Biología Celular Cell Biology - cbm.uam.es · La morfogØnesis neuronal depende de la...

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Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report

Biología Celular

Cell Biology

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BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL EN MAMÍFEROS MAMMALIAN MITOCHONDRIAL BIOGENESIS

Jefe de Línea / Group Leader: José M. CuezvaPersonal Científico Scientific Personnel: Carlo M. Di Liegro, José M. IzquierdoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Luciana K. Ostronoff, Cristina UgaldeBecarios Predoctorales Graduate Students: Miguel López de Heredia, Javier Ricart, Gema

SantamaríaTécnico de Investigación Technical Assistance: Margarita Chamorro

Resumen de Investigación

Nuestro grupo estudia los mecanismos celulares y moleculares que controlan la

biogénesis mitocondrial en células de mamíferos. Se entiende por biogénesis de la mito-

condria el conjunto de procesos que conducen a un aumento del número y de la activi-

dad mitocondrial en la célula. Estos procesos vienen mediados por la expresión coordi-

nada de los genes mitocondriales y nucleares implicados en la función del orgánulo.

Poco se conoce sobre los mecanismos moleculares que regulan la expresión coordinada

de estos dos sistemas genéticos en células de organismos superiores. Menos aún, de su

operatividad durante el desarrollo, la morfogénesis y la diferenciación de los distintos

tejidos y tipos celulares de mamíferos. La relevancia de estos estudios estriba, como se

ha puesto de manifiesto durante los últimos años, en la implicación evidente de la mito-

condria en múltiples manifestaciones de la patología humana. Por citar algunas: enve-

jecimiento, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cáncer. Más recientemente, se

ha demostrado que las mitocondrias son los orgánulos celulares responsables de inte-

grar y ejecutar el proceso de muerte celular programada o apoptosis.

Trabajos anteriores de nuestro laboratorio han permitido definir la existencia de

dos programas biológicos distintos que dan cuenta de la función mitocondrial en el


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hígado de rata en desarrollo. Estos dos programas, que son los responsables de la pro-

liferación y diferenciación funcional de la mitocondria, se encuentran regulados por

mecanismos moleculares distintos. En concreto, el programa de diferenciación mito-

condrial se encuentra regulado a dos niveles de control post-transcripcional de la expre-

sión génica. En efecto, tanto la estabilidad como la eficiencia traduccional de los tráns-

critos, codificados en ambas unidades génicas, están sometidas a una regulación con-

certada durante el desarrollo.

El descubrimiento de la existencia de mecanismos post-transcripcionales de re-

gulación de la expresión génica para la biogénesis mitocondrial ha supuesto el inicio de

estudios encaminados a caracterizar las moléculas responsables de ejercer este tipo de

control. En este sentido, hemos descrito que el mensajero nuclear que codifica para la

subunidad catalítica β del complejo mitocondrial ATP sintasa (β-mRNA), es un mRNA

localizado en unas estructuras discretas del citoplasma celular, frecuentemente asoci-

adas a la membrana del orgánulo. Hemos postulado que estas estructuras desempeñan

un papel importante en el control de la expresión citoplasmática de este gen, así como

en el �targeting� e importación del precursor citosólico de esta proteína a la mitocon-

dria. Hemos caracterizado parcialmente estas estructuras, que por distintos criterios de

co-localización, son consideradas traduccionalmente activas.

Por otro lado, hemos descrito que el control de la traducción de β-mRNA durante

el desarrollo del hígado, así como la distinta expresión tisular de este mRNA, se ejerce

por regulación de la expresión de una proteína inhibidora (3�βFBP) que, por unirse a

una secuencia intensificadora de la traducción del mRNA localizada en la región 3�-no

traducible del mismo, inhibe estéricamente la comunicación 3�-5� necesaria para la reini-

ciación eficiente de la traducción del mRNA. Hemos propuesto que la alteración de la

función mitocondrial que se observa en algunos tipos de células cancerosas es el resul-

tado de la expresión de esta proteína inhibidora (3�βFBP). En la actualidad, nuestros

esfuerzos se concentran en la caracterización molecular de dichas estructuras, así como

en la caracterización del papel funcional que las distintas proteínas que las componen

desempeñan en la localización, control traduccional y estabilidad del mensajero objeto

de nuestros estudios. Finalmente, en un trabajo en colaboración con el grupo de VPPA,

hemos descrito que en células infectadas por este virus se produce una migración masi-

va de las mitocondrias por elementos del citoesqueleto hasta las factorías virales.

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Research Summary

Our group investigates the cellular and molecular mechanisms that control the

biogenesis of mitochondria in mammalian cells. Mitochondrial biogenesis is a complex

cellular response that involves the concerted expression of the nuclear and mitochon-

drial genomes in which molecular components of the organelle are encoded. Little is

known about the basic mechanisms that regulate the coordinated expression of these

two genetic systems in cells of higher eukaryotic organisms. Even less is known about

their operation during development, morphogenesis and differentiation of the different

tissues and cellular types of mammals. The relevance of these studies steams from the

fact that mitochondria have been implicated in many manifestations of human pathol-

ogy, such as aging, diabetes, neurodegenerative diseases and cancer. More recently, it

has been demonstrated that mitochondria are the cell organelles responsible for inte-

grating and executing the process of programmed cell death or apoptosis.

Previous work from our laboratory has allowed us to define the existence of two

different biological programs responsible for the biogenesis of mitochondria in rat liver

during development. These two programs, that are responsible for the proliferation and

differentiation of the organelle, are regulated by different molecular mechanisms of

gene expression. The program of mitochondrial differentiation is controlled at two

post-transcriptional levels of the regulation of gene expression, involving profound

changes in both the stability and translational efficiency of the transcripts encoded in

both genomes.

The existence of post-transcriptional mechanisms for the regulation of the expres-

sion of the genes involved in the biogenesis of mitochondria has prompted us to initi-

ate studies aimed at characterizing the molecules responsible for exerting this type of

control. In this regard, we have described that the nuclear-encoded mRNA of the β-cat-

alytic subunit of the mitochondrial ATP synthase (β-mRNA) is localized in clusters in

the cytoplasm of the hepatocyte, an electron-dense structure that is frequently observed

associated with the mitochondria. We have suggested that these structures have an

important role in controlling the cytoplasmic expression of this gene, as well as in the

targeting and import of the cytosolic precursor protein into the mitochondria. We have

partially characterized the clusters and found, by different co-localization criteria, that

they are translationally active structures.

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At the molecular level, we have described that the control of the translation of β-

mRNA during development of the liver, as well as the tissue-specific expression level

of this mRNA, is exerted by the controlled expression of an inhibitory protein (3�βFBP)

that binds a translational enhancer sequence found in the 3�-untranslated region of the

mRNA. We have suggested that the binding of 3�βFBP to the cis-acting translational

enhancer sterically hinders the 3� to 5� communication that is required for an efficient

re-initiation of the translation of the mRNA. Furthermore, we have proposed that the

alteration in mitochondrial function observed in certain tumor cells results from the

aberrant expression of this inhibitory protein (3�βFBP). At present time, our efforts are

focused on the molecular and functional characterization of the cellular proteins

involved in the localization of β-mRNA, as well as of those controlling the translation

and the stability of the transcript. Finally, in a collaboration with the ASFV group, we

have described a massive migration of mitochondria towards viral factories through

cytoskeletal elements in the cells infected with the ASFV.

