UNE-EN ISO 9408normaespañola

Mayo 2000

TÍTULO Calidad del agua

Evaluación de la biodegradabilidad aerobia final de loscompuestos orgánicos en medio acuoso mediante ladeterminación de la demanda de oxígeno en un respirómetrocerrado

(ISO 9408:1999)

Water quality. Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous mediumby determination of oxygen demand in a closed respirometer. (ISO 9408:1999)

Qualité de l'eau. Evaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques, en milieuaqueux, par détermination de la demande on oxygène dans un respiromètre fermé. (ISO 9408:1999)

CORRESPONDENCIA Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 9408 deagosto 1999, que a su vez adopta íntegramente la Norma InternacionalISO 9408:1999.

OBSERVACIONES Esta norma anula y sustituye a la Norma UNE-EN 29408 de junio 1995.

ANTECEDENTES Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio Ambientecuya Secretaría desempeña AENOR.

Editada e impresa por AENORDepósito legal: M 19483:2000

LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:

22 Páginas

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Grupo 15

S

NORMA EUROPEAEUROPEAN STANDARDNORME EUROPÉENNEEUROPÄISCHE NORM

EN ISO 9408Agosto 1999

ICS 13.060.00 Sustituye a EN 29408:1993

Versión en español

Calidad del aguaEvaluación de la biodegradabilidad aerobia final de los compuestos orgánicos

en medio acuoso mediante la determinación de la demanda de oxígenoen un respirómetro cerrado

(ISO 9408:1999)

Water quality. Evaluation of ultimateaerobic biodegradability of organiccompounds in aqueous medium bydetermination of oxygen demand in aclosed respirometer.(ISO 9408:1999)

Qualité de l'eau. Evaluation de labiodégradabilité aérobie ultime descomposés organiques, en milieu aqueux,par détermination de la demande onoxygène dans un respiromètre fermé.(ISO 9408:1999)

Wasserbeschaffenheit. Bestimmung dervollständigen aeroben biologischenAbbaubarkeit organischer Stoffe imwäβrigen Medium über die Bestimmungdes Sauerstoffbedarfs in einemgeschlossenen Respirometer.(ISO 9408:1999)

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 1999-08-01. Los miembros de CEN están sometidos al ReglamentoInterior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la normaeuropea como norma nacional.

Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, puedenobtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros.

Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizadabajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tiene elmismo rango que aquéllas.

Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos,Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia y Suiza.

CENCOMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for StandardizationComité Européen de NormalisationEuropäisches Komitee für Normung

SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles

1999 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

EN ISO 9408:1999 - 4 -

ANTECEDENTES

El texto de la Norma Internacional ISO 9408:1999 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 147"Calidad del agua " en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 230 "Análisis del agua", cuya Secretaríaestá desempeñada por DIN.

Esta norma sustituye a la Norma EN 29408:1993.

Esta norma europea deberá recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico ala misma o mediante ratificación antes de finales de febrero de 2000, y todas las normas nacionalestécnicamente divergentes deberán anularse antes de finales de febrero de 2000.

De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, los siguientes países están obligados a adoptaresta norma europea: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda,Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia ySuiza.

NOTA DE CEN/CS: Los antecedentes son susceptibles de modificación cuando se reciba la versiónalemana. Los antecedentes confirmados o modificados, y si procede, el anexo ZA normativo para lasreferencias a publicaciones internacionales con sus publicaciones europeas correspondientes se harán circularcon la versión alemana.

DECLARACIÓN

El texto de la Norma Internacional ISO 9408:1999 ha sido aprobado por CEN como norma europea sinninguna modificación.

- 5 - ISO 9408:1999

ÍNDICE

Página

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................ 6

2 TÉRMINOS Y DEFINICIONES.......................................................................................... 6

3 FUNDAMENTO ....................................................................................................................7

4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO............................................................ 8

5 REACTIVOS ......................................................................................................................... 8

6 APARATOS ........................................................................................................................... 9

7 PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 10

8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS...................................................... 13

9 VALIDEZ DE LOS RESULTADOS.................................................................................... 15

10 INFORME DE ENSAYO...................................................................................................... 15

ANEXO A (Informativo) EJEMPLO DEL CÁLCULO DE LA DEMANDATEÓRICA DE OXIGENO .................................................................. 17

ANEXO B (Informativo) CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO PARAELIMINAR LA INTERFERENCIA CON EL PROCESODE NITRIFICACIÓN ......................................................................... 18

ANEXO C (Informativo) EJEMPLO DE UNA CURVA DE BIODEGRADACIÓN................ 20

ANEXO D (Informativo) RESPIRÓMETRO CERRADO.......................................................... 21

BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................... 22

ISO 9408:1999 - 6 -

PRECAUCIÓN − Los lodos activados y las aguas residuales contienen organismos potencialmente patógenos.Deben tomarse las precauciones adecuadas para su manipulación. Los compuestos de ensayo tóxicos y aquellosde los que se desconocen sus propiedades, deben manipularse con precaución.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma internacional especifica un método para la evaluación, en medio acuoso, de la biodegradabilidad final de loscompuestos orgánicos y de las aguas residuales a una concentración dada, bajo la acción de microorganismos aerobios,mediante la determinación de la demanda oxígeno en un respirómetro cerrado.

