Biotecnología Ambiental

Introducción

“The Keeling Curve”

27%

23% 19%

13%

6%

6% 4%

2%

Emisiones Globales de CO2

Resto

China

EUA

UE

Rusia

India

Japón

Canadá

Principales participaciones globales en la emisión de CO2. Fuente: EPA (http://goo.gl/cdb0V5)

¿Y qué se ha hecho para contrarrestar esto?

El Protocolo de Kyoto durante el año 2012 comenzó su segundo compromiso de reducir emisiones de gases de efecto invernadero, y tiene como fecha límite el 2020

¿Qué pasó al final de este protocolo?

Éxitos

Fracasos

Reino Unido Alemania República Checa Ucrania

Canadá Japón España Australia

Acciones concretas

Biocombustibles

1era generación 2 3 4

A partir de cultivos vegetales

energéticos.

Económicamente son los más importantes

Compiten contra alimentos

2da generación 1 3 4

Basados en cultivos vegetales no alimenticios

Económicamente le siguen en

importancia a la 1ra generación

También abarcan desechos y residuos

(vegetales en su mayoría)

3ra generación 1 2 4

Generados por microalgas

Aún no se producen ni consumen a gran

escala

Estos organismos tienen otras

aplicaciones, pero energía no

4ta generación 1 2 3

Son aquellos donde se aplica la

ingeniería genética para mejorarlos

Básicamente sólo existen en escala de

laboratorio

Aparentan ser los más promisorios

Tres cuartos de los 27.9 billones de galones mundiales del mercado de biocombustibles para el 2012 fueron para etanol.

Y ahora: Bioetanol y Biodiesel

Bioetanol Biodiesel

Fermentación de azúcares Transesterificación de grasas

Usado como aditivo en combustibles (gasolina)

Se mezcla con petrodiesel (no es aditivo)

A partir de cultivos “azucarados”

A partir de cultivos “grasosos”

3

Metanol Triacilglicérido Glicerol Fatty Acid Methyl Esters =

Biodiesel

Biodiesel: transesterificación

Bioetanol: fermentación

Ingeniería Metabólica

Introducción

El objetivo de la ingeniería metabólica es la modificación directa

de los flujos metabólicos.

Mejorar la producción de un metabolito

formado naturalmente por un organismo

Proveer al organismo de la habilidad de utilizar

sustratos atípicos

Formar metabolitos no producidos

naturalmente

Ingeniería metabólica racional

Modificar vías basándose en información

disponible (enzimas, reguladores, etc)

Transferencia del conocimiento y

resultados a otras especies

Ingeniería evolutiva

Insertar modificaciones

aleatorias en todo el genoma e identificar clonas potenciales

No se requiere conocimiento previo.

Descubrimientos muy interesantes

potenciales

Librerías (de sobreexpresión y

otras)

Sobreexpresión o eliminación aleatoria

de varios genes

Revelación de estrategias novedosas

de mejoramiento. Conocimiento previo

no fundamental

Ingeniería de transcripción

Reprogramar expresión de genes al modificar factores de

transcripción

Características multigénicas pueden

ser atendidas

Estrategia Descripción Ventajas

¿Y las desventajas?

GenA

Metabolito A (no muy

bueno)

Enzima A S1

Metabolito B (mejor)

Metabolito B (mejor)

GenB

Enzima B

P p GenS1

S2

GenS2

Almidón Lignocelulosa Azúcares simples

Alcohol de dos tipos:

Azúcares simples

Ingeniería Metabólica: Bioetanol

El que fermenta Como fermenta

Lo que fermenta

Almidón Lignocelulosa Azúcares simples

Almidón

Amilosa: Glucosa 1-4 Amilopectina: Glucosa 1-6

Enzima faltante para

degradar almidón

Azúcares simples

Buscar en la naturaleza

Objetivo: Mayor/mejor

producción de etanol

El héroe: Saccharomyces

cerevisiae

Enemigos:

Almidón Lignocelulosa

Insertar genes para expresar glucoamilasa, sola o en combinación con alfa-amilasa. (Nevoigt et al, 2008). Anclar estas enzimas a la membrana exterior utilizando la proteína Flo1. (Khaw et al, 2006)

Expresión de beta-glucosidasas, endoglucanasas y celulasas. (Toda et al, 2005; van Rooyen, 2006). Ingeniería de proteínas (dominios) para mejorar la unión a celulosa. (Gundlapalli et al, 2008)

Compañeros:

Pichia stipitis Zymomonas mobilis

A través de genes como XYL1 y 2, es posible fermentar xylosa, 2do azúcar más abundante en lignocelulosa (Hanh et al, 2007; Zhang, 2012)

Pretratamientos de

almidón y

lignocelulosa

Lipomyces kononenkoae y Saccharomycopsis fibuligera

P LKA1 Promotor y terminador: Fosfoglicerato cinasa

T

P LKA2 T

P SFA1 T

P SFG1 T

Alfa-amilasas (L. kononenkoae )

Alfa-amilasa (S. fibuligera)

Glucoamilasa (S. fibuligera)

Transformación de levaduras

Análisis de southern

Análisis en placas

Crecimiento en biorreactores

Resultado: Crecimiento en

almidón Aprovechamiento

de un 80% 0.06 g/L de etanol

3

Metanol Triacilglicérido Glicerol Fatty Acid Methyl Esters =

Biodiesel

Biodiesel: transesterificación

La biofábrica en Saccharomyces

Naturalmente no es gran productora de ácidos grasos, y

menos genera biodiesel

Entonces…

• Genes clave en la síntesis de ácidos grasos, sobre-

expresados (genes nativos)

• Acetil-CoA carboxilasa (ACC1)

• Sintasa de ácidos grasos 1 (FAS1)

• Sintasa de ácidos grasos 2 (FAS2)

CH2OH

CHOH

CH2OPO3H

CH2OOCR

CHOH

CH2OPO3H

Glicerol – 3 – fosfato

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OPO3H

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OH

Ácido lisofosfatídico Ácido fosfatídico Diacilglicerol

GPAT LPAT PAP

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OH

Acil-CoA

Diacilglicerol Triacilglicérido

DGAT

Síntesis de Triacilglicéridos

Levadura modificada

Contenido graso

17%-20%

Ácidos grasos libres

Biodiesel

400 mg/L

5 mg/L

Diseño de un

microorganismo capaz

de generar biodiesel a

partir de azúcares

simples

CH2OH

CHOH

CH2OPO3H

CH2OOCR

CHOH

CH2OPO3H

Glicerol – 3 – fosfato

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OPO3H

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OH

Ácido lisofosfatídico Ácido fosfatídico Diacilglicerol

GPAT LPAT PAP

Ingeniería Metabólica: Biodiesel

Ruta Bioquímica en la producción de Triacilglicéridos

CH2OOCR

CHOOCR

CH2OH

Acil-CoA

Diacilglicerol Triacilglicérido

DGAT

Ingeniería Metabólica: Biodiesel

$

Umbelopsis ramanniana Glycine max

DGAT 2

Aumento en la cantidad de lípidos en un 1.5% (peso)

$17.9 USD por tonelada métrica

$ 70.4 millones de toneladas métricas 2007-2008

$ $1.26 mil millones / año

Lardizabal et al.. 2008 Plant Physiol

Otros combustibles

Hidratos de metano

(o también clatratos)

“Moléculas cristalinas de agua con gases atrapados en su

interior formados debido a altas presiones y temperaturas”.

Depósito marino

Zona de alta presión y

baja temperatura

(2km y 0°C)

Gas generado por actividad biológica

Formación de hidratos en zonas cercanas a placas continentales.

Gas filtrado desde la

profundidad

Y llega la controversia (más que los biocombustibles)

Estimación de la reserva explotable con tecnología actual:

1 0 0, 0 0 0, 0 0 0, 0 0 0, 0 0 0, 0 0 0, 0 0 0 L

10 mil billones

100 trillones

580 trillones

Consumo de gas x 1,694,915,254

60% de las reservas actuales de gas natural

Y exactamente… ¿Cómo se pueden usar?