Publicaciones / Publications

� Egea, G., Izquierdo, J.M., Ricart, J., San Martín, C. and Cuezva, J.M. mRNA enco-

ding the β-subunit of the mitochondrial F1-ATPase complex is a localized mRNA

in rat hepatocytes. Biochem. J. 322, 557-565 (1997).

� Flores, A.I. and Cuezva, J.M. Identification of sequence similarity between 60- and

70-kDa molecular chaperones: evidence for a common evolutionary background?

Biochem. J. 322, 641-647 (1997).

� Ricart, J., Egea, G., Izquierdo, J.M., San Martín, C. and Cuezva, J.M. Subcellular

structure containing mRNA for β-subunit of mitochondrial H+-ATP synthase in

rat hepatocytes is translationally active. Biochem. J. 324, 635-643 (1997).

� Lithgow, T., Cuezva, J.M. and Silver, P.A. Highways for protein delivery to the

mitochondria�. Trends Biochem. Sci. (TIBS) 22, 110-113 (1997).

� Cuezva, J.M., Ostronoff, L.K., Ricart, J., López de Heredia, M., Di Liegro, C.M.,

and Izquierdo, J.M. Mitochondrial biogenesis in the liver during development

and oncogenesis. J.Bioenerg. Biomemb. 29, 365-377 (1997).

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� Izquierdo, J.M. and Cuezva, J.M. Control of the translational efficiency of β-F1-

ATPase mRNA depends on the regulation of a protein that binds the 3�-untrans-

lated region of the mRNA. Mol. Cell. Biol. 17, 5255-5268 (1997).

� Rojo, G., Chamorro, M., Salas, M.L., Viñuela, E., Cuezva, J.M. and Salas, J.

Migration of mitochondria to viral assembly sites in African swine fever virus-

infected cells. J. Virology 72, 7583-7588 (1998).

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ESTUDIOS SOBRE FACTORES QUE REGULAN LA DINÁMICADE MICROTUBULOS: EFECTO DE LA FOSFORILACIÓNSTUDIES ON FACTORS THAT REGULATE MICROTUBULEDYNAMICS: EFFECT OF PHOSPHORYLATION

Jefe de Línea / Group Leader: Francisco J. MorenoPersonal Científico Scientific Personnel: María José Benitez, Juan S. Jiménez, Francisco

WandosellBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: María Teresa MorenoBecarios Predoctorales Graduate Students: Ruth Gutiérrez, M Jesús Martín, Juan R. Muñoz,

Silvia Sánchez, Laura Sayas


La función de los microtúbulos en la segregación de los cromosomas, motilidad

celular, transporte intracelular y la regulación de las formas de las células se basa en su

capacidad para ensamblarse y desensamblarse. El ensamblamiento de los microtúbulos

puede además ser regulado por otras proteínas distintas a la tubulina tales como la pro-

teína tau (que es una proteína asociada a microtúbulo) que estabiliza a los microtúbu-

los o la estathmina que es otro regulador de microtúbulos y se sabe que interacciona

preferentemente con la tubulina despolimerizada y es un firme candidato que hace cre-

cer la velocidad de catástrofe de los microtúbulos. Los efectos fisiológicos tanto de la

proteína tau como de la estathmina cambian cuando ambas proteínas se encuentran fos-

foriladas. De aquí se puede deducir que los procesos de fosforilación/desfosforilación

de ambas proteínas pueden controlar la dinámica de los microtúbulos. Ambas proteí-

nas pueden ser fosforiladas en respuesta a múltiples señales extracelulares. Hemos con-

firmado la localización de los restos de amino ácidos que son modficados por la acción

de distintas proteínas quinasas como la MAP quinasa, cdc 2 quinasa, la proteína quina-


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sa A y la caseína quinasa 2 que modifican a la estathmina. Además hemos encontrado

que la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK 3β) fosforila a la ser 31. A través de los resul-

tados obtenidos se ha encontrado que la estathmina modificada por la PKA pierde su

capacidad despolimerizante de los microtúbulos, como anteriormente se había descrito

por otros grupos, mientras que la modificación por la caseína quinasa 2 o GSK 3β hace

crecer su función desestabilizadora de microtúbulos.

Además se ha estudiado si la estathmina interacciona con el extremo C terminal

de la tubulina. Nuestros resultados indican que la estathmina se une a una región de la

subunidad α de la tubulina que se extiende desde el resto 307 al 417. Por otro lado se

ha encontrado que al interaccionar la estathmina con la tubulina es capaz de modular

la interacción de la tubulina con el GTP.

La morfogénesis neuronal depende de la organización de los diferentes elementos

del citoesqueleto, en donde los microtúbulos desempeñan un papel preponderante. Otra

MAP que controla la dinámica microtubular es la MAP 1B se encuentra a una elevada

concentración en los axones que están creciendo durante el desarrollo neuronal y se ha

encontrado que es substrato de diferentes proteínas quinasas entre ellas la CK 2. La

expresión de la MAP 1B disminuye notablemente después de la maduración neuronal

en paralelo con un cambio de su localización ya que se concentra fundamentalmente en

el cuerpo neuronal y en las dendritas. Interesantemente MAP 1B permanece altamente

fosforilada en los sitios consenso de fosforilación de la CK 2 en neuronas maduras.

Nosotros hemos examinado la expresión y la localización de las subunidadescatalíticas de la CK 2 durante el desarrollo neuronal. La subunidad catalítica α de la CK2 aparece rápidamente durante el desarrollo neuronal mientras que la α� solo aparececuando maduran las neuronas justo en el momento en que se produce la maduraciónneuronal y la sinaptogénesis y en paralelo con el cambio en la localización de la MAP1B. La subunidad α se encuentra asociada con la preparación de microtúbulos obtenidostanto de la materia blanca o gris del cerebro bobino adulto mientras que la subunidad α�se encuentra enriquecida en microtúbulos procedentes de la materia gris. Estos datospermiten soportar la hipótesis que la subunidad α� se encuentra concentrada en el cuer-po neuronal y dendritas y allí se encuentra asociada con los microtúbulos contribuyen-do en un aumento en la fosforilación de la MAP 1B en estos sitios en neuronas maduras.

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Igualmente se ha estudiado diversas interacciones entre la proteína quinasa CK 2, subs-

tratos y activadores como la polilisina, con la técnica de Resonancia superficial de plasmón.

La glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK 3β) es una proteína multifuncional que fos-

forila una gran variedad de substratos incluyendo a la proteína asociada a microtúbu-

los, la proteína tau. Datos recientes han resaltado el papel de la GSK-3β como una de las

quinasas más importante en la fosforilación de tau durante el desarrollo neuronal tanto

in vivo como in vitro. Existe por tanto un gran interés en establecer como se regula la

GSK-3β en neuronas de mamífero. Los datos obtenidos nos permiten deducir que se

produce una importante caída en la cantidad de proteína de la GSK-3β como uno de los

primeros acontecimientos que se producen en el proceso de diferenciación de las célu-

las de neuroblastoma humana de la línea IMR-32. La disminución de la GSK 3β se

acompaña de un más bajo estado de fosforilación de tau. También es de un gran interés

el señalar que también se incrementa la expresión de tau al final del proceso de dife-

renciación en de las células IMR-32. Ambos datos, el aumento en la expresión de tau así

como la caída en la desfosforilación de tau durante la diferenciación de las células de

neuroblastoma pueden correlacionarse con el incremento en el ensamblaje de los

microtúbulos y la asociación de tau a los microtúbulos.