El método es aplicable a los compuestos orgánicos que:

a) sean solubles en agua en las condiciones de ensayo;

b) sean poco solubles en agua en las condiciones de ensayo, en cuyo caso puede resultar necesario poner en prácticamedidas que garanticen una buena dispersión del compuesto (véase, por ejemplo, la Norma ISO 10634);

c) no estén en contacto ni reaccionen con el absorbente de CO2;

d) sean volátiles, siempre y cuando se utilice un respirómetro adecuado o se den las condiciones apropiadas (porejemplo, una relación más pequeña entre el volumen de espacio de cabeza y el volumen del medio líquido);

e) no tengan un efecto inhibidor sobre los microorganismos de ensayo a los niveles de concentración seleccionadospara el ensayo. La presencia de efectos inhibidores se puede determinar conforme a lo especificado en el apartado7.3, o mediante la utilización de cualquier otro método para determinar el efecto inhibidor que un compuesto ejercesobre las bacterias (véase, por ejemplo, la Norma ISO 8192).

NOTA − Las condiciones que se describen en esta norma internacional no siempre corresponden a las condiciones óptimas que permiten laobtención del máximo grado de biodegradación. Otros métodos de biodegradación se indican en la Norma ISO 15462.

2 TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los fines de esta norma internacional, son de aplicación las siguientes definiciones:

2.1 biodegradación aerobia final: Descomposición de un compuesto químico o de materia orgánica en dióxido decarbono, agua y sales minerales de cualquier otro elemento presente (mineralización), con producción de nuevabiomasa, por acción de microorganismos y en presencia de oxígeno.

2.2 biodegradación primaria: Modificación estructural (transformación) de un compuesto químico por acción demicroorganismos, que produce la pérdida de una propiedad específica.

2.3 lodo activado: Biomasa producida en el tratamiento aerobio de las aguas residuales por el crecimiento de lasbacterias y de otros microorganismos en presencia de oxígeno disuelto.

2.4 concentración de sólidos en suspensión de un lodo activado: Cantidad de sólidos obtenidos por filtración ocentrifugación de un volumen conocido de lodo activado y secado a una temperatura de aproximadamente 105 ºC, hastamasa constante

2.5 demanda bioquímica de oxígeno (DBO): Concentración másica de oxígeno disuelto consumido, en condicionesdefinidas, por la oxidación biológica aerobia de un compuesto químico o de la materia orgánica presente en el agua.

NOTA − La DBO se expresa, en este caso, como miligramos de oxígeno consumido por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.

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2.6 demanda química de oxígeno (DQO): Concentración másica de oxígeno equivalente a la cantidad de un oxidanteespecífico consumido por un compuesto químico, o por la materia orgánica, cuando una muestra de agua se trata condicho oxidante bajo condiciones definidas.

NOTA − La DQO se expresa en este caso como miligramos de oxígeno requeridos por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.

2.7 demanda teórica de oxígeno (DTO): Cantidad máxima teórica de oxígeno necesaria para oxidar completamenteun compuesto químico, calculada a partir de su fórmula molecular

NOTA − La DTO se expresa en este caso como miligramos de oxígeno necesarios por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.

2.8 carbono orgánico disuelto (COD): Fracción del carbono orgánico presente en el agua que no puede eliminarsepor el método de separación de fases especificado.

NOTA − Un método de separación de fases especificado puede ser, por ejemplo, la centrifugación a 40 000 m.s-2 durante 15 min, o la filtración através de una membrana con un diámetro de poro de 0,2 µm a 0,45 µm.

2.9 fase de latencia: Período de tiempo transcurrido desde el inicio de un ensayo hasta el momento en el que seconsigue la adaptación y/o la selección de los microorganismos responsables de la degradación y en el que la tasa debiodegradación de un compuesto químico o de la materia orgánica ha aumentado hasta un 10% aproximadamente delnivel máximo de biodegradación.

NOTA − La fase de latencia de expresa en días.

2.10 nivel máximo de biodegradación: Tasa máxima de biodegradación de un compuesto químico o de la materiaorgánica en un ensayo, por encima de la cual no tiene lugar biodegradación alguna en el transcurso del ensayo.

NOTA − El nivel máximo de degradación se expresa como porcentaje.

2.11 fase de biodegradación: Período de tiempo transcurrido desde el final de la fase de latencia de un ensayo hastael momento en el que se alcanza el 90% del nivel máximo de degradación

NOTA − La fase de biodegradación se expresa en días.

2.12 fase de meseta: Período de tiempo transcurrido desde el final de la fase de biodegradación hasta el final delensayo

NOTA − La fase de meseta se expresa en días.

2.13 pre-exposición: Preincubación del inóculo en presencia del compuesto químico de ensayo o de la materiaorgánica, con el fin de aumentar la capacidad de dicho inóculo para biodegradar el material de ensayo, por adaptacióny/o selección de los microorganismos.

2.14 pre-acondicionamiento: Preincubación del inóculo en las condiciones de ensayo, pero en ausencia delcompuesto químico de ensayo o de la materia orgánica, con el fin de mejorar la eficacia del ensayo, por aclimatación delos microorganismos a las condiciones de ensayo.

3 FUNDAMENTO

Determinación de la biodegradación de los compuestos orgánicos por microorganismos aerobios en un medio de ensayoacuoso estático. En el contexto de esta norma internacional, las aguas residuales están incluidas dentro de loscompuestos orgánicos. La mezcla para el ensayo contiene un medio inorgánico, el compuesto orgánico como únicafuente de carbono y energía a una concentración generalmente de 100 mg/l de carbono orgánico [pero su demandateórica de oxígeno (DTO) debe ser de al menos 100 mg/l], y un inóculo mixto procedente de una planta de tratamientode aguas residuales o de cualquier otro origen medioambiental.

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La mezcla se agita dentro de un recipiente de ensayo cerrado y se determina el consumo de oxígeno bien por mediciónde la cantidad de oxígeno necesaria para mantener un volumen constante de gas en el respirómetro o bien midiendo elcambio de volumen o de presión (o una combinación de ambos) en el equipo. El dióxido de carbono que se libera seabsorbe con una sustancia adecuada en el interior del recipiente de ensayo.

