BIOQUIMICA

Tema 1 Concepto de bioquímica, clasificación y la vida

Concepto de bioquímica.

Es la ciencia que estudia los componentes químicos constituyentes de los seres vivos, estructura, funciones y transformaciones.

Ciencia que explica la vida utilizando el lenguaje de la química.

Ciencia que estudia la vida a nivel molecular.

Hay tres tipos de bioquímica.

-Bioquímica estructural: estudia la composición química, estructura, conformación y configuración de las materias que componen los seres vivos.

-Bioquímica metabólica o dinámica: estudia funciones, transformaciones, reacciones de la molécula que forman partes de la materia viva y los mecanismos que la regulan.

-Bioquímica molecular (genética molecular): se ocupa de estructura y dinámica en moléculas encargadas de transmitir la información genética. Ácidos nucleicos.

LA VIDA

Condiciones para estar vivo:

-tener una estructura ordenada y capacidad de renovación de esta.-capacidad de autorreproducción

A pesar de que el primer principio va contra la entropía (el mundo tiende el desorden) el resultado final es que aumenta el desorden, por tanto este primer requisito no viola las leyes de la termodinámica.

TEMA 2

COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL CUERPO HUMANO

Bioelementos

elementos químicos que forman parte del cuerpo humano. En total hay 112 elementos químicos en la tabla periódica, pero en el cuerpo humano tan solo aparecen una veintena.

Clasificación clásica.

– Primarios: H (63%), O 25,5%, C 9,5% y N 1.3% En total un 99,3%– secundarios: Ca, P, S, Na, K, Cl, Mg, Fe 0,7%– oligoelementos: Mn, Co, Cu, I, Zn, Mo, Se, Cr.

En la corteza terrestre: O, Si, Al, Fe, Ca, Na, K, Mg.Seres vivos: H+C+N 74% O 25%Corteza terrestre: H+C+N 0,5 % O: 47%

La ausencia de algún oligoelemento produce enfermedades carenciales como puede ser el bofio (produce un aumento del tiroides debido a la falta de yodo en el organismo) Se debe de comer pescado para evitarlo.

Los motivos por los cuales son estos bioelementos los que más abundan en los seres vivos es debido a que entre ellos forman muy buenos enlaces covalentes (comparticion de electrones), el C es la base de las estructuras orgánicas (debido a su estructura tridimensional), forman muy buenos dobles y triples enlaces covalentes entre ellos. Además con H, O, N y C se pueden forman la gran mayoría de los grupos funcionales químicos del cuerpo.

-Grupos funcionales:

• Alcohol (OH)• Aldehido (COH)• Acido (HCOOH)• Amino (R-NH2)• Amida (R-CO-NH2)• Tiol R-SH

BIOMOLÉCULAS

Son las moléculas que forman parte de los seres vivos. Pueden ser orgánicas o inorgánicas (basadas en la química del carbono o no)Inorgánicas: Agua, Iones y gasesOrgánicas: glucidos, lipidos, proteinas, acidos nucleicos y metabolitos

Las proteinas son indispensables para la vida

Se clasifican según el tamaño:• Precursoras: las más pequeñas.• Metabolitos: de hasta 15 moleculas.• Unidades estructurales: que dan lugar más tarde a moleculas más grandes.• Macromoléculas: Formadas por las unidades estruturales• Asociaciones macromoleculares: Unión de 2 o más macromoleculas. Un ejemplo

es la cromatina que es ADN enrollado alrededor de unas histomas.

EL AGUA

es la biomolecula orgánica mas abundante. Cuanto más activo esta el tejido, más necesidades de agua tiene

el agua es el medio de transporte en el cual viaja todo. La cantidad normal es el 70% que puede aumentar o disminuir en un intervalo del 10% hasta llegar a ser mortal.

– clasificación:Intracelular (70%) : libre ( que esta libre en el citoplasma) y ligada ( que esta unida a determinadas moleculas. No se puede disponer de este agua en condiciones normales.

Extracelular (30%): Plasmática, la que está en los vasos (7%) y la intersticial (Fuera de los vasos, 23%), por ejemplo el liquido cefalorraquídeo.

El agua es neutra, pero sus cargas no se encuentran repartidas de una forma exacatamente igual, ya que el oxigeno es más electronegativo y atrae a los electrones hacia si, lo que permite la formación de enlaces mediante puentes de hidrógeno.

PROPIEDADES DEL AGUA

• Presenta una densidad máxima a 4ºC, esto permite la vida en latitudes altas, ya que sólo se congela la capa superficial de líquido, quedando líquido en la parte profunda.

• Calor específico elevado. La cantidad de calor que hay que darle a un 1 gramo de agua para que su temperatura en un grado es muy elevada. Esto tiene una utilidad muy importante en la regulación de la temperatura corporal.

• Calor de vaporización elevado y un calor de fusión elevado. Se necesita una gran cantidad de calor para convertir el agua liquida en gaseosa y para convertir el agua sólida en liquida.

• Temperatura de ebullición elevada• Conductividad de calor elevada.• Elevada tensión superficial. Una manera de disminuir esta tensión superficial es

mediante tensioactivos. Algunas patologías del neonato se deben a esta cualidad del agua, ya que los bronquiolos, al respirar se juntan, y si no hay suficiente cantidad de tensioactivos, se puede producir un “encharcamiento” pulmonar, una llamada atelectasia.

• Constante dieléctrica elevada. Ayuda a la disolución de compuestos (compuesto iónicos).

• Capacidad de hidratar.

• Buen disolvente (disolvente universal) de sustancias polares e iónicas. Una sustancia polar es aquella que tiene en alguna de las partes de la molécula una distribución irregular de sus electrones. Mediante puentes de hidrógeno puede establecer uniones con estos compuestos. El agua es un buen disolvente de sustancias anfipáticas y no es capaz de disolver sustancias apolares.

• Es transparente. Lo que permite el paso de la luz y el desarrollo de la vida por debajo del nivel del agua.

• Es un electrolito débil.

PROPIEDADES DEL AGUA

1. Es un componente esencial de todas las macromoléculas.2. Es el disolvente universal de todas las sustancias excepto las apolares.3. Es un muy buen termorregulador.4. Participa en todas las reacciones metabólicas. Ya sea necesitandose para

realizarse la reacción y bien obteniendose como producto.

ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO HÍDIRICO

En un día se suelen ingerir un total de 3 litros, que provienen de diversas fuentes, y la cantidad de líquido que se debe de excretar debe de ser más o menos las misma que la que se ha ingerido.

Las principales excrecciones son:• Respiración: 0,6 L• Sudoración: 0,8 L• Orina: 1,5 L• Heces: 0,1 L

Existen una serie de hormonas que se encargan de regular el equilibrio hídrico del cuerpo, entre las que destaca la hormona antidiurética (ADH), la aldosterona (hormona que favorece la reabsorción del ión sodio a nivel renal) y la hormona natriurética cardiaca (factor natriurético auricular) Que se encarga de la eliminación de sodio y potasio.

Hay 2 tipos de patología por desequilibrio hídrico:• Sobrehidratación (muy raro): se puede deber o bien a un fallo renal o a un ejercicio

físico desmesurado en el cual tan solo se ha repuesto agua y no sales, debido a la ausencia de sales, aumenta la concentración de agua, y las sales están cada vez más diluidas. Los sintomas más característicos son la hipertensión arterial.

• Deshidratación: se puede producir por diarrea o vómitos, o simplemente por no beber. Los síntomas más frecuentes son la hipotensión y la falta de elasticidad en la piel. Especial atención en niños pequeños que se deshidratan mucho antes.

TEMA 3: DISOLUCIONES Y CONCEPTO DE ACIDEZ

Una disolución es una combinación homogénea de varios componentes y de composición variable, sin separación entre fases

Una mezcla en cambio es un compuesto heterogéneo con separación de fases. Por ejemplo las dispersiones.

Una dispersión coloidal es un intermedio entre la mezcla y la disolución. Es una composición heterogénea sin separación de fases.

– Las disoluciones se pueden clasificar o bien mediante su naturaleza, el número de componentes o también en función de la naturaleza del soluto (iónica o molecular). Las sustancias iónicas son aquellas en las que el soluto es un ión y las moleculares el resto ( no tienen carga).

CONCENTRACIÓN DE UNA DISOLUCIÓN

Se puede medir de varias maneras:• Porcentaje (en peso, en volumen o en peso/volumen)

En peso son los gramos de soluto en 100 gr de disoluciónEn volumen son mililitros de soluto en 100 ml de disoluciónEn peso/volumen son los gramos de soluto en 100 ml de disolución.

• Molaridad (M): numero de moles de soluto/ litros de disolución• Molalidad (m): moles de soluto/ Kg de disolvente• Normalidad (N): equivalente de gramos de soluto/ litros de disolución• Fraccion molar: moles de soluto/moles totales de disolución

pH: puede ser ácido o básico, se siguen tres teorías para decir si un compuesto es ácido o base, según Arrhenius, el ácido es capaz de ceder H+ y la base es aquel compuesto que cede OH-.Para Bronsted y Lourry el ácido es el que cede H+ y la base el que acepta esos iones. Para Lewis, el ácido acepta electrones y la base cede electrones, aunque las dos teorias que más vamos a usas son las dos primeras

H <------- H+ + OH- ---> La flecha es de longitud diferente para una lado y para el otro ya que la longitud de esta flecha depende de la frecuencia con la que se da una racción o la otra, en este caso es mucho más probable que se produzca la unión para formar agua que la separación del agua para dar los dos iones.

Hay que destacar que el agua tiene carácter anfótero, es decir, no ni ácido ni base. Por ello el producto eléctrico del agua se expresa de la siguiente manera:

Kw: [H+] x [OH-]= 10 elevado a -14

Por ello podemos decir que cuando predominan los H+ es una disolución ácida, mientras que cuando son los OH- los que aparecen en mayor cantidad estamos hablando de una disolución básica.

Cuando el ácido es fuerte, el pH de la disolución es el -log [H+]Los 7 ácidos fuertes son :

HCl (ácido clorhídrico)HBr (ácido bromhídrico)HI (ácido yodhídrico)HNO3 (ácido nítrico)HClO3 (ácido clórico)HClO4 (ácido perclórico)H2SO4 (ácido sulfúrico)

Estos ácido fuertes se caracterizan porque cuando se introducen en una disolución acuosa se disocian por completo. Los ácidos que no lo hacen por completo son los llamados ácidos débiles, la mayoría de ácidos que hay en nuestro organismo son de este tipo y el calculo de su ph en disolución se hace mediante la expresión de Henderson Hasselbach:

para calcular el pKa= -log Ka siendo Ka la constante ácida del ácido.

DISOLUCIONES REGULADORAS

pH arterial: 7,4pH venoso: 7,35liquido intracelular. Entre 6,9 y 7,2 intestino: 7,9-8,2

el organismo está preparado para soportar un cambio en el pH de 0,4, por encima de esto umbrales, existe peligro de muerte.

El pH se mantiene constante mediante tres maneras:• Disoluciones reguladoras• Ventilación pulmonar• Filtración renal

Disolución reguladora: esta formada por un ácido débil y al sal conjugada de su base conjugada o viceversa.

Cada ácido tiene una base conjugada y cada base un ácido conjugado, y son inversamente potentes, es decir, cuando el ácido es muy fuerte, su base conjugada es muy débil y al contrario.

Las disoluciones que controlan estos cambios se llaman disoluciones tampón o buffer.

El regulador puede un punto mayor o menor que la disolución que ha de controlar, es decir, si ha de controlar una disolución de pH 7, la disolución puede tener un pH entre 6 y 8, por encima de 8 y por debajo de 6, el efecto es prácticamente nulo.

Algunas disoluciones reguladoras en el organismo son:– Disolución reguladora fosfato: es intracelular, tiene un pKa de entre 6,9 y 7,2

La reacción que tiene lugar es: H3PO4-----> H2PO4- -------> HPO4 2- -------> PO4 3-

pKa: 2,7 pKa: 6,6 pKa: 12,70

En cada una de estas etapas se va perdiendo un H+.

La disolución reguladora de la sangre es la solución carbónico bicarbonato

El inconveniente resuelto de esta disolución es que su pKa es de 6,1 ( el de la sangre es 7,4) y está claro que supera en más de una unidad el pH de el fluido que regula, la ventaja de esta disolución tampón es que puede ser controlada voluntariamente por el organismo, ya que influyen en ella la respiración (mediante el aumento de la cantidad de CO2 en el organismo) también el sistema renal puede contribuir al correcto funcionamiento de este mecanismo regulador.

Por eso se puede decir que esta solución es la idónea para la regulación del pH de la sangre.

Por último también las proteinas actúan como reguladoras, ya que tiene en su estructura pequeños ácidos y pequeñas bases que pueden actuar como sistemas reguladores. Un ejemplo son la hemoglobina y al oxihemoglobina. Cambia el pKa al oxigenarse.

Patologías a la hora del mantenimiento del pH del organismo; por debajo de 7,4 se produce una acidosis, y por encima de este valor, se produce una alcalosis.

Estas enfermedades pueden tener dos orígenes: respiratoria y matabólica

Acidosis respiratoria:

CO2 + H2O -------------> HCO3- + H+

Mediante el principio de Lechatelieur si se aumenta el dióxido de carbono en uno de los lados de la reacción el equilibrio se desplaza hacia el H+ y aumenta la cantidad de este que hay en la sangre, produciéndose una acidosis.

Puede estar provocado bien por una bronquitis o por una mala ventilación. El organismo realiza actividades de compensación, sobre todo mediante los riñones, produciendo una orina más ácida que elimina protones.

Acidosis metabólica:

Puede tener varios orígenes (diabetes, ayuno prolongado, vómitos de origen intestinal, hipoaldesteronismo).Se produce por un exceso de protones debido a actividades metabólicas. Si el problema no tiene un origen renal, el riñón vuelve a sintetizar una orina más ácida. Al estas el aparato respiratorio sano, puede regular el problema mediante una hiperventilación, hiperpnea o taquipnea.El tratamiento para este problema es con bicarbonato mediante administración oral o intravenosa.

Alcalosis respiratoria:

Tiene lugar cuando hay muy poco CO2 en la sangre. El origen se debe a una respiración abundante (hiperventilación). Situaciones como el nerviosismo dan lugar a alcalosis. Se compensa mediante vía renal, excretando orina rica en bicarbonato y que retiene protones.

El tratamiento para este problema es una disolución ligeramente ácida (es muy usado el cloruro de

amonio)

Alcalosis metabólica

Puede ser de orígenes muy variados. Vómitos de origen gástrico, hiperaldosteronismo, fallos renales. Se compensa mediante una orina muy alcalinizada ( si es de origen renal) mediante la respiración se soluciona la hiperventilando, aumentando la concentración de CO2.

El tratamiento es muy sencillo, con una bolsa de papel que cubra nariz y boca del paciente, se consigue que este respire otra vez su propio CO2.

Es importante saber que muchas veces se presentan seguidas, es decir que intentado solucionar un problema de este tipo, el resultado ha sido otra de las patologías citadas anteriormente.

TEMA 4: AMINOÁCIDOS (BIOMOLÉCULAS NITROGENADAS)

Los aminoácidos suponen un total del 18% de la materia viva en peso.

Un aminoácido es una biomolécula en cuya estructura existe un grupo amino y un grupo ácido. El grupo ácido suele ser un carboxilo. Dentro de los aminoácidos hay un grupo llamados aminoácidos proteícos que son los que forman parte de las proteínas. Hay también otros aminoácidos, que a pesar de no formar parte de las proteínas, también son indispensables para la vida.

A.a proteícos: tienen una estructura muy parecida entre ellos, la única diferencia está en el radical que se les une, esta cadena le da a cada uno de ellos una naturaleza propia. Se pueden clasificar según esta cadena lateral.

-A.a polares• Glicina (gly)• alanina (ala)• Valina (val)• leucina (leu)• Metionina (met)• Isoleucina (ile)• Fenilalanina (phe)• Triptófano (trp)• Prolina (pro) Este es un caso un tanto excepcional, ya que el grupo amino se encuentra

ciclado, por lo que no es estrictamente una alfa-aminoácido, si no un iminoácido.

-Polares sin carga:• Serina (ser)• Treonina (trp)• Cisteina (cys)• Asparagina (asn)• Glutamina (gln)• tirosina (tyr)

-Aniónicos, cargados negativamente o ácidos• Ácido aspártico (asp)• glutamano o ácido glutámico (glu)

En la cadena lateral tienen otro grupo ácido adicional. A pH fisiológico tienen carga negativa.

-Básicos• Lisina (lys)• Arginina (arg)• Histidina (his)

Tienen un grupo amino adicional en el radical

Los aminoácidos esenciales son aquellos que es necesario ingerirlos en la dieta, ya que el organismo no los puede sintetizar por sí mismo, en cambio los aminoácidos no esenciales son aquellos que no es necesario ingerirlos en la dieta, ya que el organismo si que los sintetiza.

A pesar de todo, algunos, como la tiroxina, no son esenciales, siempre y cuando haya fenilalanina, en el momento que hay una falta de fenilalanina, la tirosina pasa a ser esencial. También hay alguno a.a que son esenciales en la infancia y que luego en la edad adulta dejan de serlo.

Propiedades de los a.a

Presentan isomería, la más importante es la isomería óptica.

Un requisito indispensable para que haya isomería es que aparezca una carbono asimétrico.

