Cultivos celulares

Índice1. Introducción.

1.1. Definición.1.2. Historia.

2. Tipos de cultivos celulares.3. Medios de cultivo.4. Dificultades de la implantación de cultivos en un organismo vivo5. Rutinas en el trabajo con cultivos celulares.6. Técnicas.7. Equipos.8. Aplicaciones.9. Ventajas y desventajas.

1. Introducción

DefiniciónEs un modelo de estudio in vitro realizado con unas técnicas que permiten mantener al máximo las propiedades fisiológicas bioquímicas genéticas

Historia El primer investigador fue Wilhelm Roux que cultivó células de embrión de pollo en solución salina durante días. Demostrando que las células embrionarias podían sobrevivir sin requerir la presencia de un organismo. Tenían una limitación inicial: Los cultivos no tenían medios nutritivos adecuados para la propagación celular. M. Burrows descubrió que el plasma era un nutriente esencial en los medios de cultivo, óptimos para la propagación de células.

Historia Originario del siglo XIX: Para el estudio de las variaciones/comportamiento de las células animales libres ocurridas dentro del organismo y bajo el estrés de un experimento. En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio, una amplia gama de células procedentes de diferentes

tejidos organismos

2. Tipos de cultivos

celulares

Tipos -Cultivo de órganos -Explantes primarios -Cultivo celular primario -Cultivos histotípicos y organotípicos

Cultivo de órganosColocamos el órgano rejilla en interfase líquido-gaseoso que permite obtener nutrientes y liberar desechos. Mantener la estructura característica del tejido in vivo Diferenciación de tipos celulares Inconveniente: Proliferación celular limitada Se necesita nuevo explante para cada experimento Difícil cuantificación y la cantidad de material que se puede cultivar es reducida

Explantes primariosColocamos un fragmento de tejido/órgano interfase sólido-líquido en soporte de vidrio/plástico. Se adhieren a la superficie En la periferia pueden migrar y proliferar Útil en pequeñas cantidades de tejido. Ej.- biopsias de piel

Cultivo celular primario Es el más utilizado Explantes primarios Se obtiene a partir de Suspensiones de células disgregadas Se pierden las uniones celulares Las células son capaces de proliferar notablemente Cuando ocupan toda la superficie, se inhibe la proliferación Cultivos en suspensión Hay dos tipos de cultivo celular primario Cultivos en monocapa

Cultivo celular primario: CULTIVOS EN SUSPENSIÓN

Las células crecen en suspensión en el medio de cultivo1. Recolectar en un tubo2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación3. Lavar con suero fisiológico antes de la extracción y

purificación

Cultivo celular primario: CULTIVOS EN MONOCAPA

Las células crecen en monocapa adherida a la pared del frasco de cultivo. Podemos utilizar el propio frasco para continuar el proceso de extracción. Podemos pasar la monocapa a un tubo.

Cultivos histotípicos y organotípicos Cultivos histotípicos Único tipo celular elevada densidad celular Crean una estructura tridimensional parecida al tejido original Cultivos organotípicos Varios tipos celulares muy parecidos a los original Base de la ingeniería de tejidos

Objetivo final: Crear tejidos “in vitro” completamente funcionales que pueden utilizarse en injertos o trasplantes.

3. Medios de cultivo

Medios de cultivoMedios de cultivo Condiciones necesarias para el desarrollo de organismos

Demostrar ciertas características bioquímicas de los microorganismos

NutrientesFactores de crecimientoOtros componentes

Composición de los medios de cultivo● Peptonas

○ Se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales.○ Ricas en péptidos y aa.

● Extractos, los más habituales son:○ Extracto de carne.○ Extracto de levadura.

● Fluidos corporales ○ Los más utilizados son la sangre y el plasma.○ Contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos

microorganismos. ● Los Sistemas Amortiguadores se utilizan para mantener el pH del medio. Se usan sobre

todo fosfatos disódicos y dipotásicos.

Composición de los medios de cultivo II ● Indicadores de pH: se añaden con frecuencia a los medios de cultivo para:

○ Poner de manifiesto ciertas propiedades bioquímicas.○ Comprobar si el microorganismos es capaz de utilizar ciertas sustancias.

● Agentes reductores (cisteína, tioglicolato y otros): Se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de microorganismos anaerobios.

● Agentes selectivos (cristal violeta, sales biliares, determinados antibióticos…): se usan para convertir al medio selectivo a determinados microorganismos.

● Si el medio es sólido, ágar: agente gelificante, polisacárido que se obtiene de las algas marinas.

4. Dificultades en la implantación de cultivos en un organismo vivo

● Proliferación ● Diferenciarse en los tipos celulares deseados ● Sobrevivir en el receptor tras el implante ● Integrarse en el tejido circundante ● Funcionar apropiadamente durante toda la

vida del receptor ● No producir daño al receptor

Dificultades en la implantación de cultivos en un organismo vivo

5. Rutinas en el trabajo con cultivos celulares

Puntos a tener en cuenta en cultivos celulares● No mezclar nunca dos cultivos diferentes. ● No tener mucho tiempo fuera de estufa los cultivos.● No invadir campos. ● Tapar rápidamente los frascos. ● Agitación del cultivo sembrado de dcha/izq y de arriba/abajo. Nunca agitar en

círculo.● Para transferir las células un pequeño número de estas a un nuevo

recipienteCultivarse más tiempo Si se transfiere habitualmente se evita que envejezcan (situaciones prolongadas de alta densidad celular)○ Cultivos adherentes (despegar y pasar)○ Cultivos en suspensión (tomar unas pocas y resuspender en medio fresco)