Se realiza el seguimiento de la degradación durante un período de 28 días, o más si fuera necesario, mediante ladeterminación automática o manual del consumo de oxígeno. La cantidad de oxígeno consumida por el compuestoorgánico (después de realizada la corrección por comparación con el ensayo en blanco) se expresa como porcentaje dela demanda teórica de oxígeno (DTO) calculada a partir de la fórmula del compuesto, o bien como porcentaje de lademanda química de oxígeno (DQO).

Para los compuestos suficientemente solubles en agua, es posible determinar (opcionalmente) la eliminación de carbonoorgánico disuelto (COD) midiendo la concentración de COD al principio y al final de la incubación, con el fin deobtener información adicional relativa a la biodegradación final. Puede obtenerse información acerca de labiodegradación primaria siempre que se disponga de un método analítico específico para la sustancia.

4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO

La incubación debe realizarse en la oscuridad o con iluminación difusa, a una temperatura que se encuentre en elintervalo comprendido entre 20 ºC y 25 ºC y que no varíe en más de ± 1 ºC durante el ensayo.

5 REACTIVOS

Deben utilizarse únicamente reactivos de calidad analítica reconocida.

5.1 Agua

Agua destilada o desionizada cuyo contenido en COD sea inferior a 1 mg/l.

5.2 Medio de ensayo

5.2.1 Composición

5.2.1.1 Solución a). Se disuelven:

dihidrógenofosfato de potasio anhidro (KH2PO4) 8,5 g

hidrógeno fosfato de dipotasio anhidro (K2HPO4) 21,75 g

hidrógeno fosfato de disodio dihidratado (Na2HPO4.2H2O) 33,4 g

cloruro de amonio (NH4Cl) 0,5 g

agua (5.1), en la cantidad necesaria para enrasar a 1 000 ml

Con objeto de controlar esta solución tampón, es recomendable medir el pH, que debe tener un valor aproximado de7,4. En caso contrario debe prepararse una nueva solución.

5.2.1.2 Solución b). Se disuelven 22,5 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) en agua (5.1) y seenrasa a 1000 ml.

5.2.1.3 Solución c). Se disuelven 36,4 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) en agua (5.1) y se enrasa a1 000 ml.

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5.2.1.4 Solución d). Se disuelven 0,25 g de cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3.6H2O) en agua (5.1) y seenrasa a 1 000 ml. La solución se prepara inmediatamente antes de su utilización, o se añade una gota de ácidoclorhídrico concentrado (HCl) para evitar la formación de precipitados.

5.2.2 Preparación del medio de ensayo. Para preparar 1 000 ml de medio de ensayo se añaden, a unos 800 ml deagua (5.1):

− 10 ml de la solución a);

− 1 ml de cada una de las soluciones b), c) y d).

Se enrasa a 1 000 ml con agua (5.1). El medio de ensayo debe prepararse inmediatamente antes de su utilización. Lassoluciones a), b) y c) pueden conservarse hasta 6 meses, en la oscuridad y a temperatura ambiente.

5.3 Absorbente del dióxido de carbono

Solución de hidróxido de potasio (aproximadamente 10 mol/l), carbonato de sodio granulado o cualquier otroabsorbente adecuado.

5.4 Solución de cloruro de mercurio

Se disuelve 1 g de cloruro de mercurio (II) (HgCl2) en 100 ml de agua (5.1).

5.5 Solución de hidróxido de sodio

Se disuelve hidróxido de sodio (NaOH) en agua (5.1) para obtener una solución con una concentración entre 0,1 mol/l y0,5 mol/l.

5.6 Solución de ácido clorhídrico

Se diluye ácido clorhídrico concentrado (HCl) en agua (5.1) para obtener una solución con una concentración entre0,1 mol/l y 0,5 mol/l.

6 APARATOS

Es necesario asegurarse de que todo el material de vidrio ha sido limpiado cuidadosamente y que se encuentra exento decualquier sustancia orgánica o tóxica.

6.1 Respirómetro cerrado

El anexo D describe el principio de funcionamiento de un respirómetro cerrado. El respirómetro contiene los recipientesde ensayo que permiten el suministro de oxígeno, aporta la agitación, e incluye los tubos impermeables al oxígeno y aldióxido de carbono. Los recipientes del respirómetro se conservan en un recinto que esté a temperatura constante o enun baño de agua termostatizado. Cuando se realizan ensayos sobre compuestos volátiles, deben utilizarse aparatosespecíficos apropiados o adaptados a esta utilización particular. Deben tomarse las medidas adecuadas para evitarpérdidas de compuesto a causa del aparato.

6.2 Baño de agua o recinto termostatizado (para satisfacer los requerimientos del capítulo 4).

6.3 Equipo para la determinación del carbono orgánico disuelto

Instrumento de sensibilidad suficiente para la medida del carbono orgánico disuelto (COD) (opcional).

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6.4 Dispositivo para la determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) (opcional)

6.5 Centrífuga o sistema de filtración

La centrífuga debe ser capaz de producir una aceleración de 4 000 g.

El sistema de filtración debe estar equipado con filtros de membrana (de diámetro nominal de poro de 0,2 µm a0,45 µm), que no absorban ni liberen carbono orgánico.

6.6 pH-metro (equipo corriente de laboratorio).