Un aminoácido con actividad óptica es aquel que es capaz de desviar la luz polarizada. Cada aminoácido desvía esta luz de una manera diferente. Los isómeros pueden ser D o L dependiendo del lugar que ocupe el grupo amino. Os aminoácidos se representan de una forma plana, aunque en el espacio no tienen esa forma estructural, es decir, en el espacio presentan una estructura tridimensional, la representación lineal de los aminoácidos se realiza mediante las representaciones de Fisher. A estos aminoácidos se les llama enantiómeros, es decir, uno es la imagen especular del otro. Todos los aminoácidos del organismo son del tipo L.

No todos lo a.a proteícos tienen isomería óptica, por ejemplo la glycina no tiene ningún tipo de isomería porque su radical es una H, por lo tanto tiene dos grupos H iguales unidos al carbono, por lo que no es asimétrico. Otros a.a tienen más de un carbono asimétrico.

La luz puede girar en dos direcciones al atravesar el a.a, si esta luz gira hacia la derecha se le llama dextrógiro, en cambio si lo desvía a la izquierda es levógiro. No tiene nada que ver con la L y con la D, son independientes, si el a.a es dextrógiro se señala con un (+) y si es levógiro se le coloca un (-).

Otra propiedad de los a.a es que son eltectrolitos débiles, son anfóteros, pueden comportarse,al igual que el agua, como un ácido o como una base. Dependiendo de como se comporten tienen un pKa diferente.

La mayoría de los a.a que nos vamos a encontrar se encuentran con el grupo carboxilo que ha perdido un el H+ , quedando COO-, este protón ha sido ganado por el NH2, que pasa a ser NH3+.

Dependiendo de como sea la cadena lateral también pueden tener cargas extras ( el ácido aspártico y el ácido glutámico) que pueden perder más H+ (siendo ácidos) y otros (los que contienen sobre todo grupos OH en sus radicales) se comportan como bases.

Punto isoeléctrico: es el pH del medio en el que se encuentra el a.a en el cual su carga es 0.

Los a.a aromáticos (aquellos que presentan en sus radicales derivados del benceno) se pueden detectar por absorción en el ultravioleta. Los a.a son susceptibles de reacciones de identificación. La ninidrina es el colorante más utilizado para detectar la presencia de a.a. Si el compuesto contiene a.a se torna de color azul púrpura, excepto con al prolina, que da un color amarillo anaranjado.

AMINOÁCIDOS PROTEÍCOS MINORITARIOS

aquellos que presentan un grupo OH añadido, algunos son tan importantes como el colágeno. También se les puede añadir un grupo metil.Un a.a minoritario proteico a destacar es la cisteina que se una a otras cisteina mediante un puente disulfuro entre los dos sulfuros que componen los grupos tiol de ambos a.a.

AMINOÁCIDOS NO PROTEICOS

A pesar de no constituir parte activa en las proteínas, son muy importantes para la vida, sin ellos sería imposible vivir.Un ejemplo es L-DOPA (dihidroxifenilalanina) que se encarga de la síntesis de catecolaminas (hormonas y neurotransmisores del organismo)

GABA: es inhibitorio, un neurotransmisor que inhibe la transmisión nerviosa.

TEMA 5 PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

– Enlace peptídico:

Es el que tiene lugar entre 2 aminoácidos (también se le llama enlace amida). Se forma por la reacción del COOH con el grupo amino del otro aminoácido. Durante la formación de este enlace se pierde una molécula de agua.

Tiene cierto carácter de doble enlace. Esto le hace ser muy fuerte, casi imposible de romper, no permite el giro de los átomos a los que une. Además permite la formación de puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos.

Se clasifican según el número de a.a que unen.• 2 a.a: dipéptido• Hasta 10 a.a: oligopéptido• a partir de 50 a.a (aunque el límite es dificil de asegurar ya que no hay total acuerdo):

proteína.

Todo aquello que se puede sintetizar en un laboratorio, pero que no se encuentra en la naturaleza no es considerado como una proteína, sino como un péptido.

Se empieza a nombrar una proteína a partir del grupo amino libre, y se termina por el grupo carboxilo libre del a.a.

Péptidos necesarios para la vida.

Hay varios, algunos de ellos son la glutamida, formada por 3 aminoácidos (ac. Glutámico, cisteína y glicina), ademas tiene naturaleza antioxidante, debido al grupo tiol que tiene. Hay que destacar que se une con la cadena con la cadena lateral, no con el COOH.

La oxitocina, la vasopresina, la enefalina (pentapéptido) son opiáceos, al igual que las endorfinas. Esto significa que se unen a receptores opiáceos que producen placer, no dolor.

Los ionófobos son aquellos que tienen la estructura de los péptidos cerrada en forma circular.

Clasificación de las proteínas.

-Según composiciónSimples: sólo tiene aminoácidosCompuestas: además de los a.a tiene algo más añadido. Puede ser un glúcido (glucoproteína) un lípido (lipoproteína), un ácido nucleíco (nucleoproteína) o metales o grupos pequeños (metaproteína o hemoproteína (tienen grupos prosteicos).

Si a una de estas proteínas les quitamos el grupo proteíco o metal pasa a ser una apoproteína y pierde su función.

-Según forma:

globulares: solubles en agua (enzimas)fibrosas: son alargadas. No son solubles en agua, también se las llama escleroproteínas. El termino “esclero” significa dureza.

-Según su función:

• Catalítica: enzimas• Transportadora: Hemoglobina, entre otras.• Reserva: ovoalbúmina• Contráctiles. Miosina• Estructurales: colágeno y las fibrosas en general• Defensa: inmunoglobulinas• Hormonal: insulina• Factores tróficos: desarrollan tejidos• Receptoras• Cromosómicas: histomas• Reconocimiento celular: glicocaliz• Factor de transcripción: controla la síntesis de proteínas.

Estructura de las proteínas:

Las proteínas tienen una estructura nativa, si esta estructura se cambia, la proteína se desnaturaliza, es decir, pierde si formación espacial. Las proteínas se estudian en 4 niveles.-Estructura primaria: es la secuencia de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico.

-Estructura secundaria: la disposición espacial de determinadas zonas de la cadena peptídica. Hay dos tipos de estructura secundaria. La hélice alfa, que presenta una disposición de hélice dextrógira con las cadenas hacia fuera, está unida mediante puentes de hidrógeno. La estructura en beta lámina, en cambio, se dispone la proteína plegada en zig-zag. Puede ser o bien paralela o antiparalela, dependiendo de la dirección que tengan cada una de las cadenas de a.a. Esta estructura también se mantiene unida por puentes de hidrógeno.

-Estructura terciaria: es la forma de toda proteína. Los enlaces de puentes de H+, junto con las interacciones electrostáticas, los puentes disulfuro, las alteraciones hidrofóbicas y las fuerzas de Van der Waals mantienen unidos los a.a.

-Estructura cuaternaria: no la tienen todas las proteínas. Cuando está formada, lo está por más de una cadena polipeptídica. Un ejemplo es la hemoglobina que está formada por 4 cadenas polipetídicas más un anillo tetrapirrónico.

PROTEÍNAS FIBROSAS

Presentan estructura alargada, además la estructura secundaria y al terciaria son iguales. Al igual que en todas hay de varios tipos.-Alfa queratinas: formadas en su totalidad por la estructura alfa hélice. Aparecen en pelo, piel, uñas y cuernos.-Beta queratinas: todo hoja plegada. Aparecen en escamas y picos.-Elastina: aparece en tendones y cartílagos.-Colágeno: es la proteína más abundante. Aparece en tejido óseo, cartilaginoso... está formado por hidroxiprolina e hidroxilsina. Cada tres aminoácidos que componen la cadena del colágeno, uno de ellos es glicina, por lo que se puede decir que está formada por un 33% de glicina. El segundo más abundante es prolina e hidroxiprolina. El colágeno está formado por 3 cadenas de tropocolágeno unidas unas a otras.

Proteínas en disolución:

Las proteínas tienen carga, que depende del pH, de este depende que las cadenas estén cargadas o bien positivamente o bien negativamente. El punto en el cual la carga de las proteínas es 0 se llama punto isoeléctrico. Las proteínas son macromoléculas, por lo que forman dispersiones coloidales.

Desnaturalización:

Consiste en romper la estructura de las proteínas. Que pierdan desde la estructura cuaternaria (si la tiene) hasta quedarse en estructura primaria, ya que esta no se rompe. Lo normal es que este proceso se irreversible, aunque puede ocurrir un renaturalización. Los ajustes que producen la desnaturalización son facores mecánicos, el calor, el pH entre otros, rompen os enlaces que se está formando.

El plegamiento de las proteína depende de las chaperonas y las chapeninas. Las chapeninas hacen una especia de cámara dentro de la cual actúan las chaperonas realizando el plegamiento.

Enfermedades priónicas.

Se caracterizan por el deposito, generalmente en el SNC, de una especie de proteína parecido al almidón. Se deben a un plegamiento erróneo de las proteínas. La proteína que se deposita es la beta-amiloide. Genéticamente estas enfermedades se llaman amiloideas.

También son conocidas como encefalopatía espongiforme transmisible. El causante de este tipo de enfermedad son los priones. Fueron descubiertas pro Creutzfeld- Jakob.

Una proteína del cerebro (PRPT) presenta estructura en alfa hélice, el problema aparece cuando se detecta su proteína analoga, pero con estructura en beta-lámina. La principal característica de esta proteína patógena es que es capaz de convertir las proteínas sanas en proteínas enfermas con estructura en beta-lámina.

El inconveniente de este tipo de estructura es que a diferencia de las alfa hélice, que son fácilmente hidrolizables, las que tiene estructura en beta-lámina son prácticamente irrompibles.

Estas proteínas se depositan en el cerebro, creando unos agujeros, que dan al cerebro un aspecto espongiforme. También se ha detectado una posible vía de transmisión genética.

TEMA 6 CATALASAS ENZIMÁTICAS

Las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones metabólicas. En su ausencia no se producen estas reacciones y por lo tanto no se produce la vida. Son unas proteínas cuya función es la catalisis. En total, son capaces de aumentar la velocidad de reacción aproximadamente 10 elevado a 20 veces. No se consumen durante la reacción, por lo que pueden usarse varias veces. Son muy específicas, no actúan sobre cualquier cosa, si no sólo sobre para la que están preparados. Ademas son susceptibles a una muy buena realización.

Sustrato: molécula sobre la que actúa la enzima realizando su acción.Coenzima: Pequeñas moléculas que no tienen naturaleza proteíca y que están en la enzima. Pueden ser de dos tipos:-un ión metálico (metaloenzima)-Coenzima: pequeñas moléculas orgánicas que ayudan a realizar su función. Hay dos tipos, las que están fuertemente unidas a la enzima (grupo prostático) y esl cosustrato, que tienen una acción parecida a la del sustrato.

El consumo de vitaminas es muy importante en el organismo humano ya que las enzimas se obtienen a partir de ellas.

• Apoenzima: enzima a la se le quita el cofactor, no tiene propiedades activas.• Holoenzima: apoenzima + cofactor. Sí tiene actividad.• Centro activo: es la zona de la enzima mediante la cual se une el sustrato a la enzima y

donde se produce la reacción.

No todos las enzimas son proteínas, aunque son muy pocas, hay algunas enzimas que son funcionalmente otros compuestos.Ribozima: Moléculas de ARN con actividad catalítica. Hay pocas.Abzima: anticuerpo con capacidad catalítica

Una condición necesario para que se de cualquier reacción química es que la la energía libre de Gibbs ha de ser menor de 0. todos los compuestos han de llegar a un estado de transición, en el cual se producen todos los cambios en la molécula. Para llegar a este estado de transición es necesario aplicar una gran cantidad de energía a la molécula, esta energía es tan grande que sin la acción de las enzimas, no podría existir reacción alguna. La enzima lo que hace es disminuir la energía de activación.

Las enzimas se clasifican en seis grupos:1. Oxidorreductoras ( reacciones redox)2. Tranferasas (reacciones de transferencia de grupos funcionales de las moléculas)3. Hidrolasas (reacciones e hidrolisis, rotura de enlaces mediante el agua)4. Leasas ( rotura de enlaces sin presencia de agua y además se encargan de la eliminación y

adicción de NH2 y CO2)5. Isomerasas (catalizan reacciones de transformación de un isómero a otro)6. Ligasas o sintetasas ( forman enlaces y uniones de grupos funcionales, simpre con la

participación de una molécula energética)

Nomenclatura

N. recomendada: su acción terminado en -asa.N. sistemática: oxígeno oxidorreductasa.Número de clasificación: EC. 1.1.3.4 El primer dígito es el número de clase y se identifica con el

grupo de enzimas.

Centro activo. Es el lugar por el cual se une el sustrato a la enzima y en donde tienen lugar todas las reacciones que transformarán la molécula. En el el hay determinado a.a y cofactores. Da lugar a un microentorno en el que la reacción ocurre a mucha velocidad. Hay varios modelos que explican la forma que tiene el sustrato para acoplarse al centro activo.

– Modelo de la llave- cerradura: El centro activo coincide perfectamente con la forma del sustrato. Este modelo fue propuesto en 1890 por Fischer.

– Ajuste inducido (modelo del guante y la mano) el sustrato no encaja perfectamente en el centro activo, pero este se adapta ligeramente para tomar la forma del sutrato.

Efecto del pH y la temperatura.

El pH de una enzima depende del lugar en el cual desempeña su función. Por ejemplo, la pepsina de l estómago actúa a un pH idóneo de , mientras que la pepsina del intestino tiene un pH óptimo de 8.

La temperatura es también un factor importante ya que a más temperatura la enzima actúa a más velocidad, aunque sin llegar a una temperatura máxima, en la cual la proteína se desnaturaliza y pierde totalmente su función..

Hay una regla general y es que a cada 10ºC que aumenta la temperatura, la velocidad de la reacción se duplica.

Isoenzimas o isozimas

Son formas múltiples de una enzima, es decir, enzimas que tiene un parecido estructural muy grande, que realizan la misma función, pero en moléculas distintas (misma función biológica).

Por ejemplo, LDH (una enzima) tiene hasta cinco isozimas. Es un enzima con prpteína cuaternaria, que según domine un tipo de cadena peptídica está localizada o bien en el músculo o bien el corazón.

TEMA 7 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS ENZIMAS

-Actividad enzimática

Es la velocidad de una reacción catalizada por una enzima.

E +S K1/K2= ES

Velocidad de la reacción es la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo, o la cantidad de producto que va apareciendo.

La concentración de enzimas se expresa mediante la velocidad de reacción. Se expresa en unidades internacionales. Una unidad internacional es un micromol partido por minuto.Es la cantidad de sustrato que cataliza un micromol de enzima en un minuto.

La medida del sistema internacional es la “cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato por minuto”, es el Katal (mol/seg). Hay que tener en cuenta que esta unidad es mucho más grande.

La actividad específica de un preparado es la actividad. Otra magnitud importante es el número de recambio de una enzima, es “el número de moles de sustrato transformados por unidad de tiempo y mol de enzima”

a mayor eficiencia de la enzima, mayor es la velocidad de reacción. Un ejemplo de eficiencia es la anidrasa carbónica, que se dedica a la transformación de CO2 y bicarbonato en los pulmones. En un segundo transforma 600,000 moléculas de CO2.

Cinética enzimática.

Estudia el comportamiento de las enzimas, el científico pionero en esta rama fue Leonor Michaelis. Este creo un grupo de enzimas, dentro de las cuales se engloban la amplia mayoría de las enzimas del organismo. Este grupo son las enzimas michaelianas.

Todas ellas se comportan de la misma manera. Aumenta muy rápido la velocidad de la reacción, pero llega un momento en el que todas las enzimas tienen su centro activo saturado y por muchos sustratos que haya la velocidad de la reacción no va a ser mayor ya que todos los centros activos están ocupados.

La ecuación de Michaelis Menten describe esta gráfica.

A grandes concentraciones de sustrato, la v0 es igual a la vmax..

Km es igual a la constante de Michaelis. Es una magnitud constante para cada enzima. También es la cantidad de sustrato con la cual la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la velocidad máxima.

La Km se mide en unidades de concentración de sustrato. Nos indica la afinidad que tiene la enzima de que venga el sustrato a reaccionar. A más Km menos afinidad y viceversa.

Si la concentración de sustrato está entorno a la Km, un pequeño cambio produce un gran cambio en la velocidad. El número de recambios es proporcional a la velocidad máxima. Entra cada enzima,

incluso entre isozimas, cambia la Km

Inhibición enzimática

Es el proceso por el cual una molécula disminuye la actividad de la enzima. Puede ser una inhibición reversible o irreversible. La primera es la base de muchos fármacos, el segundo tipo es el que predomina en el organismo.

Un ejemplo de inhibición irreversible es la acetilcolinesterinasa ( que rompe la acetil colina) la función de esta acetil colina es la de contraer el músculo cuando recibe la orden. Este inhibidor evita que el músculo esté continuamente contraído , rompe esta enzima tras su uso.

La mayoría de las encimas dependen de un compuesto fosfatado, por eso se les llama compuestos organofosforados. La totalidad de los inhibidores se usan para fines farmacológicos, aunque también se han utilizado en el terrorismo biológico, un ejemplo es el gas sarin.

También la penicilina es un inhibidor irreversible, inhibe el glicopeptidotranspeptidasa (bloquea su centro activo). Esta enzima es la responsable de la síntesis de la pared bacteriana. El problema es que las bacterias mutan y se adaptan a las circunstancias por lo que llega un momento en el cual las enzimas se hacen resistentes a la penicilina, lo que se hace es enviarles un cebo, una enzima suicida, que suele ser el ácido clavulánico, se encuentra por ejemplo en el augmentine. Lo que hace es bloquear la enzima que degrada la penicilina y la destruye.

