“Biotecnología moderna en la salud humana y en el mejoramiento de la

biodiversidad animal”

Ricardo Fujita, Ph.D.Ricardo Fujita, Ph.D.Centro de Genética y Biología MolecularCentro de Genética y Biología Molecular

Facultad de MedicinaFacultad de MedicinaUniversidad de San Martín de PorresUniversidad de San Martín de Porres

rfujita@usmp.edu.perfujita@usmp.edu.pe

Tópicos

• Genética Humana: diferencias, predisposiciones

• Predicción: familia, edad, industria• Cambio: proteínas recombinantes,

terapia génica• Animales: antropomorfización,

derechos

Los de arriba y los de abajoLos de arriba y los de abajo

• Avances cientAvances científicos y tecnológicos más íficos y tecnológicos más rápidos que nunca en historiarápidos que nunca en historia

• Beneficio de tecnologBeneficio de tecnología principalmente para ía principalmente para poblaciones de papoblaciones de países desarrolladosíses desarrollados

• Brecha tecnológica con países pobres Brecha tecnológica con países pobres demasiado grande para beneficiarnosdemasiado grande para beneficiarnos– económicaeconómica– educativaeducativa– social social – conocimientosconocimientos– Comunicaciones (contenido)Comunicaciones (contenido)

Algunos avances para el análisis en Genética Molecular

• Biología Molecular: Reconocimiento de estructuras y funcionamiento de la expresión de genes. Identificación de herramientas para analizar y manipular material genético.

• Clonación Molecular: DNA recombinante, da capacidad de identificar y aislar genes. Bancos genómicos, proteínas recombinantes, transgénicos, K.O.

• Transcriptasa Reversa: Permite analizar expresión específica de genes. Tejidos, órganos, estadíos, medio ambiente, etc. Bancos de expresión, cDNAs.

• Amplificación PCR: Análisis de pequeños segmentos de ADN. Diagnóstico, marcadores.

• Secuenciación: Análisis a nivel de una letra (base de DNA: A, T, C, G). Análisis de genes, identificación de mutaciones

• Bioinformática: identificación y comparación de millones de secuencias ente miles de organismos

• Clonación celular: stem cells, animales clonados

Algunos aspectos de biotecnología y salud

1. An1. Anáálisis y caracterizacilisis y caracterizacióón de material genn de material genéético y su funcitico y su funcióón:n:– Mapeo e identificaciMapeo e identificacióón de genes individualesn de genes individuales– Genoma, conjunto del material genGenoma, conjunto del material genééticotico– Transcriptoma, estudio de la expresiTranscriptoma, estudio de la expresióónn– Proteoma, estudio de la expresiProteoma, estudio de la expresióón y produccin y produccióón de n de

proteproteíínasnas– Metaboloma, expresiMetaboloma, expresióón conjunta y coordinada de genes n conjunta y coordinada de genes

y protey proteíínasnas2. Ingenier2. Ingenieríía Gena Genéética (manipulacitica (manipulacióón genn genéética):tica):

– ProteProteíínas recombinantesnas recombinantes– Terapia gTerapia géénicanica

3. C3. Céélulas Troncales (Stem cells)lulas Troncales (Stem cells)– Regeneración de tejidos– Organogénesis

Sistema de vigilancia Sistema de vigilancia éticaética• El científico no puede ser Dr. Frankenstein, hacer lo que se El científico no puede ser Dr. Frankenstein, hacer lo que se

ocurre.ocurre.• Declaración de Helsinski (versión vigente 2004)Declaración de Helsinski (versión vigente 2004)• GuGuíaíass Eticas Internacionales para Investigaci Eticas Internacionales para Investigaciónón BiomBiomédédiica que ca que

Involucra a Humanos, del CIOMS y de la OMSInvolucra a Humanos, del CIOMS y de la OMS http://www.who.int/tdr/publications/publications/pdf/ethicssp.pdfhttp://www.who.int/tdr/publications/publications/pdf/ethicssp.pdf• National Institutes of Health Ethics ProgramNational Institutes of Health Ethics Program • ComitComités de ética universidadesés de ética universidades• AsociaciAsociación de comités de ética Perú:ón de comités de ética Perú:http://www.ins.gob.pe/gxpsites/hgxpp001.aspx?http://www.ins.gob.pe/gxpsites/hgxpp001.aspx?