Estos resultados sugieren un importante papel a la GSK-3β en los acontecimien-

tos moleculares que se suceden en la diferenciación de las células de neuroblastoma.

Entre todos estos hay que destacar que una menor fosforilación de tau contribuye a la

estabilización de los microtúbulos en la formación de neuritas.

Mecanismos moleculares implicados en la reparación del SNC

En el Sistema Nervioso Central (SNC) la mayor parte de la extensión de axones

cesa al final del periodo del desarrollo. Sin embargo el CNS sigue manteniendo la capa-

cidad de activar la neuritogénesis. Después de una lesión y en muchas situaciones neu-

ropatológicas, el SNC responde con una respuesta de activación glial, que en su con-

junto es conocida como �gliosis reactiva�. Además de toda una serie de cambios mor-

fológicos la glia expresa toda una serie de moléculas que, o son especificas de esta situa-

ción de lesión o tenían un bajo nivel de expresión en situaciones fisiológicas normales.

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Para nuestro trabajo hemos desarrollado un modelo animal de lesión del CNS con el

análogo de glutamato denominado ácido kaínico. Este compuesto produce una muerte

específica de algunas neuronas de hipocampo. A partir de este modelo pudimos com-

probar que este tejido gliótico contenía moléculas con capacidad inhibitoria de la ini-

ciación y de la extensión axonal. Además de la presencia de este tipo de proteínas

hemos podido comprobar la presencia de moléculas que previamente se han usado

durante el desarrollo, como la molécula precursora del Amiloide /APP). Esta proteína

y su péptido derivado el ßA han sido implicados en la etiología de la enfermedad de

Alzheimer, como elementos responsables de la formación de las placas Seniles. Por

tanto nos ha interesado analizar el papel del péptido Amiloide y del APP en la res-

puesta glial ante una lesión.

Usando cultivos primarios de células gliales hemos demostrado la respuesta de

los astrocitos ante la presencia del péptido Amiloide. El cambio morfológico observado

en el tratamiento está acompañado de una sobre-expresión de algunas proteínas de los

astrocitos como el APP o la Fibronectina.

En paralelo a estos experimentos hemos analizado más en detalle la activación

glial en nuestro modelo de lesión. En este sentido hemos elegido los receptores con acti-

vidad kinasa de tirosina (Trks) y sus ligandos como uno de elementos más generales

implicados en activación celular.

Nuestros datos sugieren un papel importante en lesión de la familias Trks deno-

minados EPH. Muchos de los miembros de esta familia son usados durante el Desarrollo

del CNS, presentan un patrón restringido; y ellos y sus ligandos han sido implicados en

guia axonal, mediando repulsión axonal. Varios de estos elementos responden diferen-

cialmente tras una lesión llegándose a un nivel alto de sobre-expresión en algunas de las

regiones del hipocampo afectado. En estos momentos estamos estudiando las bases de

los mecanismos de señalización mediado por estas Trks y sus ligandos.

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Research Summary

Microtubule functions in chromosome segregation, cell motility, intracellular

transport, and regulation of cell shape are based on the ability of microtubules to assem-

ble and disassemble. Microtubule assembly could also be modulated by other proteins

apart from tubulin such as tau (one microtubule-associated proteins) which stabilize

and stathmin that is another microtubule regulator that preferentially interacts with

unpolymerized tubulin and it is a candidate for increasing the microtubule catastrophe

rate. These effects are significantly changed when tau or stathmin are phosphorylated,

suggesting that phosphorylation and dephosphorylation of both proteins could be used

to regulate microtubule dynamics in vivo. Both proteins are phosphorylated in res-

ponse to numerous extracellular signals. We have confirmed the localization of the resi-

dues modified by MAP kinase, cdc 2 kinase, protein kinase A and casein kinase 2 on

brain stathmin. Additionally, we have localized the region for Glycogen synthase kina-

se 3β (GSK 3β) modification and we postulate that modification by GSK 3β could occur

at serine 31. Our results have indicated that modification of stathmin by, mainly, pro-

tein kinase A results in a decrease of its depolymerizing activity, as previously indica-

ted by others, whereas modification by casein kinase 2 or GSK 3β results in a slight

increase of stathmin activity.

Furthermore, we have studied if Op18/stathmin binds to the C-terminus of α-tubulin

subunits or to other tubulin regions. Our results indicate that stathmin binds to the α-tubu-

lin region comprising residues 307 to 417. Additionally, we observed that the interaction of

stathmin with tubulin is capable of modulating the binding (or exchange) of GTP to tubulin.

Neuronal morphogenesis depends on the organization of cytoskeletal elements

among which microtubules play a very important role. Another MAPs that control the

microtubule dynamic is MAP1B, which is very abundant within growing axons of

developing neurons where it is found phosphorylated by several protein kinases inclu-

ding CK 2. The expression of MAP1B is notably decreased after neuronal maturation in

parallel with a change in the localization of the protein, which becomes largely concen-

trated in neuronal cell bodies and dendrites. We have analyzed the expression and loca-

lization of CK 2 catalytic subunits along neuronal development. CK 2α subunit appe-

ars early during development whereas CK 2α� subunit appears within mature neurons

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at the time of dendrite maturation and synaptogenesis, in parallel with the change in

the localization of MAP1B. CK 2α subunit is found associated with microtubule prepa-

rations obtained from either grey matter or white matter from adult bovine brain, whe-

reas CK 2α� subunit is highly enriched in microtubules obtained from grey matter.

These results lend support to the hypothesis that CK 2α� subunit is concentrated in neu-

ronal cell bodies and dendrites, where it associates with microtubules, thus contribu-

ting to the increased phosphorylation of MAP1B in this localization in mature neurons.

The interaction between protein kinase CK 2, substrates and enzyme activators

such as polylysine has been studied by Surface Plasmon Resonance.

Glycogen synthase kinase 3β is a multifunctional protein kinase that phosphoryla-

tes a variety of substrates including the neuronal-specific microtubule-associated protein

tau. Recent evidence has emphasized the role of GSK 3β as a major kinase involved in

the phosphorylation of Tau protein in developing neurons both in culture and in vivo.

Thus, there is considerable interest in the regulation of GSK 3β in mammalian neurons.

We have reported that the down-regulation of the GSK 3β protein is an early event in the

course of the differentiation of human neuroblastoma IMR-32 cells. This decline in GSK

3β is accompained by a significant decrease in the phosphorylation state of tau protein.

A noteworthy increase in tau protein expression also takes place later during the diffe-

rentiation of IMR-32 cells. The augmented expression and diminished phosphorylation

of Tau protein in differentiated IMR-32 cells can be correlated with increments in the

assembly of microtubules and in the association of tau with microtubules.

These results suggest a contribution of a decrease in GSK 3β to molecular events

leading to neuroblastoma cell differentiation. Among these, tau dephosphorylation

might favor microtubule stabilization within neurites.

