no se recomienda su uso para inseminación de donadoras para la transferencia de embriones, pero ha sido empleado con éxito en la FIV.

Micromanipulación de embriones para producir gemelos Micromanipulación de embriones para producir gemelos idénticos y quimerasidénticos y quimeras

Esta 1ra técnica permite duplicar el número de embriones disponibles y posibilita la inducción de partos dobles de igual sexo, eliminando el riesgo del freemartinismo y le brinda al productor una posibilidad de incremento en la tasa de natalidad.

Estos animales genéticamente idénticos, tienen a su vez gran importancia para el desarrollo de investigaciones sobre comportamiento fisiológico, ya que los mismos son un material difícil de obtener en la naturaleza

Existen diferentes formas en las cuales los embriones pueden ser divididos satisfactoriamente y hay gran variación en las técnicas, producto fundamentalmente de hábitos y experiencias individuales.

Estas técnicas pueden ser divididas en tres grupos, en relación con el estadio de desarrollo con que se trabaje: Separación de blastómeros, división de mórulas antes de la compactación y división de mórulas compactas o blastocitos. Las principales diferencias entre cada procedimiento se basan fundamentalmente en: Instrumentos empleados y medios de cultivo (tanto para realizar la manipulación, como para la conservación o cultivo).

Producción de quimeras: Producción de quimeras: Es otro ejemplo práctico del uso de la micromanipulación en la obtención de individuos por combinación o agregación de células de 2 ó más embriones, es decir de 2 ó más pares parentales. Esta técnica resulta ser el procedimiento inverso al realizado en la producción de individuos idénticos u homocigóticos.

Las quimeras como hemos planteado tienen tejidos de cada embrión que la originó, por lo cual poseen cuatro ó más padres. A su vez si uno de los embriones originales era hembra y el otro macho, el sexo de la quimera resultará indudablemente macho. Desgraciadamente los tejidos que se desarrollan de cada embrión, no pueden ser hasta ahora controlados, de aquí que la contribución de cada embrión original es usualmente desigual y no es raro obtener un 5% proveniente de un animal y un 95% del otro. Por esta razón son empleados en la actualidad solo para lograr transgénicos quiméricos.

Clonación:

Clonar significa crear un ser vivo idéntico a otro, a partir de una célula del individuo original. Hasta hace poco tiempo, los únicos clones que se podían obtener en el laboratorio eran los de células embrionarias. Todas las células o blastómeros que componen un embrión son totipotentes, capaces de regenerar todo el embrión y todas contienen la misma información genética. Cuando llegan al estadio de blastocisto, es cuando comienza la diferenciación celular, ya que las células del trofoblasto darán lugar a la formación de la placenta y las otras, las llamadas del nódulo embrionario o de la masa celular interna, son las que originaran el ectodermo, mesodermo, y el endodermo. Éstas son células diferenciadas y darán lugar a la formación del órgano o tejido para el cual están programadas. Para poder formar clones los requisitos mínimos son: núcleo de una célula donante y ovocitos previamente enucleados.

La clonación de células somáticas por transferencia nuclear (TN), ha permitido la propagación de animales élites y la generación de animales transgénicos para fines agrícolas y biomédicos. La TN implica la enucleación de un ovocito receptor, seguido de la fusión con una célula donante del núcleo. Luego su activación para continuar su desarrollo hasta estadios transferibles. Esto ha sido logrado por múltiples autores en ovejas, cabras y vacas, entre otras especies. Factores como métodos de enucleación, fusión, activación, tipo de célula donante, sincronía del ciclo celular donante/ receptora influyen en los resultados de la TN, los cuales a un resultan en una baja supervivencia de los embriones y los fetos clonados.

Las principales técnicas de clonación son:

- Por separación de blastómeros en los embriones

-Por transferencia nuclear, que fue el método utilizado para clonar a la oveja Dolly.

-Agregación de embriones clonadospara incrementar los resultados depreñez.

La clonación por TN es hoy una realidad pero aún hay mucho por investigar en cuanto a incrementar la eficiencia de las técnicas, resultados de preñez y sobrevida de los fetos producido, así como trastornos en su desarrollo hasta adultos.

Empresas dedicadas a la clonación comercial de animales:

•Genetic Savings & Clone

• RNL Bio

• Cyagra

•AdvancedCell Technology.

• Viagen, entre otras.

