Biología Molecular y Filogenia en Micología

Micología 2014Biól. Nicolás Pastor

¿Por qué usar herramientas moleculares?

Sistemática- Delimitación de especies

→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies

- Resolución de conflictos taxonómicos

¿Por qué usar herramientas moleculares?

Sistemática- Delimitación de especies

→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies

- Resolución de conflictos taxonómicos

Evolución- Estudios de co-evolución- Evolución de caracteres morfológicos

¿Por qué usar herramientas moleculares?

Sistemática- Delimitación de especies

→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies

- Resolución de conflictos taxonómicos

Evolución- Estudios de co-evolución- Evolución de caracteres morfológicos

Ecología- Independencia de basidiomas y ascomas- Cambios en la composición espacial y temporal de las comunidades

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

PREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

BIOINFORMATICA

LAB. HUMEDO

Flujo de trabajo

Pregunta y selección del material biológico

- Morfología muestra algunos caracteres afines a algún género conocido, pero...

No se lo puede identificar mediante las claves existentes, ni es similar a nada publicado

(al menos de lo que se conoce!!)

Pregunta y selección del material biológico

Si así es, ¿cómo está relacionada con el resto de las especies más cercanas del género?

¿Encontré una nueva especie?¿Encontré una nueva especie?

¿Cuál es su posición filogenética ¿Cuál es su posición filogenética en el género?en el género?

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

Extracción de ADN

- Disgregación mecánica del tejido

- Lísis celular (mecánica y química)

- Secuestro de ADN y precipitación de otros contenidos celulares (proteínas, lípidos, etc)

- Precipitación de ADN

Kit Comercial Protocolo tradicional

ADN genómico

- Lavado y resuspensión de ADN

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

Amplificación y secuenciación de ADN

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html

Amplificación y secuenciación de ADN

- ¿Con cuántos marcadores voy a trabajar?

- ¿Que nivel taxonómico quiero resolver?

- ¿Qué hay disponible en las bases de datos?

→ loci independientes (no ligados)

→ tasas de evolución de ADN

→ meramente pragmático!!!

Amplificación y secuenciación de ADN

Marcadores más utilizados

→ No-codificantes (intrones, DNAr)

- ITS = espaciador interno de la transcripción - LSU/25S = subunidad ribosomal mayor - SSU/18S = subunidad ribosomal menor

→ Codificantes (expresan proteínas)

- rpb1/rpb2 = RNA polimerasa subunidad I ó II - atp6 = subunidad 6 ATPasa mitocondrial - tef1 = factor de enlongación 1-α - β-tubulina = subunidad beta de Tubulina

Amplificación y secuenciación de ADN

Bellemain et al.(2010). BMC Microbiology.10: 189-198

www.clarku.edu/faculty/dhibbett/

Cebadores: específicos y no específicos

Amplificación y secuenciación de ADN

www.macrogen.com/eng/

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

Minería de datos

- Búsqueda de secuencias por similitud

BLAST

Busca en una BD determinada, las secuencias similares a la que uno provee.

- ¿Por qué buscamos secuencias similares?

Similitud Homología

Altschul etl al. 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-410.

asicocallignmentearchool

Minería de datos

- Bases de datos más utilizadas en Micología

www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank

BD general (todo tipo de secuencias, todo tipo de organismos)

www.unite.ut.ee/

BD específica de secuencias de ITS de hongos

maarjam.botany.ut.ee/

. : M A A R J A M : .

BD específica para Glomeromycota. Varios

marcadores

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA)

s1:EN LA RAMA NOS CANTA LA RANA [22 letras]s2:LA RANA NO CANTA EN LA CAMA [21 letras]

ENLARAMANOSCANTA--LARANA--LARANANO-CANTAENLACAMA **** *** ***** ** * *

ENLARAMANOSCANTALARANALARANANOCANTAENLACAMA- * * *

3/22 = 0,1363

14% similitud

16/22 = 0,7272

73% similitud

insercion/deleción mutación puntual

Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA)

- Existen programas para realizar MSA de manera automática, basados en diferentes algoritmos:

→ Clustal (W, IX, Ω) → MUSCLE → T-Coffee → MAFFT

Flujo de trabajoPREGUNTA

MATERIALBIOLÓGICO

EXTRACTODE ADN

AMPLICON

SECUENCIADE ADN

ALINEAMIENTODE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

ARBOLFILOGENÉTICO

ANÁLISISFILOGENÉTICO

Análisis filogenético

- ¿Puedo hacer filogenía sin biología molecular?

Esporas

A BC D

Habito Esp Orna Color

A 0 a a 0

B 0 a b 0

C 1 b c 1

D 1 c c 1

HábitoHipógeo [0] / Epígeo [1]EsporasNegra [a] / Blanca [b] / Rosa [c]OrnamentaciónesVerrugas [a] / Sin [b] / Espinas [c]Color basidiomaAzul [0] / Rojo [1]

A B C D

hipogeo epigeo

negra

blancarosa

espinas

sinverrugas

azul rojo

Análisis filogenético

Entonces... ¿Por qué utilizar ¿Por qué utilizar caracteres moleculares?caracteres moleculares?

Análisis filogenético

- Enorme disponibilidad de caracteres

→ Cada sitio de las secuencia es un carácter distinto

→ Elección objetiva del carácter y sus estados

- Tasas de evolución conocidas→ Modelos de evolución de ADN→ Relojes moleculares

Análisis filogenético

- Métodos basados en matriz de distancias→ Neighbor-joining→ Mínimos cuadrados→ UPGMA

- Método de Máxima Parsimonia

- Métodos Probabilísiticos

→ Máxima Verosimilitud

→ Inferencia Bayesiana

¡¡¡ NO ES FILOGENIA !!!

DISCUTIDO

MODELOS DE SUBSTITUCION

DE ADN