Molecular mechanisms implicated in CNS repair

Most neuritic outgrowth in the mammalian central nervous system ceases at the

end of the developmental period. However CNS neuron maintain their ability to rea-

rrange their axons. After any type of brain insult and in many neurophatological disor-

ders, the CNS respond with a �glial cell activation�. The overall glial response is refe-

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rred as �reactive gliosis�. In addition to the morphological changes they express a num-

ber of molecules absent or reduced in �resting� CNS.

We performed a CNS lesion model, using an analog of glutamate, kainic acid.

This produces neuronal death and glial activation in the hippocampus. From this tissue,

we demonstrated that they contained �new� molecules that inhibited the neurite initia-

tion and the axonal elongation. In addition of this new types of molecules expressed

after brain insult, other molecules, previously used during brain development, appea-

red to be over-expressed, such as Amyloid precursor protein (APP). This protein and its

derived peptide βA have been implicated in the ethiology of Alzheimer�s disease, as

responsible elements of Senile plaques. Therefore, we analysed the role of Amyloid

peptide (βA) and APP in the glial response after brain damage.

Using primary cultures of glial cells we demonstrated the response of astrocytes

to the presence of βA peptide. The morphological change observed after βA addition is

accomplished by the over-expression of some molecules such as the APP and

Fibronectin.

In parallel, we have analysed more in detail the glial activation. In this sense, pro-

tein tyrosine kinases (PTK) receptors (TKR) and their ligands are the most common ele-

ments implicated in cell activation. The purpose of our work was to analyse the role of

TKRs in our CNS lesion model. Our results suggest a role for the Eph family of TKRs in

injury. Its members, named according to the first described member, are developmentally

regulated, with restricted expression patterns. They and their ligands have been implica-

ted in processes of neural pathfinding, mediating axonal repulsion. However their role in

the adult brain, particularly after neuronal injury, remains unexplored. We are currently

analysing the signalling pathway/s linked to this group of molecules EPH/EPHRINS.

83


� Muñoz-Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Díaz-Nido, J. Lithium inhibits

Alzheimer�s disease-like tau protein phosphorylation in neurons FEBS Lett. 411,

183-188 (1997).

� Benítez, M.J., Mier, G., Briones, F., Moreno, F.J. and Jiménez, J.S. A surface-plas-

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tein kinase CK2 and with enzyme Biochem J. 324, 987-994 (1997).

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� Moreno, F.J. and Avila, J. Phosphorylation of stathmin modulates its function as

a microtubule depolymerization factor. Mol. Cell. Biochem. 183, 201-209 (1998).

� Moreno-Flores, M.T., Salinero, O. and Wandosell, F. β-Amyloid peptide induced

APP expression in cultured astrocytes. J. Neurosc. Res. 52, 661-671 (1998).

� Salinero, O., Garrido, J.J. and Wandosell, F. Amyloid precursor protein prote-

oglycan is increased after brain damage. Biochim. Biophys. Acta. 1406, 237-250

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� Pérez, M., Wandosell, F., Colaço, C. and Avila, J. Sulfated glycosaminoglycans

prevent neurotoxicity of a human prion protein fragment. Biochem J. 335, 369-374

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� Moreno, F.J., Diaz-Nido, J., Jímenez, J.S. and Avila, J. Distrihbution of CK 2, its

substrate MAP 1B and phosphatases in neuronal cells. Mol. Cell. Biochem. 191, 201-

205 (1999).

84

� Benítez, M.J., Mier, G., Briones, F., Moreno, F.J. and Jiménez, J.S. Binding of

polylysine to protein kinase CK 2, measured by surface plasmon resonance. Mol.

Cell. Biochem. 191, 29-33 (1999).

Tesis Doctorales / Doctoral Theses

Juan R. Muñoz: �La fosforilación de la proteína tau por la glucógeno sintasa quinasa

3�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.

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BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA ACTIVACIÓN CELULAR Y SUS IMPLICACIONES TERAPÉUTICAS MOLECULAR BIOLOGY OF CELL ACTIVATION AND ITS THERAPEUTIC IMPLICATIONS

Jefe de Línea / Group Leader: Jorge MoscatPersonal Científico Scientific Personnel: Edurne Berra, Mª Teresa Díaz-Meco, Laura Sanz Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Guillermo de Cárcer, Trudy A. Kohout, Mª José

Lallena Becarios Predoctorales Graduate Students: Sonia Frutos, Jose Lozano, Alicia Monjas, Mª Mar

Municio, Javier Pastor, Pilar Sánchez, Patricia Hernanz

Técnicos de Investigación Technical Assistance: Esther Garcia, Carmen Ibañez, Beatriz RaneraCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Geir Bjorkoy (University of Tromso. Norway)

Esta línea de investigación se desarrolla en el seno del Laboratorio GlaxoWellcome-

CSIC de Biología Molecular y Celular/ This research project is developed in the

GlaxoWellcome-CSIC Laboratory of Molecular and Cellular Biology.

El Laboratorio está dirigido por su Comité Ejecutivo, compuesto por los siguien-

tes miembros/The Laboratory is directed by its Executive Committee:

María Teresa Díaz-Meco

Federico Gómez de las Heras

Jorge Moscat

Gonzalo Paris

Isabel Pérez

Director del CBMSO



El objetivo del Laboratorio es el estudio de las bases moleculares de los mecanis-

mos de activación celular, con el fin de contribuir a la identificación de nuevas dianas

terapéuticas para el tratamiento de procesos patológicos, en los que las alteraciones de

la transducción de señales desempeñan un papel destacado tales como en el cáncer, la

inflamación, o los procesos neurodegenerativos.

En la actualidad, el Laboratorio centra su atención sobre la regulación y función

de los isotipos λ/ι y ζ de la proteína quinasa C (PKC). Estos, son los únicos dos miem-

bros conocidos pertenecientes a la subfamilia atípica de PKC y desempeñan un papel

crucial en el control de la proliferación y la supervivencia celular, a través de la acti-

vación del factor de transcripción NF-κB. Resultados recientes de nuestro laboratorio

han permitido desvelar el mecanismo por el que estas PKCs regulan NF-κB. Así, hemos

identificado a la IκB quinasa-β (IKKβ) como la diana de la acción de las PKCs atípicas

(aPKCs). Las aPKCs interaccionan con IKKβ activándola por fosforilación, iniciando la

cascada que culmina en la translocación al núcleo de NF-κB. El siguiente reto que se nos

plantea es, por tanto, el estudio de los eslabones moleculares que conectan a estas

aPKCs con los complejos de los receptores de TNFα e IL-1 que son potentes activadores

de NF-κB y de estas quinasas. En este sentido, se debe tener en cuenta que la regulación

de las aPKCs es en estos momentos objeto de una intensa investigación. A diferencia de

otros isotipos, las atípicas no son activables por calcio, ésteres de forbol o diacilglicerol,

pero se regulan por importantes segundos mensajeros lipídicos como el fosfatidilino-

sitol 3,4,5-P3. Por otra parte, nuestro laboratorio ha contribuido de manera decisiva a la

caracterización de un nuevo mecanismo de regulación de estas quinasas que implica la

interacción con proteínas que modulan su actividad, o su localización subcelular, fun-

cionando como adaptadores. Así, hemos identificado tres nuevos moduladores pro-

teicos de la actividad y/o función de estas quinasas: LIP, Par-4, y p62/ZIP. LIP es un

activador selectivo de λ/ιPKC, mientras que Par-4, que se induce durante la parada del

crecimiento celular y la apoptosis, es un inhibidor de ζPKC y λ/ιPKC. La interacción

de las aPKCs con LIP y Par-4, ha permitido desvelar el papel fundamental de estas

quinasas en la supervivencia celular. Por otra parte, p62 localiza a ambas aPKCs en los

endosomas, permitiendo que estas quinasas puedan recibir las señales generadas por

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los receptores de citoquinas y factores de crecimiento, que se internalizan tras la inte-

racción con sus respectivos ligandos. Cómo p62 acopla las aPKCs a las señales activadas

por los receptores de membrana, será uno de los objetivos de nuestra investigación en

los próximos meses.