Inhibición reversible

Es la que aparece de forma natural en el metabolismo. Se clasifican en tres tipos, pueden ser competitivas, no competitivas o acompetitivas. La gran mayoría de las enzimas que hay en el cuerpo son competitivas, es decir, compiten con el sustrato por acoplarse al centro activo. Tiene una configuración estructural muy parecida al sustrato. Cuando aumenta la Km se puede sospechar la presencia de un inhibidor competitivo. Aunque haya o no inhibidores, la velocidad máxima de la reacción no se va a ver afectada, la única diferencia puede ser que la reacción tarde un poco más en llegar al punto de velocidad máxima, pero esta llegará igual.

Regulación enzimática

Hay varios tipos de regulación enzimática.1. PH y temperatura2. concentración de enzimas3. concentración de sustrato4. tipo de isoenzima que esté actuando5. presencia o no de cofactores6. inhibidores7. activadores8. interacción enzimas con las proteínas.

Alosterismo

Son todas aquellas enzimas que no pertenecen al grupo de las enzimas de Michaelis. Son enzimas reguladoras la gran mayoría de ellas. Aparecen en etapas claves del metabolismo, tales como las

bifurcaciones que toman las moléculas durante sus divisiones. Tienen una cinética sigmoidea, al contrario que las michaelianas.

Además estas enzimas tienen carácter cooperativo, cambia la afinidad conforme aumenta el sustrato. Es decir, el primer sustrato tiene una afinidad determinada, el siguiente sustrato tendrá más afinidad, y así sucesivamente, hasta que tenga un máximo de afinidad. Son proteínas oligoméricas (tienen más de una cadena). Por tanto se puede decir que tiene estructura cuaternaria. Se les pueden unir ligandos, efectores o moduladores. Se unen al sitio alostérico, una abertura diferente al centro activo.

Inhibición por el producto final (FEED-BACK)

Consiste en que el producto de una ruta metabólica se une a la enzima que produce el ciclo, por eso la enzima es alostérica. Cuando no hay producto, la enzima no continúa trabajando.

Un ejemplo de este tipo de inhibición son todas las rutas metabólicas como la glucolísis o el ciclo de de Krebs.

Modificación covalente

Consiste en la modificación de una enzima por la unión de un grupo químico. Puede aumentar o disminuir su actividad. El grupo fosfato (fosforilación) es la unión más común. Gracias a la intervención de una quimasa se acepta el grupo fosfato, este proceso requiere el uso de ATP.

Esto sólo ocurre en aquellas proteínas que tienen en sus radicales grupos OH, ya que son los únicos que permiten este tipo de uniones. Son la serina, la treonina y a tirosina. Esta unión no es irreversible, se puede romper y de hecho lo hace bastante, ya que

muchas veces el grupo fosfato se rompe y se libera

Activación de zimógenos

Un zimógeno es una forma inactiva de una enzima, que es necesario activar para que sea funcional. Son elementos muy importantes en el organismo. La mayoría se sintetizan en el páncreas y si se activaran allí, provocarían daños bastantes graves. El organismo lo que hace es activarlos en el lugar en el cual van a desempeñar su función. Se les llama también proenzimas. La activación consiste en eliminar un fragmento de la proteína, se elimina un trozo de péptido, este trozo estaba ocultando el centro activo, por lo que al eliminarlo este queda al descubierto y la proteína pasa a ser funcional.

Un defecto de esta activación en el lugar correspondiente es la pacreatitis. Es muy curioso el proceso el proceso por el cual se activan, ya que la enteropeptidasa activa a la pepsina y este activa a todas las demás enzimas.

Aplicaciones clínicas.

Se pueden ver desde dos perspectivas, la perspectiva diagnóstica y la terapeútica..

Diagnóstica

Un claro ejemplo de la utilización de las enzimas en la actividad diagnóstica son las bioquímicas que se piden para analizar los componentes de la sangre de un paciente, la concentración de

enzimas nos puede reveler una gran cantidad de cosas. Las enzimas se vierten a la sangre, por lo tanto, cuando estas están elevadas, se puede decir que el órgano que las vierte está dañado. También pueden estar disminuidas, aunque esto es muy poco probable.Algunos ejemplo de enzimas de la sangre son las transaminasas, que en el caso de estar elevadas indican que hay una lesión hepática. La enzima gamma gt revela un alcoholismo en el paciente.

La creatina quinasa es una marcadora del infarto de miocardio. Tiene varias isozimas típicas del corazón (cuya concentración aumenta tras el infarto de miocardio) y otras que son típicas del cerebro. Son las CK2 y la CK3.

Lo más importante para ver los problemas relacionados con las enzimas son los cambios en la concentración y las isozimas. Para calcular la concentración de otro sustrato se utilizan reacciones enzimáticas acopladas.

Terapeútica.

No se pueden añadir enzimas a una persona como tratamiento, ya que al ser proteínas extrañas, el organismo las disolvería como si fueran agentes patógenos. Se podrían introducir por vía endovenosa, pero aparece el problema a la hora de dirigirlas, que es casi imposible.Cuando existe un coagulo si que es posible introducir enzimas que lo que van a hacer es disolver el coagulo.

Algunas enfermedades debidas a un problema en las proteína, como la leucemia linfocítica aguda, se puede tratar con una enzima, con asparragina, ya que es un material necesario para el desarrollo de las células cancerígenas, y si se les corta el suministro de este material indispensable, mueren, el problema está en que las células cancerígenas son muy mutables, y lo que van a hacer es buscar otra vía para obtener su alimento. Es una solución temporal.

La forma de tratar algo relacionado con las enzimas suele ser mediante la inhibición, que realizan gran cantidad de fármacos, entre los que destaca la penicilina. El inhibidor de la MAO (monoaminoxidasa) es una enzima que aparece en la vía de síntesis de las catecolaminas (dopamina, adrenalina, noradrenalina). La MAO tiene la función de catalizar las reacciones que convierten la dopamina en otras moléculas, si este proceso se detiene, las concentraciones de dopamina aumenta, y al ser considerada como una de las moléculas de la felicidad, combate la depresión. Ahora también se usa la inhibición que aumente las concentraciones de serotonina.

También se utilizan muchos inhibidores competitivos que impiden la formación del colesterol (componente necesario para gran cantidad de actividades de la vida, pero que en exceso produce placas de ateroma que si se acumulan en los vasos pueden provocar obstrucciones que pueden incluso llegar a dar lugar a un infarto de miocardio). La HMG CoA reductasa es la enzima que inhibe la formación de colesterol.

También para la detoxificación del alcohol se utilizan las enzimas, mediante el sistema MEOS del cti P450 (mecanismo usado también en bastantes fármacos). El etanol se degrada por la ADH, que lo hace pasar a acetaldehído, y entonces es cuando actúa la acetildeshidrogenasa, que elimina el acetaldehído a ácido acético, que posteriormente va a la sangre y es eliminado. Esta enzima tiene dos isozimas, cada una actúa en un lugar diferente, una es mitocondrial con una Km menor, y otra citosólica con una Km, por tanto la mitocondrial es más efectiva. En la raza asiática, esta enzima está menos desarrollada, por lo que toleran menos el alcohol. También es este método el que se usa en el tratamiento del alcoholismo, ya que hace que la reacción al alcohol sea horrible. El fármaco usado para este tratamiento es el Antabús.

TEMA 8: PROTEÍNAS EN LA SANGRE

Proteínas plamáticas

Hay alrededor de 300 proteínas que aparecen en el plasma. Se clasifican en función de su electroforensis (consiste en colocar una gota de sangre y aplicar una corriente eléctrica) los más negativas se van al polo positivo y viceversa.

La totalidad de las proteínas del organismo se pueden incluir dentro de estos grupos:1. Albúmina, ella sola constituye el 55% del total de las proteínas sanguíneas.2. Alfa 1 globulinas. 5%.3. Alfa 2 globulinas. 9%4. Beta globulinas 13%.5. gamma globulinas 11%6. fibrinógeno (sólo se encuentra en el plasma, no en el suero) 7%

Las funciones de las proteínas de la sangre, son, entre otras, el equilibrio ácido-base, tienen una función defensiva (todos los anticuerpos son proteínas), mantienen el equilibrio electrolítico, son una reserva nutritiva, tienen función transportadora, participan activamente en la coagulación sanguínea y mantienen la presión oncótica.

Albúmina

Es una muy buena transportadora, tanto que transporta prácticamente la totalidad de los compuestos que se transportan en la sangre, desde aminoácidos, fármacos hasta bilirrubina. Es la que más contribuye al mantenimiento de la presión oncótica.Las alfa 1 globulinas, como la fetoglobulina, sólo aparecen en el feto, debido a que se usan cuando se necesitan unas cantidades de crecimiento enormes. También puede volver a aparecer cuando hay situaciones tumorales.Las alfa dos globulinas transportan cobre, entre otras cosas.Las beta globulinas, (c-reactiva y transferrina) esta última, como bien dice su nombre, transporta hierro.Las gamma globulinas son todos los anticuerpos, G,A,M,D,E.

Al gráfico que revela la cantidad de proteínas en sangre (también puede expresarse de una forma escrita) se le llama proteinograma.

Un cambio en la concentración de las proteínas puede dar lugar a efecto patológicos, como pueden ser la disproteínosis, la paraproteinosis, que es cuando aparece una proteína que no debería de aparecer o una hipoproteinosis, que es cuando no aparece una proteína que sí debería de estar presente.

Hay un total de 30 proteína que son las llamadas de fase aguda, son las que aumentan sus niveles cuando ocurre un proceso inflamatorio o infeccioso. Las del grupo 1 o de respuesta rápida son aquellas que tienen un tiempo de respuesta de entre 6 y 8 horas. Un ejemplo es la proteína c reactiva, que aumenta su concentración hasta 1000 veces. Las proteínas del grupo 2 o de respuesta media, tardan algo más en responder, aunque también lo hacen con cierta rapidez, tardan en actuar

entre 24 horas. Son las alfa 1 globlinas, y las alfa antitripsinas. El grupo 3 está constituido por las proteínas de respuesta lenta, aquellas que aumentan pasadas entre 48 y 72 horas. Un ejemplo es la celuloplasmina.

Algunas patologías tienen su origen en el defecto de las proteínas, por ejemplo el kwashioskor es un patología producida por una una hipoproteinemia. El origen de esta enfermedad es que el niño al ser destetado, deja de recibir una dieta adecuada, por lo que se alimenta sobre todo de maiz, que no le aporta determinadas proteínas. Este es un problema que no ocurre en países desarrollados, sólo en los que se encuentran en vías de desarrollo. Los síntomas más claros son al pérdida de bolemia, que se escapa y da lugar a edemas, uno muy evidente es el que aparece en la cavidad abdominal. Le mayor problema de esta enfermedad es que el sujeto deja de sintetizar todo tipo de proteínas, por lo que tampoco tiene enzimas capaces de digerir los alimentos que come.

Hemoglobina

Es la proteína que supone nada menos que el 33% de la masa del eritrocito, es una hemoproteína. Tiene una parte proteíca, la globina y una parte que no lo es, el grupo hemo. Tiene 4 cadenas y cada una de esas cadenas proteícas tiene un grupo hemo acoplado.

El grupo hemo es una protoporfirina y un átomo de hierro. Este átomo de hierro debe de ser Fe2+

para que todo funcione bien. Cuando el hierro es Fe3+ es una metahemoglobina. Es una patología.

Las cadena de globina son iguales dos a dos. Depende del tipo de hemoglobina cambian de un tipo a otro. La hemoglobina A tiene dos cadenas alfa y dos cadenas beta. En el adulto existe una pequeña proporción de hemoglobina A2 con dos cadenas alfa y dos cadenas delta, con una estructura muy similar a las cadenas beta. En el feto, la hemoglobina es F con dos cadenas alfa y dos delta (no estoy seguro). También existe la hemoglobina A1, que está glicosiladas. La hemoglobina A1c es la hemoglobina glicada, es una hemoglobina con una glucosa unida a sus estructura y sirve para saber si la persona ha estado expuesta a altos niveles de glucosa en un período de 3 a 4 meses. Si la persona no es diebética, los niveles normales son de 2.2% al 4.8%. un diabético oscila entre 2.5 y 5,9%. La hemoglobina cargada con O2 es la oxihemoglobina y la que no tiene O2 es la desoxihemoglobina. Lo máximo que pueden llevar son 4 moléculas de oxígeno, una por cada una de los grupos hemo.

La hemoglobina trabaja sobre todo en los lugares en los cuales hay una mayor concentración de hemoglobina.

La carga de O2 tiene una cinética sigmoide. Lo que nos indica que la hemoglobina es una molécula cooperativa. Es una proteína oligomérica. La entrada de oxígeno a la hemoglobina le modifica su estructura y facilita la entrada de la siguiente molécula. La mioglobina en cambio se puede decir que es una muy mala proteína transportadora por que presenta cinética hipervólica.

A 100 Torr (la presión que hay en condiciones normales en los pulmones) la hemoglobina se carga al 98%, a 20 torr, que es la presión que hay en los tejidos, se carga en un 32%, lo que significa que se descarga apróximadamente un 66%. La mioglobina, que no trabaja en la sangre, se cargaría también aproximadamente lo mismo en las condiciones del pulmón, pero al tener una curva hipervólica, en los tejidos tan sólo descargaría un 7%.

Factores que afectan a la descarga.

Junto a la hemoglobina existe también el 2-3 bisfosfoglicerato (BPG), que facilita la descarga de O2. Aumentando los niveles de BPG en el organismo se aumenta considerablemente la capacidad del

organismo de asimilar el oxígeno.También el pH es importante a la hora del transporte de oxígeno, a menos pH la hemoglobina es capaz de transportar una cantidad algo mayor. Esto se conoce como la racción de Bohr. A un pH de 7.2 la hemoglobina descarga el 77%.

La hemoglobina es muy afín al monóxido de carbono, un gas que es tóxico para el organismo, si no fuera por el medio de la sangre, la hemoglobina se acoplaría siempre a esta molécula y la vida sería imposible. Cuando se produce la intoxicación con CO, la solución es colocarle al paciente una mascarilla de oxígeno.

La temperatura también es un factor importante. A mayor temperatura la descarga de oxígeno es mayor, por eso se da la fiebre.

Hemogobinopatías y talacsemias. Alteraciones de la hemoglobina.

La gran mayoría de las hemoglonipatías se deben a alteraciones en su estructura, derivadas de mutaciones de los genes que las codifican.

La más importante de las alteraciones de la hemoglobina es la anemia falciforme, en la cual los hematíes tienen forma de hoz. Es frecuente en individuos de origen africano. Su alta incidencia en esta zona de África ha llevado a proponer que el gen mutado que codifica este tipo de hemoglobina puede, a su vez, servir de protección frente a las formas más letales de la malaria (el paludismo). El no afectarles esta enfermedad es porque sus eritrocitos viven menos que los de un individuo normal, por lo tanto, al virus de la malaria no le da tiempo a asentarse y a proliferar.Éste sería un claro ejemplo del denominado polimorfismo balanceado o ventaja heterocigótica.estos individuos no sufren la anemia falciforme y también son inmunes a la malaria. La hemoglobina responsable de la anemia falciforme es la hemoglobina S, que presenta cambios en su unidad beta, en la posición 6 de la cadena beta se produce la sustitución de un residuo de ácido glutámico cargado por uno de valina neutro. Ello representa la desaparición de dos cargas positivas respecto a la hemoglobina A.

La hemoglobina C también tiene el mismo problema que la hemoglobina S, pero aquí ese lugar lo ocupa una molécula de lisina, esto ocurre mucho menos que en el caso anterior, aunque la supervivencia de los individuos afectados por este problema es similar los que tienen la hemoglobina normal. Otras hemoglobinas mutadas son la Hb B en la que la glutamina sustituye al ácido glutámico en la posición 121 de la cadena beta, y la HB E, en la que la lisina sustituye al ácido glutámico en la posición 26 de la cadena beta. En estos casos aparece anemia hemolítica moderada.

Las hemoglobinas que sufren problemas en el grupo hemo. Esto dificulta de una manera muy clara el acoplamiento al oxígeno. A este grupo pertenecen las metahemoglobinas. Los individuos que sufren este problema sufren cianosis continúa debido a que la hemoglobina es incapaz de fijar el oxígeno y cederlo a los tejidos.

Las hemoglobinas inestables son aquellas que sufren algún problema en su estructura lo que les hace mucho más propensas a sufrir una desnaturalización. Esto origina los llamados cuerpos de Heinz. Dentro de este grupo hay varias, desde las que sufren problemas en el grupo hemo, alteraciones en la estructura secundaria, terciaria, el cambio entre las subunidades e incluso la delección de algunos de ellos.

Aquellas que sufren problemas a la hora de formar su estructura cuaternaria no son viables con la vida, un ejemplo es la hemoglobina Kansas.

Talasemias

Se denominan así las enfermedades en las que existe un defecto hereditario en la síntesis de algunas de las subunidades de la hemoglobina, aunque la estructura de las cadenas es normal; esto es lo que diferencia este grupo de alteraciones de las hemoglobinopatías comentadas anteriormente. Están distribuidas sobre todo por la zona mediterránea. Existen dos grandes grupos de talasemias, las alfa y las beta. Cada una de ellas toma en nombre de la cadena en la cual tiene defectos.