7 PROCEDIMIENTO

7.1 Preparación de las soluciones de ensayo

7.1.1 Compuesto de ensayo. Se prepara una solución madre de un compuesto de ensayo suficientemente soluble enagua, en el medio de ensayo (5.2) y se añade una cantidad adecuada de esta solución a los recipientes de ensayo demodo que se obtenga una concentración másica final de 100 mg/l del compuesto de ensayo, equivalente como mínimo auna demanda teórica de oxígeno (DTO) de 100 mg/l. En función de las propiedades del compuesto de ensayo (porejemplo, la toxicidad) y del objetivo del ensayo, pueden utilizarse otras concentraciones. Los compuestos poco solublesse añaden directamente en los recipientes de ensayo. Se determina la cantidad añadida con exactitud. Se determina, sifuera necesario, la DQO del compuesto de ensayo conforme, por ejemplo, a la Norma ISO 6060.

NOTA − Véase la Norma ISO 10634 para más detalles relativos a la manipulación de compuestos débilmente solubles en agua.

7.1.2 Solución del compuesto de referencia. Se utiliza como compuesto de referencia un compuesto orgánico debiodegradabilidad conocida, como por ejemplo anilina o benzoato de sodio, que tienen tasas de degradación > 60%. Seprepara una solución madre del compuesto de referencia en el medio de ensayo (5.2), de la misma forma que se hacepara el caso del compuesto de ensayo soluble en agua (7.1.1), con objeto de obtener una concentración másica final de100 mg de compuesto de referencia por litro de medio de ensayo.

7.1.3 Solución de control de la inhibición. Si fuera necesario (por ejemplo, cuando no se dispone de informaciónacerca de la toxicidad del compuesto de ensayo), se prepara una solución que contenga, en el medio de ensayo (5.2), ala vez el compuesto de ensayo (7.1.1) y el compuesto de referencia (7.1.2), preferiblemente con unas concentracionesde 100 mg/l de cada uno de ellos.

7.2 Preparación del inóculo

7.2.1 Generalidades. Se prepara el inóculo utilizando preferiblemente un lodo activado procedente de las fuentessiguientes (7.2.2 a 7.2.4) o una mezcla de dichas fuentes, de modo que se obtenga una población microbiana quepresente una suficiente actividad de biodegradación. Se controla la actividad del inóculo a través del compuesto dereferencia (7.1.2 y capítulo 9). La DBO del blanco debe satisfacer las exigencias del criterio de validez (véase elcapítulo 9). Para reducir la influencia del blanco, puede resultar de utilidad realizar un pre-acondicionamiento delinóculo, por ejemplo aireándolo durante una semana antes de su utilización. Debe utilizarse un volumen adecuado parala inoculación.

NOTA − Con objeto de permitir una predicción general del comportamiento de degradación en el medio ambiente, generalmente no es convenienterealizar una pre-exposición del inóculo al compuesto de ensayo. No obstante, en ciertas circunstancias y según el propósito del ensayo,puede realizarse una pre-exposición del inóculo, siempre que este hecho se especifique claramente en el informe de ensayo (por ejemplo,porcentaje de biodegradación = x %, utilizando un inóculo pre-expuesto) y a condición de que el método de pre-exposición se detalle en elinforme de ensayo. Los inóculos pre-expuestos pueden obtenerse a partir de ensayos de biodegradación en laboratorio, efectuados endiferentes condiciones (por ejemplo, ensayo de Zahn-Wellens conforme a la Norma ISO 9888 y el ensayo SCAS según la NormaISO 9887) o a partir de muestras recogidas de lugares en los que se dan circunstancias ambientales particulares (por ejemplo, plantasdepuradoras que tratan compuestos similares o zonas contaminadas).

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Basándose en la experiencia, un "volumen adecuado" es aquel:

− que permite obtener una población que ofrece suficiente actividad de biodegradación;

− que degrada el compuesto de referencia en el porcentaje estipulado (véase el capítulo 9);

− que proporciona entre 103 y 106 unidades formadoras de colonias por mililitro en la mezcla final;

− que no proporciona más del equivalente a 30 mg/l de sólidos en suspensión de lodo activado en la mezcla final;

− que la cantidad de carbono orgánico disuelto aportado por el inóculo sea preferentemente menor al 10% de laconcentración inicial de carbono orgánico introducida por el compuesto de ensayo.

Generalmente, son suficientes de 1 ml a 10 ml de inóculo por cada 1 000 ml de solución de ensayo.

7.2.2 Inóculo procedente de planta de tratamiento con lodos activados. Se toma una muestra de lodo activado deun tanque de aireación de una planta de tratamiento de aguas residuales, o de una planta piloto de laboratorio, que tratepredominantemente aguas de origen urbano. Se mezcla bien y se determina la concentración de sólidos en suspensióndel lodo activado (utilizando, por ejemplo, la Norma ISO 11293). Si fuera necesario, se concentra el lodo pordecantación, de manera que el volumen de lodo añadido en el ensayo sea mínimo, pero que cumpla en cualquier casolos criterios indicados en 7.2.1. Si se sospecha la presencia de sustancias inhibidoras en el lodo, se centrifuga, se lavacon medio de ensayo (5.2), se vuelve a centrifugar y se suspende nuevamente en el medio de ensayo. La muestra debemantenerse en condiciones aerobias y es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Debe utilizarse un volumenadecuado (véase 7.2.1) como para obtener una concentración de 30 mg/l de sólidos en suspensión en la mezcla final.

7.2.3 Inóculo de agua residual. Se toma una muestra del influente o del efluente de una planta de tratamiento deaguas residuales, o de una planta piloto de laboratorio, que trate predominantemente aguas de origen urbano. Si fueranecesario, se concentra la muestra por filtración o centrifugación. Se mezcla bien. La muestra debe mantenerse encondiciones aerobias y es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Antes de su utilización, se deja decantar lamuestra durante 1 h y se toma un volumen adecuado del sobrenadante para la inoculación.

