Bio Film Ssss

8/12/2019 Bio Film Ssss

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Las enfermedades periodontales son infeccionescausadas por microorganismos que colonizan la su-perficie del diente en el margen gingival o debajo deste. Aunque estas infecciones tienen muchas pro-piedades en comn con otras enfermedades infec-ciosas, presentan propiedades nicas conferidas porsu sitio de colonizacin y la naturaleza del entorno enque residen. En la tabla 1 se presenta un resumen bas-tante simplificado de cuatro categoras brutas de en-fermedades infecciosas bacterianas. Cuando se hablade infecciones, se tiende a pensar en procesos infec-ciosos agudos. Estos procesos estn causados habi-tualmente por agentes exgenos, tienen un inicio r-pido poscolonizacin y siguen su curso en un perodoque puede durar das o semanas. Con frecuencia, seconoce la fuente de los organismos, normalmente otraenfermedad similar de presentacin individual. Lascaractersticas principales de esta categora de infec-

cin son que el microorganismo o sus productos con-siguen entrar en el cuerpo y que la infeccin se solu-

ciona habitualmente de forma rpida mediante unacura, la extirpacin de parte del cuerpo o el falleci-miento del paciente. Habitualmente, el tratamientode estas infecciones es de apoyo, aunque, con fre-cuencia, se usan antibiticos en los casos ms graves.Algunos ejemplos de estas infecciones son abscesoslocales causados por microorganismos como Staphy-lococcus aureus, infecciones de las vas respiratoriassuperiores causadas por grmenes como Haemophi-lus influenzae o infecciones gastrointestinales infe-riores producidas por organismos como Vibrio chole-rae o Salmonella typhi.

Las infecciones bacterianas crnicas como la tu-berculosis o la lepra presentan con frecuencia un ata-que poscolonizacin muy lento. Se considera que losmicroorganismos son exgenos, sin embargo, puedenpresentar caractersticas de infecciones endgenas, yaque la colonizacin por Mycobacterium tuberculosis

puede ocurrir aos antes de la deteccin de la enfer-medad.

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Periodontology 2000 (Ed Esp),Vol. 3, 2003, 12-55

Biofilms dentales:objetivos teraputicos difciles

SIGMUND S. SOCRANSKY YANNE D. HAFFAJEE

Copyright Blackwell Munksgaard

PERIODONTOLOGY 2000ISSN 0906-6713

Copyright STM Editores, S.A.

PERIODONTOLOGY 2000 (Ed Esp)ISSN 1695-1808

Tabla 1. Caractersticas de las enfermedades infecciosas bacterianasAguda Crnica Retardada Biofilm

EjemplosVas respiratorias superiores Tuberculosis Fiebre reumtica CariesAbsceso local Lepra Sfilis Enfermedad periodontalAparato gastrointestinal lcera gastrointestinales Otros

Enfermedad de LymeEnfermedades cardiovasculares?

Ataque poscolonizacinRpido Lento Retardado Retardado

DuracinDas a semanas Meses a aos Aos Aos

Agente causalExgeno Exgeno Varios Endgeno

Endgeno

FuenteCon frecuencia desconocida En ocasiones conocida Con frecuencia desconocida Habitualmente desconocida

CaractersticasEntra en el cuerpo, Entra en el cuerpo, Ataque desfavorable, Biofilmresolucin rpida el husped no es capaz posteriormente nueva forma Fuera del cuerpo

de hacer frente de enfermedad

TratamientoDe apoyo Antibiticos Antibiticos Fsico

Antibiticos De apoyo ? AntimicrobianoEcolgico


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La fuente de los microorganismos es en ocasionesconocida. Habitualmente se trata de un individuo quepresenta signos de enfermedad similares. Las caracte-rsticas principales de las infecciones crnicas son quelos microorganismos consiguen entrar en el cuerpo ypersisten durante largos perodos, y que el husped noes capaz de hacer frente a las especies infecciosas y eli-minarlas. El tratamiento de estas infecciones incluye,con frecuencia, antibiticos, pero la terapia de apoyoes fundamental.

Una tercera clase de enfermedades infecciosas bac-terianas es bastante misteriosa, ya que los signos y lossntomas de la enfermedad que preocupan en gran me-dida al paciente no aparecen hasta meses o aos des-pus de la infeccin local inicial. Dentro de esta cate-gora de enfermedades se incluiran, entre otras, la fiebrereumtica, la sfilis, la enfermedad de Lyme, lceras delaparato gastrointestinal o, presumiblemente, enferme-

dades cardiovasculares (12, 13, 126). El ataque poste-rior a la colonizacin inicial dura, habitualmente, aosy las lesiones producidas pueden persistir toda la vida.Con frecuencia, se desconoce la fuente de los micro-organismos causantes de algunas de estas infecciones.Las enfermedades se caracterizan por un inicio pocoevidente, con frecuencia con signos de infeccin loca-les mnimos, que posteriormente conducen a una nuevaforma de enfermedad. El tratamiento ms eficaz con-tra estas enfermedades es la antibioterapia durante lafase inicial de la infeccin. El tratamiento en fases pos-teriores plantea muchas ms dificultades.