CRONOLOGÍA DEL DESAROLLO DE LA CLONACIÓN ANIMAL

Rana: 1952Carpa: 1963Ratón: 1986, 1991 y 2007Oveja: 1986, de células secundarias, 1995, de células diferenciadas de un embrión, 1996, Oveja Dolly.1997, clones trangénicos, Polly y Molly.Macaco Rhesus: 2000Cerdo: 2000, 5 cerdos escocesesG bovino aur: 2001, Noah.Bovino : 2001, 2002, Gato 2001, 2004, 2007, 2008Conejo: 2003, Francia y Corea del Norte.Mula: 2003, Venado: 2003Yegua: 2003Rata: 2003Mosca de fruta: 2007Perro: 2005Camello: 2009Toro de lidia: 2010

Bisección y selección del

citoplasma receptor * *

Pareo celular

1st and 2nd Fusión

Eliminación del cumulus y zona pelúcida * **

Activación, cultivo y transferencia

Transgénesis

La transgénesis que significa la introducción de ADN exógeno en el genotipo de un animal, es una herramienta importante tanto para la agricultura, como para la farmacología, la biomedicina y la biotecnología. Una gran variedad de métodos han sido desarrollados para introducir ADN, entre ellos la inyección de ADN en embriones y la transfección de células somáticas seguidas del transplante nuclear o clonación. Las técnicas de trangénesis permitirán la creación de fenotipos totalmente novedosos, que confieren a las especies de interés zootécnico características beneficiosas para la producción, tales como la resistencia a enfermedades, una mayor eficiencia en la obtención de energía, o la producción de proteínas de interés industrial o biomédico entre otras.

Bisección y selección del

citoplasma receptor * *

Pareo celular

1st and 2nd Fusión

Eliminación del cumulus y zona pelúcida * **

Activación, cultivo y transferencia

Microinyección de ADN exógeno en los pronúcleos:Ha demostrado ser útil en especies de importancia zootécnica, pero presenta dificultades en el bovino por la baja visualización de los pronúcleos

Transgénesis por clonación (TN): Esta tecnología haido reemplazando a la anterior y se han aprovechado las células somáticas de los animales transgénicos para ser estos clonados por TN.

Inyección intracitoplasmática de células o espermatozoides transfectados con ADN foráneo seguido de inseminación: Esta técnica posee un altoíndice de mosaisismo y puede que el transgen quede extracromosómico y no integrarse al ADN del embrión.

Inyección intracitoplasmática de espermatozoides: Se microinyecta un espermatozoide o una célula trans-fectados con ADN foráneo, pero es indispensable la posterior activación para el inicio de las divisiones ya sea por estímulos físicos o químicos.

Transferencia de genes por microinyeccióncitoplasmática de células o fragmentos: La inyección intracitoplasmáticamente en ovocitosen metafase II, de células somáticas o frag-mentos de ellas previa coincubación con ADN externo y luego al someter los ovocitos a FIV se pueden lograr embriones que expresen el transgen. La eficiencia es aceptable pero hay grancantidad de mosaisismo.

En la actualidad se están desarrollando trabajos que han logrado clonar incluso células gaméticas (ovocitos y embriones), lo cual sin dudas permitirá elevar la eficiencia de la transgénesis disminuyendo el frecuente mosaisismo encontrado, de forma tal que ambos gametos puedan portar el transgen deseado.

Las aplicaciones de estas tecnologías están solo limitadas por nuestras capacidades de imaginación e innovación. Por tales razones podemos decir que están abiertos nuevos caminos hacia el futuro.

Vaca clonada con genes humanos produce leche similar a la materna

“Rosita” provee de leche compuesta con dos proteínas de alta importancia para la nutrición de los lactantes

ConclusionesConclusiones • El empleo de todas estas biotecnologías reproductivas, va estar condicionado a la posibilidad de constar con la infraestructura necesaria y el personal capacitado para ejecutarlos.

• Resulta indispensable que nos preocupemos realmente por buscar los fondos requeridos para poder implementar aquellas, que nuestro sector pecuario necesita en la brevedad posible para poder enfrentar los retos del presente siglo y finalmente salir airosos con una ganadería altamente productiva.

• A pesar de disponerse en la actualidad de un gran parque de biotecnologías reproductivas listas para su empleo en la producción pecuaria, nos queda mucho por investigar para elevar sus resultados, hacerlas sostenibles y evitar los problemas éticos que su aplicación pueden provocar.