Puntos a tener en cuenta en cultivos celulares II

● Las células están en continua división durante el cultivo, crecen hasta ocupar todo el área disponible. Esto puede generar varios problemas: ○ Agotamiento de los nutrientes del medio○ Acumulación de células apoptóticas y/o

necróticas ○ Inhibición de la división celular por contacto

Evitarlo cambiar este medio:● Cultivos en

suspensión (centrifugación)

● Cultivos adherentes (aspiración)

6. Técnicas

TécnicasLos cultivos animales tienen aplicación en muchas investigaciones, hasta tal punto que han sido fundamentales para numerosos avances científicos alcanzados en distintas ramas biomédicas.

Las técnicas de cultivo celular permiten el estudio de:● Metabolismo celular.● El control del ciclo celular.● El cultivo de virus.● La clonación.

Hay investigaciones, como el trabajo con animales transgénicos, que no pueden realizarse sin el cultivo de células.

Asimismo se han desarrollado numerosas aplicaciones para investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, en procesos industriales para la obtención de anticuerpos u hormonas y técnicas diagnósticas para el diagnóstico prenatal de enfermedades y para el cáncer...

7. Equipos

Equipos● Realización del cultivo

○ Autoclave

○ Baño termostático

○ Incubador con CO2

○ Campana de flujo laminar

● Visualización y verificación del cultivo

○ Microscopio invertido

● Mantenimiento del cultivo en un breve período

de tiempo

○ Nevera

○ Depósito de CO2

● Mantenimiento del cultivo en un período

prolongado

○ Congelador

○ Depósito de CO2

Autoclave

Sirve para esterilizar todo el material que vamos a utilizar.Es de metal y debe aguantar las elevadas temperaturas y presiones.

Realización del cultivo celular

Campana de flujo laminar

Permiten obtener una zona estéril y segura en la que trabajar.

Realización del cultivo celular

Baño termostático

Son recipientes que contienen agua y un sistema de regulación de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso para incubar cultivos de microorganismos.

Realización del cultivo celular

Incubador con CO2

Es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos celulares. Mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su atmósfera interior.

Realización del cultivo celular

Microscopio invertidoEn este microscopio, los cultivos o muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables, lo cual permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa.Además, se pueden observar grandes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite disminuir las condiciones de estrés

Visualización y verificación del cultivo

Nevera y sistema de CO2

La nevera sirve para mantener los cultivos entre 2-4 ºC.El sistema de CO2 sirve para mantener las condiciones adecuadas.

Mantenimiento del cultivo celular (breve período de tiempo)

Congelador y CO2

Mantienen los cultivos celulares a temperaturas inferiores a -20ºC

Nos permiten conservar los cultivos durante mucho más tiempo, comparándolo con la conservación en nevera.

Mantenimiento del cultivo celular (período de tiempo prolongado)

8. Aplicaciones

Con los cultivos celulares podemos estudiar distintas actividades de las células, como por ejemplo:● Actividad intracelular.● Movimiento intracelular de moléculas.● Interacción célula-célula.● Interacción con el medio extracelular.● Genética.● Productos celulares y tisulares.

Aplicaciones

Cultivo celular de las células “in vitro”.Sirve para trabajar:● En estudios contra el cáncer

Reproducción asistida● En reproducción y diferenciación celular

Clonación● Medicina regenerativa de tejidos (total o parcial)

Principales usos

Ramas en las que se utilizan los cultivosAlgunas de las áreas que más trabajan con cultivos son:● Oncología● Virología● Inmunología● Odontología● Otras ramas: transplantes, reproducción

asistida...

9. Ventajas y desventajas

● Control fino y preciso del medio. Se pueden controlar factores:○ Físico-químicos: pH, Ta, presión osmótica, niveles de O2/CO2…○ Fisiológicos: Hormonas, nutrientes, factores de crecimiento

Ventajas

● Caracterización y homogeneidad de la muestra. Todas las células son homogéneas, lo que supera el problema de la heterogeneidad.

● Economía. Al realizarse en volúmenes reducidos, se requieren menos cantidad de reactivos o drogas.

● Técnica sensible. El crecimiento celular es muy lento y se necesita un medio muy complejo similar al plasma o líquido intersticial. Por ello se necesitan unas continuas condiciones de asepsia.

Desventajas

● Cantidad y coste. Producir 1g de tejido en cultivo cuesta 10 veces más que obtener tejido animal. Además, se obtienen cantidades muy pequeñas (para tener 100g requerimos instalaciones industriales).

● Inestabilidad. Muchas líneas celulares son inestables debido a aneuploidías. Para evitarlo, se resiembra cada cierto tiempo con líneas estables a partir de un stock.

● Difícil relación células cultivadas-células derivadas del tejido, debido a sus diferentes propiedades.

● Problemas de inestabilidad genética al realizar varios pases de cultivos de células no transformadas.

● Sacrificio de miles de animales de experimentación.

Alicia Costa CarreraClaudia Lamela OujoCarolina Pérez BarreiroAarón Vicente Pintos

1º de Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

2015/16