La cuarta categora de enfermedades es la que ataede forma directa a los lectores de este volumen. Se tratade las enfermedades que resultan de la formacin debiofilms en la superficie del diente. Estas infecciones son,probablemente, las enfermedades infecciosas ms co-munes que afectan al ser humano: las caries dentales ylas enfermedades periodontales. El comienzo de estasenfermedades se retrasa, habitualmente, durante per-odos prolongados tras la colonizacin inicial de los pa-tgenos. Habitualmente, estas enfermedades siguen sucurso durante aos. En la mayora de los casos, los agen-tes causales parecen ser miembros de las microfloras au-tctonas, de manera que cabra pensar que las infec-

ciones son endgenas. Habitualmente se desconoce lafuente de los agentes infecciosos de un individuo dado,aunque se piensa que la herencia de los padres desem-pea un papel fundamental (151, 152, 155, 168, 197). Lacaracterstica principal de estas enfermedades es queson causadas por grmenes que residen en biofilms pre-sentes fuera del organismo. Su tratamiento, como se hamencionado, es complejo, ya que se necesitan aborda-jes fsicos, antimicrobianos y ecolgicos. Las enferme-dades iniciadas por biofilms no son, de ningn modo,exclusivas de la cavidad oral. Potera (153) ha argumen-tado que el 65 % de las infecciones que afectan al ser hu-mano son producidas por microorganismos que crecenen biofilms.

Explosin en la investigacinde biofilms

Los biofilms se han convertido en un tema can-dente tanto en el campo de la microbiologa ambientaly las enfermedades infecciosas, como en la prensa po-pular. Los biofilms pueden encontrarse prcticamenteen cualquier lugar: colonizan una amplia variedad desuperficies hmedas, entre ellas, la cavidad oral, elfondo de barcos y muelles y el interior de tuberas yde rocas de arroyos. Los investigadores de enferme-dades infecciosas estn interesados en los biofilms quecolonizan una amplia gama de dispositivos artificialesque se utilizan en el hombre, como catteres, prtesisde laringe y de cadera y lentes de contacto. Los mi-crobilogos que estudian el medio ambiente estn in-teresados en la prevencin de los efectos de los bio-films en los procesos industriales sucios o, como

alternativa, en la utilizacin de biofilms para fines pro-ductivos (p. ej., en las plantas de tratamiento de aguasresiduales). Los biofilms constan de una o ms comu-nidades de microorganismos, enclavados en un glico-cliz, que estn unidos a una superficie slida (37, 38,40, 47, 48, 95, 105, 110, 111, 137, 163, 179, 205, 215). Larazn de la existencia de un biofilm es que permiteque los microorganismos se adhieran a las superficiesy se multipliquen. De esta forma, las bacterias (fijas)adheridas que crecen en un biofilm despliegan unaamplia gama de caractersticas que proporcionan unaserie de ventajas con respecto a las bacterias (planc-

tnicas) unicelulares.

Naturaleza de los biofilms

Los biofilms son estructuras fascinantes. Son el m-todo de crecimiento preferido de muchas, tal vez lamayora, de las especies de bacterias (164). Este m-todo de crecimiento proporciona una serie de venta-jas a las especies colonizadoras. La ventaja principales la proteccin que ofrece el biofilm a la especie co-lonizadora frente a mecanismos competitivos proce-dentes de factores ambientales y de los mecanismos

de defensa del husped, asi como frente a sustanciasambientales potencialmente txicas, como productosqumicos letales o antibiticos. Los biofilms tambinpueden facilitar el procesamiento y la ingestin de nu-trientes, la alimentacin cruzada (una especie proveede nutrientes a otra), la eliminacin de productos me-tablicos potencialmente dainos (con frecuencia me-diante la utilizacin llevada a cabo por otras bacterias),as como el desarrollo de un ambiente fisicoqumicoapropiado (como el potencial de reduccin-oxidacinreducido adecuadamente).

A grandes rasgos, podra establecerse una analogaentre el desarrollo de un biofilm y el de una ciudad.El xito de la colonizacin humana de nuevos am-

Biofilms dentales: objetivos teraputicos difciles

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bientes requiere varios factores importantes, entre losque se incluyen un suministro estable de nutrientes,un ambiente que contribuya a la proliferacin y unambiente con riesgos potenciales limitados.