El estudio de los mecanismos por los que las aPKC regulan la supervivencia y

el crecimiento celular ha sido objeto de nuestro trabajo reciente. Es de destacar el papel

clave que tanto la cascada de MAPK como de PI-3K tienen en estos fenómenos. Las

aPKCs constituyen una ruta paralela a Raf para activar MAPK sin afectar la cascada de

SAPK. Esto puede ser de especial relevancia ya que el balance de la actividad de MAPK

frente a SAPK y p38 puede ser crítico en la inducción de apoptosis. De hecho, el blo-

queo de las aPKCs por Par-4 conlleva la inhibición de MAPK y una activación con-

comitante de p38. Resultados recientes demuestran, además, que la simple inhibición

de la actividad basal de MAPK es suficiente para inducir apoptosis y desencadenar la

activación de p38 de manera dependiente de caspasas. Este efecto se bloquea en pre-

sencia de suero a través de la cascada de PI 3-quinasa-Akt, lo que desvela un �crosstalk�

entre señales de supervivencia celular, susceptibles de intervención con nuevos

inhibidores farmacológicos con potencial terapéutico. En este sentido, nuestro

Laboratorio, como parte de un esfuerzo común de GlaxoWellcome para la obtención de

nuevos fármacos, ha iniciado la búsqueda de inhibidores de las aPKCs utilizando el sis-

tema de HTS (�High Throughput Screening�). La obtención de estos inhibidores per-

mitirá reevaluar el papel de las aPKCs en modelos animales de enfermedades humanas,

así como el diseño de posibles nuevos fármacos.

Research Summary

The main objective of the Laboratory is the study of the molecular basis of cell

activation, toward the identification of novel therapeutic targets for human diseases

such as cancer, inflammation or neurodegenerative processes.

In this moment, the work of the Laboratory is focused on the regulation and func-

tion of the atypical PKC isotypes λ/ιPKC and ζPKC. These PKCs have been shown to

play critical roles in the control of cell growth and survival through the activation of the

87

NF-κB transcription factor. Recent results from our group have identified the IκB

kinase-β (IKKβ) as the target of the aPKCs in the activation of NF-κB. Thus, we show

that the aPKCs bind to, and activate IKKβ triggering the whole cascade that culminates

in the nuclear translocation of the NF-κB complex. The next challenge for our

Laboratory is to identify the links that connect the aPKCs to the signaling complex of

the receptors for TNFα and IL1, two reported potent activators of NF-κB and the

aPKCs. In this regard, the mechanism that regulate these PKCs is a matter of intense

research. In contrast to other isotypes, the atypicals are not activated by Ca2+, phorbol

esters or diacylglycerol, but can be activated by other important lipid second messen-

gers such as the 3�-phosphoinositides. Our laboratory has contributed significantly to

the characterization of a novel mechanism for the regulation of the aPKCs. This mech-

anism involves the interaction with proteins that act as regulators of their enzymatic

activity or adapters that serve to localize the aPKCs to intracellular regions critical for

their signaling function. Thus, we have recently described three novel protein modula-

tors of the aPKCs: LIP, Par-4, and p62/ZIP. LIP is a selective activator of λ/ιPKC,

whereas Par-4, whose expression is induced in cells undergoing growth arrest and

apoptosis, is an inhibitor of both λ/ιPKC and ζPKC. The interaction of the atypicals

with Par-4 and LIP unveils their role in cell survival. The third protein, p62, serves to

localize both aPKCs in the endosomes, where these kinases receive signals from

cytokine and growth factor receptors internalizing once they are bound to their respec-

tive ligands. The mechanisms whereby p62 couples the aPKCs to the membrane sig-

naling events will be addressed in the forthcoming months.

How the aPKCs regulate cell survival and growth has also attracted the interest

of our group during this past year. It should be stressed the role played by other kinas-

es such as MAPK and PI 3-kinase in these processes. The aPKCs constitute a parallel

pathway to that of Raf for the activation of MAPK. This is particularly relevant because

the balance of MAPK to SAPK and p38 appears critical for apoptosis in response to dif-

ferent cellular insults. In fact, the blockade of the aPKCs by Par-4 triggers the inhibition

of MAPK and the subsequent activation of p38. Recent data from this Laboratory

demonstrates that the simple inhibition of the MAPK basal activity is sufficient to trig-

ger apoptosis and p38 activation through a caspase-dependent mechanism. This effect

88

89

is blocked by serum survival factors acting through the PI 3-kinase/Akt cascade. These

findings unveil an interesting cross-talk between different signaling mechanisms,

involving potential new targets for novel therapeutic intervention. In this regard, our

laboratory, as part of the effort of GlaxoWellcome to develop new medicines has under-

taken the search of aPKC inhibitors using the HTS (High Throughput Screening)

methodology. The finding of these potential new inhibitors will permit the re-evalua-

tion of the role of the aPKCs in animal models of human diseases as well as the design

of new therapeutic agents.

Publicaciones/Publications

� Bandyopadhyay, G., Standaert, M.L., Zhao, L., Yu, B., Avignon, A., Galloway, L.,

Karnam, P., Moscat, J. and Farese, R.V. Activation of Protein Kinase C (α,β,ζ) by

Insulin in 3T3/L1 Cells. Transfection Studies Suggest a Role for PKC-ζ in Glucose

Transport. J. Biol. Chem. 272, 2551-2558 (1997).

� Cai, H., Smola, U., Wixler, V., Eisenmann-Tappe, I., Diaz-Meco, M.T., Moscat, J.,

Rapp, U. and Cooper, G. Role of Diacylglycerol-Regulated Protein Kinase C

Isotypes in Growth Factor Activation of the Raf-1 Protein Kinase. Mol. Cell. Biol.

17, 732-741 (1997).

� Berra, E., Municio, M.M., Sanz, L., Frutos, S., Diaz-Meco, M.T. and Moscat, J.

Positioning Atypical Protein Kinase C Isoforms in the UV-Induced Apoptotic

Signaling Cascade. Mol. Cell. Biol. 17, 4346-4354 (1997).

� Bandyopadhyay, G., Standaert, M.L., Galloway, L., Moscat, J. and Farese, R.V.

Evidence for Involvement of Protein Kinase C (PKC) ζ and Non-Involvement of

Diacylglycerol-sensitive PKCs in Insulin-Stimulated Glucose Transport in L6

Myotubes. Endocrinology 138, 4721-4731 (1997).

� Standaert, M.L., Galloway, L., Karnam, P., Bandyopadhyay, G., Moscat, J. and

Farese, R.V. Protein Kinase C-ζ as a Downstream Effector of Phosphatidylinositol

3-Kinase During Insulin Stimulation in Rat Adipocytes. Potential Role in Glucose

Transport. J. Biol. Chem. 272, 30075-30082 (1997).