7.2.4 Inóculo procedente de aguas superficiales. Se toma una muestra de un agua superficial adecuada. Si fueranecesario, se concentra la muestra por filtración o centrifugación. La muestra debe mantenerse en condiciones aerobiasy es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Se utiliza un volumen adecuado como inóculo.

7.3 Ensayo

Se instala el respirómetro (véase 6.1 y el ejemplo que se describe en el anexo D). Se prepara un número suficiente derecipientes de ensayo con el fin de disponer de:

− al menos 2 recipientes de ensayo (símbolo FT) que contengan el compuesto de ensayo (7.1.1);

− al menos 2 recipientes para el ensayo en blanco (símbolo FB) que contengan el medio de ensayo y el inóculo;

− al menos 1 recipiente destinado al control del procedimiento (símbolo FC) que contenga el compuesto de referencia(7.1.2);

− si fuera necesario, 1 recipiente (símbolo FI) destinado a verificar un posible efecto inhibidor del compuesto deensayo, que contenga la solución (7.1.3);

− si fuera necesario, 1 recipiente (símbolo FS) para verificar la posible degradación abiótica, que contenga elcompuesto de ensayo (7.1.1) pero no el inóculo, esterilizado por adición de un compuesto inorgánico tóxicoapropiado que inhiba la actividad microbiana. Se utiliza, por ejemplo, 1 ml/l de una solución de cloruro de mercurio(II) (5.4). Si fuera necesario, se añade la misma cantidad de sustancia tóxica dos semanas después del inicio delensayo.

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Se añaden, en los recipientes de ensayo respectivos conforme a la Tabla 1, las cantidades apropiadas de medio deensayo (5.2), de inóculo (7.2), de compuesto de ensayo (7.1.1) y de compuesto de referencia (7.1.2), a lasconcentraciones adecuadas para obtener el volumen final de ensayo deseado. Se añade el absorbente (5.3) en loscompartimentos de absorción de CO2 de los recipientes. Se mide el valor del pH del contenido de los recipientes y, si esnecesario, se ajusta a 7,4 con ayuda de las soluciones 5.5 ó 5.6.

Tabla 1Distribución final de los compuestos de ensayo y de referencia en los recipientes de ensayo

RecipienteMedio de ensayo

(5.2)

Compuestode ensayo

(7.1.1)

Compuestode referencia

(7.1.2)

Inóculo

(7.2)FT compuesto de ensayoFT compuesto de ensayo

++

++

−−

++

FB ensayo en blancoFB ensayo en blanco

++

−−

−−

++

FC control del inóculo + − + +FI control de inhibición (opcional) + + + +FS control de la degradación abiótica(opcional)

+ + − −

Se colocan todos los recipientes de ensayo en el baño de agua o en el recinto termostatizado (6.2), se espera hasta quetodos los recipientes alcancen la temperatura deseada (véase el capítulo 4), se cierran herméticamente y, en los casos enlos que se utilicen respirómetros automáticos, se hacen las conexiones pertinentes, y se acciona el agitador. Se efectúanlas lecturas de demanda bioquímica de oxígeno (consumo de oxígeno) en los manómetros (en caso de que seanmanuales) o se verifica el correcto funcionamiento del dispositivo de registro del respirómetro automático. Debeseguirse el método indicado por el fabricante para el tipo correspondiente de respirómetro.

Cuando el nivel de consumo de oxígeno se estabiliza (fase de meseta) y no es previsible ninguna biodegradaciónsuplementaria, se considera finalizado el ensayo. Generalmente la duración máxima del ensayo no debe exceder los28 d. El ensayo se prolonga por espacio de una o dos semanas si la degradación ha comenzado de manera patente perono se ha alcanzado la fase de meseta.

Se mide el pH el último día del ensayo.

Cuando se controla la concentración de COD, se toman muestras de volumen apropiado de los recipientes de ensayo alinicio (tiempo 0) y al final (tiempo t) del período de ensayo. Es igualmente posible determinar el valor inicial (tiempo 0)en un recipiente preparado de forma independiente o calcularlo a partir de la cantidad de compuesto de ensayo añadida.Las muestras se filtran a través de un filtro de membrana o se centrifugan a 4 000 g durante 15 min (véase 6.5). Cuandolas medidas de COD no se lleven a cabo el mismo día, se conservan las muestras durante un período máximo de 48 h,en la oscuridad, a una temperatura de 4 ºC y en recipientes herméticamente cerrados.

NOTA − La eliminación de COD puede deberse no solo a la biodegradación sino también a procesos abióticos tales como la adsorción sobre elinóculo o las paredes del recipiente, o, en el caso de compuestos de ensayo volátiles, por volatilización y adsorción sobre los tubos.Cuando se trabaje con mezclas, puede producirse una adsorción selectiva de los diferentes componentes.

Cuando se esté controlando la degradación primaria, se determina la concentración del compuesto de ensayo utilizandoanálisis específicos, en los recipientes FT y FS al final del ensayo (tiempo t).

Si el compuesto de ensayo contiene nitrógeno, se determina la concentración final de nitrato y nitrito inmediatamentedespués de finalizado el ensayo, o bien sobre muestras adecuadamente conservadas. Alternativamente, puede utilizarseun procedimiento de ensayo cualitativo para el nitrito y el nitrato en un pequeño volumen de mezcla de reacción,tomado de cada recipiente, poniéndose en práctica después un método cuantitativo únicamente si se obtienen resultadospositivos. Si se ha producido nitrificación, se corrige el consumo de oxígeno (véase el anexo B).