Cuando el problema está en las cadenas alfa, el organismo genera las pseudohemoglobina, que está formada por 4 cadenas beta. A este tipo de hemoglobina se le llama H. también puede estar formada por 4 cadenas gamma, que es la hemoglobina de Bart. Estas hemoglobinas no son cooperativas por lo que su descarga de oxígeno es bastante mala. Un ejemplo es el síndrome de la hidropesía fetal, en la que sólo existe hemoglobina de Bart y algo de HbH. Los individuos afectados por esta patología, mueren antes de nacer, a las 34 semanas aproximadamente, aunque algunos consiguen nacer, aunque mueren a las pocas horas.

En las beta talasemias homocigótica, el déficit en las síntesis de las cadenas beta hace que para compensar, persista la síntesis de cadenas y, y haya hemoglobina F en etapas de la vida posteriores al nacimiento. Estos enfermos suelen fallecer antes de llegar a la madurez. El exceso de cadenas origina su precipitación en el interior del eritrocito, lo que produce una maduración anormal del eritrocito y hemólisis. La talasemia Beta+ es más leve. En ella la transcripción de los genes beta no estña bloqueada por completo, por lo que sintetizan cadenas beta en parte. También se dividen en “major” y en “minor”. Un ejemplo de major es la anemia de Cooley, en la que no hay ni cadenas beta ni delta, por lo que la hemoglobina está formada por 4 cadenas alfa.

Cuando hay alteraciones en la síntesis del grupo hemo se produce una porfiria. Cada uno de los pasos por los cuales el grupo hemo ha de pasar para convertirse en un grupo funcional está catalizado por una enzima, por lo que si hay un fallo en alguna de ellas, se produce un error en el grupo hemo. Si se acumulan dan lugar a una cierta toxicidad en el organismo. Hay multitud de posibilidades de fallo, ya que hay varias enzimas catalizando varias reacciones.La porfiria de Günter es una patología que se produce precisamente por un fallo de este tipo, sus efectos son que da lugar a una toxicidad en la sangre, que hace al individuo tener un color rojizo, fotofobia, y algunos otros defectos. Puede ser uno de los orígenes del vampirismo.

El grupo hemo se degrada pasando a bilirrubina, que más tarde pasa al hígado, intestino, y finalmente es excretada ya sea mediante las heces o por la orina. Si la bilirrubina no se elimina correctamente, da lugar a ictericias, que producen un color amarillento en la piel y en el fondo de ojo. Este defecto se llama hiperbilirrubinemia.

Gases en la sangre

El oxígeno va siempre unido a la hemoglobina, pero el otro gas dominante en la sangre, el CO2 al ser algo más soluble que el O2, puede ser transportado por otros mecanismos. Un 6% va en el plasma y en los hematíes, un 24% está unido a la hemoglobina formando la carboaminohemoglobina, y por último, un 70% se transporta en forma de bicarbonato.

La carga de CO2 implica la liberación de protones, lo que facilita la descarga. Todo está catalizada por la enzima más importante del cuerpo, la anhidrasa carbónica. Todo este proceso es conocido como el efecto Haldane.

El óxido nítrico (NO) es capaz de unirse también a la hemoglobina, ya que esta tiene unos grupos tioles que dan esta posibilidad. La función principal de este gas es ser un chivato, ya que nos puede

decir si en alguna parte del organismo hay una ve,a capilar o tejido que necesita más aporte de oxígeno. También es capaz de reducir la presión arterial. Es un gas que está siendo muy trabajado en la actualidad.

Coagulación sanguínea

La contención de una hemorragia por el proceso que se denomina hemostasia, en el que se produce un tapón de fibrina a partir de fibrinógeno. Antes tiene un lugar una vasoconstricción, más tarde comienzan las palquetas a trabajar ya sintetizar tromboxones y después toman una agregación plaquetaria. Lo que pasa se denomina “cascada de coagulación” ya que es una respuesta muy rápida y muy potente, al activarse una molécula esta activa a otra y así en un montón de casos.

La coagulación está producida por proenzimas, que se activan en el momento de la necesidad. Cuando están activadas se les coloca una A en el subíndice. El ión calcio es una de los coagulantes más importantes que hay. Existen muchos factores de coagulación que numeran mediante números romanos. El factor 6 no existe.

Coagulación intrínseca: comienza con el contacto de la sangre con el tejido conjuntivo subendotelial.Coagulación extrínseca: se inicia por la liberación a la sangre de una factor proteíco llamado tromboplastina o factor tisular.

Las vías intrínsecas y extrínsecas están unidas entre sí. Cuando ambas se juntan da comienzo la vía común, que empieza con la activación del factor10, que puede ser activado por el factor 9 o por el 7. el ión calcio (aunque no aparece de forma manifiesta en ninguna de las reacciones) es muy importante para todo el proceso. El factor 5A también es muy necesario. El factor 10A activa la protrombina a trombino, esta activa al fibrinógeno (el factor 1), que lo convierte en fibrina. La eliminación, al igual que con las enzimas, consiste en eliminar unos cuantos péptidos, al quitarle estos péptidos cambian las cargas de la fibrina, esta puede juntarse y unirse.

Cuando esto ocurre, se forma el coágulo blando, está formado por enlaces covalentes entre moléculas de fibrina, para que este coágulo blando pase a ser un coágulo duro hace falta que el factor 13 se active a factor 13A, a partir de la trombina. Esta reacción es la reacción de transamidación.

Es muy importante decir que la respuesta ante la pérdida de sangre es muy rápida. También es fundamental para la vida la respuesta regulable, esto se debe a la naturaleza inestable de los factores, es decir, su vida media es muy corta y gracias a esto tampoco hay una coagulación contínua, además también existen inhibidores de los factores. El más famoso de esto inhibidores es la antitrombina 3, que como su nombre indica, inhibe a la trombina (factor 2). La heparina, es también un anticoagulante, ya que modifica a la antitrombina y la hace aún más afín a la trombina, por lo que se acola más y coagula menos.

También existe, como es lógico, una manera de eliminar una coagulación. El proceso para deshacer un coágulo es la fibrinolísis (rompe la fibrina) el responsable de este proceso es el plaminógeno (TPA). Tiene ese nombre porque no está activado, mientras esté desactivado no deshace ningún coágulo, pero una vez que pasa a plasmina, si es capaz de disolver coágulos. La plasmina activada es capaz de por si misma activar a otras moléculas de plasmina. También es de vida corta. También existen enzimas que contribuyen a la coagulación, como son la estreptoquinasa y la uroquinasa, que tambien activan TPA.

La antiplasmina es la encargada de inhibir la plasmina. Hay un control absoluto de todos de los procesos de coagulación..

Patologías

Es la ausencia de uno de los factores de coagulación. La hemofiliaA o clásica es la más común, es el proceso por el cual hay una carencia del factor de coagulación 8 (o bien hay muy poco o nada).. es una enfermedad recesiva en el varón. La padece un varón de cada 10.000. el tratamiento habitual ha sido la extracción de factor 8 de los animales e inyectarlo en los pacientes, actualmente se sintetiza en el laboratorio y se suministra de forma endovenosa a los pacientes.

También una patología puede tener su origen en el hígado, ya que la mayoría de los factores se sintetizan allí.

Las enfermedades de malabsorción de grasas (de origen genético), consistentes en que o bien no se absorben las grasas o bien no se absorben nada. Al no haber absorción de grasas no hay vitamina K, que es fundamental para la coagulación, ya que se encarga de la síntesis de los factores de coagulación 7. 9 y 10, además de la protrombina. La vitamina K es un lípido, por tanto, si no se absorben grasas no se obtiene este vitamina.

Para evitar que la sangre no se coagule en una preparación a la que se le va a realizar un análisis o cualquier otro proceso, se le añade o bien citrato, oxalacetato o EDTA, que eliminan el calcio que hay en la sangre.

Los anticoagulantes orales se usan para evitar la coagulación (son el sintron y el aldocumar) aunque cada uno utiliza un compuesto diferente, la función es la misma, la de hacer la sangre más líquida. Son inhibidores de la vitamina K. Contienen vitamina K reductasa, los pacientes que toman estos medicamentos tienen que llevar un control exhaustivo para evitar una sangre demasiado líquido, el principal riesgo de estos tratamientos son al posibilidad de que se produzca una hemorragia interna. Actualmente se usa también la “pradoxa” que inhibe la trombina y requiere menos control.

TEMA 9 GLÚCIDOS

Son cadenas hidrocarbonadas polialcohólicas (polihidroxiladas), con un grupo carbonilo. Puede o bien ser un bien un aldehído o una cetona. También son llamados hidratos de carbono o azúcares, aunque ahora ya se sabe que esto términos no son totalmente correctos, ya que no todos tienen la estructura hidratada y no todos son dulces.

-Funciones• Material energético de uso inmediato (glucosa en sangre)• Material energético de reserva (glucógeno y almidón en vegetales)• estructural: las paredes de las células vegetales (celulosa), caparazones de los crustáceos

(quitina), paredes bacterianas (glicopéptido), y tejido óseo (condrotinas)

Son en suministro de átomos para otras moléculas, como por ejemplo la ribosa y la desoxirribosa del ADN y ARN. También participan en el reconocimiento celular. Las lectinas reconocen glúcidos. Esta unión sirve para saber si la célula es propia, para reconocimiento de grupos sanguíneos. Para la infección y para la fertilización de gametos (permiten que el espermatozoide se acople al óvulo).

Clasificación

Presentan tamaños muy variados, en función de ellos se clasifican en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

Los monosacáridos contienen de 3 a 8 átomos de carbono. Son las unidades básicas y no pueden hidrolizarse para dar azúcares más sencillos.Los oligosacáridos son compuestos formados por uniones de algunos monosacáridos. Los más importantes tienen sólo 2 unidades y se llaman discáridos. A partir de ahí, los trisacáridos y sucesivos son poco abundantes y su importancia en el metabolismo animal es muy escasa.Los polisacáridos están constituidas por un alto número de unidades de monosacáridos, que puede superar el millar. Son largas cadenas lineales o ramificadas, dependiendo del tipo de unión entre las unidades. Se dividen en homopolisacáridos y heteropolisacáridos, según que estén formados por el mismo tipo de monosacáridos o por varios diferentes.

monosacáridos

Los monosacáridos se pueden clasificar , a su vez, según tres criterios.

Número de átomos de carbono que contienen. Se nombran con un prefijo que hace referencia a dicho número y con sufijo -osa. Así, existen triosas, tretrosas, pentosas, hexosas, heptosas y octosas. Las más importantes son las hexosas, seguidas de las pentosas. Las heptosas se forman durante la fotosíntesis y las tetrosas y triosas son intermedios metabólicos

Naturaleza química. Los que presentan el grupo carbonilo en un extremo se llaman aldosas (de aldehídos) y los que lo presentan en la posición 2 son cetosas (de cetonas). Por lo tanto podemos decir que existen en referencia a las hexosas, las cetohexosas y las aldohexosas. Las cetosas también pueden llamarse -ulosa, omitiendo el prefijo ceto.

Estereoisomería, por la presencia de carbonos asimétricos. Ello da lugar a una gran diversidad de monosacáridos. También dan lugar a la serie L y D. A diferencia de las proteínas, en el organismo, todos los glúcidos pertenecen a la serie D.

Un átomo de carbono asimétrico permite que sus sustituyentes puedan permutar en sus posiciones. En el plano, si estos cambian de lado, se colocan en el lado opuesto, a este compuesto se le llama enantiómero. Estos dos compuestos son isómeros ópticos y tienen cualidades diferentes.

En el caso de los monosacáridos, el compuesto con actividad óptica más sencillo es una aldotriosa, el gliceraldehído. La estructura de los dos isómeros ópticos posibles y su proyección en el plano. Para saber que tipo de isómero es el que estamos viendo, se ha de mirar el carbono que está más alejado del grupo funcional.

Las imágenes especulares cambian la configuración de todos los grupos OH, es como mirar la molécula en un espejo. El número de isómeros aumenta conforme va aumentando el número de carbonos que tiene la molécula, es decir, un compuesto con n carbonos quirales presenta 2n

isómeros ópticos. Al igual que antes, hay isómeros D y L. es muy importante destacar que este dato de D o L, es independiente de que si la molécula desvía la luz polarizada hacia la derecha o hacia la izquierda, eso se indica con un signo + o – junto a la molécula. Los estereoisómeros que no son enantiómeros se llaman diastereoisómeros. Dentro de estos,, las parejas que sólo se diferencian en la cofiguración de un carbono asimétrico se llaman epímeros. Por ejemplo la D-glucosa y la D-manosa son epímeros en el carbono 2, y la D-glucosa y la D-galactosa, son epímeros en el carbono 4.

Respecto a las cetosas, a igual número de carbonos que las aldosas, presentan un carbono asimétrico menos, ya que uno de ellos tiene un doble enlace.

La estructura de Fischer se llama también abierta, pero no es la única para estos compuestos. Cuando las pentosas y las hexosas se disuelven en agua, el grupo carbonilo tiene una gran tendencia a formar un enlace, el llamado enlace hemiacetálico, con hidroxilo de unos de los carbonos más distantes de dicho grupo. Así se produce una estructura cíclica. Estas estructuras cíclicas se llaman estructuras de Haworth. Por convenio, en ellas, el oxígeno hemiacetálico se encuentra en el vétice superior derecho y el grupo CH2OH terminal, hacia arriba del plano que forma el ciclo.

Una vez formado el enlace hemiacetálico se forma un nuevo centro asimétrico a partir de un carbono carbonílico, loq ue da lugar a la aparición de un nuevo par de estereisómeros para cada monosacárido. Este carbono se llama anomérico, y los dos estereoisómeros son una pareja de anómeros que se designan por las letras griegas alfa y beta, según que se oriente el nuevo grupo hidroxilo, hacia arriba o hacia abajo en el plano.

En disolución no hay un 50% de cada uno de estos, si no que hay apróximadamente un un 66% de beta y un 33% de alfa, quedando apenas un 1% sin ciclar.

Derivados de los monosacáridos

-Alditoles y desoxiazúcares: estos se forman por reducción bien del grupo carbonilo a alcohol o por la pérdida de algún grupo hidroxilo. Los alditoles se denominan con el mismo nombre terminado en -itol. Los alditoles no se pueden ciclar y ello hace que no se puedan absorber en el intestino pero si pueden usarse como alternativa de la D-glucosa en la alimentación intravenosa en pacientes en los que la primera pueda suponer alguna complicación. Los desoxiazúcares son importantes sobre todo en la formación de compuestos necesarios para los ácidos nucleicos.

-Aminoazúcares: contienen un grupo amino sustituyendo a un grupo hidroxilo, generalmente en C2.

-Azúcares ácidos: los carbonos terminales de las aldosas pueden oxidarse a grupos carboxilo, dando lugar a estos grupos. Pueden ser, según el extremo que se oxide, los urónicos, los aldónicos y los aldáricos. Uno importante es el NANA (ácido neurámico), que forma los antígenos de la membrana responsables de los grupos sanguíneos. También el ácido murámico es importante en la pared de las bacterias.

Enlace glicosídico

Es un subtipo del enlace acetálico. Se produce una reacción de OH de unos carbonos anoméricos (esto es un requisito indispensable) con un alcohol de otro monosacárido. Se pierde una molécula de H2O y se establece un puente de oxígeno.

No es exclusivo de los glúcidos, también se usa en las bases nitrogenadas, en las que se une a un grupo nitrogenada, mediante el llamado enlace N-glicosídico, normalmente de tipo beta.

El compuesto final, tras el enlace, se llama glocósido, y puede ser o bien alfa o beta.

Disacáridos

Son los compuestos resultantes tras la unión de dos monosacáridos. Si se forman uniones entre estos disacáridos, se forman los oligosacáridos y finalmente los polisacáridos.

Los mas importantes son la lactosa, formada por un enlace beta 1->4 entre galactosa y glucosa. Este disacáridos se encuentra en el azúcar de la leche.

La sacarosa, el azúcar común, formado también por enlace beta 2->1 entre fructosa y glucosa.

La maltosa también es de las más importante, está formada por dos glucosas, unidad por enlace alfa 1->4.

Polisacáridos

Están formados por la unión de más de 1000 monosacáridos. También son llamados glicanos. Tienen un tamaño molecular muy grande y generalmente son son insolubles y forman dispersiones coloidales. Normalmente se forman mediante enlace entre el carbono anomérico y los hidroxilos situados sobre los carbonos 4, 6 y 3, es ese orden. Pueden estar formados por sólo una cadena o por varias, en este caso se llaman polisacáridos ramificados.

Pueden ser homopolisacáridos o heteropolisacáridos. Los primeros son más abundantes y se suelen llamar con la terminación -ano. Los principales son el almidón, de reserva en vegetales, y el glucógeno, material de reserva en animales, también la celulosa y la quitina.

-Homopolisacáridos

Los más importantes dentro de este grupo son el almidón, producto de reserva energética en las plantas. Está formado por dos monosacáridos que se repiten de forma contínua. La amilosa, que es una cadena lineal, que adopta una estructura helicoidal y la amilopectina, que tiene una estructura ramificada. Está formada por enlaces alfa 1-4, y cada 25 enlaces apróximadamente, aparece un enlace alfa 1-6.

El glucógeno se encuentra formado por unidades de glucosa. Es muy similar a la amilopectina, por lo que decimos que es un homopolisacárido ramificado. También tiene enlace alfa 1-4,, y también presenta enlace 1-6, aunque lo hace con mayor frecuencia que el almidón, cada 8 o 10 enlaces.