Las ciudades (al igual que los biofilms) se transfor-man, mediante una adhesin inicial de los seres hu-manos, en un lugar habitable, seguido por la multi-plicacin de los habitantes existentes y la suma denuevos habitantes. Las ciudades y los biofilms se ex-tienden tpicamente de forma lateral y, posterior-mente, en direccin vertical, formando, con frecuen-cia, hbitats con forma de columna. Las ciudades ylos biofilms ofrecen a sus habitantes muchos benefi-cios como, por ejemplo, los recursos compartidos ylas actividades interrelacionadas. Los habitantes de lasciudades o los biofilms son capaces de llevar a caboprocesos metablicos y funciones sintticas que losindividuos no podran desarrollar en un estado no fijo

(planctnico) o nmada. Una ventaja importante queproporciona una ciudad o un biofilm es la proteccinfrente a otros colonizadores potenciales de la mismaespecie, frente a especies exgenas y frente a cambiosperjudiciales repentinos en el ambiente. Los indivi-duos de la comunidad clmax de una ciudad o bio-film floreciente pueden desarrollar actividades con-juntas y vivir en un ambiente mucho ms estable quelos individuos que viven aislados. Las ciudades, al igualque los biofilms, precisan medios para conseguir losnutrientes y las materias primas y para deshacerse delos productos residuales. En las ciudades, estos me-dios son las carreteras, las tuberas de agua y el al-cantarillado; en los biofilms, podran ser canales deagua como los que se describen a continuacin. Lasciudades tienen un tamao prctico mximo basadoen las limitaciones fsicas y en los lmites de nutrien-tes y de deshechos. Lo mismo sucede con los biofilms.Las ciudades que son alteradas por una leve tormentade nieve o por un incendio, vuelven a formar, habi-tualmente, una comunidad clmax similar a la queexista en un principio, del mismo modo que lo ha-cen los biofilms. Sin embargo, perturbaciones mayo-res en el ambiente, como, por ejemplo, una sequaprolongada o una nube radiactiva, pueden devastar

una ciudad. Perturbaciones mayores en el ambiente,como una sustancia qumica txica, pueden afectargravemente la composicin o existencia de un bio-film. La comunicacin entre individuos en una ciu-dad es esencial para permitir a sus habitantes inter-actuar de forma ptima. Esta comunicacin se realizahabitualmente a travs de medios orales, escritos oilustrados. La comunicacin entre clulas bacterianasdentro de un biofilm tambin es necesaria para un de-sarrollo ptimo de la comunidad. Se lleva a cabo me-diante la produccin de molculas de seal como lasque se encuentran en el quorum sensing o, quiz,mediante el intercambio de informacin gentica. Lasupervivencia a largo plazo de la especie humana y de

una especie en un biofilm es ms probable si esa es-pecie (o la humana) coloniza sitios mltiples. De estamanera, los biofilms de especies mixtas pueden con-siderarse como precursores primitivos de organiza-ciones ms complejas observadas por especies euca-riotas. El estudio de los biofilms es, tcnicamente,bastante ms complejo debido, en parte, a la natura-leza microscpica de los individuos participantes y,en parte, a la complejidad de las relaciones ecolgi-cas que se producen en un nivel microscpico. Se hantenido que desarrollar nuevas tcnicas para examinarlos biofilms. La mayora de los estudios se han llevadoa cabo en sistemas diferentes de la placa dental, perolos principios generales extrados de otros sistemas,probablemente, tambin son adecuados para los bio-films dentales. Se han utilizado mtodos como el mi-croscopio confocal lser para examinar las clulas bac-terianas en el interior de los biofilms (111). Se han

empleado microelectrodos minsculos que permitenmedir el ambiente local (118) de los biofilms. Se handesarrollado estadios microscpicos programadosque permiten obtener imgenes precisas de biofilmsen tres dimensiones (117). De esta forma, la estruc-tura y las propiedades fsicas de los biofilms son cadavez ms claras.

Propiedades de los biofilms

Estructura

Los biofilms estn compuestos por microcoloniasde clulas bacterianas (15-20 % por volumen) que noestn distribuidas aleatoriamente en una matriz es-tructurada o glicocliz (75-80 % del volumen). Estu-dios ms recientes acerca de biofilms gruesos (> 5 mm)desarrollados en plantas de tratamiento de aguas re-siduales indicaron la presencia de vacos o canales deagua entre las microcolonias presentes en estos bio-films. Los canales de agua permiten el paso de los nu-trientes y de otros agentes a travs del biofilm, ac-tuando como un sistema circulatorio primitivo. Losnutrientes entran en contacto con las microcolonias

(adheridas) fijas mediante la difusin a partir del ca-nal de agua en la microcolonia en lugar de la matriz.Se han sugerido, sin embargo, otros modelos de bio-films, como los mosaicos heterogneos y los modelosde biofilms densos (189). Las microcolonias se dispo-nen de diferentes formas en los biofilms que son diri-gidos por fuerzas de erosin debido al paso del fluidosobre el biofilm. Con una fuerza de erosin baja, lascolonias se forman como torres o championes, mien-tras que con una fuerza de erosin alta, las colonias sealargan y son capaces de oscilaciones rpidas (183).Las microcolonias individuales pueden constar de unaespecie simple, pero lo ms frecuente es que estncompuestas de varias especies diferentes.

