Biomarcadores y su utilidad en laevaluación de la biodegradación del petróleo

J.E. OrtizDr. Ingeniero de MinasM.J. GarcíaIngeniero de MinasLaboratorio de EstratigrafíaBiomolecularE.T.S.I. de Minas de Madrid

J.L. Rodríguez GallegoIngeniero de MinasDpto. Explotación de Minas-MetalogeniaE.T.S.I. de Minas de Oviedo

N N

CH 3

C2H5

CH

H3C

Mg

NNH3C

H

H CH 2

CH 2

CO O

CH 2

CH 3

OCO O CH 3

N N

X

X

X

X

M

NN

X

X

X

XX

N N

X

X

X

X

M

NN

X

X

X

Diagénesis

Clorofila-a

Figura 1. Esquemade la degradaciónde la clorofila-a,que puede derivarmediante procesosdiagenéticos apristano (vía de laizquierda) o fitano(vía de laderecha).

ducirse (mediante hidrogena-ción), lo que resulta en la for-mación de hidrocarburos alifáti-cos (esteranos, hopanos…), o aaromatizarse.

Los biomarcadores son muyimportantes dado que, en ge-neral, pueden proporcionarinformación acerca de: fuen-tes biológicas de materia or-gánica sedimentaria, mediosdeposicionales, madurez de lamateria orgánica, edad geo-lógica… Estos compuestos sontan sólo constituyentes traza,pero pueden ser muy útiles,especialmente en el caso delos petróleos: se emplean unagran cantidad de tipos estruc-turales en la geoquímica delpetróleo y, lo que es más im-portante en el tema que nosocupa, también se ha demos-trado su gran utilidad en laevaluación de la efectividad

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El empleo de biomarcadoreses útil en el estudio de la evo-lución de la degradación delpetróleo cuando se empleanmicroorganismos. En funciónde la resistencia a la degrada-ción, existen biomarcadoresque sirven para evaluar me-jor la eficacia de la biorreme-diación en las primeras eta-pas, como es el caso de los hi-drocarburos alifáticos, mien-tras que otros, como los hi-drocarburos aromáticos o loshopanos, permiten determi-nar la degradación a más lar-go plazo.

Biomarkers are usefulcompounds for the deter-mination of the oil degra-dation when microorga-nisms are used. There aresome biomarkers such asthe aliphatic hydrocarbonswhich are used to evalua-te the bioremediation inthe first stages after an oilspill, while others, aroma-tic hydrocarbons or hopa-nes, are used to determinethe contamination at lon-ger stages.

Introducción

Los biomarcadores presentanuna gran utilidad en el estudiode la eficiencia de la biorreme-diación. Se conoce como bio-marcadores a aquellos com-puestos que pueden ligarse deforma inequívoca con sus pre-cursores biológicos y cuyo es-queleto de carbonos base sepreserva de tal forma que es re-conocible a pesar de la diagé-nesis y de gran parte de la cata-génesis. Muchos biomarcadorestienen inicialmente grupos fun-cionales que contienen oxígeno(dado que muchos de ellos de-rivan de los lípidos de los orga-nismos) y se ven sometidos almismo proceso de pérdida degrupos funcionales que el restode la materia orgánica. Por lotanto, los productos diagenéti-cos son generalmente hidrocar-buros, aunque pueden sobrevi-

vir a la diagénesis pequeñascantidades de compuestos congrupos funcionales, como losácidos grasos. Al mismo tiem-po, los compuestos no satura-dos (aquellos que contienendoble enlace C=C) tienden a re-

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tidos de petróleo como se ex-pondrá a continuación.

Aplicación de losbiomarcadores a labiorremediación

El estudio de biomarcadorespermite obtener informaciónsobre el rendimiento de losdistintos métodos de degra-dación de los residuos del pe-tróleo, principalmente losque se refieren el empleo demicroorganismos. Asimismose puede evaluar la eficaciadel uso de diferentes fertili-zantes o catalizadores que in-tervienen en la proliferaciónde las bacterias y, en conse-cuencia, en la degradación delos productos del petróleo.

Los biomarcadores son molé-culas que retienen el esquele-to básico hidrocarbonado delos compuestos biológicos através de los procesos de ma-duración. La mejor opción pa-ra el control van a ser algu-nos tipos de biomarcadores,en especial aquellos cuya de-gradación biológica es muylenta o directamente no va atener lugar. En concreto, loscompuestos que se utilicendeberían ser referencias queno se originen en el crudo nien ningún derivado en proce-sos de envejecimiento o bio-degradación. Además, seacual fuere el tipo de analíticautilizada se debe demostrarque la eficiencia en la extrac-ción del biomarcador es lamisma que para el resto delos compuestos (Riser-Ro-berts, 1998).