La celulosa se encuentra en la pared de los vegetales, por lo que podemos decir que es un homopolisacárido de sostén. Es de cadena lineal, con enlaces beta 1-4. En el resto de aspectos es exactamente igual a la amilosa. Está formado por celobiosa (que son dos glucosas unidas por enlace beta 1-4)

La quitina se encuentra formando sobre todo los esqueletos de los artrópodos, las conchas de los moluscos y demás estructuras de los animales. Está formado por una glucosamina a la que se une un grupo nitroógeno. La unidad que se repite es la N-acetilglucosamina, unida por enlace beta 1-4. forman una cadena lineal.

-Heteropoliscáridos

Son cadenas monosacáridos que no se repiten, puede ser la repetición de una pareja o de un trío, pero no del mismo. Lo más normal es que la repetición se de una pareja. Uno de ellos suele ser el ácido glucarónico y el otro algún derivado que incluya en su estructura un grupo amino (galactosamina, glucosamina, etc...). Una condición indispensable para considerar a un heterpolisacárido como tal es que sus unidades estén unidas por enlaces beta.

Algunos de los heteropolisacáridos del organismo son el acido hialurónico, que se encuentra en el líquido sinovial y en las mucosas, las condrotinas del hueso, los queretinocitos en la córnea y la heparina, que está dentro del heparan sulfato.

Patologías asociadas a los glúcidos.

La más importante debido quizá a la gran cantidad de gente que la padece y a la masiva educación que se da acerca de ella es la diabetes mellitus. Es una patología producida por hiperglucemia, eso conlleva una glucosuria (glucosa en orina). El problema principal de este diabetes es que los

glúcidos pueden llegar a unirse a las proteínas, al haber en exceso en la sangre, lo que puede provocar efectos fatales en el organismo, entre los que podemos destacas una nefropatía, retinopatía, etc...

Hay tres sintomas muy característicos de esta enfermedad, son la poliuria (muchas orinas diarias), la polidipsia (mucha sed) y la polifagia (mucha hambre).

Una de las consecuencias finales de esta enfermedad es que puede llegar a producir una acidosis metabólica, ya que al tener mucha glucosa en sangre, pero no poder usarla, el cuerpo tira de lípidos para abastecerse de energía. Esto hace que se libere mucho acetil coenzima A

Hay dos tipos de diabetes:Diabetes tipo 1: su organismo no tiene insulina. Es una enfermedad autoinmune ya que el organismo no recorre como suyas las células encargadas de producir la insulina, y por tanto las destruye.

Diabetes tipo 2: No depende de la insulina. Los receptores de la membrana no funcionan, esta es una de las teorías, aunque aún no está totalmente clarificado.

La diabetes insípida es otra enfermedad de este tipo, aunque estos enfermos no tienen el hambre que tienen los de la otra diabetes. Puede tener origen en un problema nefrológico o de hormonas, como la vasopresina.

Galactosemia: es una acumulación de galactosa en la sangre. Da lugar a la aparición de galactitol que puede producir cataratas. Es muy a tener en cuenta sobre todo en niños pequeños.

Intolerancia a la frutosa, no se tienen las enzimas que digieren la frustosa, puede ser de dos tipos, la frustosemia esencial, en la que falla la primera enzima del ciclo, no tiene apenas consecuencias, tan sólo la fructosa actúa como la fibra, se excreta y ahí se acaba el problema. Cuando falla la segunda enzima el problema es mucho más grave, ya que se produce la fructosemia congénita, que tiene efectos mucho más importantes sobre la salud. Se debe a que la frustosa pasa a estar fosforilada tras la primera reacción y así el cuerpo no la tolera.

Intolerancia a la sacarosa. Muy sencillo, unicamente falta una enzima que la enzima que cataliza la rotura de estos enlaces. No tiene más repercusión en la vida del paciente.

La intolerancia a la lactosa se debe a la ausencia de beta galactidasa, que se pierde al estar durante un período de tiempo más o menos largo sin tomar leche.

Cuando se acumulan heteropolisacáridos en el cuerpo, se produce una mucopolisacaridosis, son bastante graves, ya que esta acumulación se produce sobre todo en hígado y sistema nervioso.

Grupos sanguíneos

La base de todos los grupos en el antígeno 0, es la base de todos, al grupo A se le añade la Nacetilgalactosamina y al grupo B tan sólo una galactosa. Esto es lo que hace que existan tres grupos sanguíneos diferentes. El 0, al no tener nada en especial, es el donante universal, aunque sólo puede recibir de su propio grupo. Es una ventaja evolutiva.El NANA es un indicador de la vida útil de un eritrocito. Las lectinas son las proteínas encargadas de reconocer los monosacáridos. La gente del grupo 0 está también más predispuesta a sufrir un problema de úlcera gastroduodenal, ya que la bacteria que lo produce es más afín a este grupo sanguíneo.

La gripe también es un virus que se aprovecha de los grupos sanguíneos, la hemoglutina se acopla al NANA y le ayuda a entrar al interior de la célula una vez que esta se ha reproducido usando todos los orgánulos de la célula infectada, sale mediante la neuroamidasa, que rompe el NANA y le deja salir. Los grupos se clasifican según sean estas dos moléculas, por ejemplo el H1N1.

TEMA 10 LÍPIDOS

Se les conoce como biomoléculas orgánicas insolubles en agua y solubles en algún líquido apolar (como puede ser el éter, el cloroformo el acetato y el benceno)

-Funciones

Clara función energética, aportan por cada gramo unas 9.3 calorías, en cambio un gramo de proteínas nos aporta 4,1 calorías.Son componentes esenciales de las membranas biológicas.Actúan como lubricantes y emulsionantes.Necesarios como aislante térmicos. Tiene una muy baja conductividad del calor. Implicados en la regulación metabólica. Muchas hormonas son lípidos.

Clasificación

No existe una única forma de clasificación de los lípidos, debido a la enorme variedad de ellos que hay en la naturaleza. En esta clasificación se van a presentar los que son más importantes para el metabolismo del cuerpo humano.

-Lípidos simples.Son los formados por las unidades estructurales, de naturaleza bien ácida o bien alcohólica, los ésteres de estas y los derivados relacionados con las unidades ácidas, con importante efecto sobre el metabolismo intracelular en tejidos más o menos específicos.Están formados por las unidades estructurales no esterificadas, los ácidos grasos y alcoholes grasos. Ésteres: como los monoacilglicéridos, diacilglicéridos y triglicéridos. Derivados de ácidos grasos de importancia reguladora: prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos.

-Lípidos complejos.Las unidades de los lípidos simples unidas mediante enlace éster. Son de mayor tamaño y siempre son anfipáticos. Se pueden subclasificar en: fosfolípidos (tienen un grupo fosfato), glicolípidos (poseen esfingosina y algún glúcido en su composición), y los lípidos conjugados con otras moléculas como pueden ser las lipoproteínas y los lipopolisacáridos.

-Lípidos isoprenoidesDereivados del isopreno y no contienen enlaces éster. Dentro de este grupo están los terpenos y los aromas.

En esta clasificación no están todos los lípidos del organismo, hay muchos que no se ajustan a ninguno de estos grupos.

Un ácido graso saturado es aquel que en su cadena no tiene ningún doble enlace, todo son enlaces simples. Los monoinsaturados tiene 1 doble enlace y los polinsaturados tienen más de un doble enlace.

Unidades básicas

Los ácidos grasos son ácidos monocarboxilados de cadena lineal, con un número de carbonos de entre 4 y 26. Lo más habitual es que lo ácidos grasos tengan entre 14 y 20 carbonos, sobre todo 18. en el organismo existen más de 100 diferentes, pero el 95% de ellos son sólo 9, cuatro saturados y cuatro insaturados y cinco saturados.

Los saturados son: milístico, palmítico, esteárico y araquidico.Los monoinsaturados son el palmotélico, y el ac. Oleico.Los polinsaturados son el linoleico, el linolénico y el araquidónico.

Todos lo que son polinsaturados son ácidos grasos esenciales, es decir, hay que ingerirlos en la dieta ya que el organismo no los puede sintetizar. Se les ha llamado incorrectamente vitamina F.

Una forma de nombrar los ácidos grasos para acortar es con la letra delta y un superíndice con el número de dobles enlace en el caso de haberlo, una C, y un subíndice que indique el número de carbonos.

Ej: delta9,12,15 C18:3 esta sería la forma abreviada de nombrar al ácido linolénico. La nomenclatura omega consiste en empezar a contar por el final (el carbono más alejado del grupo funcional) y ver en que posición tiene el doble enlace, dependiendo de la posición de ese doble enlace, el ácido graso pertenece a una familia o a otra. En los animales, existen sólo las familias 3, 6, 7 y 9.

Las propiedades más importantes y comunes de los ácidos grasos naturales son:• El número de carbonos es casi siempre par. Ello se debe a que para formarse se produce la

adición de unidades de acetilo que contiene dos unidades de carbono.• Los dobles enlaces no son conjugados, sino que siempre aparecen a una distancia de 3

carbonos. Además, siempre aparecen en la posición cis, y nunca en la trans. Esto es un tipo de isomería, la isomería geométrica.

• A igualdad de carbonos, los insaturados cis tienen menos temperatura de fusión que los trans, y estos menores que los saturados. Por ello las grasas animales ricas en a. grasos saturados son sólidas a temperatura ambiente. Esto se debe al grado de empaquetado de las moléculas, que es mucho mayor en el cis que en el trans.

• Los ácidos grasosinsaturados son fácilmente oxidables por el O2, lo que explica su tendencia a enranciamiento y a la pérdida de calidad.

Los alcoholes grasos son 2 fundamentalmente, el glicerol y la esfingosina. Son compuestos de cadena hidrocarbonadas lineales de longitud variable y que contienen, al menos, una función alcohol en uno de sus extremos.

Acilglicéridos

Son también llamados grasas neutras, debido a su ausencia de carga. Se forman mediante el enlace éster, que consiste en la unión de un grupo alcohol y un grupo carboxilo perdiendo una molécula de agua. La reacción contraria es la reacción de saponificación. Son las principales moléculas energéticas de la célula. La glicerina se puede esterificar con tres grupos OH, dando lugar a los monoacilglicéridos (1 ácido graso), diacilglicéridos (2ac. Grasos) y a los triglicéridos (3 ac. Grasos) .

Las enzimas que catalizan las roturas de los enlaces éster son las lipasas.

Derivados de ácidos grasos

Un ejemplo son las prostaglandinas, que derivan del ácido araquidónico. Son muy importantes en el organismo y tienen unas 1000 funciones conocidas en el organismo entre ellas, la regulación del músculo liso, intervienen en el dolor, la fiebre, la inflamación, disminuyen la presión arterial...)

Hay varias grupos o familias de enzimas que se encargan de su formación, aunque podemos decir que la más importante es la citoxigenasa. Esta enzima también es muy conocida por que es el blanco de las aspirinas (ácido acetilsalicítico), que es un inhibidor irreversible de esta enzima. Si se inhibe no se produce la portaglandina, por lo tanto no hay inflamación, dolor, ni fiebre. El problema es que también inhibe la secrección gástrica, lo que puede dar lugar a una úlcera de estómago.

También se ha usado la aspirina como un anticoagulante, ya que esta proteína está también asociada a la coagulación sanguínea. En realidad no es esta enzima la que está directamente implicada, sino sus isozimas, la cox 1 y la cox 2.

Durante un tiempo hubo unos fármacos que inhibían sólo a una de estas isozimas, pero se tuvieron que retirar ya que se detenía la producción de anticoagulante, pero los tromboxanos (coagulantes) seguían funcionando, por lo que el paciente era muy propenso a sufrir un trombo o una embolia.

El paracetamol tiene un efecto interesante, ya que no se sabe sobre qué actúa, pero se cree que puede ser sobre una supuesta cox 3 que aún es desconocida.

Los eicosanoides son derivados de ácido araquidónico. Los tromboxanos (tx) son sintetizados por las plaquetas y tiene una función de estimulación de la agregación plaquetaria y la vasoconstricción. Los leucotrienos son también unos eicosanoides, sintetizados a partir de los leucocitos, que tienen función quimiláctica, dirigen las moléculas hasta el foco de la infección.

Lípido complejos

Uno de los grupos más importantes son los fosfolípidos; dentro de los cuales están los fosfoglicéridos y los esfingolípidos. Tienen carácter anfipático con una zona polar y otra apolar, están especialmente especializados en la formación de la bicapa lipidica.

-Fosfoacilglicérido: el glicerol con 2 ácidos grasos esterificados y en la tercera posición que queda libre se le acopla un grupo fosfato, el cual puede estar enlazado a un alcohol. Cuando el fosfato no tiene el alcohol se le llama ácido L- fosfatídico. Además los fosfolípidos contienen otro alcohol esterificando un segundo grupo ácido del grupo fosfato, asi que pueden por tanto considerarse como ésteres derivados del ácido fosfatídico.

Hay varios tipos, uno de ellos son las lecitinas, a las que se le une la colina, que actúan como tensioactivos, es decir, reducen la tensión superficial del agua, aparecen en los pulmones, donde evitan que los broquiolos se peguen y no se puedan separar. Esta enfermedad por ausencia de estas lecitinas se llama, síndrome disneico agudo o enfermedad de las membranas hialinas, y pueden llegar incluso a producir la muerte por asfixia.

Las cefalinas se obtuvieron por primera vez a partir de la masa encefálica, pero también existen en otros tejidos. Las de etanolamina son más abundantes que las de serina. Son los dos tipos que existen.

Las cardiolipinas deben su nombre al hecho de que fueron descubiertas en las mitocondrias de las células cardinectoras, y son muy ricas en ácidos grasos polinsaturados. Contienen dos moléculas dos moléculas de ácido fosfatídico unidas a la molécula central de glicerol.

Los fosfatidilinositoles son menos abundantes en las membranas biológicas, pero tienen función reguladora importante, al ser fuente de inositolfosfatos, que son unos segundos mensajeros, un segundo mensajero es el que lleva la información desde la membrana (tras ser recibida por el primer mensajero) hasta las partes de la célula en donde se va a llevar a cabo la acción.

Las esfingomielinas contienen esfingosina, además de un ácido graso en la posición 2 del alcohol, y un fosfato unido al carbono 1. Es el único tipo de lípido que contiene a la vez esfingosina y fosfato, por lo que pertenece a los fosfolípidos y a los esfingolípidos. Abunda en las vainas de mielina de las células de Schwann del SN periférico. La unión de la esfingosina y un ácido graso en C2, se denomina genéricamente ceramida, y es la unidad estructural de las esfingomielinas y de todos los glicolípidos.

Glicolípidos

Estos lípidos complejos tienen la unidad ceramida unida por enlace glicosídico de configuración beta, entre en hidroxilo de C1 de la esfingosina y un hidrato de carbono de complejidad variable. Son muy abundantes en las membranas del sistema nervioso central, sobre todo en la sustancia blanca. Se clasifican en:

-Cerebrósido: contienen sólo un monosacárido, generalmente D-galactosa, que le da hidrofilia a esa parte de la molécula, pero no carga neta.

-Sulfátidos o sulfolípidos: son glicolípidos en los que a su vez en el monosacárido contiene ésteres sulfato y por tanto, son glicolípidos con carga negativa neta. El más abundante es el cerebósido con D-galactosa sulfatada en el C3.

-Globósidos: contienen un oligosacárido simple. El más abundante contiene lactosa.

-Gangliósidos: contienen un oligosacárido complejo y ramificado, con enlaces glicosídicos diversos y siempre con una o varias unidades siálicas. Lo más frecuente es el ácido N-acetilneuramínico. No se conoce su función clara, pero se sabe que pueden unir toxinas bacterianas o incluso células bacterianas íntegras con relativa afinidad y son las moléculas diana de infecciones como el cólera, el tétanos o el botulismo.

El mal procesamiento de los esfingolípidos son las esfingolipidosis. Se deben, como siempre, al fallo de una enzima. Se incluyen dentro de las enfermedades lisosomales, por que los encargados de esta transformación son los lisosomas. Dentro de este grupo están las esfingolipidosis, las glucodosis y las mucopolisacaridosis.

Isoprenoides

Son derivados del isopreno, que es una molécula muy versátil, ya que sus dobles enlaces permiten que la ruptura de uno de ellos forme un radical libre bivalente, es decir, una especie reactiva con dos electrones libres, uno en cada extremo, que puede unirse a moléculas por ambos lados. El mayor polímero del isopreno es el caucho o el látex. Los derivados del isopreno con mayor interés bioquímico son los terpenos o los

esteroides.

Terpenos.

Están formados por varias unidades de isopreno que tiene mínimas modificaciones y mantienen su naturaleza de hidrocarburo. Su olor constituye la gran parte aromas de plantas y frutos. El escualeno es un triterpeno, que es precursor del colesterol.

Esteroides

Este es el grupo más importante de sustancias isoprenoides, aunque su naturaleza triterpénica no se deduce tan facilmente ya primera vista por observación de su estructura, ya que hay cantidad de enlaces que ciclan la molécula, dando lugar a una gran molécula formada por 4 anillos condesados y que se llama ciclopentanoperhidrofenantreno.

El número de enantiómeros es muy grande.Los esteroides se pueden clasificar dependiendo de su complejidad en esteroles, familia de las vitaminas D, ácidos biliares, hormonas sexuales. Y corticoesteroides.