CH4 CH4 CO2 CO2

Se inyecta CO2 Se recupera CH4

¿Y las microalgas?

Schenk et al, 2008. Bioenerg. Res.

% de aceite por biomasa

Litros de aceite / Ha al año

Tierra: m2 año/Kg biodiesel

40 1070 11

36 5366 2

30 58 700 0.2

70 136 900 0.1

Plantas y microalgas para biocombustibles

CO2

No compiten por territorio arable

[ Eficiente uso de espacio ]

Diferentes biocombustibles

Aún así, se requieren mejoras considerables para un escalamiento industrial.

Basados en microalgas

La microalga ideal

Wijffels et al., 2010. Science

Aceites excretados Fácil recuperación

Insensible a altas concentraciones de oxígeno

Capaz de crecer y producir lípidos al mismo tiempo

Células grandes con membranas delgadas

Alta productividad con luz intensa

46

Zuppini et al., 2010. Plant Cell Physiol. Se utilizó a esta alga como modelo de tolerancia a estrés osmótico y de temperatura, así como la Muerte Celular Programada.

Zuppini et al., 2009 J Exp Bot. El citocromo F está involucrado en la MCP, así como una participación del

cloroplasto.

Tan et al., 1991. Hydrobiol. Las condiciones del cultivo heterotrófico pueden cambiar significativamente la composición y cantidad de lípidos.

Otros trabajos: Fusión de protoplastos, biomarcador de

contaminación, osmoregulación, etc.

Algunos estudios

47

Células (x106)

Existe un reporte sobre el uso de esta alga como potencial productor de lípidos para biocombustibles

Herrera-Valencia et al., 2011. Curr Microbiol

Control NaCl ND NaCl/ND

Número de células: Decremento en tratamiento de Deficiencia de Nitrógeno y en combinación con salinidad.

Co

nte

nid

o d

e líp

ido

s (%

de

DB

W)

Contenido de lípidos: Superior a los cultivos heterotróficos (55.2% para Chlorella protothecoides). Superior a estrés por Nitrógeno en Neochloris oleobundans (56%)

[Salinidad] [Deficiencia de N]

Chlorella saccharophila para biocombustibles

48 Control NaCl ND ND/NaCl

103.73 ± 0.11

160.13 ± 77.52

315.53 ± 15.01

220.33 ± 7.22

Alto rendimiento de FAMEs sin afectar biomasa Alta productividad de lípidos Perfil de FAMEs deseable (C-18:1 cis y trans, C-18:0 y C-16:0)

Chlorella saccharophila para biocombustibles

Rendimiento de metil ésteres de ácidos grasos (FAMEs) (mg/L)

49

Transformación de Chlamydomonas reinhardtii

Líneas modificadas de C. reinhardtii sobreexpresando CreDGAT

B: Medio completo

C: Medio con DN

Líneas modificadas de C. reinhardtii sobreexpresando CreDGAT

Deng et al, 2012. Mol. Plant

Precios esperados Precios reales

Economía

Energía

Y ahora

Biorremediación

Introducción

VS

Combustibles fósiles

Combustibles fósiles

Combustibles fósiles: Ingeniería genética

Fitorremediación

Solventes

Fertilizantes

Explosivos

Metales pesados

Desechos animales

Desechos y contaminantes

variados y complejos

Bacterias Algas

Aprovechamiento y usos industriales potenciales

En acuacultura

El combustible “casi” perfecto:

Hidrógeno

H Hidrógeno

1 Valencia 1

Peso 1.00797

Estructura 1s1

El más abundante en

el universo

Presente en… todas partes

Forma parte de todos los demás

combustibles

Usos del Hidrógeno

Petróleo [refinación]

Grasas saturadas [estabilización]

Soldadura Vidrio

Vehículos espaciales [Propulsión y

mantenimiento]

Vehículos domésticos

Agua como desecho [Reuso y reciclaje]

Hidratación de personal

Recolección

Combustible

Hidrogenación Manufactura

Energía

Piezoelectricidad

70