90

� Berra, E., Diaz-Meco, M.T. and Moscat, J. The Activation of p38 and Apoptosis bythe Inhibition of Erk is Antagonized by the Phosphoinositide 3-Kinase/AktPathway. J. Biol. Chem. 273, 10792-10797 (1998).

� Sanchez, P., De Carcer, G., Sandoval, I.V., Moscat, J. and Diaz-Meco, M.T.Localization of Atypical Protein Kinase C Isoforms into the Lysosome-targetedEndosomes Through the Interaction with p62. Mol. Cell. Biol. 18, 3069-3080 (1998).

� Lallena, M.J., Diaz-Meco, M.T., Bren, G., Payá, C.V., Moscat, J. Activation of IκBKinase β by Protein Kinase C Isoforms. Mol. Cell. Biol. 19, 2180-2188 (1999).

� Frutos, S., Moscat J., Diaz-Meco, M.T. Cleavage of ζPKC but not of λ/ιPKC byCaspase-3 During UV-Induced Apoptosis. J. Biol. Chem. 274, 10765-10770 (1999).

Tesis Doctorales/Doctoral Theses

José Lozano Castro: �Identificación de la ribonucleoproteína heterogénea nuclear A1como un nuevo substrato de la proteína quinasa C ζ�. Universidad Autónoma deMadrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

María del Mar Municio Escurín: �Identificación y caracterización molecular de regu-ladores específicos de proteínas quinasa C atípicas�. Universidad Autónoma deMadrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Colaboraciones con la industria / Collaborations with Industry

Acuerdo de colaboración entre el CSIC y GlaxoWellcome para la creación del�Laboratorio GlaxoWellcome-CSIC de Biología Molecular y Celular� en el Centro deBiología Molecular-Severo Ochoa.

Collaboration agreement between the CSIC and GlaxoWellcome for the creation of the�GlaxoWellcome-CSIC Laboratory of Molecular and Cellular Biology�, in the CBMSO.

Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions

Jorge Moscat:

� Homenaje a la Biomedicina Española, 1998. Fundación Ciencias de la Salud.

91

TRANSPORTE DE PROTEÍNAS: MECANISMOS MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRANSPORTE DEPROTEÍNAS LISOSOMALES Y VACUOLARES TRANSPORT OF PROTEINS: MOLECULAR MECHANISMSIMPLICATED IN THE TRANSPORT OF LYSOSOMAL AND VACUOLAR PROTEINS

Jefe de Línea / Group Leader: Ignacio V. Sandoval Personal Científico Scientific Personnel: Diego Pulido Vega, Vassiliki LaliotiBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Sonia Martínez Arca, Yolanda Robledo Ozaya,

Mercedes del Valle SanzBecarios Predoctorales Graduate Students: Silvia Palacios Lidón, Eduardo Silles Mc Caney,

Julio Valdueza Beneitez, Silvia Vergara-Jaúregui

Publicaciones / Publications� Sandoval, I.V. and Carrasco, L. Poliovirus infection and expression of the polio-

virus protein 2B provoke the disassembly og the Golgi complex, the organelle tar-get for the antipoliovirus drug Ro-090179. J. Virol. 71, 4679-4693 (1997).

� Sánchez, P., De Carcer, G., Sandoval, I.V., Moscat, J. and Díaz-Meco, M.T.Localization of Atypical Protein Kinase C Isoforms into the Lysosome-targetedEndosomes Through the Interaction with p62. Mol. Cell. Biol. 18, 3069-3080 (1998).

� Di Jeso, B., Pereira, R., Consiglio, E., Formisano, S., Satrústegui, J. and Sandoval,I.V. Demonstration of a Ca2+ requirement for thyroglobulin dimerization andexport to the Golgi complex. Eur. J. Biochemistry 252, 583-590 (1998).


Sonia Martínez Arca: �Mecanismos moleculares involucrados en la segregación y el trans-

porte de dos proteínas de membrana, LIMPII y GLUT4, en la red trans del aparato de

Golgi. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.


92


CITOESQUELETO Y NUCLEOESQUELETO CYTOSKELETON AND NUCLEOSKELETON

Jefe de Línea / Group Leader: Isabel CorreasBecarios Predoctorales Graduate Students: Carlos Manuel Luque, Carmen María Pérez-

Ferreiro, Mª José Lallena Jimeno


Algunos componentes del citoesqueleto están presentes también en otros com-

partimentos celulares. La proteína 4.1 fue originalmente descrita como un compo-

nente de 80 kDa del citoesqueleto del eritrocito humano. Estudios posteriores

pusieron de manifiesto que es una proteína común a todas las células y tejidos, si bien

presenta una gran variabilidad de tamaños moleculares y de distribución subcelular.

Durante el periodo 97-98, el interés de nuestro grupo de trabajo se ha centrado en la

caracterización de las señales responsables de la distribución diferencial de las isofor-

mas de 4.1, así como en el estudio de la función que estas proteínas desempeñan en

los distintos compartimentos celulares en los que han sido detectadas, especialmente

en el núcleo.

Mediante análisis de deleción y/o mutación de cDNAs específicos de 4.1 clo-

nados en nuestro laboratorio, hemos podido establecer un orden jerárquico en las

secuencias de la proteína 4.1. Así, las secuencias responsables de la entrada al núcleo

de la molécula se localizan en la zona carboxilo-terminal (común para las isoformas

traducidas tanto desde el ATG1 como desde el ATG2). La zona amino-terminal especí-

fica de las isoformas traducidas desde el ATG1 bloquea estas señales nucleares de

manera que las proteínas que contienen dicha región permanecen en el citoplas-

ma/membrana plasmática. Estos resultados indican que las señales nucleares son

inactivadas en presencia de la región dominante amino-terminal específica de las iso-

formas traducidas desde el ATG1. Este hallazgo concuerda con el hecho de que solo

se hayan aislado isoformas nucleares dentro del grupo de proteínas 4.1 que se tra-

ducen desde el ATG2.

Respecto al posible papel funcional de 4.1 en el núcleo, hemos continuado cola-

borando con el grupo del Dr. Juan Valcárcel (EMBL, Heidelberg) sobre la caracteri-

zación de la asociación de la proteína 4.1 con factores de splicing. Hemos determina-

do que una de las isoformas de 4.1 clonadas, al igual que el factor de splicing SC35,

interacciona con el factor U2AF35 y no con el U2AF65. Estos datos junto con resultados

previos obtenidos por nuestro grupo, sugieren un papel estructural para la proteína

4.1 nuclear como componente del nucleoesqueleto celular al que se anclan compo-

nentes de la maquinaria de splicing.

Research Summary

Many cytoskeletal proteins have also been detected in other cellular compart-

ments. Protein 4.1 was originally identified as an 80 kDa component of the membrane

skeleton of human red blood cells. Posterior studies showed that multiple immunore-

active proteins 4.1, varying widely in size, were also detected in nucleated cells not

strictly confined to the plasma membrane. Thus, stress fibers, perinuclear regions, cen-

trosomes and the nucleus are different intracellular sites where 4.1 epitopes have been

detected. Studies carried out by our group have confirmed the nuclear localization of

4.1 by transfection experiments of different 4.1 cDNAs isolated from human T lym-

phocytes. During 1997-1998, we have approached to identify the sequence motifs invol-

ved in differential targeting of proteins 4.1 and to investigate the roles that 4.1 plays in

the nucleus. Two main groups of proteins 4.1 can be generated by differential use of

two translation initiation sites, ATG1 and ATG2. The use of ATG1 as translation start

site generates isoforms containing N-terminal extensions of up to 209 amino acids as

compared to those translated from ATG2.