Los esteroles contienen siempre algún grupo alcohol. El más importante de este grupo es el colesterol, con un hidroxilo en la posición 3-beta, un doble enlace en posición 5 y una cadena hidorcarbonada de 8 carbonos sobre el carbono 17. Tiene una estrecha relación con la hipercolesterolnemía y la ateroesclerosis.

Los derivados de la vitamina D se forman por accón de la luz UV sobre los esteroles. Su característica estructural principal es la abertura del anillo B, con formación de un doble enlace entre los carbonos 10 y 19. la cedan lateral que llevan sobre el carbono 17 es igual a la del esterol. Por tanto, la estructura de la vitamina D3 o colecalciferal se forma a partir del 7-deshidrocolesterol. A partir de este compuesto se sintetizan multitud de compuestos derivados que regualn el metabolismo del calcio y el fosfato. Su carencia ocasiona una serie de enfermedades relacionadas con los huesos, entre las que destaca el raquitismo.

El siguiente grupo son los ácidos biliares, que tiene como característica especiales:Una cadena lateral de 5 carbonos que finaliza con un grupo carboxilo. Hay muy pocos ácidos biliares en el organismo, ya que unen su grupo carboxílico a glicina o taurina, alargando la cadena lateral y formando los derivados glico y tauro.

Las sales biliares que se forman son, por orden de solubilidad el ácido cólico, el ácido desoxicólico, el ácido quenodesoxicólico y el ácido litocólico. Este último es el responsable de la formación en muchas ocasiones de cálculos renales en la vesícula biliar.

Las hormonas sexuales son de dos tipos, los andrógenos o masculinas y los estrógenos o femeninas. En ambos casos, no existe cadena lateral en C17. El anillo A de los estrógenos es aromático y no contiene grupo metilo en C10, por lo que sólo tiene 18 carbonos.

Carotenos y retinoles

Los carotenos son los precursores de los retinoles, y estos a su vez dan lugar a la vitamina A, que es

un antioxidante y necesario par la visión. Los beta carotenos se encuentran en los vegetales que tienen un color intenso. Las hipervitaminosis lipídicas son también problemáticas.

Otro tipo importante son los tocoferoles, el más famoso de ellos es la vitamina E. Actúa como antioxidante y además es necesario para la fertilidad. También la poliprenilquinasas, de las que destaca la vitamina K.

Al igual que las hipovitaminosis son peligrosas, lo son también las hipervitaminosis, sobre todo las hiperlipovitaminosis. Ya que un exceso de este tipo de vitaminas produce entre otras cosas la aparición de cálculos y problemas en el riñón.

Un tipo de lípido son el HDL y el LDL, el primero es el llamado colesterol bueno y el segundo el malo. El depósito de LDL produce placas de ateroma, que atascan los vasos sanguíneos y dan lugar a infartos de miocardio. En la hipercolesterolemia no funcionan los receptores de las membranas del colesterol.

También los ácidos grasos en disposición trans son malos para el organismo. Estos no aparecen de forma natural, pero si cuando se solidifica un ácido graso cis mediante la hidrogenización. Lo que ocurre es que algunos de los dobles no se rompen (que es el objetivo de este proceso) pero se cambian de disposición y pasan a ser ácidos grasos trans.

Se ha demostrado que los ácidos grasos omega, muy abundantes en los pescados azules contribuyen a la salud cardiovascular, ya que disminuyen la agregación plaquetaria, los acilglicéridos y el colesterol. Esto lo hace el omega 3, el omega 6 en cambio, no contribuye a la salud.

PRÁCTICAS BÁSICAS PARA GRADOS EN CIENCIAS DE LA SALUD. CURSO 2010-2011GRADO EN ENFERMERÍA

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR B e INMUNOLOGIA

UNIVERSIDAD DE MURCIA

P1. Medida de pH. Poder regulador. Acción de la lipasa

P2. Propiedades de aminoácidos y proteínas

P3. Disoluciones y determinaciones analíticas. Acción de amilasa sobre el almidón

P4. Determinación de creatinina en orina y de otros parámetros en sangre

PRÁCTICA 1

MEDIDAS DE pH. TAMPONES. SEGUIMIENTO DE LA HIDRÓLISIS DE GRASAS POR LA LIPASA.

INTRODUCCIÓN

La medida del pH es una de las determinaciones analíticas más utilizadas en disoluciones acuosas y

por tanto en Bioquímica, ya que los fluidos biológicos son soluciones acuosas. El valor de pH determina

muchas características estructurales y funcionales de biomoléculas, incluyendo las macromoléculas,

proteínas y ácidos nucleicos, y por tanto, la actividad metabólica de los organismos vivos. En el hombre, el

control del pH sanguíneo es importante porque sus cambios alteran no solamente las biomoléculas del

plasma, sino además el pH intracelular, lo que a su vez afecta profundamente al metabolismo. Así, el plasma

presenta un pH casi constante de 7.4, unas décimas superior al que presenta el citosol intracelular de las

células sanguíneas y endoteliales. La sangre es fácilmente asequible para análisis y un buen vehículo para

suministrar eficazmente agentes alcalinizantes o acidificantes cuando es necesario alterar el pH, por estados

de acidosis o alcalosis metabólica.

Químicamente, el pH es definido como −log [H+], y su medida es, por tanto, un reflejo en escala

logarítmica de la concentración de protones, es decir, de la acidez del medio. Las medidas se realizan

experimentalmente con electrodos combinados de vidrio, que presentan una respuesta rápida y son más

sencillos de utilizar por lo que han desplazado a los antiguos y "ortodoxos"" electrodos de hidrógeno

(platino con hidrógeno gas absorbido). Los electrodos de vidrio no miden valores absolutos, por lo que

deben, antes de su utilización, calibrarse con disoluciones patrón de pH conocido y exacto y tener unas

condiciones de conductancia (contenido iónico) adecuadas para asegurar una medida precisa. El pH del agua

pura es difícil de medir con precisión por este motivo. Además, el agua puede variar drásticamente su pH

con pequeñas adiciones de un ácido o una base.

El mantenimiento del pH de una solución acuosa en unos límites de variación controlada se

consigue con los denominados tampones, reguladores, amortiguadores o buffers. Estos sistemas están

normalmente formados por un par mezcla de un ácido débil y la sal de su base conjugada, que se pueden

interconvertir como consecuencia de la adición de H+ u OH- variando sus proporciones relativas sin un

cambio drástico del pH gracias al equilibrio químico entre las dos especies del tampón.

Volviendo al caso de la sangre humana, el intervalo compatible con la vida es, a lo sumo, de

aproximadamente una unidad, entre 6.8 a 7.8. Por ello, la sangre posee sistemas muy eficaces de regular el

pH de tal forma que no varíe significativamente frente a una aparición más o menos masiva de ácidos o

bases como consecuencia de desórdenes metabólicos y/o respiratorios. En la sangre, el sistema regulador

principal es el CO2/HCO3-, pero también participan el sistema fosfato H2PO4

-/HPO42- y algunas proteínas

plasmáticas, éstas gracias a ciertos residuos aminoacídicos, principalmente el grupo imidazol de las

histidinas. Por ejemplo, en la hemoglobina, existen 38 histidinas por tetrámero, constituyendo el principal

sistema regulador del pH intraeritrocítico (cuyo valor es aproximadamente 7.2).

La relación fundamental entre las dos especies que constituyen un sistema regulador es la ecuación

de Henderson-Hasselbalch:

pH = pKa + log [BASE CONJUGADA] / [ÁCIDO]Así, respecto al sistema carbónico/bicarbonato, en el plasma siempre se cumple:

pH= pK1 + log [-HCO3] / [CO2]

De lo cual, conociendo el valor de pK1 (aprox. 6.1) y la relación entre las dos concentraciones, se

puede determinar fácilmente el pH.

Las experiencias a realizar en la primera parte de la práctica van encaminadas a familiarizarse con el

uso del pHmetro y con el poder tamponante de alguno de estos sistemas. En la segunda parte utilizaremos la

medida indirecta del pH para poder seguir la acción de una enzima digestiva y la liberación de ácidos grasos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL

pHmetro con electrodo de vidrio combinado Rollo de papel "científico" 1 vaso de 50 y 1 de 100 ml2 Gradillas 2 Pipetas de 1 y 2 de 5 ml Micropipeta P100 o P200.7 Tubos de ensayo de boca ancha para introducir electrodo6 tubos de ensayo transparentes (pueden ser altos y más estrechos)1 Baño termostático a 37 ºC 1 Varilla de agitación

REACTIVOS

Disolución patrón de pH 7 HCl 1NTampón fosfato 0,1 M pH 7 NaOH 1NKCl Saturado Agua destiladaFenolftaleína 1% en etanol Pancreatina bovina al 2%Carbonato sódico 0.1 M Bilis 2% (o desoxicolato 2%)

Parte A: UTILIZACION DEL ELECTRODO MEDIDA DEL pH. VARIACIÓN DEL pH EN

AGUA Y EN DISOLUCIONES TAMPONADAS.

IMPORTANTE: PRECAUCIONES PARA EL USO DEL ELECTRODO

Un electrodo convencional, como el electrodo utilizado en la práctica, tiene la membrana porosa en

la pared lateral protegida del daño mecánico, pero en algunos casos se encuentra más expuesta en la zona

inferior. Si es así, lleven especial cuidado de no dañarla.

a) Antes de efectuar cualquier medida, debe asegurarse de que el electrodo está limpio pasando suavemente

un trozo de papel científico.

b) Es esencial que la membrana porosa situada en el lateral de electrodo esté SIEMPRE totalmente

sumergida en la disolución para realizar las medidas. Es el área por donde se produce el intercambio entre

la disolución exterior y la interior del electrodo.

c) En casos donde se necesite agitación magnética, no agiten a gran velocidad ni con movimientos

excéntricos de la barra magnética para evitar que ésta pueda golpear y romper el electrodo.

1. Calibración del electrodo.

Extraer el electrodo de la capucha con disolución de KCl saturado donde debe mantenerse al finalizar

las medidas.

Lavar con agua destilada y secarlo pasando suavemente papel por el electrodo.

Preguntar al profesor encargado de la práctica si el electrodo ha sido calibrado recientemente. Si

es así, pasar directamente al punto 2. De lo contrario:

• Añadir unos 5 ml de disolución patrón pH 7 en un tubo de ensayo.

• Sumergir el electrodo en esa disolución.

• Conectar el pHmetro y esperar unos segundos hasta estabilización de la lectura.

• Si ésta es distinta de pH 7, ajustar con el mando correspondiente.

• Desconectar el botón de lectura de pH.

• Sacar el electrodo de la disolución patrón, quedando listo para medidas.

2. Medidas de pH. Poder tamponante.

Utilizar las 2 series de 3 tubos marcados con 1A, 2A 3A y 1B, 2B, 3B. A la serie A añadir 10 ml de agua

destilada a cada tubo y a la serie B 10 ml de tampón fosfato pH = 7. Utilizar los tubos 1A y 1B para medir el

pH inicial del agua o del tampón fosfato, que deberá ser próximo a 7. Después, adicionar con una

micropipeta 100 µl (microlitros) de HCl 1N a los tubos 2A-2B y otros 100 µl (o 2 gotas de disolución de

NaOH) a los tubos 3A-3B. En defecto de la micropipeta adecuada, utilizar una pipeta Pasteur y añadir 2

gotas del ácido o la base respectivamente. Tener siempre la precaución de cambiar las cánulas de la

micropipetas o lavar bien las pipetas Pasteur si se van a utilizar para más de un reactivo.

Medir los pH de todos los tubos y calcular los cambios de pH producidos por la adición de un ácido o una

base fuertes sobre el agua o el tampón fosfato.

Tubo pH inicial pH final Variación respecto a 1A o 1B

1A (agua) 02A (agua+ HCl)3A (agua+ NaOH)1B (fosfato) 02B (fosfato+ HCl)3B (fosfato+ NaOH)

Parte B: APLICACIÓN DEL CAMBIO DE pH A MEDIDAS ENZIMÁTICAS: HIDRÓLISIS

DE TRIACILGLICÉRIDOS.Algunas reacciones metabólicas o procesos fisiológicos producen sustancias que modificarían

sustancialmente el pH celular si no estuvieran suficientemente tamponados. Un ejemplo es la hidrólisis de

los triacilglicéridos, principales componentes de los lípidos de la dieta, durante la digestión en el lumen

intestinal, gracias a la actuación de la lipasa, enzima que se sintetiza en el páncreas y que cada vez que llega

alimento al intestino se vierte como constituyente del jugo pancreático.

La reacción que tiene lugar se denomina saponificación y es contraria a la esterificación que tiene

lugar cuando los triacilglicéridos se forman a partir de glicerina y ácidos grasos. Una vez que actúa la lipasa

y se produce la hidrólisis (saponificación), la glicerina y los ácidos grasos quedan libres como tales y liberan

H+, produciendo un descenso del pH cuya magnitud depende de que el medio este tamponado o no. Dicho

descenso se podría seguir utilizando el pHmetro de la parte primera. Pero en este caso, vamos a utilizar

indicador que cambie de color como consecuencia del paso de pH de ácido a base y que cualitativamente

puede reemplazar al electrodo.

Se utiliza como fuente de enzima la pancreatina bovina, una mezcla de enzimas que contiene lipasa.

Como fuente de triacilglicéridos se utilizará leche entera de vaca, que está poco tamponada puesto que la

caseína es una proteína bastante pobre en residuos de Histidina. Mediante fenolftaleína, un indicador

CH2-OOC-R

CH-OOC-R

CH2-OOC-R

TAG

H2O R-COOH

RCOO- H+

+

CH2-OH

CH-OH

CH2-OH

+

+Glicerol

Acido grasolipasa

ácido/base, es posible visualizar el descenso de pH ya que este indicador a pH>7 presenta coloración rosa,

mientras que a pH<7 es incoloro.

Puesto que la leche entera natural tiene un pH inicial inferior a 7, para acercar el pH al óptimo de

actuación de la lipasa, es decir un pH próximo a 8, la leche debe basificarse previamente mediante adición

de carbonato sódico. Para poder visualizar los cambios de pH, el procedimiento debe realizarse en presencia

de fenolftaleína.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Añadir unos 25 ml de leche entera al vaso de precipitados y adicionar 5 gotas de fenolftaleína

disuelta en etanol. Agitar y verificar que la leche sigue con la coloración inalterada. Ir adicionando poco a

poco disolución de carbonato sódico con agitación continua hasta que se adquiera un color rosa homogéneo

y permanente, de una intensidad que recuerde un batido de fresa. A continuación se numeran 4 tubos de

ensayo y se les añade los reactivos reflejados en la Tabla (cantidades expresadas en ml). Las adiciones se

deben realizar en el orden expresado, y con agitación cada vez que se añade un nuevo reactivo.

REACTIVOS 1 2 3 4 Leche basificada 5 5 5 5 Agua destilada 1.5 1 0.5 0 Sales biliares 0 0.5 0 0.5 Pancreatina (con lipasa) 0 0 1 1

Agitar todos los tubos con rapidez y hasta homogenización total y situarlos a 37 ºC en un baño termostático

o termobloque, observando atentamente lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo. Anotar el tiempo

necesario para que se produzcan las decoloraciones desde el inicio de la reacción en los tubos donde se

produzcan. Interpretar resultados.

CUESTIONES A1) ¿Quién introdujo la escala de pH como una escala logarítmica de la concentración de protones? ¿Qué

ventajas tiene?

A2) ¿Cuál es la relación entre el pH y el pOH? ¿Por qué?

A3) Razone por qué los grupos imidazol de las proteínas son buenos agentes tamponantes en la sangre.

A4) ¿Hay alguna relación entre el pKa de un grupo y su eficacia tamponante en un rango de pH

determinado? Explique por qué.

A5) El principal sistema regulador del pH sanguíneo, bicarbonato/carbónico, tiene características especiales

que hacen que no sea un buen sistema tamponante "in vitro". ¿Cuáles son? ¿Por qué el sistema bicarbonato

en el plasma se expresa como bicarbonato/CO2 y no como bicarbonato/Ac. Carbónico como parecería

lógico?

B1) ¿Cómo funciona un indicador ácido-base? ¿Por qué cambia de color? Encuentre y cite algún otro

distinto de la fenolftaleína. ¿Hay alguno que sea universal y válido para todos los rangos de pH?

B2) ¿Cómo justifica que al añadir gotas de carbonato sódico sobre la leche con fenolftaleína aparezca el

color rosa de forma local y transitoria?

B3) ¿A qué pH fisiológico actúan las lipasas? ¿Qué producto de la acción de las lipasas es el responsable

directo del cambio de color de la fenolftaleína?

B4) ¿Cuál es el efecto de las sales biliares sobre la digestión de triacilglicéridos? ¿Afecta a otras clases de

lípidos?

B5) En el experimento de la digestión de los TAG de la leche ¿En qué orden se produce el cambio de

coloración? ¿Por qué? ¿Observa diferencias entre los tubos 1 y 2 a tiempo final? ¿Y entre el 3 y 4? ¿Tiene

alguna explicación para los hechos observados?

PRÁCTICA 2 PROPIEDADES DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS.

INTRODUCCIÓN

A. AMINOÁ CIDOS. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA .

Los α-aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Se caracterizan por la presencia

sobre el mismo carbono (Cα) de un grupo básico (amino, –NH2 o –NH3+) y un grupo ácido (carboxilo, –

COOH o –COO-), además de una cadena lateral de naturaleza química muy diversa entre los 20 aminoácidos

proteinogénicos.