2,13,59,O,S,0,MNU;E;20;5;MNU;,2,13,59,O,S,0,MNU;E;20;5;MNU;,• Conflictos de interés comercialConflictos de interés comercial

DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE EL GENOMA DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE EL GENOMA HUMANO Y LOS DERECHOS HUMANOSHUMANO Y LOS DERECHOS HUMANOS

Declaración aprobada, el 11 de noviembre de1997.Declaración aprobada, el 11 de noviembre de1997. A. LA DIGNIDAD HUMANA Y EL GENOMA

HUMANO

• Artículo 1.El genoma humano es la base de la unidad fundamental de tu los los miembros de la familia humana y del reconocimiento de su dignidad y diversidad intrínsecas. En sentido simbólico, el genoma humano es el patrimonio de la humanidad. ﾊﾊ Articulo 2.a) Cada individuo tiene derecho al respeto de su dignidad y derechos, cualesquiera que sean sus características genéticas.b) Esta dignidad impone que no se reduzca a los individuos a sus características genéticas y que se respete su carácter 從 ico y su diversidad. ﾊﾊ Articulo 3.El genoma humano, por naturaleza evolutivo, est� sometido a mutaciones. Entra 紡 posibilidades que se expresan de distintos modos en funci 溶 de entorno natural y social de cada persona, que comprende su estado de salud individual, sus condiciones de vida, su alimentación y su educación. ﾊ Artículo 4.El genoma humano en su estado natural no puede dar lugar a beneficios pecuniarios.

DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE EL GENOMA DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE EL GENOMA HUMANO Y LOS DERECHOS HUMANOSHUMANO Y LOS DERECHOS HUMANOS

Declaración aprobada, el 11 de noviembre de1997.Declaración aprobada, el 11 de noviembre de1997.

• INVESTIGACIONESINVESTIGACIONES

• Artículo 12Artículo 12• a) Toda persona debe tener acceso a los progresos de la a) Toda persona debe tener acceso a los progresos de la

biología, la genética y la medicina en materia de genoma biología, la genética y la medicina en materia de genoma humano, respetándose su dignidad y derechos.humano, respetándose su dignidad y derechos.

• b) La libertad de investigación, que es necesaria para el b) La libertad de investigación, que es necesaria para el progreso del saber, procede de la libertad de pensamiento. Las progreso del saber, procede de la libertad de pensamiento. Las aplicaciones de la investigación sobre el genoma humano, aplicaciones de la investigación sobre el genoma humano, sobre todo en el campo de la biología, la genética y la medicina, sobre todo en el campo de la biología, la genética y la medicina, deben orientarse a aliviar el sufrimiento y mejorar la salud del deben orientarse a aliviar el sufrimiento y mejorar la salud del individuo y de toda la humanidad.individuo y de toda la humanidad.

• SOLIDARIDAD Y COOPERACISOLIDARIDAD Y COOPERACIÓNÓN• Artículo 19Artículo 19• a) En el marco de la cooperación internacional con los países a) En el marco de la cooperación internacional con los países

en desarrollo, los Estados deberán esforzarse por fomentar en desarrollo, los Estados deberán esforzarse por fomentar medidas destinadas a:medidas destinadas a:– i) i) evaluar los riesgos y ventajasevaluar los riesgos y ventajas de la investigación sobre el de la investigación sobre el

genoma humano y prevenir los abusos;genoma humano y prevenir los abusos;– ii) ii) desarrollar y fortalecer la capacidaddesarrollar y fortalecer la capacidad de los de los países en países en

desarrollodesarrollo para realizar investigaciones sobre biología y para realizar investigaciones sobre biología y genética humanas, tomando en consideración sus genética humanas, tomando en consideración sus problemas específicos;problemas específicos;

– iii) permitir a los iii) permitir a los países en desarrollopaíses en desarrollo sacar provechosacar provecho de los de los resultados de las investigaciones científicas y tecnológicas a resultados de las investigaciones científicas y tecnológicas a fin de que su utilización en pro del progreso económico y fin de que su utilización en pro del progreso económico y social pueda redundar en beneficio de todos;social pueda redundar en beneficio de todos;

– iv) fomentar el iv) fomentar el libre intercambiolibre intercambio de conocimientos e de conocimientos e información científicos en los campos de la biología, la información científicos en los campos de la biología, la genética y la medicina.genética y la medicina.

• b) Las organizaciones internacionales competentes deben b) Las organizaciones internacionales competentes deben apoyar y promover las iniciativas que tomen los Estados con apoyar y promover las iniciativas que tomen los Estados con los fines enumerados más arriba.los fines enumerados más arriba.