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8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1 Cálculo

8.1.1 Demanda bioquímica de oxígeno específica. Los valores de consumo de oxígeno en cada recipiente, obtenidosa partir de las lecturas del respirómetro, se expresan como demanda bioquímica de oxígeno. Se calcula la demandabioquímica de oxígeno específica BS de acuerdo a la ecuación (1). El consumo de oxígeno se corrige en el caso en quese haya producido nitrificación (véase 7.3 y el anexo B).

BB Bt t

SB

TC=

−ρ

(1)

donde

BS es la demanda bioquímica de oxígeno específica, en miligramos de oxígeno por gramo de compuesto de ensayo;

Bt es la demanda bioquímica de oxígeno del compuesto de ensayo FT medida a tiempo t, en miligramos por litro;

BBt es la demanda bioquímica de oxígeno del ensayo en blanco FB medida a tiempo t, en miligramos por litro;

ρTC es la concentración del compuesto de ensayo, en gramos por litro.

8.1.2 Porcentaje de biodegradación. La biodegradación se define como la relación entre la demanda bioquímica deoxígeno específica y la demanda teórica de oxígeno (DTO) (véase el ejemplo de cálculo del anexo A) o la demandaquímica de oxígeno (DQO). El porcentaje de degradación en cada recipiente de ensayo se determina mediante lasecuaciones (2) y/o (3):

DB

DTOS

DTO= × 100 (2)

DB

DQOS

DQO= × 100 (3)

donde

DDTO es el porcentaje de biodegradación de la DTO a tiempo t;

DDQO es el porcentaje de biodegradación de la DQO a tiempo t;

BS es la demanda de oxígeno específica del compuesto de ensayo, expresada en miligramos por gramo decompuesto de ensayo;

DTO es la demanda teórica de oxígeno, en miligramos por gramo del compuesto de ensayo;

DQO es la demanda química de oxígeno determinada experimentalmente, en miligramos por gramo de compuesto deensayo.

NOTA − Dado que la DQO de un compuesto químico rara vez alcanza el valor de la DTO, el porcentaje de degradación de la DQO es generalmentesuperior al porcentaje de degradación de la DTO. Este último valor es más preciso y es el que se debe utilizar con preferencia.

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8.1.3 Cálculo de la eliminación del carbono orgánico disuelto. Para la determinación de la eliminación de COD deun compuesto de ensayo soluble en agua, se calcula para cada recipiente de ensayo FT el porcentaje de eliminación decarbono orgánico disuelto DC utilizando la ecuación (4):

DCt t= −

−−

�

���

��×1 100

0 0

ρ ρρ ρ

cT cB

cT cB(4)

donde

ρcT0 es la concentración de COD, a tiempo 0, en el recipiente de ensayo FT, en miligramos por litro;

ρcB0 es la concentración de COD, a tiempo 0, en el recipiente de ensayo en blanco FB, en miligramos por litro;

ρcTt es la concentración de COD, a tiempo t, en el recipiente de ensayo FT, en miligramos por litro;

ρcBt es la concentración de COD, a tiempo t, en el recipiente de ensayo en blanco FB, en miligramos por litro;

Si ρcT0 se calcula a partir de la cantidad de compuesto de ensayo añadido, se desprecia ρcB0.

8.1.4 Cálculo de la biodegradación primaria. Cuando se realicen análisis específicos del compuesto de ensayo, secalcula el porcentaje de biodegradación primaria DS del compuesto de ensayo por comparación con la cantidad decompuesto de ensayo en el recipiente FS al final del ensayo, utilizando la ecuación (5):

DSS T

S=

−×

ρ ρρ

100 (5)

donde

ρT es la concentración del compuesto de ensayo en el recipiente FT, a tiempo t, en miligramos por litro;

ρS es la concentración del compuesto de ensayo en el recipiente FS, a tiempo t, en miligramos por litro.

8.1.5 Compuesto de referencia, eliminación abiótica y control de inhibición. Se calcula de la misma forma la tasade biodegradación y la eliminación de COD del compuesto de referencia FC y, si estuvieran incluidos en el ensayo, delcontrol de degradación abiótica FS y del control de inhibición FI.

8.2 Expresión de resultados

Se presentan en forma tabulada los valores medidos de DBO y los porcentajes de biodegradación DDTO y/o DDQO paracada intervalo de medidas y para cada recipiente de ensayo. En el caso de respirómetros automáticos, puedenseleccionarse puntos correspondientes a tiempos apropiados a partir de la curva de consumo de oxígeno trazada deforma automática. Se traza una curva de biodegradación, en porcentaje, en función del tiempo y se indican las fases delatencia y de degradación. Si se obtienen resultados comparables en los recipientes de ensayo por duplicado FT

(diferencia < 20%) se traza una curva media; en caso contrario, se traza una curva para cada recipiente (véase elejemplo descrito en el anexo C). Se traza de la misma forma una curva de biodegradación del compuesto de referenciaFC y, si estuvieran incluidos en el ensayo, del control de degradación abiótica FS y del control de inhibición FI.

Se determina el valor medio del porcentaje de biodegradación en la fase de meseta o se utiliza el valor más alto, porejemplo cuando la curva descienda en la fase de meseta, y en el informe de ensayo este nivel máximo debiodegradación se indica como "tasa de biodegradación del compuesto de ensayo".

- 15 - ISO 9408:1999

La información relativa a la toxicidad del compuesto de ensayo puede resultar de utilidad en la interpretación de losresultados de ensayo que muestren una baja biodegradación. Si en el recipiente FI el porcentaje de degradación esinferior al 25% y en los recipientes FT se observa una degradación insuficiente del compuesto de ensayo, puedeentonces suponerse que el compuesto de ensayo tiene un efecto inhibidor. En este caso, el ensayo debe repetirseutilizando una concentración menor o empleando otro inóculo. Si en el recipiente FS (control de la degradaciónabiótica, en el caso de que se incluya en el ensayo) se observa una cantidad significativa de DBO (> 10%), puedenhaberse producido procesos de degradación abiótica.