Además, en la aplicación delas técnicas de biorremedia-ción es de vital importancia laselección de compuestos quedentro de la mezcla complejadel petróleo no sean biode-gradables. Este hecho seráaprovechado para conseguirreferencias que permitan me-dir si la degradación que tie-ne lugar es biológica o no y,si es así, qué microorganismos

y de qué manera están degra-dando los contaminantes ycuáles no. Como criterio gene-ral, partiremos de que la pro-porción entre compuestosbiodegradables y no biode-gradables en una mezcla decontaminantes disminuye sihay biodegradación.

Entre los hidrocarburos delpetróleo es fácil encontrarcantidades relativamente pe-queñas de biomarcadores(usualmente por debajo del1% en peso) de origen lipídi-co. Al final de la diagénesissus precursores son transfor-mados en hidrocarburos que,después de la catagénesis, to-davía permiten fijar los pre-cursores específicos.

Cualquier programa de ensa-yo sobre biorrecuperaciónque implique la desapariciónde residuos de petróleo o dehidrocarburos, presentará di-ficultades analíticas. Ello esdebido a que existen otrosprocesos que implican la desa-parición de residuos de petró-leo o de hidrocarburos medi-dos mediante cromatografíade gases, que pueden afectaro contribuir a la desapariciónde los residuos. Para hacerfrente a estos problemas, sesupone que la desaparición dealgunos grupos de hidrocar-buros se puede utilizar comoindicador definitivo de la bio-degradación. Los indicadoresde la biodegradación estaríanasociados a cambios sustancia-les en la composición de va-rias fracciones del petróleo,

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Figura 2.Cambios en

las relacionesn-C18/fitanoen playas deguijarros de

Alaska.Modificadode Pritchard

(1997).

especialmente los hidrocarbu-ros aromáticos. También sesupone una correlación entrelos cambios en la composiciónde los hidrocarburos y loscambios de peso residual delpetróleo, para poder calculartasas de desaparición de lospesos residuales como primerindicativo cuantitativo delefecto del fertilizante y, enconsecuencia, de la eficaciade la limpieza durante perío-dos de tiempo más largos.

Existen varios parámetros quese pueden emplear para de-terminar el grado de biode-gradación. En primer lugar, sepuede usar la concentraciónde hidrocarburos alifáticos,aunque presenta algunas des-ventajas, ya que constituyenla fracción más fácil de degra-dar, son los menos tóxicos ysuponen solamente un pe-queño porcentaje en peso delpetróleo. También se puedendeterminar los cambios pro-ducidos por los organismos yfertilizantes en la fracciónaromática, que es más resis-tente a la degradación y mástóxica. Por último, otro méto-do eficaz para estimar la efi-cacia de la biorremediaciónse basa en la separación delas distintas fracciones del pe-tróleo: alifática, aromática,heterocíclica, polar y asfálti-ca, y determinar la disminu-ción del peso de cada una(Jobson et al., 1972).

No obstante, todos estos índi-ces se verán afectados en ma-yor o menor medida por los

et al., 1992). Por lo tanto, es-tudiando la evolución en eltiempo del ratio n-C18/fitano,se puede estimar el grado debiorrecuperación de una zonaafectada por un vertido depetróleo (figura 2).

Su utilización solamente esválida al comienzo del trata-miento; si se analizan cuandoel proceso ha avanzado mu-cho, pueden subestimar labiodegradación. Concreta-mente, durante la remedia-ción del vertido del ExxonValdez, el pristano y el fitanose degradaron rápidamente ysólo pudieron utilizarse comobiomarcadores adecuados enlas primeras semanas (Bragget al., 1994).

Biodegradación del Fitano

En la utilización de los bio-marcadores influyen tambiénlas condiciones locales de ca-da zona. De hecho, en ciertascostas, como en la de PrinceWilliam Sound de Alaska, sedesarrollan bacterias con grancapacidad de degradar alca-nos ramificados como el fita-no, por lo que el estudio de laevolución del ratio n-C18/fita-no no es útil como indicadorde biorremediación. Es más,en el vertido del Exxon Valdezse observó en algunas zonasde Alaska una degradación si-milar de fitano y de n-C18(Pritchard, 1997). En estos ca-sos, el contenido total defitano por sí solo se puede em-plear como marcador biológi-

otros procesos, ya citados quepuedan contribuir a la desa-parición de los hidrocarburos.Es aquí cuando entra el usode los biomarcadores, en con-creto de aquellos que no sonbiodegradables, como formade evaluar qué parte desapa-rece por biodegradación ycuál por otros procesos dife-rentes. A continuación se ex-pondrán los diversos biomar-cadores que se emplean enlos estudios de degradacióndel petróleo.