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por

distribución entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, que transporta las sustancias que se separan y que

progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas

y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido. Estas técnicas también permiten identificar un compuesto

comparando su comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón.

En la cromatografía en capa fina (TLC, por Thin Layer Chromatography), la fase estacionaria es

una fina capa de material poroso e hidrofílico (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida sobre un soporte plano

inerte (vidrio o aluminio), y la fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que migra

por la fase estacionaria por capilaridad. La fase móvil, en su movimiento, arrastra en mayor o menor medida

a los componentes de la mezcla.

Durante la cromatografía, un determinado soluto interactúa con las dos fases y experimenta una serie

de procesos (solubilización en cada fase, adsorción en fase sólida, arrastre por la fase móvil, etc.) que

condicionan su reparto entre ellas. En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto de ambas

fases es constante. Este parámetro se denomina coeficiente de reparto y depende de la naturaleza del

compuesto y la de las fases, así como de las condiciones en las cuales se corre la muestra (temperatura, vapor

de saturación, etc). La separación de los componentes de una mezcla se considera buena si todos presentan

coeficientes de reparto diferentes.

El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar,

e íntimamente relacionado con él, se emplea el denominado Rf,

característico de cada sustancia y definido como la relación entre la

distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase móvil.

Los componentes de la mezcla más insolubles en el disolvente

empleado tendrán un Rf próximo a cero, mientras que el de los más

solubles se acercará a uno.

La cromatografía en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomoléculas, tales

como aminoácidos, fosfolípidos, azúcares, etc, y en cada caso cambiaría la fase móvil empleada y los

reactivos de revelado. En esta práctica, separaremos aminoácidos y revelaremos la placa con ninhidrina, que

al reaccionar con el grupo amino de los aminoácidos produce un color púrpura (en algunos casos puede ser

rosa o rojizo), y con el grupo imino o amino secundario (iminoácidos) da un color amarillo.

B. PROTEÍNAS

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Están formadas por α-

aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, lo que origina cadenas lineales. Las proteínas conjugadas

contienen otros componentes de distinta naturaleza (no peptídica), que se denominan grupos prostéticos. Las

propiedades físico-químicas de las proteínas pueden ser muy diferentes: así, proteínas estructurales como la

queratina del pelo se parecen poco a la hemoglobina o a la hormona insulina.

Para que las proteínas cumplan su función biológica tienen que adoptar una estructura espacial

determinada, denominada nativa. La mayoría de las proteínas globulares son solubles en disoluciones acuosas

y a pH próximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteración de esta estructura

tridimensional conlleva la pérdida de su actividad biológica, proceso que se denomina desnaturalización: las

propiedades físico-químicas cambian drásticamente y, en el caso de las proteínas globulares solubles,

generalmente se produce una insolubilización o precipitación. Agentes desnaturalizantes típicos son el calor,

valores extremos de pH, disolventes orgánicos, metales pesados (Pb+2, Hg+2, Ag+), agentes caotrópicos y

detergentes iónicos.

La presencia de proteínas en una disolución puede ponerse de manifiesto por gran número de ensayos,

basados en la formación de un compuesto coloreado entre la proteína y un reactivo específico. Dentro de un

rango de concentraciones adecuado, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de

proteína, por lo que se puede cuantificar y correlacionar con la cantidad de proteína presente en la muestra. Los

distintos métodos colorimétricos presentan diferencias de sensibilidad, especificidad y variables como la

dificultad o el precio del ensayo, que es importante valorar a la hora de elegir el más idóneo para cada caso.

Entre los métodos más utilizados para proteínas destacan:

a) Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul al púrpura

cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El ensayo es bastante específico para proteínas (pocos

interferentes) y barato, pero poco sensible: se requieren de 1 a 10 mg de proteína.

b) Ensayo de Lowry: Es hasta 10 veces más sensible que el de Biuret, pero más tedioso de realizar. El

principio de la reacción es similar a aquél: se basa en la reacción de proteínas con el Cu (II) en medio alcalino y

en la reacción de grupos fenólicos (mayoritariamente de tirosina) con un reactivo, denominado de Folin-

Ciocalteau, que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato. Como inconvenientes destacan su dependencia del

contenido en Tyr y Trp de la proteína y las interferencias debidas a la eventual presencia de compuestos

fenólicos en el medio.

c) Ensayo de Bradford: Es un ensayo rápido y sensible para cuantificar proteínas (1-20 µg), aunque la

presencia de detergentes en la muestra puede producir interferencias. El método se basa en el cambio de color

que experimenta el colorante azul coomassie en medio ácido en presencia de proteínas. Las proteínas producen

el cambio de la coloración anaranjada del reactivo a una tonalidad azulada.

En esta práctica se utilizarán y compararán los ensayos de Biuret y de Bradford.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA .MATERIAL.Placa fina de celulosa Micropipeta 1-10 µl y puntasCubeta para el revelado Cubeta cromatográficaPinzas de madera Lápiz nº 2Regla de 20 cm Secador

REACTIVOS.Muestras de aminoácidos al 1% Ninhidrina (1mg/ml en acetona)Fase móvil: n-butanol/acetona/acético/agua (35/35/20/10)

Importante: Coger la placa por los bordes, sin tocar la superficie, para evitar contaminarla.

1. Colocar 25 ml (aprox.) de fase móvil en la cubeta y cerrarla, para saturar su atmósfera. La

cromatografía se efectuará en esa cubeta cerrada.

2. Trazar con un lápiz, sin apretar demasiado para no dañar la placa, una línea horizontal a 1,5 cm del

borde inferior de la placa. Marcar sobre ella 5 puntos con igual separación entre sí, y aplicar en cada uno

de esos puntos 0,5 µl de cada aminoácido con la micropipeta. Es importante que las gotas se extiendan

lo menos posible, por lo que se debe secar la primera antes de aplicar la segunda, si es necesario

utilizando el secador. Anotar las posiciones en que se han colocado los diferentes aminoácidos y el

problema.

3. Colocar la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de la línea de

aplicación de las muestras. Cerrar y esperar unos 35-45 minutos. La fase móvil no debe llegar al

extremo superior de la placa. En ese tiempo, realizar los otros apartados de la práctica.

4. Sacar la placa, marcar en un borde el nivel alcanzado por la fase móvil, secarla en la estufa (si huele

algo a disolvente orgánico, eliminar los últimos residuos con aire caliente del secador) y sumergirla en la

cubeta de revelado en la que, previamente, se habrá puesto una pequeña cantidad del revelador (20-30

45 min

ml de ninhidrina). Meter la placa en la estufa unos 3-5 min, a 105ºC, o hasta la aparición de manchas.

5. Observar las manchas aparecidas, su forma e intensidad. Calcule en Rf de cada muestra estándar y

determine cuál(es) es (son) el (los) desconocido(s) de la muestra problema.

Rf = Distancia corrida por la muestra / Distancia recorrida por la fase móvil

Distancia recorrida por la fase móvil: _____________

Tubo Aa patrón Color de la manchaDistancia recorrida

Rf

12345 PROBLEMA

¿Cuál es el aminoácido problema?

B. PROTEÍNAS

MATERIAL.Tubos de ensayo (vidrio y plástico) PropipetasMicropipetas de 200µl y 1000 µl Puntas de micropipetaCalefactor Pinzas de maderaPipetas de 1, 5 y 10 ml

REACTIVOS.Disolución de albúmina (10 mg/ml) Tampón fosfato pH 7, 10 mMNaOH 2.5 N Ácido tricloroacético (TCA) 10%Acetona Acetato de plomo 0.2 MReactivo de Biuret Reactivo de Bradford

1. Precipitación de proteínas.

Rotular cinco tubos de ensayo del 1 al 5, y añadir a cada tubo 1 ml de la disolución de albúmina de 10

mg/ml. A continuación proceder como sigue para constatar el efecto que sobre la solubilidad de la proteína

tienen los siguientes agentes:

Tubo Condición Tratamiento Observaciones1 Calor Calentar a 100 ºC unos minutos

2 Medio ácido Añadir 1 ml de ácido

tricloroacético

3 Medio básico Añadir 1 ml de hidróxido sódico

4 Disolv. orgánico Añadir 2 ml de acetona

5 Catión pesado Añadir 1 ml de acetato de plomo

Mezclar bien los tubos y observar los cambios producidos.

2. Ensayo del Biuret.

Preparar, a partir de la disolución de albúmina original, 10 ml de disolución 2 mg/ml en albúmina. Rotular 4

tubos de vidrio y añadir, en el orden indicado, cada uno de los reactivos que se especifican (en ml):

1 2 3 4

H2O destilada 2 1.8 1 -

Albúmina 2 mg/ml - 0.2 1 2

Reactivo de Biuret 3 3 3 3

Diferencia de color respecto al

control No

Una vez agitados, esperar 10 min y observar resultados apuntado si el color producido permite dar el ensayo

como positivo.

3. Ensayo de Bradford.

Rotular dos tubos de plástico y añadir los reactivos en el orden que se indica:

1 2

H2O destilada 800 µl 700 µl

Albúmina 2 mg/ml -- 100 µl

Reactivo de Bradford 200 µl 200 µl

Agitar y observar el color de los 2 tubos.

CUESTIONES A1) Calcule el Rf de los Aminoácidos patrones y el problema (tabla) e identificar el/los aminoácidos

problema.

A2) ¿Qué naturaleza tienen las fases estacionaria y móvil empleadas? Con una fase móvil más polar, la

separación ¿sería mejor o peor? ¿Por qué? Poner un ejemplo de una fase móvil más polar que la empleada en

la práctica y de otra más apolar.

A3) Describir la reacción de ninhidrina con los aminoácidos y los colores obtenidos.

A4) ¿Qué aminoácido de cada una de las siguientes parejas tendrá mayor Rf en el sistema cromatográfico

empleado? ¿Por qué?

a) Ala y Lys; b) His y Phe; c) Asp y Leu; d) Gly y Ser.

A5) La detección precoz de algunas enfermedades congénitas relacionadas con el metabolismo de

aminoácidos se realiza por esta técnica, empleando una muestra de sangre. El caso más importante es la

fenilcetonuria. Consultar el problema metabólico que origina la enfermedad y describir qué observaríamos

en la cromatografía de un suero fenilcetonúrico con respecto a uno sano.

B1) ¿Cómo operaría para transformar la disolución de albúmina 10 mg/ml en otra de concentración 0.4 mg/ml?

B2) Para desproteinizar un plasma sanguíneo ¿qué sería mejor añadirle, ácido tricloroacético o hidróxido

sódico? ¿Por qué?

B3) En el ensayo del Biuret, ¿qué color presenta la disolución del tubo 1? ¿Por qué?

B4) Calcular los mg de albúmina presentes en los tubos nº 2 de los ensayos de Biuret y de Bradford, y

justificar, en función de los resultados, cuál de los dos métodos es más sensible para detectar proteínas.

B5) Si los valores normales de proteína total en suero (adultos) son entre 6,4 y 8,3 g/dl, ¿qué método

emplearíamos para cuantificar la proteína total de un suero problema a partir de 100 µl de una muestra

diluida 200 veces?

PRÁCTICA 3. DISOLUCIONES Y DETERMINACIONES ANALÍTICAS. APLICACIÓN A

LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

INTRODUCCIÓN.

Una disolución es una mezcla homogénea de dos o más sustancias, cuyos componentes son un medio

dispersante denominado disolvente, que es generalmente líquido, y las sustancias que se disgregan en su seno

denominadas solutos. En los seres vivos el disolvente fundamental, el agua, sirve para disolver la mayoría de

las biomoléculas y sales, aunque en el caso de las biomoléculas de gran tamaño como las proteínas, más que

disoluciones verdaderas son sistemas coloidales.

La composición de una disolución se puede expresar de diferentes maneras:

Peso del soluto por volumen de disolución (por ejemplo g/L o mg/ml).

Porcentajes en peso (% peso): peso de soluto en 100 g de disolución.

Porcentajes en volumen (% volumen): volumen de soluto en 100ml de disolución.

Porcentajes peso/volumen (% peso/volumen): peso de soluto en 100 ml de disolución.

Molaridad (M): moles de soluto por litro de disolución.

Molalidad (m): moles de soluto por Kg de disolvente.

Normalidad (N): equivalentes de soluto por litro de disolución.

Fracción molar (X): moles de un componente por moles totales de la disolución.

Mientras que las concentraciones de los diferentes metabolitos en extractos celulares o de los

sustratos y productos en las reacciones enzimáticas se suelen expresar en μM o mM, en los análisis

bioquímicos de la sangre la concentración de diferentes componentes como glucosa o triglicéridos se expresa

generalmente como mg/dL.

Las disoluciones de la mayoría de las biomoléculas son incoloras, por lo que para calcular la

concentración de un determinado soluto incoloro hay que hacer reaccionar dicho compuesto con otra

sustancia que genere un producto coloreado. En la medida de diversas actividades enzimáticas se utilizan

métodos basados en la generación de compuestos coloreados, que sirven para cuantificar la cantidad de

producto formado en la unidad de tiempo.

Una de las características de las disoluciones coloreadas es la de absorber radiaciones

electromagnéticas del espectro de la luz blanca. La ley de Lambert-Beer relaciona la absorción de luz con las

propiedades de la disolución atravesada por un haz de luz. En la presente práctica se medirán, por medio de

un espectrofotómetro, las absorciones correspondientes a diferentes concentraciones de una disolución de

una sustancia coloreada, utilizando una cubeta de 1 cm de paso de luz. En el esquema 1 se representa el paso

de un haz de luz monocromática de longitud de onda λ a través de una cubeta de tamaño (paso de luz) l que

contiene una disolución de concentración c, y en donde I0 e It son las intensidades del haz lumínico antes y

después de atravesar la disolución.

La ley de Lamber-Beer enuncia que existe una relación exponencial entre la transmisión de la luz a

través de una sustancia (transmitancia) y la concentración de la sustancia y longitud del cuerpo que atraviesa

la luz. Dicha ley queda reflejada en la expresión

Transmitancia (T) = It/I0 = 10-ε l c

Si al valor –logT se denomina absorbancia (A), la ecuación anterior queda como

Absorbancia (A) = ε l c

que nos dice que la absorbancia de una disolución es función directa de la concentración de dicha disolución

y de la longitud que atraviesa la luz. Para una cubeta de l = 1 cm la ecuación se transforma en:

A = ε c

donde ε es el coeficiente de absorción molar de la sustancia o absorbancia molar, y cuyas dimensiones

vienen dadas en M-1 cm-1.

Io c, ε

l

It

haz de luz

A = ε l c T = (It/Io) = 10- ε l c A = -log T

A es la absorbanciaT es transmitanciaIo es la intensidad de la luz incidenteIt es la intensidad de la luz transmitida

c es la concentración de la muestraε es el coeficiente de absorciónl es la distancia que la luz atraviesa

por la disolución

Esquema 1.

Io c, ε

l

It

haz de luz

Io c, ε

l

It

haz de luz

A = ε l c T = (It/Io) = 10- ε l c A = -log T

A es la absorbanciaT es transmitanciaIo es la intensidad de la luz incidenteIt es la intensidad de la luz transmitida

c es la concentración de la muestraε es el coeficiente de absorciónl es la distancia que la luz atraviesa

por la disolución

Esquema 1.

En la primera parte de la práctica se van a preparar disoluciones de concentraciones diferentes a

partir de una disolución patrón de concentración conocida, midiéndose a continuación la absorbancia de cada

una de las disoluciones con la ayuda de un espectrofotómetro. A continuación, se representaran en un

diagrama x/y los valores de absorbancia frente a las concentraciones, obteniéndose la recta correspondiente y

a partir de la misma determinar el coeficiente de absorción molar (ε) de la sustancia analizada.

En la segunda parte, se llevará a cabo la medida de la aparición o desaparición de un color para

detectar la presencia de una biomolécula como el almidón y la degradación del mismo por la amilasa salivar.

Para ello se hará uso de la propiedad que tienen las cadenas de amilosa del almidón para generar un color

azulado/violeta cuando interaccionan con el yodo, y de la capacidad de amilasa salivar para degradar el

almidón, hidrolizando los enlaces glicosídicos α (1→ 4) de dicho polímero.

PARTE A. LEY DE LAMBERT-BEER. CALCULO DE ε Y DE LA CONCENTRACIÓN

DE UNA DISOLUCIÓN PROBLEMA.

MATERIALESEspectrofotómetro. Gradilla tubosJuego de micropipetas. Tubos de plástico de 10 ml.Puntas de micropipetas Disolución patrón 300 μM.Frasco lavador Disolución problema (P).Cubetas de espectrofotómetro. Agua destilada.Guantes.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

a) Rotular 6 tubos de plástico y añadir a cada uno de ellos los volúmenes de agua destilada y de disolución

patrón que se indican en la siguiente tabla

1 2 3 4 5 6Agua destilada (ml) 3 2.97 2.94 2.85 2.70 2.40Disolución patrón (ml) 0 0.03 0.06 0.15 0.30 0.60

Agitar los tubos y mediar la absorbancia a λ=550 nm de cada uno de los tubos. Para ello se debe de ajustar en

primer lugar los valores de 0 y 100% de transmitancia, utilizando una cubeta de espectrofotómetro llena con

la disolución del tubo 1. A continuación medir y anotar los valores de absorbancia de todos los tubos,

calculando a continuación la concentración de la sustancia medida en cada uno de los tubos. Medir la

absorbancia del problema (P)

Tubo 1 2 3 4 5 6 PAbsorbanciaConcentración

A partir de los valores anotados, obtener la representación gráfica de los mismos, utilizando el papel

milimetrado y calcular el coeficiente de absorción y la concentración de la disolución problema:

Coeficiente de absorción: Concentración problema:

PARTE B. ACTIVIDAD AMILASA SALIVAR. REACCIÓN DE COLOR DEL ALMIDÓN CON EL YODO.