FOMENTO DE LOS PRINCIPIOS DE LA DECLARACIÓN

• Art. 20 Los Estados tomaràn las medidas adecuadas para fomentar los principios establecidos en la Declaración, a través de la educación y otros medios pertinentes, y en particular, entre otras cosas, la investigación y formación en campos interdisciplinarios y el fomento de la educación en materia de bioética, en todos los niveles, particularmente para los responsables de las políticas científicas.

• Art. 21 Los Estados tomarán las medidas adecuadas para fomentar otras formas de investigación, formación y difusión de la información que permitan a la sociedad y a cada uno de sus miembros cobrar mayor conciencia de sus responsabilidades ante las cuestiones fundamentales relacionadas con la defensa de la dignidad humana que puedan plantear la investigación en biología, genética y medicina y las correspondientes aplicaciones. Se deberán comprometer, además, a favorecer al respecto un debate abierto en el plano internacional que garantice la libre expresión de las distintas corrientes de pensamiento socioculturales, religiosas y filosóficas.

• Diagnostic Confirmation of clinical diagnosisMajority of requests

• PredictiveTesting at risk relatives for presence of familial mutation

• Prenatal diagnosisTesting foetal DNA: CV sample (10-11 wks gestation)Amniocytes (14-16 wks gestation)To date a VERY small part of the service(approx 3-4 reports/year)Preimplantional

• Population ScreeningIdeally offered to all individualsAutosomal recessive disorders are particularly suitable e.g. Cystic fibrosis

Categorías de pruebas diagnóstico

Ethical Problems

• Sex selection• Generation of unwanted information eg in HD• Discovery of paternity problem eg in CF• Confidentiality issue eg translocation in Down

syndrome• Discovery of genetic predisposition affects job

/ insurance

1122*33

1122*33

1122*33

1122*33

1122*33

1122*33

112233

112233

112233

112233

112233

112233

Cromosoma 1Cromosoma 2Cromosoma 3....

Mapeo Genético Monogenico(Linkage)

Chequear segregación de una enfermedad (humanos) o un caracter (otros organismos)

Marcadores

....Cromosoma 22

Diagnóstico gen glaucoma familia AndahuaylasDiagnóstico gen glaucoma familia AndahuaylasGlaucoma primario ángulo abiertoGlaucoma primario ángulo abierto5-7% población5-7% población6 genes6 genesMYOCMYOC Glaucoma juvenil Glaucoma juvenil

Guevara-Fujita, Perez-Grosman, Estrada, Pawar, Vargas, Richards y Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17: 67-72.

normal

afectado

T G A T T G A C T A C A A N C C C C T G G A C A A

nt1440 (aa 480)

Guevara-Fujita, Perez Grossman, Estrada, Vargas, Richards y Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17: 67-72.)

Fig.2 Sequence of MYOC exon 3 in a POAG patient of family. N Fig.2 Sequence of MYOC exon 3 in a POAG patient of family. N indicates a double reading (C and G) in nucleotide position 1440 of indicates a double reading (C and G) in nucleotide position 1440 of gen MYOC. Normal sequence 1438-1440 (AAC) corresponds to gen MYOC. Normal sequence 1438-1440 (AAC) corresponds to codon Asn, whereas mutation changes codon to AAG, Lys. This codon Asn, whereas mutation changes codon to AAG, Lys. This transversion yields a MYOC Asn480Lys mutation (charge). transversion yields a MYOC Asn480Lys mutation (charge).

Amplificación del gen de la Corea de Huntington

Umbral > 36-40

Umbral < 36-40

Expansión (CAG)n - (Glu)n P N N N N

*

*

** *

*

*

***

Hurtado, Acevedo, Guevara, Fujita, IGBM, USMP, Lima, PerúBiancalana, Mandel, LGME, Strasbourg, France

Analisis Molecular de Huntington - PCR exon 1Familia U - Lima

Guevara M.L. y Fujita R. (IGBM, Jun. 2002)

M10 m25 N 1 2 3 4 5 6 7

umbral 40 repeticiones

¿De quién se secuenció en Proyecto Genoma Humano?