Ratio de n-alcanosnormales respecto a n-alcanos ramificados

Este ratio se determina calcu-lando la relación del peso en-tre un hidrocarburo de biode-gradación fácil, principalmen-te los n-alcanos de 17 y 18átomos de carbono (n-C17 yn-C18), y un hidrocarburoque se biodegrada más lenta-mente, generalmente hidro-carburos ramificados como elpristano (Pr) y fitano (Ph). Es-tos dos últimos compuestosson isoprenoides que derivande la degradación de la cloro-fila-a (Figura 1), generalmen-te mediante oxidación y re-ducción, respectivamente.

Se seleccionan el pristano y elfitano para realizar las com-paraciones debido a que sonlos isoprenoides más abun-dantes en el petróleo. Se em-plean, por tanto, las relacio-nes n-C17/pristano o n-C18/fi-tano, aunque es preferibleemplear la última, ya que, enocasiones, el agua del marpresenta pristano de formanatural. La base del estudiose basa en que, por un lado,la mayor parte de los proce-sos (meteorización física, lixi-viación, etc) no producen pér-didas acusadas de hidrocar-buros ramificados y alifáticosy, por otro, los alcanos ramifi-cados se biodegradan a dis-tinta velocidad que los alca-nos lineales, que en generales más rápida en los primeros(Prinik, et al., 1977; Mueller

co interno al igual que el deln-C18 (figura 3).

Cambios en la composiciónde hidrocarburosaromáticos

Para poder determinar de for-ma absoluta la efectividad dela biorrecuperación, no es sufi-ciente únicamente con el estu-dio de la biodegradación de lafracción alifática. Se debe tam-bién estudiar el comporta-miento y evolución de la frac-ción aromática, ya que es lamás complicada de degradar(Kennicutt, 1988; Rowlandet al., 1986) debido a que pre-senta una baja solubilidad. Es-to es importante no sólo por-que permite evaluar la capaci-dad de recuperación de unazona, sino porque algunos hi-drocarburos policíclicos aromá-ticos (PAHs) son altamente tó-xicos y potencialmente cancerí-genos bajo ciertas condiciones.

Para evaluar la capacidad dedegradación, se suelen emplearcompuestos de forma indivi-dual y familias de PAHs (nafta-lenos, fenantrenos, crisenos,etc). Asimismo, se puede de-terminar la eficiencia de losmicroorganismos en una zonasometida a biodegradación delpetróleo, mediante el estudiode la evolución de la abundan-cia de la suma total de PAHscon el tiempo (Figura 4).

Generalmente, el estudio serealiza comparando la propor-ción de los diferentes hidrocar-

Figura 3. Cambiosen la concentración

de fitano y n-C18(expresado como

cambio porcentualen relación a la

concentraciónmedia a t=0) en las

muestras de petróleoen arena y grava de

las playas tratadasen Sung Harbour

(Alaska).Modificado de

Pritchard (1997).

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En el caso del vertido del Ex-xon Valdez, se observó un au-mento de más del doble en lavelocidad de desaparición delpetróleo residual sobre loscantos al añadir un fertilizan-te (tabla I).

Hopanos

Derivan del acoplamiento deseis unidades de isopreno.Son abundantes en sedimen-tos y en el petróleo, si loscomparamos con otros bio-marcadores. Proceden de pre-cursores con grupos funciona-les (biohopanoides) presentesen las bacterias. Los hopanoi-des (bacteriohopanotetroles)están presentes en las mem-branas de numerosos organis-mos procariotas, tanto aero-bios como anaerobios, y sufunción parece ser la de me-jorar la estabilidad de las pa-redes celulares. En este senti-do, no sólo su función, sinosu estructura está muy rela-cionada con la de los estero-les (el más conocido de estoses el colesterol) en organis-mos eucariotas (Madigan etal., 2000). Los grupos funcio-nales se pierden durante ladiagénesis aunque, en gene-ral son resistentes a la degra-dación. Además de a los ho-

buros aromáticos con el conte-nido del hopano C30-17a(H),21b(H), ya que es sumamenteresistente al ataque biológicoy, por consiguiente, proporcio-na un estándar constante paranormalizar el contenido en hi-drocarburos aromáticos. Másadelante se realiza una des-cripción más detallada de loshopanos y de su empleo en labiorremediación.

Cambio de composición ycambio en el peso residual

En principio se podría pensarque la rápida reducción en larelación n-C18/fitano no vaacompañada de un cambioimportante en el peso resi-dual del petróleo. Sin embar-go, diversos estudios han con-firmado que cuando comien-za la degradación de la frac-ción alifática, se inicia tam-bién la descomposición deotras fracciones del petróleo,aunque a velocidades dife-rentes. Existe, por lo general,una correlación entre las va-riaciones del ratio n-C18/fita-no y del peso residual, con eltiempo de actuación de losorganismos.