MaterialesGradillaTubos de vidrio de 10 ml. Disolución de almidón 1%Juego de micropipetas. Disolución de yodo 1 mMPuntas de micropipetas. Agua destiladaTermobloque SalivaVaso pequeño desechable.

Procedimiento experimental

a) Recolectar saliva utilizando el vaso de plástico, y diluir dicha saliva con un volumen

aproximadamente igual de agua destilada.

Numerar seis tubos. Adicionar a los tubos 1 y 2 los siguientes componentes:

Tubo 1 2Almidón 1% (ml) 1 1Agua destilada (ml) 1 0Saliva (ml) 0 1

Agitar los tubos y dejar incubar hasta realizar el apartado b.

b) Añadir los siguientes reactivos a los otros cuatro tubos

Tubo 3 4 5 6Almidón 1% 1 0 1 1Agua destilada 1 1 0 0Disolución de yodo 1 mM 0 1 1 1

Agitar y anotar los cambios observados.

Introducir el tubo 5 en el calefactor puesto a una temperatura de 90ºC. Ir observando los cambios producidos

en relación con el tubo 6 mantenido a la temperatura ambiente. A continuación enfriar el tubo 5 usando el

agua del grifo. Anotar los cambios.

c) Una vez terminado el apartado b, añadir 1ml de disolución de yodo a cada uno de los tubos 1 y 2 y

agitar. Comparar la coloración de ambos tubos.

CUESTIONES

A1) ¿Qué absorbancia tendría una disolución 50 μM?

A2) ¿Qué cantidad de soluto existe en 3 ml de la disolución 60 μM?

A3) ¿Cuál será la concentración mM de glucosa en sangre si el valor de la glucemia es 90 mg/dL?

(El peso molecular de la glucosa es 180).

B1) ¿Qué estructura química tiene el almidón?

B2) ¿A que se debe la coloración observada en los tubos 5 y 6?

B3) ¿Cómo explicaría los cambios observados al calentar y enfriar el tubo 5?

B4) ¿A que se deben los cambios observados entre los tubos 1 y 2?

PRÁCTICA 4.DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA Y DE OTROS

PARÁMETROS EN SANGRE.

INTRODUCCIÓN

A. DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA.El fosfato de creatina es un compuesto que actúa como almacén de alta energía fácilmente

convertible en ATP, en músculo y otros tejidos de mamíferos.

La creatina se sintetiza en hígado y páncreas. Desde estos órganos, a través del aparato circulatorio,

se transporta hacia diferentes tejidos, donde puede fosforilarse. El contenido de creatina y fosfocreatina

alcanza los 400 mg por 100g de músculo. Ambos componentes pueden convertirse espontáneamente en

creatinina, que es eliminada por el riñón.

Cada día, y de forma constante, un 2% de la creatina muscular se convierte en creatinina. A

continuación pasa a la sangre y, posteriormente, a la orina. En condiciones normales, sus niveles plasmáticos

y en orina dependen de la masa muscular, por lo que su producción varía según el sexo y edad del individuo.

Los valores normales de creatinina en plasma son 0.5-1.3 mg/ml para hombres y 0.4-1.0 mg/ml para

mujeres.

Las determinaciones de creatinina en orina y en plasma se utilizan para calcular el aclaramiento de

creatinina (clearance), prueba utilizada para estimar el filtrado glomerular y, por tanto, para valorar la

función renal. Se han propuesto distintas fórmulas o expresiones para el cálculo del aclaramiento, como la

de Cockcroft-Gault o la de Jelliffe.

Aunque se han descrito otros procedimientos más específicos para determinar creatinina en plasma u

orina, el método más rápido es el basado en la reacción de Jaffé, que consiste en la formación de un

complejo con coloración amarillo-naranja por reacción con el picrato en medio alcalino.

En la presente práctica se va a proceder la determinación de la concentración de creatinina en una

orina problema, sometiendo diversas muestra de la misma a la reacción de Jaffé. A continuación se

procederá a la medida de absorbancia en el colorímetro. Finalmente, se calculará la concentración de la

creatinina en la orina problema utilizando una recta de calibrado obtenida con anterioridad.

MATERIAL Y REACTIVOS

Colorímetro Micropipeta de 1000 µlNaOH 1,4 M Tubos de ensayo y gradillaClH 25 mM Ácido pícrico 14 mM

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Rotule cuatro tubos y adicione los siguientes reactivos (mililitros) en el orden establecido, siguiendo

las indicaciones pertinentes.

REACTIVO / nº tubo 1 2 3 4HCl 25 mM 1,6 0,8 0,4 --

Orina problema -- 0,8 1,2 1,6

Ácido Pícrico 14 mM 2,6 2,6 2,6 2,6

NaOH 1,4 M (AGITAR) 0,8 0,8 0,8 0,8

AGITE todos los tubos y espere 15 minutos. Mida la absorbancia en el colorímetro a una longitud

de onda de 500 nm. Utilice el tubo nº 1, exento de creatinina, para ajustar el cero de absorbancia.

A continuación, y haciendo uso de la recta de calibrado siguiente, calcule la concentración de

creatinina en la orina problema.

Recta de calibrado: Absorbancia500 = 0,626 x (miligramos de creatinina)

CUESTIONES

A1) ¿Cuál es la concentración de creatinina en la orina problema?

A2) Encuentre una fórmula para calcular el aclaramiento de creatinina en función de la concentración de

creatinina en orina y en sangre y del volumen de diuresis. ¿Cuáles son los valores normales del

aclaramiento?

A3) ¿Por qué se debe incluir el valor de la superficie corporal en la fórmula?

A4) ¿Cuál es el valor medio de la superficie corporal humana?

A5) Encuentre una fórmula para calcular la superficie corporal en función del peso y la altura.

A6) Encuentre la fórmula de Cockcroft-Gault para el cálculo del aclaramiento de creatinina. ¿Qué ventaja

posee frente a otras expresiones para el cálculo del aclaramiento?

A7) ¿Qué relación existe entre el filtrado glomerular y el valor la concentración de creatinina en sangre?

B. DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE HEMATOCRITO.

El hematocrito representa la proporción de glóbulos rojos a sangre entera, y se expresa en

volúmenes por ciento. Su medida se realiza por centrifugación de la sangre heparinizada o tratada con algún

otro inhibidor de la coagulación, calculando el % que alcanza la masa globular.

Normalmente, en el adulto oscila del 36-50 %, con un valor medio de 46 para varones y 40 para

mujeres. En neonatos, los valores normales son más altos, sobre el 56%, pero la cifra decrece

progresivamente en el primer mes hasta alcanzar un mínimo próximo al 35% y ascender de nuevo

lentamente.

Aproximadamente, el hematocrito multiplicado por 100.000 nos indica el número de eritrocitos por

milímetro cúbico. Ello es debido a la poca contribución que los glóbulos blancos y plaquetas tienen sobre el

volumen celular de la sangre.

MATERIAL Y REACTIVOS

Centrífuga de hematocrito Sangre enteraCapilares heparinizados de 1.8 mm de diámetro máximo y longitud no superior a 75 mm. En caso de no estar heparinizados, deben ser previamente tratados con una disolución al 3.8% de citrato sódico en agua, bañando su superficie interna y secándolos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

Todas las personas que manejen sangre deben conocer las denominadas PRECAUCIONES

UNIVERSALES EN EL MANEJO DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES, que establecen que toda muestra de

sangre o fluido corporal debe ser considerada como potencialmente infecciosa. Por ello, se deben

adoptar las medidas adecuadas para evitar cualquier posible contagio. El alumno de Ciencias de la Salud

está obligado a conocerlas (consúltense en las normativas, manuales o sitios pertinentes) y a ponerlas en

práctica de manera inexcusable. Entre ellas, es fundamental la utilización obligatoria de guantes y la

evitación del contacto de la sangre o fluidos con heridas, ojos y mucosas.

1. Introducir la sangre en el tubo capilar por capilaridad, sumergiendo éste, con un cierto ángulo

respecto a la vertical, en una gota de sangre por uno de sus extremos. Mantener el otro extremo abierto. No

llenar el capilar menos de 40 mm ni más de 70 mm.

2. Tapar el extremo del tubo capilar con plastilina u otro tipo de cera extendida sobre una lámina.

Para ello, tapone con el dedo el extremo superior del capilar y apriételo en forma vertical sobre dicha

lámina, con cuidado de no romperlo.

3. Sitúe el capilar en una hendidura del rotor de la centrifuga de hematocrito, con el extremo tapado

con plastilina hacia la parte exterior.

4. Centrifugue durante 3 minutos y lea el volumen de hematocrito mediante el empleo de la plantilla

excéntrica correspondiente, ajustando el cero en el inicio de la sangre y el 100 en el menisco superior del

plasma.

CUESTIONESB1) Exprese el resultado obtenido para el volumen de hematocrito, e indique si se trata de un valor normal o,

por el contrario, es indicativo de anemia o de poliglobulia.

B2) ¿De qué factores depende el valor del volumen de hematocrito?

B3) ¿Cómo calcularía el volumen corpuscular medio (VCM) de los eritrocitos? ¿Cómo clasificaría las

anemias en función del VCM? ¿Y en función del contenido en hemoglobina?

B4) Explique la diferencia existente entre los términos sangre entera, plasma y suero.

B5) Si la sangre está tratada con heparina, razone qué obtendría en el sobrenadante y en el sedimento, tras

centrifugarla.

B6) ¿Para qué se utiliza la heparina? Explique su mecanismo de acción.

B7) ¿Qué puede significar la obtención de un plasma de color rojizo?

DETERMINACIÓN AUTOMATIZADA DE PARÁMETROS CLÍNICOS. C. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SANGRE.

En humanos, el ácido úrico es el producto final del catabolismo de las purinas (adenina y guanina).

La producción diaria de ácido úrico procedente del catabolismo de productos endógenos es,

aproximadamente, 400 mg por día; el procedente de la dieta supone unos 300 mg diarios. El ácido úrico es

un ácido débil cuyo pKa es 5,75. Por tanto, en el medio fisiológico se encuentra en forma de urato. Los

valores normales de referencia oscilan entre 3-7 mg/dl en hombres y 2-6 mg/dl en mujeres.

La causa más común de hiperuricemia es la disminución de la excreción de urato, fundamentalmente

de origen renal. Aparece hiperuricemia en enfermedades neoplásicas de la sangre (leucemias), en el

alcoholismo, tras llevar a cabo ejercicio físico intenso o en el caso de deshidratación o tratamiento con

diuréticos. Se ha descrito la existencia de hipouricemia, entre otras situaciones, durante las primeras 28

semanas de gestación, lo que explicaría tal vez la mejora de la gota (síndrome que se caracteriza por

hiperuricemia) durante el embarazo.

La gota es un síndrome que se caracteriza por hiperuricemia, artritis aguda y, en algunos casos,

depósitos tisulares de urato sódico, que se da en un grupo heterogéneo de enfermedades. La crisis aguda de

gota se inicia por la respuesta inflamatoria a los cristales de urato monosódico.

La determinación analítica de ácido úrico se lleva a cabo habitualmente utilizando dos enzimas

acopladas: uricasa (urato oxidasa) y peroxidasa, según la secuencia de reacciones expresada a continuación:

Ácido úrico + O2 + 2H2O ---- (uricasa) → alantoína + H2O2 + CO2

H2O2 + indicador reducido ----(peroxidasa) → indicador oxidado + H2 O

En esta práctica vamos a utilizar un sistema de química seca, útil para la medida de ácido úrico y otros

parámetros, tales como hemoglobina, glucosa, colesterol, glucosa, creatinina, urea, triglicéridos, GPT, GOT,

etc. El aparato de medida consiste en un fotómetro de reflexión. El fundamento de la medida se basa en la

reflexión de luz sobre una tira portarreactivos que contiene un sustrato cromógeno. Dicha tira portarreactiva

dispone de una banda magnética que contiene todas las informaciones específicas del método, necesarias

para la ejecución y calibración del aparato de forma totalmente automatizada. Sólo se necesitan 32 µl de

sangre y el tiempo de medida es de 3 minutos.

MATERIAL Y REACTIVOS-Tiras portarreactivos-Instrumento medidor Reflotrón-Papel científico-Pipeta Reflotrón de 32 µl

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

(Este apartado de la práctica lo realizará el profesor a modo de demostración)

1. Conecte el aparato y ponga el interruptor en la posición I (parte trasera).

2. Déjelo que se caliente hasta que en la pantalla aparezca el mensaje “LISTO”. Si no va a ser utilizado

durante algún tiempo, puede pulsar la tecla “Stand-by”, situada en la parte inferior derecha de la pantalla.

(Al mismo tiempo que sigue este protocolo, la lectura de las hojas informativas para cada test, que se

incluyen en este cuadernillo como apéndice, pueden facilitarle el proceso).

3. Tome una tira portarreactivos correspondiente al parámetro que pretende determinar. Cierre

inmediatamente el tubo. No toque la zona gris.

4. Retire la hoja protectora de la tira portarreactiva, evitando doblar la tira.

5. Introduzca la tira cuidadosamente en la ranura para los portarreactivos, situada debajo de la cámara de

medición.

6. Utilice la pipeta de volumen fijo para aspirar sangre (bien de la muestra proporcionada o bien por punción

en el dedo de algún voluntario -en este caso consulte con el profesor-)

7. Coloque la muestra como gota en el centro del campo de aplicación (rojo) provisto de una malla, evitando

tocar éste con la punta de la pipeta.

8. Antes de que transcurran 15 segundos, introduzca la tira horizontalmente en la ranura de la cámara de

medición. Cierre la tapa.

9. En la pantalla aparece la confirmación de la medida que estamos realizando (UA), Asimismo aparece el

tiempo necesario hasta que disponible el resultado. Tome nota de la lectura.

10. Abra la cámara de medición y retire la tira. Observe que el color debe haberse desarrollado en toda la

zona del test, presente en la tira.

11. Descarte la tira.

CUESTIONES

C1) Los valores normales de urato en sangre son muy cercanos al límite de solubilidad de dicho compuesto,

por lo que un ligero aumento de la cantidad de urato en sangre puede conducir a síndromes gotosos. ¿Por qué

los niveles de urato son tan altos?

C2) ¿Conoce algún tipo de ser vivo en el que el producto final del metabolismo de las purinas sea la

alantoína? ¿Por qué en el ser humano es el urato y no la alantoína?

C3) ¿Cuál es la enzima responsable de la última etapa en la vía de formación del ácido úrico?

C4) El alopurinol suele ser utilizado para el tratamiento de la gota. ¿Por qué se utiliza? ¿Cuál es su modo de

actuación?

D. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE.

La determinación de la glucemia es una prueba frecuentemente utilizada en Bioquímica Clínica. La

concentración normal de glucosa en sangre para un individuo en ayunas oscila entre 80 y 120 mg/100ml.

Después de una comida que contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en unas dos horas a

los niveles basales. Si el ayuno es prolongado el nivel de glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50-60

mg/100 ml; la razón fundamental es que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa.

Aunque el número de métodos utilizados históricamente para la determinación de glucosa es

abundante, la mayoría son ya una mera anécdota. En cualquier caso, si los agrupamos según el tipo de

reacción química que se lleva a cabo, podemos distinguir tres grandes grupos:

1. Métodos basados en el poder reductor de la glucosa sobre un agente oxidante, generalmente

una sal de cobre o hierro. Han sido utilizados los métodos clásicos de Folin-Wu, Hagedorn y Jensen entre

otros, hoy día en desuso.

2. Métodos de determinación de furfural. Más específicos que los de reducción, se basan en el

comportamiento de las hexosas y pentosas en medio muy ácido, donde forman furfural. A partir de glucosa

se obtiene hidroxi-metil furfural, que puede detectarse colorimétricamente utilizando diversos métodos. El

más utilizado es el de la o-toluidina.

3. Métodos enzimáticos. Son los más utilizados en la actualidad. Entre ellos destacan:

a) Método de la glucosa-oxidasa y peroxidasa acopladas . Se mide colorimétricamente la formación

de un aceptor de oxígeno cromogénico como el ABTS.

b) Método de la glucosa deshidrogenasa , en el que se sigue colorimétricamente la formación de

NADH.

c) Método de la hexoquinasa . Utiliza esta enzima acoplada a la deshidrogenasa de la glucosa -6-P,

con la formación concomitante de NADH y su medida colorimétrica a 340 nm.

La determinación de glucosa en esta práctica se lleva a cabo por el método enzimático de la glucosa

oxidasa y peroxidasa acopladas.

Glucosa + O2 ----- (Glucosa oxidasa) → δ-D-gluconolactona + H2O2

H2O2 + indicador reducido -----(peroxidasa) → indicador oxidado + H2O

CUESTIONES

D1) ¿Qué problema puede conllevar el uso de los métodos basados en la medida del poder reductor de la

glucosa?

D2) ¿Y los basados en la formación de furfural?

D3) ¿Cuál es la ventaja fundamental de los métodos enzimáticos para medir la concentración de glucosa en

sangre?

D4) ¿En qué consiste las prueba de tolerancia oral a la glucosa?

■ Información sobre los métodos de determinación de Glucosa y Ácido Úrico.