Biología Molecular y Filogenia en Micología
Micología 2014Biól. Nicolás Pastor
¿Por qué usar herramientas moleculares?
Sistemática- Delimitación de especies
→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies
- Resolución de conflictos taxonómicos
¿Por qué usar herramientas moleculares?
Sistemática- Delimitación de especies
→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies
- Resolución de conflictos taxonómicos
Evolución- Estudios de co-evolución- Evolución de caracteres morfológicos
¿Por qué usar herramientas moleculares?
Sistemática- Delimitación de especies
→ Concepto filogenético de especie→ Diagnosis inequívoca(?) de especies
- Resolución de conflictos taxonómicos
Evolución- Estudios de co-evolución- Evolución de caracteres morfológicos
Ecología- Independencia de basidiomas y ascomas- Cambios en la composición espacial y temporal de las comunidades
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
PREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
BIOINFORMATICA
LAB. HUMEDO
Flujo de trabajo
Pregunta y selección del material biológico
- Morfología muestra algunos caracteres afines a algún género conocido, pero...
No se lo puede identificar mediante las claves existentes, ni es similar a nada publicado
(al menos de lo que se conoce!!)
Pregunta y selección del material biológico
Si así es, ¿cómo está relacionada con el resto de las especies más cercanas del género?
¿Encontré una nueva especie?¿Encontré una nueva especie?
¿Cuál es su posición filogenética ¿Cuál es su posición filogenética en el género?en el género?
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
Extracción de ADN
- Disgregación mecánica del tejido
- Lísis celular (mecánica y química)
- Secuestro de ADN y precipitación de otros contenidos celulares (proteínas, lípidos, etc)
- Precipitación de ADN
Kit Comercial Protocolo tradicional
ADN genómico
- Lavado y resuspensión de ADN
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
Amplificación y secuenciación de ADN
http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html
Amplificación y secuenciación de ADN
- ¿Con cuántos marcadores voy a trabajar?
- ¿Que nivel taxonómico quiero resolver?
- ¿Qué hay disponible en las bases de datos?
→ loci independientes (no ligados)
→ tasas de evolución de ADN
→ meramente pragmático!!!
Amplificación y secuenciación de ADN
Marcadores más utilizados
→ No-codificantes (intrones, DNAr)
- ITS = espaciador interno de la transcripción - LSU/25S = subunidad ribosomal mayor - SSU/18S = subunidad ribosomal menor
→ Codificantes (expresan proteínas)
- rpb1/rpb2 = RNA polimerasa subunidad I ó II - atp6 = subunidad 6 ATPasa mitocondrial - tef1 = factor de enlongación 1-α - β-tubulina = subunidad beta de Tubulina
Amplificación y secuenciación de ADN
Bellemain et al.(2010). BMC Microbiology.10: 189-198
www.clarku.edu/faculty/dhibbett/
Cebadores: específicos y no específicos
Amplificación y secuenciación de ADN
www.macrogen.com/eng/
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
Minería de datos
- Búsqueda de secuencias por similitud
BLAST
Busca en una BD determinada, las secuencias similares a la que uno provee.
- ¿Por qué buscamos secuencias similares?
Similitud Homología
Altschul etl al. 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-410.
asicocallignmentearchool
Minería de datos
- Bases de datos más utilizadas en Micología
www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank
BD general (todo tipo de secuencias, todo tipo de organismos)
www.unite.ut.ee/
BD específica de secuencias de ITS de hongos
maarjam.botany.ut.ee/
. : M A A R J A M : .
BD específica para Glomeromycota. Varios
marcadores
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA)
s1:EN LA RAMA NOS CANTA LA RANA [22 letras]s2:LA RANA NO CANTA EN LA CAMA [21 letras]
ENLARAMANOSCANTA--LARANA--LARANANO-CANTAENLACAMA **** *** ***** ** * *
ENLARAMANOSCANTALARANALARANANOCANTAENLACAMA- * * *
3/22 = 0,1363
14% similitud
16/22 = 0,7272
73% similitud
insercion/deleción mutación puntual
Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA)
- Existen programas para realizar MSA de manera automática, basados en diferentes algoritmos:
→ Clustal (W, IX, Ω) → MUSCLE → T-Coffee → MAFFT
Flujo de trabajoPREGUNTA
MATERIALBIOLÓGICO
EXTRACTODE ADN
AMPLICON
SECUENCIADE ADN
ALINEAMIENTODE SECUENCIAS
BASE DE DATOS
ARBOLFILOGENÉTICO
ANÁLISISFILOGENÉTICO
Análisis filogenético
- ¿Puedo hacer filogenía sin biología molecular?
Esporas
A BC D
Habito Esp Orna Color
A 0 a a 0
B 0 a b 0
C 1 b c 1
D 1 c c 1
HábitoHipógeo [0] / Epígeo [1]EsporasNegra [a] / Blanca [b] / Rosa [c]OrnamentaciónesVerrugas [a] / Sin [b] / Espinas [c]Color basidiomaAzul [0] / Rojo [1]
A B C D
hipogeo epigeo
negra
blancarosa
espinas
sinverrugas
azul rojo
Análisis filogenético
Entonces... ¿Por qué utilizar ¿Por qué utilizar caracteres moleculares?caracteres moleculares?
Análisis filogenético
- Enorme disponibilidad de caracteres
→ Cada sitio de las secuencia es un carácter distinto
→ Elección objetiva del carácter y sus estados
- Tasas de evolución conocidas→ Modelos de evolución de ADN→ Relojes moleculares
Análisis filogenético
- Métodos basados en matriz de distancias→ Neighbor-joining→ Mínimos cuadrados→ UPGMA
- Método de Máxima Parsimonia
- Métodos Probabilísiticos
→ Máxima Verosimilitud
→ Inferencia Bayesiana
¡¡¡ NO ES FILOGENIA !!!
DISCUTIDO
MODELOS DE SUBSTITUCION
DE ADN