We have identified the nuclear localization signals at the central part of the 4.1

molecule, therefore, they are present in both groups of 4.1 isoforms. Interestingly, the

209 amino acids block nuclear entry of protein 4.1. Thus, appendage of this sequence to

nuclear 4.1 isoforms encoded from ATG2 abrogate their nuclear targeting.

93

94

Concomitantly with this, 4.1 isoforms encoded from ATG1 are predominantly localized

to the plasme membrane, endoplasmic reticulum and cytoplasm but not to the nucleus.

These results indicate that the amino-terminal region of proteins 4.1 encoded from

ATG1 plays a pivotal role in the differential targeting of proteins 4.1.

Regarding to the studies on the nuclear role of proteins 4.1, we have continued

our collaboration with Dr. Juan Valcarcel�s group (EMBL, Heidelberg). We have deter-

mined that a specific nuclear 4.1 isoform associates with the splicing factor U2AF35 but

not with U2AF65, in a similar way as SC35 does. These data together with previous

results obtained by our group indicate that protein 4.1 is a component of the nucle-

oskeleton to which proteins of the splicing machinery attach.


� Lallena, M.-J. and Correas, I. Transcription-dependent redistribution of nuclearprotein 4.1 to SC35-enriched nuclear domains. J. Cell Sci. 110, 239-247 (1997).

� Lallena, M.-J., Martínez, C., Valcárcel, J. and Correas, I. Functional association ofnuclear protein 4.1 with pre-mRNA splicing factors. J. Cell Sci. 111, 1963-1971 (1998).

� Franco, P., Massa, O., García-Rocha, M., Chiaradonna, F., Iaccarino, C., Correas,I., Méndez, E., Ávila, J., Blasi, F. and Stopelli, P. Protein kinase C-dependent invivo phosphorylation of prourokinase leads to the formation of a receptor compe-titive antagonist. J. Biol. Chem. 273, 27734-27740 (1998).

� Luque, C.M., Lallena, M.-J., Alonso, M.A. and Correas, I. An alternative domaindetermines nuclear localization in multifunctional protein 4.1. J. Biol. Chem. 273,11643-11649 (1998).


María José Lallena Jimeno: �Identificación de isoformas nucleares de la proteína 4.1:Asociación con factores implicados en el procesamiento del RNA precursor�Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

95

GRUPO DE TERAPIA GÉNICA EXPERIMENTALEXPERIMENTAL GENE THERAPY GROUP

Investigadores Principales /Principal Investigators: Marta Izquierdo y Antonio TalaveraPersonal Científico Scientific Personnel: Antonio Liras MartínBecarios Predoctorales Graduate Students: Marisa Cortés, Pablo de Felipe, Laura Fuentes

Sánchez, Isabel Jimenez, Luisa Fernanda Mariscal, Verónica Martín, Fernando Martín Gordillo, RaquelMartín Palomeque, Humberto Sánchez González

Técnicos de Investigación Technical Assistance: Marta Vaz, Belén ViñaCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Nora Calcaterra (Universidad de Rosario.

Argentina), Marcelo López-Lastra (INSERM U412, Francia)

Resumen de Investigación (M. Izquierdo)

Terapia génica de tumores cerebrales malignos

Los glioblastomas representan casi el 40% de los tumores primarios cerebrales,

poseen una mortandad superior al 90 % considerándose prácticamente incurables. Los

tratamientos empleados hasta el momento (radioterapia, quimioterapia y cirugía) no

han sido capaces de mejorar estos drásticos resultados. Los avances recientes en inge-

niería genética permiten la utilización de nuevas estrategias. Una de estas estrategias es

la utilización de vectores retrovíricos que depositen en cada célula tumoral un gen

capaz de inducir su destrucción. Los retrovirus solamente infectan células en división y

la gran mayoría de las células del cerebro adulto no se dividen; prácticamente las úni-

cas células proliferativas en un cerebro que alberga un tumor son las neoplásicas. Se

pueden elaborar �retrovirus terapeúticos� en los que algunos genes esenciales del virus

están sustituidos por genes asesino-suicidas entre los que se encuentra el gen de la


quinasa de timidinas del virus Herpes simplex (tk ); esta quinasa no es tan estricta como

su homóloga celular y fosforila análogos de nucleósidos, como el �ganciclovir�, convir-

tiéndolo en un competidor de la guanosina trifosfato. La incorporación en el DNA del

ganciclovir fosforilado interfiere con la replicación y produce la muerte celular.

También se estan utilizando vectores que llevan otros genes asesino-suicida como por

ejemplo el gen de la linamarasa (lin ). El gen lin codifica la enzima β-glucosidasa (lina-

marasa) que hidroliza la linamarina (2-0H-isobutironitrilo-β-D-glucopiranósido) a glu-

cosa y cianuro. El cDNA ha sido clonado y caracterizado, se han construído vectores

retrovirales portadores del gen y se ha determinando su efectividad como gen suicida

in vitro e in vivo. Es la primera vez que se utiliza un gen de origen vegetal para el

tratamiento del cáncer. Hemos encontrado que el efecto colateral del cianuro produci-

do en el sistema linamarasa/linamarina permite eliminar tumores de gran tamaño. No

hemos encontrado efectos secundarios aparentes en los animales de experimentación,

cuya evolución patológica se ha seguido por imágenes de resonancia magnética.

Resumen de Investigación (A. Talavera)

Nuestro interés se centra en la adaptación de vectores retrovirales a terapia géni-

ca de sustitución y de células en reposo. El uso de la primera es apropiado en el trata-

miento de enfermedades monogénicas debidas a mutaciones puntuales, (como la ane-

mia falciforme), y/o pequeñas alteraciones (hemofilias), ya que soslayaría los inconve-

nientes encontrados en la terapia génica de adición en que, debido a efectos de posición

y al uso de promotores y otras secuencias ajenas al gen, éste es comúnmente silenciado

o exhibe expresión inadecuada para los fines terapéuticos perseguidos. A fin de favo-

recer la interacción homóloga entre la secuencia génica correctora incluída en el vector

y el gen residente, hemos estudiado dos modos de inhibir la integración propia de los

retrovirus: 1) en cis, (deleción de secuencias de DNA reconocidas por la integrasa); 2) en

trans, (uso de un gen de integrasa con terminación prematura). Células murinas conte-

niendo el gen de la timidina kinasa inactivado por una mutación quasi-puntual, fueron

transfectadas con vectores retrovirales deficientes en integración y portadores de una

secuencia parcial del gen no mutado. La obtención de clones con actividad timidina

kinasa (seleccionables en medio HAT), cuyo gen curado está siendo actualmente carac-

96

97

terizado, nos permite concluir que los vectores retrovirales son aplicables a la terapia

génica sustitutiva. La evaluación de la frecuencia de curación respecto a la de insercio-

nes no homólogas permitirá abordar la optimización de este tipo de vectores

Los vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina de Moloney

(MoMLV) son incapaces de transfectar células que no pasen por mitosis en un corto

periodo tras la infección, lo que impide su uso en numerosos casos en que el objeto de

la terapia génica lo constituyen las células madres hematopoyéticas. Actualmente se

están desarrollando vectores basados en lentivirus (incluyendo el VIH), ya que éstos, a

diferencia del MoMLV, presentan señales de localización nuclear (SNL) en proteínas

que acompañan al DNA recién retrotranscrito. Este tipo de vectores de genoma com-

plejo es dificil de manejar y, cuando se basan en el VIH, su uso comporta evidente ries-

go. Nuestro grupo ha diseñado un enfoque alternativo en el que la preparación de vec-

tores basados en el MoMLV, incluye una integrasa a la que se ha añadido la SLN del

antígeno T de SV40. Experimentos preliminares sugieren que estos vectores, a diferen-

cia de sus homólogos sin la NLS, son capaces de transfectar células arrestadas en la fase

S del ciclo celular.