Si se ha determinado la eliminación de DQO, la degradación primaria y/o el contenido de nitratos/nitritos, debenindicarse los valores medidos y los valores calculados. Deben indicarse los valores de pH medidos.

9 VALIDEZ DE LOS RESULTADOS

9.1 Criterios de validez

El ensayo se considera válido si:

a) el porcentaje de degradación obtenido en el decimocuarto día en el recipiente FC (control del inóculo) es superior al60%;

b) la cantidad de DBO en el ensayo en blanco FB al finalizar el ensayo, que habitualmente se encuentra en el intervalocomprendido entre 20 mg/l y 30 mg/l, no excede los 60 mg/l una vez transcurridos 28 d.

Si no se satisface alguna de las condiciones a) o b), es conveniente repetir el ensayo con otro inóculo o bien utilizandoun inóculo mejor pre-acondicionado.

9.2 Inhibición

Si el recipiente FI (control de inhibición) está incluido en el ensayo, se considera que el compuesto de ensayo tiene unefecto inhibidor cuando el porcentaje de degradación del compuesto de referencia en el recipiente FI es inferior al 40%al finalizar el ensayo. En ese caso, es recomendable repetir el ensayo con una menor concentración del compuesto deensayo.

9.3 Valor de pH

Si, una vez finalizado el ensayo, el valor del pH se encuentra fuera del intervalo comprendido entre 6 y 8,5 (porejemplo, a causa de la nitrificación de un compuesto de ensayo que contenga nitrógeno) y si el porcentaje dedegradación del compuesto de ensayo es inferior al 60%, es recomendable repetir el ensayo con una menorconcentración del compuesto de ensayo, utilizando un lodo activado no nitrificante como inóculo o aumentando lacapacidad tampón del medio inorgánico. Este hecho debe indicarse en el informe de ensayo.

10 INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe contener, al menos, la siguiente información:

a) una referencia a esta norma internacional;

b) toda la información necesaria para la identificación del compuesto de ensayo;

c) todos los datos medidos y calculados (presentados, por ejemplo, en forma tabulada) que se han obtenido, así como lacurva de degradación;

d) la concentración, la DTO y/o la DQO del compuesto de ensayo y del compuesto de referencia utilizados;

ISO 9408:1999 - 16 -

e) el nombre del compuesto de referencia utilizado y la degradación obtenida con este compuesto;

f) el origen, las características, la concentración o el volumen del inóculo utilizado, así como toda la informaciónrelativa a cualquier pretratamiento;

g) las características principales del respirómetro utilizado;

h) la temperatura de incubación del ensayo;

i) si estuviera incluido, el porcentaje de eliminación de COD o la biodegradación primaria;

j) si estuviera incluido, el porcentaje de degradación obtenido en el recipiente FS (degradación abiótica);

k) si estuviera incluido, el porcentaje de degradación en el recipiente FI (control de inhibición) y una indicación acercade la toxicidad del compuesto de ensayo;

l) las razones de un eventual rechazo del ensayo;

m) toda modificación del procedimiento operativo así como cualquier circunstancia que pueda haber influido en losresultados.

- 17 - ISO 9408:1999

ANEXO A (Informativo)

EJEMPLO DEL CÁLCULO DE LA DEMANDA TEÓRICA DE OXÍGENO

A.1 Generalidades

La demanda teórica de oxígeno (DTO) de una hipotético sustancia Cc Hh Clcl Nn Nana Oo Pp Ss, de peso molecular Mr,puede calcularse según la fórmula:

DTONHr

3=

+ − − + + + −�!

"$#

16 212

3 352

12

c h cl n s p na o

M

( )

Este cálculo implica que el C se ha mineralizado a CO2, el H a H2O, el P a P2O5 y el Na a Na2O. El halógeno se eliminacomo haluro de hidrógeno. El nitrógeno se elimina en forma amoniacal y no se oxida a nitrito o nitrato. Se supone queel azufre se oxida al estado +VI.

En el caso de un compuesto nitrogenado, el nitrógeno puede eliminarse después de un proceso de nitrificación a nitritoo nitrato, con demandas teóricas de oxígeno iguales respectivamente a:

DTONOr

2=

+ − + + + + −�!

"$#

16 212

332

52

12

c h cl s n p na o

M

( )

DTONHr

3=

+ − + + + + −�!

"$#

16 212

352

52

12

c h cl s n p na o

M

( )

A.2 Ejemplo: glucosa

Fórmula molecular: C6H12O6; peso molecular: Mr = 180.

DTO mg / mg del compuesto=× + × −�

! "$# =

16 2 61

212 6

1801 07,

A.3 Ejemplo: n-dodecilbencenosulfonato de sodio

Fórmula molecular: C18H29SO3Na; peso molecular: Mr = 348.

DTO mg / mg del compuesto=× + × + + −�

! "$# =

16 2 181

229 3

1

23

3482 34,

A.4 Ejemplo: di-n-dodecilamina

Fórmula molecular: (C12H25)2NH; peso molecular: Mr = 353.

Se asume que se ha observado mediante análisis una conversión completa a nitrato.

DTO mg / mg del compuestoNO3=

× + × +�!