Socransky y Haffajee

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Exopolisacridos: la columna vertebralde los biofilms

Como ya se ha mencionado, la mayor parte de losbiofilms est constituido por la matriz. Est compuestaprincipalmente por agua y sustancias disueltas acuo-sas. El material seco es una mezcla de exopolisacri-dos, protenas, sales y material celular. Los exopolisa-cridos, que son producidos por las bacterias de losbiofilms, constituyen el componente principal del bio-film, ya que representan el 50-95 % del peso seco (189).Desempean un papel importante en el mantenimientode la integridad del biofilm y confieren otras propie-dades beneficiosas. Las bacterias pueden producir va-rios polisacridos diferentes dependiendo de su estadofisiolgico y de la presencia de sustratos especficos. To-dos los biofilms contienen exopolisacridos, aunquepueden variar muy significativamente en la composi-

cin bacteriana y en la composicin de la matriz celu-lar. Algunos exopolisacridos son neutros, como el mu-tano de Streptococcus mutans, mientras que otros sonmacromolculas polianinicas altamente cargadas. Lacarga inica diferente y las concentraciones de exopo-lisacridos alterarn la estructura y causarn cambiosrpidos en la red de gel tridimensional de polisacri-dos. Asimismo, se pueden producir efectos similaresmediante el suministro de sacarosa u otros azcares.Los exopolisacridos pueden ser degradados y utiliza-dos por las bacterias dentro del biofilm. Una caracte-rstica distintiva de los biofilms orales es que muchosde los microorganismos pueden sintetizar y degradarlos exopolisacridos.

Los exopolisacridos pueden existir en formas tantoordenadas como desordenadas. A temperaturas ele-vadas y, con frecuencia, en concentraciones inicasmuy bajas, predomina la forma desordenada, aunqueson pocos los biofilms que presentan una ausencia to-tal de una estructura ordenada (188). Las matrices delos biofilms son estructuras complejas que contienenmasas de fibras de tamao, estructura, composiciny rigidez variables que interactan entre s, con clu-las y con matrices de superficie. Existe una ampliagama de conformaciones, flexibilidad y configuracio-

nes posibles entre las diferentes clases de polisacri-dos. La densidad de las masas fibrilares afectar la ac-cesibilidad de las clulas y superficies a los nutrientesy a otras sustancias disueltas.

La composicin qumica y la estructura terciaria delos exopolisacridos determinar si se forma un adhe-sivo eficaz. Asimismo, afectar la naturaleza hidrfila ohidrofbica de la superficie. Los exopolisacridos con-tribuyen a la proteccin de las clulas microbianas den-tro del biofilm evitando su desecacin y el ataque deagentes dainos. Tambin pueden unirse a nutrientesesenciales como los cationes para crear un ambiente lo-cal nutricionalmente rico que favorezca microorganis-mos especficos. La matriz de los exopolisacridos tam-

bin podra actuar como un amortiguador y ayudar aretener enzimas extracelulares (y sus sustratos), au-mentando la utilizacin de sustratos por parte de las c-lulas bacterianas. Los exopolisacridos son eficaces paramantener la estructura del biofilm a travs de la forma-cin de macromolculas lineales interconectadas. En lamayora de los biofilms mixtos se encuentran numero-sos tipos de polisacridos que complican la estructuraen forma de red. La cantidad de exopolisacridos de unbiofilm no refleja necesariamente la proporcin de es-pecies bacterianas que produce. La prdida o elimina-cin de un tipo de exopolisacrido puede tener un efectoms drstico sobre la matriz del biofilm que otro, inclusosi el polmero eliminado no es dominante.

Heterogeneidad fisiolgica dentro de los biofilms

Las clulas de la misma especie microbiana pueden

presentar estados fisiolgicos extremadamente diferen-tes en un biofilm, aunque estn separados por slo10 m. Xu y cols. (219) cultivaron Pseudomonas aerugi-nosa en un reactor de flujo continuo ventilado y mi-dieron varias propiedades fisiolgicas mediante tintese indicadores. El ADN indicativo de la presencia de c-lulas bacterianas se detect a travs de un biofilm de110 m de grosor. La sntesis de protenas poda detec-tarse en los 30 m externos, la actividad respiratoria enlos 24 m externos, y el ARN determinado por el na-ranja de acridina y la hibridacin in situ en los 21 mexternos. Los autores sugieren que los antibiticos quedestruyen de forma activa las clulas en crecimientoafectaran la capa externa del biofilm, pero no actua-ran sobre las clulas que permanecen en su interior.