Research Summary (M. Izquierdo)

Gene therapy in malignant brain tumors

The glioblatoma represents almost 40% of all primary brain tumors, have over

90% mortality and are considered virtually incurable. The current cancer therapies

such as surgery, radiation and/or chemotherapy, have had little success to improve the

median survival, of less than a year, in patients with malignant gliomas. The new

advances in genetic engineering allows the use of new strategies. One of these new

strategies is based upon retroviral vectors carrying potentially killer-suicide genes, able

to kill each cell of the tumor cells. Retrovirus infect and integrate only into dividing cells

offering a very selective possibility of targeting neoplastic cells within an adult brain,

this mainly constituted by nondividing cells. Retroviral vectors have been created from

the Moloney murine leukemia virus; one of these vectors carried the potential suicide

gene thymidine kinase (tk) from the herpes simplex virus. The thymidine kinase (TK)

98

produced by the herpes simplex virus (HSV) is not as strict as its mammalian cellular

counterpart and can phosphorilate nucleoside analogs such as ganciclovir or aciclovir

into nucleotide-like precursors that will block replication of the DNA which results into

killing the dividing cell. We have also made vectors carrying other killer-suicide gene

called linamarasa (lin ). The gene codes for the enzyme β-glucoxidase (linamarasa) that

hydrolizes linamarine (2-0H-isobutyronitrilo-β-D-glucopyranoxide) to cyanide and

glucose. The efficiency of this and other new constructs is being tested both in vitro and

in vivo. It is the first time that a plant gene is used in cancer therapy. We have shown

that the system can eradicate very large intracerebral gliomas in vivo helped by a

cyanide bystander effect. Animals showing a total regression of the tumor by magnetic

resonance imaging (MRI), do not show other appreciable toxic effects.

Research Summary (A. Talavera)

Our aim is the adaptation of retroviral vectors to substitutive- or resting-cell gene

therapy, the former being the best option for the correction of monogenic diseases due

to point mutations (e.g. sickle-cell anemia) or small alterations (e.g. hemophilias). This

type of gene therapy is expected to circunvent the difficulties inherent to the use of

additive gene therapy, in which the therapeutic gene is frequently silenced or its expres-

sion imbalanced, due to position effects as well as to the use of promoters and other

expression signals that are not the ones that control the gene in a natural context. With

the purpose of favouring the homologous interaction between the correcting gene

sequence included in the vector and the resident cellular gene we have studied diffe-

rent ways to inhibit the random integration characteristic of retroviruses: 1) in cis, by

deleting the DNA sequence recognized by the viral integrase; 2) in trans, by using a pac-

kaging system that includes a prematurely truncated integrase gene. Cells containing a

point mutation-inactivated thymidine kinase were transfected with integration-defi-

cient retroviral vectors carrying a partial sequence of the native gene. The isolation of

HAT-resistant cells that produce active thymidine kinase, whose corrected gene is

currently being characterized allowed us to conclude that retrovirus-based vectors can

be used in substitutive gene therapy. The evaluation of the relative frequencies of

homologous correction and random, non-homologous insertion is expected to be of

help in the optimization of this type of vectors.

99

Retroviral vectors based on Moloney murine leukemia virus (MoMLV) are una-

ble to transfect cells unless these undergo mitosis shortly after infection. This fact pre-

vents the use of these vectors in gene therapy aimed to hematopoietic stem cells.

Currently, vectors are being developed that are based on lentivirus (including HIV), as

these carry nuclear localization sites (NLS) in proteins that bind to the newly retro-

transcribed DNA. The manipulation of these vectors is difficult, given their complex

genome and, in the case of HIV-based vectors, dangerous, due to the patogenicity of the

corresponding wild-type virus. We have devised an alternative approach in which the

preparation of MoMLV-based vectors includes the use of an engineered integrase to

which the SV40 T-antigen NLS sequence has been added. Preliminary experiments sug-

gest that these vectors, unlike their NLS-less counterparts, are able to transduce cells

that are arrested in the S phase of the cell cycle.


� Izquierdo, M., Cortés, M.L., Martín, V., de Felipe, P., Izquierdo, J.M., Pérez-

Higueras, A., Paz, J.F., Isla, A. and Blázquez, M.G. Gene therapy in brain tumors:

implications of the size of glioblastoma on its curability. Advances in Stereotactic

and functional neurosurgery (12), and Acta Neurochirurgica 68, 111-117 (1997).

� Izquierdo, M. Situación actual de la terapia génica en enfermedades hereditarias

y cáncer. Capítulo del libro titulado Biotecnología y enseñanza . Ed. Colegio Oficial

de Biólogos, Madrid. pp. 149-161 (1997).

� Begreve, B., Andrei, G., Izquierdo, M., Piette, J., Morin, K., Knaus, E.E., Wiebe,

L.I., Basrah, I. Walker, R.T., De Clercq and Balzarini, J. Varicella zoster virus thy-

midine kinase gene and antiherpetic pyrimidine nucleoside analogues in a com-

bined gene/chemotherapy treatment for cancer. Gene Therapy 4, 1107-1114 (1997).

� Izquierdo, M. Papel de la terapia génica en oncología: el tratamiento de los tumo-

res cerebrales malignos como modelo. 27, Cáncer 96. Actualizaciones en oncología.

Ed. Fundación BBV. Bilbao pp. 392-408 (1997).

100

� Izquierdo, M. Gene therapy. Methods and findings in experimental and clinical phar-

macology 19, (suppl. A) 7-8 (1997).

� Izquierdo, M. An overview of gene therapy approaches to neurological malig-

nancies. BioDrugs 4, 337-349 (1998).

� Cortés, M.L., de Felipe, P., Martín, V., Hughes, M.A. and Izquierdo, M. Successful

use of a plant gene in the treatment of cancer in vivo. Gene Therapy 5, 1499-1507

(1998).


Fernando Martín Gordillo: "Nuevos sistemas de empaquetamiento de vectores retro-

virales para terapia génica". Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación:

Apto cum laude.

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry

Colaboración con la empresa Boehringer Ingelheim International/ IMP Viena en el

proyecto: Gene therapy of rat glioblastoma using the AVET technique (1997).

Colaboración con la empresa Boehringer Ingelheim International/ IMP Viena en el

proyecto: Glioblastoma total regression in vivo by linamarase/linamarin killer-suicide

gene therapy system (1998).

Biología Celular Cell Biology - cbm.uam.es · La morfogØnesis neuronal depende de la...

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