• Mixtura de varias personas• generado de 10-20 muestras de donantes anónimos de

diferentes grupos étnicos (caucásicos > afroamericanos> asiáticos). Hispanos

• Sudamericanos (nativos y mestizos) sub-representados

Etnias estudiadas en PGH

Poblaciones sudamericanas no representadas en estudios del genoma humano

CayapasCayapas

LambayequeLambayeque

ColoradosColorados(Cóngoma y Chiguilpe)(Cóngoma y Chiguilpe)

LoretoLoreto

JunínJunínUcayaliUcayali

AyacuchoAyacucho

Lago Titicaca (Taquile,Lago Titicaca (Taquile,Amantaní, Los Uros yAmantaní, Los Uros yAnapia)Anapia)

MapuchesMapuches

Distribución de MBL (defensa contra patógenos) Distribución de MBL (defensa contra patógenos) deficiente en Sudaméricadeficiente en Sudamérica

0102030405060708090

Cayap

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Cóngo

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Chiguilp

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Anapia

Chirigu

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Poblaciones

porc

enta

je

Cayapas Cóngoma Chiguilpe Loreto Ucayali San José Junín

Ayacucho Taquile Amantaní Los Uros Anapia Chiriguanos Mapuches

ChiriguanosChiriguanos2424 2727 3636 2727 2222

41412222

3535

8080 8080

3535

5858

4242 4646

Human Genome MeetingHuman Genome MeetingKyoto, April 2005Kyoto, April 2005

Sandoval, Madsen, Sandoval, Madsen, Velazquez, Descailleaux, Velazquez, Descailleaux, Ñique, Di Stefano, Ñique, Di Stefano, Garred, FujitaGarred, Fujita

Problemas potenciales para Genographic

• Mala información:– Venta de sangre– Venta de células

• Politización (Bolivia, Ecuador, Brasil) National Geographic transnacional imperialista

• Motivos tradicionales/religiosos

Proteínas Recombinantes Proteínas Recombinantes Proteínas humanas para reemplazo (en pacientes con Proteínas humanas para reemplazo (en pacientes con deficiencias) obtenidas en mayor cantidad, purificadas, a partir deficiencias) obtenidas en mayor cantidad, purificadas, a partir de bacterias, plantas o animales transgénicosde bacterias, plantas o animales transgénicos

Mercado de miles de millones US Dollars

Vacunas comestibles• Protección contra la hepatitis B

(antígeno de superficie HBsAg), el cólera, la diarrea (E. coli, toxina LT-B, CT-B), HIV (gp120), herpes

• Plantas: papa, plátano, tomate, tabaco, otras frutas

• Evaluaciones en laboratorio en estado avanzado. En papa, hasta 0.3% de ab solubles de LT-B en papas hervidas (Tacket et al, 1998)

• Actualmente, fase de prueba en voluntarios

http://home.cwru.edu/~eay3/ESR/vaccine2big.htm

http://www.sciam.com/2000/0900issue/0900langridge.html

Terapia génica

• Modificar o activar la expresión de un gen endógeno mediante la introducción de una versión modificada in vitro

• Ataca causa primaria vs. síntomas

• Especificidad en celula o tejido blanco• Localizado vs. sistémico

• Rangos de duración más largos

• Varias estrategias dependiendo de enfermedad

Estrategia de reemplazo de gen mutante

Introducción de gen normal en celulas mutantes

Incorporación de gen por crossing over

Celulas con función normal

Cuando el gen mutante es nocivo, ejm. enfermedades dominantes

Ashanti da Silva

• Deficiencia de ADA (adenosina deaminasa)• Ciclo de salvamento de purinas, importante

en linfocitos T, SCID (severe combined immunodeficiency).

• Gen clonado, pequeño• Celulas blanco (MO) accesible y cultivables• Enfermedad recesiva, niveles normales

10-5000 % del promedio.

Sobrevivientes de SCID

Cynthia (1991) y Ashanti (1990)

Protocolos presentados / aprobados

Tipos celulares en terapia génica

Jesse Gelsinger

• Ornitina transcarbamilasa (OTC)• Protocolo aprobado en 1995• Adenovirus• Muere de shock anafiláctico Oct 99!!!!

Preocupación en terapia genica

• Somatica vs. Germinales (integracion al azar, modificacion a varias generaciones, fertilizacion in vitro).

• Enfermedades letales/cambios cosméticos• Calibracion de virus (adenovirus/AVhelper)• Tratamientos alternativos• Terapia génica ≈ transplante?• Organogénesis/clonación• Que enfermedades tratar?