El uso de microelectrodos ha mostrado que el pHpuede variar significativamente en cortas distanciasdentro de un biofilm (204). El microscopio de excita-cin bifotnica de la placa in vitrocompuesta por diezespecies intraorales mostr que, tras un estmulo consacarosa, podan detectarse microcolonias con un pHinferior a 3,0 adyacentes a microcolonias con un pH su-perior a 5,0 (204). El nmero de iones metlicos puedediferir de forma suficiente en regiones diferentes de unbiofilm, de modo que una diferencia en la concentra-

cin de iones puede producir diferencias potencialesmensurables (40). Las clulas bacterianas dentro de losbiofilms pueden producir enzimas como la beta-lacta-masa contra los antibiticos o catalasas, como las su-perxido-dismutasas contra los iones oxidantes libera-dos por los fagocitos. Estas enzimas son liberadas en lamatriz, produciendo una lnea de defensa casi inex-pugnable. Las clulas bacterianas de los biofilms tam-bin pueden producir elastasas y celulasas, que se con-centran en la matriz local y producen lesin en los tejidos.La medicin del oxgeno y otros gases ha demostradoque ciertas microcolonias son completamente anaero-bias, aunque estn tambin compuestas por especiesfacultativas simples y crecen al aire libre (48). El dixido


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can adheridas a ellas (181). Este hecho tiene conse-cuencias para la colonizacin de superficies por biofilms.Generalmente, se cree que la formacin de un biofilmse inicia mediante la colonizacin de clulas planctni-cas que se adhieren y, posteriormente, se multiplican.Los datos de Stoodley y cols. (181) sugieren que la colo-nizacin de estructuras bioflmicas llevadas a cabo puedeproducirse cuando estas estructuras se mueven a reasadyacentes. Este hecho puede presentar ciertas venta-jas, ya que la formacin de los biofilm no depende delas clulas planctnicas, que son conocidas por ser mssensibles a los agentes antimicrobianos (66).

Quorum sensing

Algunas funciones de los biofilms dependen de lacapacidad de las bacterias y las microcolonias en elinterior del biofilm para comunicarse entre s. El quo-

rum sensing en las bacterias comprende la regula-cin de la expresin de genes especficos a travs dela acumulacin de compuestos de sealizacin quemedian en la comunicacin intercelular (157). Elquorum sensing depende de la densidad de las c-lulas. Con unas pocas clulas pueden producirse com-puestos de sealizacin a bajos niveles; sin embargo,la autoinduccin conduce a un incremento de la con-centracin cuando la densidad celular aumenta. Unavez que el compuesto sealizador alcanza un nivelumbral (densidad de la clula qurum), se activa laexpresin del gen. Las seales de las clulas se han es-tudiado ampliamente en bacterias luminiscentes y pa-recen ser mediadas por una lactona N-acil-homose-rina codificada por un gen lux1. Se ha demostrado queexiste un sistema similar en algunas otras especiesgram-negativas. Las concentraciones de clulas ele-vadas en biofilms presentan una situacin ideal parael quorum sensing, ya que incluso microcoloniaspequeas (< 10 clulas) pueden inducir una expresinde gen, dado que los compuestos de sealizacin pue-den concentrarse dentro de la microcolonia y no serdegradados. El quorum sensing puede proporcionara los biofilms sus propiedades distintivas. Por ejem-plo, la expresin de genes para la resistencia antibi-

tica en densidades de clulas elevadas puede propor-cionar proteccin. El quorum sensing tambin tienela capacidad de influir en la estructura de la comuni-dad estimulando el crecimiento de especies benefi-ciosas (para el biofilm) e inhibiendo el crecimiento decompetidores. Tambin es posible que las propieda-des fisiolgicas de las bacterias de la comunidad sealteren a travs del quorum sensing. La influenciaque podra ejercer el quorum sensing en las pro-piedades de los biofilms fue sugerida por primera vezpor Cooper y cols. (36).

Las seales no son la nica forma de transferir in-formacin en los biofilms. La elevada densidad de c-lulas bacterianas que crecen en biofilms favorece el

intercambio de informacin gentica entre clulas dela misma especie y a travs de especies e, incluso, degneros. Se ha demostrado que la conjugacin (78), latransformacin (212), la transferencia de plsmidos(3, 11, 25, 112, 119) y la transferencia de transposones(165) ocurren de forma natural o en biofilms de es-pecies mixtas, preparadas in vitro. Especialmente in-teresante fue la demostracin de la transferencia deun transposn conjugativo que confiere resistencia ala tetraciclina de clulas de un gnero, Bacillus subti-lis, a una especie de estreptococo presente en la placadental que crece como un biofilm en un fermentadorde biofilm de profundidad constante (165).