"$# =

16 2 2412

5152

3533 44,

ISO 9408:1999 - 18 -

ANEXO B (Informativo)

CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO PARA ELIMINAR LA INTERFERENCIACON EL PROCESO DE NITRIFICACIÓN

Si se ha producido nitrificación pero ésta no es completa, el consumo de oxígeno observado en la mezcla de reacciónpuede corregirse teniendo en cuenta la cantidad de oxígeno empleada en la oxidación del amoníaco a nitrito y del nitritoa nitrato, siempre que se determinen los cambios en la concentración de nitritos y nitratos durante la incubación. Lacorrección se realiza considerando las siguientes reacciones:

2NH4Cl + 3O2 = 2HNO2 + 2HCl + 2H2O (B.1)

2HNO2 + O2 = 2HNO3 (B.2)

Por tanto, de forma global:

2NH4Cl + 4O2 = 2HNO3 + 2HCl + 2H2O (B.3)

De la reacción (B.1) se deduce que el consumo de oxígeno necesario para oxidar al estado de nitrito 28 g de nitrógenocontenidos en el cloruro de amonio (NH4Cl) es de 96 g, es decir un factor de 3,43 (96/28). De la misma forma, a partirde la ecuación (B.3), el consumo de oxígeno asociado a la conversión de 28 g de nitrógeno al estado de nitrato es de128 g, es decir, un factor de 4,57 (128/28).

Dado que las reacciones son secuenciales y que se llevan a cabo por especies diferentes de bacterias, es posible que laconcentración de nitrito aumente o disminuya; en este último caso, se formaría una cantidad equivalente de nitrato. Deeste modo, el oxígeno consumido en la formación de nitrato es de 4,57 veces el aumento de la concentración deN-nitrato mientras que el oxígeno asociado a la formación de nitrito es de 3,43 veces el aumento de la concentración deN-nitrito. Si la concentración de nitrito disminuye, la pérdida de oxígeno es de 3,43 veces el valor de dicha disminuciónde la concentración.

Es decir:

O1 = 4,57 x ∆NO N3− (B.4)

O2 = 3,43 x ∆NO N2 − (B.5)

O3 = − [3,43 x ∆NO N2 − ] (B.6)

donde

O1 es el oxígeno consumido en la formación de nitrato;

O2 es el oxígeno consumido en la formación de nitrito;

O3 es la pérdida de oxígeno asociada a la desaparición de nitrito;

∆NO N3− es el aumento en la concentración de nitrato-N;

∆NO N2 − es la variación en la concentración de nitrito-N.

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Así, utilizando las ecuaciones (B.4) y (B.5) o (B.6):

O4 = [4,57 x ∆NO N3− ] ± [3,43 x ∆NO N2 − ] (B.7)

y:

O5 = O6 − O4 (B.8)

donde

O4 es el consumo de oxígeno resultante de la nitrificación;

O5 es el consumo de oxígeno resultante de la oxidación del carbono;

O6 es el consumo total de oxígeno observado.

De forma alternativa, si solamente se determina el nitrógeno oxidado total, el consumo de oxígeno debido a lanitrificación puede considerarse, en una primera aproximación, como 4,57 veces mayor que el aumento en laconcentración de nitrógeno oxidado.

El valor corregido correspondiente al consumo de oxígeno debido a la oxidación del carbono se compara entonces a laDTONH3

calculada según el método descrito en el Anexo A.

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ANEXO C (Informativo)

EJEMPLO DE UNA CURVA DE BIODEGRADACIÓN

Fig. C.1 − Biodegradación de la anilina en el ensayo respirométrico

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ANEXO D (informativo)

RESPIRÓMETRO CERRADO

Leyenda1 Absorbente de CO2

2 Monitor3 Impresora, registro u ordenador4 Manómetro5 Baño de agua6 Unidad productora de oxígeno7 Recipiente de ensayo8 Agitador

Fig. D.1 − Principio de funcionamiento de un respirómetro cerrado

La mezcla de ensayo se agita con ayuda de un agitador magnético colocado dentro del recipiente de ensayo, que seencuentra lleno de líquido hasta un tercio de su capacidad. Si la biodegradación tiene lugar, los microorganismosconsumen oxígeno y producen dióxido de carbono. En ese caso, el oxígeno presente en la fase gaseosa del recipiente sedisuelve en el líquido. El dióxido de carbono que se encuentra en la parte superior del recipiente es adsorbido y, comoconsecuencia, la presión total en el interior del recipiente disminuye.

Esta caída de presión se detecta con la ayuda de un manómetro, que se utiliza para iniciar la generación electrolítica deoxígeno. Una vez restablecida la presión original, la electrólisis se detiene y la cantidad de electricidad utilizada se mideen el monitor. La cantidad de electricidad empleada es proporcional a la cantidad de oxígeno consumida. Este valorqueda registrado en una impresora, aparato registrador o directamente en un ordenador.

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BIBLIOGRAFÍA

[1] ISO 6060:1989 − Calidad del agua. Determinación de la demanda química de oxígeno.

[2] ISO 7827:1994 − Calidad del agua. Evaluación en medio acuoso de la biodegradabilidad aerobia final de loscompuestos orgánicos. Método por análisis del carbono orgánico disuelto (COD).

[3] ISO 8192:1986 − Calidad del agua. Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodo activado.

[4] ISO 8245:1999 − Calidad del agua. Directrices para la determinación del carbono orgánico total (COT) y elcarbono orgánico disuelto (COD).

[5] ISO 9887:1992 − Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia de los compuestos orgánicosen medio acuoso. Método semicontinuo con lodos activados (SCAS).

[6] ISO 9888:1999 − Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia de los compuestos orgánicosen medio acuoso. Ensayo estático (Método de Zahn-Wellens).

[7] ISO 10634:1995 − Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestosorgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso.

[8] ISO 11923:1997 − Calidad del agua. Determinación de los sólidos en suspensión. Método de filtración por filtrode fibra de vidrio.

[9] ISO/TR 15462:1997 − Calidad del agua. Selección de ensayos de biodegradabilidad.

g

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