Con este estudio comparati-vo y a partir de la ecuaciónde la recta resultante, se pue-de determinar la vida mediade permanencia del petróleoen la costa, es decir, la tasade descomposición del mis-mo y los días que tardará endesaparecer.

panos, los productos diagené-ticos de los biohopanoides in-cluyen a los hopanoles, ácidoshopanoicos y hopenos.

Entre todos los hopanos, elC30-17α(H), 21β(H)-hopano esun buen biomarcador, por-que tiene baja solubilidad ymuy baja volatilidad, con loque no sólo la biodegrada-ción, sino también la disolu-ción o la evaporación sonprácticamente descartables.

Para calcular la eficiencia dela biodegradación del petró-leo a partir de los hopanos sepuede utilizar la siguienteecuación (Douglas et al.,1994):

Donde Ho es la concentra-ción del hopano C30-17α(H),21β(H) en el petróleo origina-riamente y Hs es la concentra-ción del hopano C30-17α(H),21β(H) en la muestra despuésde haber sido sometida a bio-degradación.

Pese a todo, algunos autores(Sasaki et al., 1998; Pollardet al., 1999) ponen en duda suutilización por varios motivos:

• En algunos crudos pesadossu presencia es muy limita-da, con lo que el error analí-tico podría ser muy grande.

• Parece que existe algunaevidencia de su degrada-ción en arenas asfálticas.

Las alternativas existentes noson muchas, ya que los mis-mos problemas se puedenaducir si se usa algún otrocompuesto del petróleo, obien metales pesados seleccio-nados de entre los más abun-dantes (vanadio o níquel).

Figura 4. Contenidototal de PAHs endistintas áreassometidas a laacción de lasmareas en PrinceWilliam Sound(Alaska) después dehaber sidosometidas adegradaciónbiológica.Modificado deBoehm et al.(1995).

Playa Pendiente Vida media Tiempo para eliminar el 90%del residuo T (días)

Tratada -0.016 44 146No tratada -0.006 124 411

Tabla I. Análisisde las tasas dedescomposiciónen playas deSnug Harbor(Alaska).Modificado dePritchard(1997).

% petróleo degradado = (1- Ho/Hs) x 100

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ción, existen biomarcadoresque sirven para evaluar mejorla eficacia de la biorremedia-ción en las primeras etapas,como es el caso de los hidro-carburos alifáticos, mientrasque hay otros, como los hi-drocarburos aromáticos o loshopanos, que permiten deter-minar la degradación a máslargo plazo y la recuperaciónde las zonas contaminadas.

Referencias

Boehm, P.D.; Page, D.S.;Gilfillan, E.S.; Stubble-field, W.A. y Harner, E.J.(1995). Shoreline ecologyprogram for Prince Williamsound, Alaska, followingthe Exxon Valdez oil spill:Parts 2-Chemistry and toxi-cology. En: Exxon Valdez OilSpill; Fate and Effects inAlaskan Waters (Wells, P.G.,Butler, J.N., Hughes, J.S.,Eds.). American Society ofTesting and Materials Spe-cial publication, pp 347-397.

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Jobson, A.M.; Cook, F.D. yWestlake, D.W.S. (1972).Microbial utilization of cru-de oil. Applied Microbio-logy 23: 1082-1089.

Otros biomarcadores

Como alternativa a los com-puestos ya señalados, se po-dría elaborar una lista deotros posibles biomarcadoresque se podrían utilizar paracuantificar la biodegradacióndel petróleo:

• Esteranos: Son compuestoscon una estructura similar ala de los hopanos (cuatroanillos frente a cinco). Elmás conocido entre ellos esel colestano cuyo precursores el colesterol de los orga-nismos eucariotas.

• Esteroides: También con es-tructura similar a los hopa-nos, pero con anillos bencé-nicos en ella. Son, por tanto,hidrocarburos aromáticos.

• Porfirinas: Son un grupo ex-tremadamente complejo decompuestos tetrapirrólicos.Se originan en el mismo pro-ceso diagenético (precursor:clorofila) en el que se forma-ban pristano y fitano.

• Metales: Por diversos moti-vos (Sasaki et al., 1998) seha propuesto el vanadio co-mo marcador interno de labiodegradación.

Existen otros biomarcadores,entre los cuales se encuen-tran: compuestos con NSO,tales como porfirinas, carba-zoles, fenoles, ácidos carboxí-licos y compuestos del azufre.

Conclusiones

En este artículo se pone demanifiesto la utilidad de losbiomarcadores en el estudiode la evolución de la degrada-ción del petróleo cuando seemplean microorganismos.Generalmente, en función dela resistencia a la degrada-

Kennicutt, M.V. (1988). Theeffect of biodegradation oncrude oil bulk and molecu-lar composition. ChemicalPollutans 4: 89-112.

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Figura 5.Representaciónhabitual delhopano C30-17a(H), 21b(H) ysu verdaderaestructuratridimensional.