Adhesin de las bacterias

La caracterstica principal de un biofilm es que las

microcolonias de su interior se adhieren a una su-perficie slida (76). De esta forma, la adhesin a unasuperficie constituye el primer paso esencial en el de-sarrollo de un biofilm. En la boca, las bacterias pue-den adherirse a una amplia variedad de superficies,entre ellos los tejidos blandos orales, los dientes cu-biertos de pelcula y otras bacterias. Muchas especiesde bacterias poseen estructuras de superficie, comofimbrias y fibrillas, que ayudan a que se adhieran a lasdiferentes superficies. Las fimbrias (pili)son apndi-ces proteinceos similares a un pelo, de 2-8 nm dedimetro (56), compuestas de subunidades de prote-nas denominadas fimbrillinas (fimbrinas). Algunasfimbrias tambin transportan adhesinas. Se han de-tectado fimbrias en una serie de especies orales, comoActinomyces naeslundii (75), Porphyromonas gingiva-lis (221), y algunas variedades de estreptococos comoS. salivarius(74), S. parasanguis (58) y miembros delgrupo S. mitis (75). El examen de las fimbrias de va-riedades orales indica que son muy delgadas, flexiblesy de 2-3 nm de dimetro, diferencindose de este modode las fimbrias ms rgidas y largas que se encuentranen otras bacterias, como Escherichia coli. Tambin sehallan fibrillas en una serie de especies de bacteriasorales. Son morfolgicamente diferentes y ms cortas

que las fimbrias y pueden distribuirse de forma densao escasa en la superficie de la clula (73). Las especiesorales que poseen fibrillas son S. salivarius (74), elgrupo S. mitis (75), Prevotella intermedia, Prevotellanigrescens (53) y S. mutans (83).

Como se ver ms adelante,A. naeslundii es una delas especies colonizadoras ms importante en las su-perficies de los dientes. Esta especie, junto con Acti-nomyces, comprende el segmento fundamental de lamicroflora adherida al diente, y puede considerarse queforma parte de la estructura de andamiaje de la placadental. Por esta razn, se justifica el estudio en pro-fundidad de sus medios de adhesin (16, 71, 97, 104,125). Las fimbrias de A. naeslundii son las mejor ca-


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racterizadas de las bacterias orales grampositivas. Mi-den alrededor de 3-4 nm de ancho por ms de 1,5 mde largo. Se han identificado dos tipos principales defimbrias, aunque no es posible la diferenciacin ultra-estructural entre ellas. Algunas variedades de A. naes-lundii transportan ambas, mientras que otras slotransportan una (220). Las fimbrias de tipo 1 se aso-cian a la adhesin de A. naeslundii a las protenas ri-cas en prolina acdica salival y a la estaterina deposi-tada dentro del biofilm salival (27). A las fimbrias detipo 2 se las asocia con la adhesin de A. naeslundii alos receptores glucosdicos en las clulas epiteliales, alos leucocitos polimorfonucleares y a los estreptococosorales (16, 97, 104). Esta adhesin similar a la lectina aestos sustratos es inhibida por galactosa y N-acetil-ga-lactosamina (210).

Las fimbrias mejor caracterizadas de las bacteriasgramnegativas orales son las de P. gingivalis. Se han

identificado tres tipos de fimbrias que miden 3 m delargo y 5 nm de ancho, la mayora de los cuales secompone de fimbrillina. Las fimbrias parecen ser losprincipales determinantes que median la adhesin deP. gingivalis. El polipptido fimbrillina une protenasricas en prolina, estaterina, lactoferrina, clulas epi-teliales orales, estreptococos orales, A. naeslundii, fi-bringeno y fibronectina (109). Las fimbrias de P. gin-givalis presentan propiedades quimiotcticas einduccin de citocinas, ambas necesarias para que P.gingivalis invada las clulas epiteliales (207) y endo-teliales (52). Estudios recientes han sugerido la pre-sencia de estructuras similares a las fimbrias en Pep-tostreptococcus micros (106), aunque todava no se haaclarado su papel en la adhesin.