La Promesa de las células madre (Stem cells)Búsqueda de fármacos y tests de toxicidad

Estudios del control de genes y desarrollo

Células cultivadas troncales multiplicadas

Tejidos células para terapia

médula ósea neuronas músculos páncreas

Células madre• Célula madre: se reproduce y da lugar a diferentes tipos

celulares in vitro• Diferencia con células embrionarias: provienen del mismo

paciente (evita rechazo).• Corrientemente usado en linfomas y leucemias con células de

médula ósea o cordón umbilical.• Para reemplazar células anormales degenerativas (Alzheimer,

Parkinson, diabetes), proliferativas (tumores, cáncer), accidentes (tetraplégicos) o intoxicaciones.

• Organogénesis: formación de órgano o parte de función a partir de células madre.

• Todavía en experimentación en mayoría de países. China turismo médico en células madre.

• Perú: INCOR infartos OK, compañías? (a probar)

Terapia génica

• Modificar o activar la expresión de un gen endógeno mediante la introducción de una versión modificada in vitro

• Ataca causa primaria vs. síntomas

• Especificidad en celula o tejido blanco• Localizado vs. sistémico

• Rangos de duración más largos

• Varias estrategias dependiendo de enfermedad

Derechos animales

• Salud humana vs. Animal• Modelos naturales y creados• Crueldad excesiva e inútil• Activismo

Proyecto Genoma Alpaca:Proyecto Genoma Alpaca:Generación y Localización de Generación y Localización de

Marcadores Genéticos Asociados a Marcadores Genéticos Asociados a Calidad de Fibra e Inmunidad para el Calidad de Fibra e Inmunidad para el

Mejoramiento de Alpacas usando Mejoramiento de Alpacas usando Bancos Genómicos y de ExpresiónBancos Genómicos y de Expresión

INCAGROINCAGRO

Institución Responsable: Centro de Genética y Biología Institución Responsable: Centro de Genética y Biología Molecular, Facultad de Medicina, U. San Martín de PorresMolecular, Facultad de Medicina, U. San Martín de Porres

Instituciones Colaboradoras:Instituciones Colaboradoras:• Sociedad Peruana de Criadores de Alpacas y Llamas (SPAR) Sociedad Peruana de Criadores de Alpacas y Llamas (SPAR) • Centre National de SequenCentre National de Sequenççage de France (Genoscope)age de France (Genoscope)• Equine and Bovine Genome Center, Animal Sciences, Texas Equine and Bovine Genome Center, Animal Sciences, Texas A&M University, USA.A&M University, USA.

En el estudio se propuso…En el estudio se propuso…

1.1. Bancos GenBancos Genómicos. ómicos. Primer banco de genoma BACs Primer banco de genoma BACs de camélidos (sudamericanos, africanos o asiáticos) de camélidos (sudamericanos, africanos o asiáticos) del mundo. Bancos de fagos.del mundo. Bancos de fagos.

2.2. Generación de marcadores genéticos en camélidos. Generación de marcadores genéticos en camélidos. Hasta ahora menos de 100; necesarios más de Hasta ahora menos de 100; necesarios más de 500-1000.500-1000.

3.3. Identificación de genes y marcadores asociados a Identificación de genes y marcadores asociados a fibra e infecciones (candidatos para mejoramiento). fibra e infecciones (candidatos para mejoramiento).

4.4. Primer mapa genético y cromosómico de alpacas (y Primer mapa genético y cromosómico de alpacas (y camélidos). camélidos).

5.5. Estudio multinacional de genómica de una especie Estudio multinacional de genómica de una especie bandera liderado desde Perúbandera liderado desde Perú

Proyecto de Interés Nacional (PIN)PCM FINCyT-BID

Evaluación de la Biodiversidad Genética de 4 Recursos Marinos (Anchoveta, merluza, pota, concha

de abanico) • Institución Responsable: Centro de Genética y Biología Molecular - Facultad de Medicina-U San Martín de Porres•Instituciones colaboradoras: • Laboratorio de Artes de Pesca- Fac. Biología - U Nacional de San Marcos• Instituto del Mar del Perú (IMARPE)• University of South Caroline• Universidad Federal de Minas Gerais• Universidad Autónoma de México

Problemas de Aduana

• Importación de BACs (SENASA)• Importación de vectores fagos

(DIGEMID)• Importación de insumos (primers,

enzimas, etc.)• Autoridades no preparadas

Conclusiones

• Avances muy rápidos en CyT• Capacidad de leer (predecir) y

modificar la información genética• Sociedad no preparada: muy

fantasiosa, muy asustada• Incrementar la información veraz• Comités de ética y bioseguridad