Otros factores diferentes a las fimbrias o pilison im-portantes en la adhesin inicial de otras especies de bac-terias. Se cree que el movimiento que genera fuerza esun primer paso importante en la formacin de biofilmspor bacterias gramnegativas como E. coli, P. aeruginosa,Pseudomonas fluorescensy V. cholerae (154). Se cree quela motilidad activa debida a la produccin de flagelos olos movimientos de contorsin debidos a las fimbrias detipo IV aumentan el nmero de interacciones inicialesentre clulas bacterianas y superficies slidas y ayudan

a superar fuerzas repulsivas iniciales entre las bacteriasy las superficies. Los mutantes que no poseen flagelos ofimbrias de tipo IV muestran formaciones bioflmicasatrasadas o no producen biofilms. Este mecanismo noes una necesidad absoluta para toda la taxonoma, yaque las especies grampositivas como las que predomi-nan en la superficie de los dientes no son mviles.

Aunque las fimbrias o pilison importantes para laadhesin de ciertas especies a superficies slidas, noconstituyen el nico medio de adhesin inicial. Lasprotenas de superficie celular de Staphylococcus epi-dermidis (80, 81) y Caulobacter crescentus (108) sonimportantes en la adhesin inicial de estas especies asuperficies slidas, y una adhesina polisacrida cap-

sular de S. epidermidistambin puede mediar en laadhesin de esta especie a superficies slidas (138).

Estudios recientes han sugerido que las adhesinas in-volucradas en la adhesin inicial a superficies slidasson en muchos aspectos diferentes de las molculas im-plicadas en la formacin de una estructura multicapa(45, 80). Mientras que un grupo de protenas media enla adhesin de S. epidermidis a superficies slidas (80,81), un segundo grupo de protenas (90) o polisacri-dos (133, 167, 223) media en la adhesin clula a clulaen la construccin de una estructura tridimensional. Deforma similar, E. coli se adhiere a las superficies me-diante las fimbrias de tipo I (61), pero el desarrollo deuna estructura tridimensional compleja parece ser de-bida a la produccin de un cido colnico exopolisac-rido (45).

Coagregacin de bacterias

La asociacin de bacterias dentro de biofilms mix-tos no es aleatoria. Se ha demostrado que hay asocia-ciones especficas entre bacterias en los biofilms den-tales. Socransky y cols. (174) estudiaron ms de 13.000muestras de placas subgingivales de un total de 185individuos adultos y utilizaron tcnicas de anlisis degrupo y de ordenacin de comunidad para demostrarla presencia de grupos microbianos especficos en laplaca dental (fig. 1). Se reconocieron seis grupos es-trechamente asociados de especies de bacterias, entrelas que se incluyeronActinomyces, un complejo ama-rillo que consta de miembros del gnero Streptococcus,un complejo verde compuesto por especies de Cap-nocytophaga, Actinobacillus actinomycetemcomitansserotipo a, Eikenella corrodens, Campylobacter conci-sus y un complejo prpura consistente en Veillonellaparvula y Actinomyces odontolyticus. Estos grupos deespecies son colonizadores tempranos de la superficiedel diente. Su crecimiento habitualmente precede a lamultiplicacin de los complejos naranja y rojo gram-negativos predominantes (fig. 1). La figura 2 muestraque ciertos complejos se observan juntos con mayorfrecuencia que otros en la placa subgingival. Por ejem-

plo, es muy poco probable que se encuentren especiesdel complejo rojo en ausencia de miembros del com-plejo naranja. Por el contrario, los miembros de los com-plejos Actinomyces, amarillo, verde y prpura se ob-servan con frecuencia sin miembros del complejo rojo,o incluso sin los complejos naranja y rojo.

Los estudios in vitro que examinaron las interac-ciones entre las diferentes especies bacterianas oraleshan mostrado relaciones similares (100). Estos estu-dios de las bacterias orales han indicado que el reco-nocimiento entre clulas no es aleatorio, sino que cadavariedad tiene un grupo definido de patrones de co-agregacin. Adems, las adhesinas funcionalmente si-milares en bacterias de diferente gnero pueden re-


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conocer los mismos receptores en otras clulas bac-terianas. La mayora de las bacterias orales humanasse adhieren a otras bacterias orales. Esta adhesin c-lula a clula se conoce como coagregacin.

Como se ha sealado anteriormente, el primer pasoen la formacin de un biofilm consiste en la adhesinde un organismo a una superficie slida. En la placasupragingival, la pelcula adquirida que se forma enuna superficie dental limpia en unas pocas horas de-riva de la saliva y del fluido gingival crevicular. Estapelcula acondicionada proporciona varios recepto-res para la unin de bacterias orales, como las prote-

nas ricas en prolina acdica que unen Streptococcusgordonii (64, 87) y A. naeslundii con las fimbrias detipo 1 (26, 62, 141). Otras especies que se unen a lapelcula adquirida son las fusobacterias a travs de es-taterina y las especies Veillonella (136) y S. mutans(169) a travs de glucanos catalizados por glucosil-transferasas en presencia de sacarosa.

Los estreptococos representan el 47-82 % de las mi-crofloras que colonizan la superficie limpia del diente(100). La mayora de los estreptococos viridans ad-hieren a la cubierta de hidroxiapatita salival, aunqueciertas variedades de S. gordonii no lo hacen (64, 87).


19

P. gin gival i s

B. forsythu s

T. den ti cola

S. m it is

S. oral i s

S. san gui s

Streptococcus sp.S. gord oni i

S. in term edi us

C. gracil isC. rectu s

C. showae

E. noda tum

F. nu cleatum nu cleatum

F. nucleatum polymorph um

P. i nt erm edi a

P. mi cros

P. n i grescens

S. constella tu s

Acti nom yces

species

V. par vul a

A. odontol yt icusE. corr odens

C. gingival is

C. spu ti gena

C. och ra ceaC. conci sus

A. acti no. a

Fig. 1. Diagrama de la asociacin entre especies subgingi-

vales (adaptado de Socransky y cols. [174]). Los datos pro-

ceden de 13.321 muestras de placas subgingivales toma-

das de la cara mesial de cada diente en 185 adultos. Cada

muestra se analiz de forma individual con respecto a la

presencia de 40 especies subgingivales utilizando anlisis

tablero de ajedrez por hibridacin DNA-DNA. Se buscaron

asociaciones entre especies mediante tcnicas de anlisis

de grupo y de ordenacin comunitaria. La base de la pir-

mide comprende las especies que se creen que colonizan

la superficie del diente y que proliferan en una fase tem-

prana. El complejo naranja se vuelve numricamente pre-

dominante ms tarde y se cree que sirve de puente entre

los colonizadores tempranos y las especies del complejo

rojo, que predominan numricamente en las fases tardas

del desarrollo de la placa.


9/44

La especie Streptococcus, a diferencia de otras espe-cies orales, muestra un alto grado de coagregacin en-tre variedades, que puede contribuir a su dominiocomo colonizador temprano (101, 103). Este hechoconcuerda con la descripcin de un complejo amari-llo que consta de especies de estreptococo (174), queparece ser un complejo colonizador temprano. Con eltiempo, los biofilms orales se vuelven ms complejosy otras especies se unen a ellos o los remplazan. Porejemplo, especies de cinco gneros diferentes, que sonHaemophilus parainfluenzae (120), Prevotella loescheii(208), S. gordonii (28, 101, 209),A. naeslundii (99) y Vei-llonella atypica (88), reconocen el mismo receptor dehidratos de carbono en Streptococcus oralis(100). Tam-bin se ha demostrado la coagregacin entre Acti-nomyces y Veillonella, aunque se desconocen las mo-lculas que median en esta asociacin. La coagregacinentre las especies Capnocytophaga ochraceay Strepto-

coccus depende de receptores diferentes de los res-ponsables de la coagregacin entre los estreptococos.Es interesante el hecho de que los patrones de coa-gregacin in vitroson similares a la relacin que existeentreActinomycesy los complejos amarillo, prpura yverde encontrados in vivo.

Las especies gramnegativas que se vuelven, num-ricamente, ms importantes en una fase posterior enel biofilm dental son dominadas por Fusobacteriumnucleatum(140). Esta especie se coagrega con todaslas bacterias orales probadas hasta ahora in vitro, quecomprenden cepas de P. gingivalis, Treponema denti-cola, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, espe-cies de Eubacterium, especies de Selenomonas y es-

pecies deActinomyces(2, 102, 103). Fusobacterium nu-cleatum es tambin capaz de unirse a estaterina, unafosfoprotena encontrada en la pelcula adquirida (63).La capacidad de esta especie para coagregarse conmltiples especies diferentes, as como para unirse ala pelcula salival, puede explicar su dominio en bio-films dentales ms complejos. Las complejos rojo ynaranja contienen muchas de estas especies coagre-gadas como F. nucleatum, P. intermedia, especies deEubacterium, P. gingivalisy T. denticola.

Los estreptococos y F. nucleatum proporcionanejemplos de similitud funcional. Siete especies de dis-tinto gnero reconocen los receptores en S. oralis,mientras que 10 especies diferentes reconocen lamisma adhesina en F. nucleatum. Es poco probableque estos dos ejemplos sean los nicos existentes enlos biofilms dentales. As pues, la observacin, en es-tudios tanto in vivo como in vitro, de que la coagre-

gacin de muchas bacterias orales no es aleatoriapuede explicarse por la similitud funcional de mol-culas, asociadas a la coagregacin, que se encuentranen la superficie de una amplia gama de bacterias (100).

Factores que afectan la adhesinde los biofilms

Factores fsicos y qumicos pueden afectar la adhe-sin de biofilms a la superficie. Propiedades fsicascomo la rugosidad de la superficie pueden incremen-tar el rea de superficie y, por lo tanto, aumentar lacolonizacin. La rugosidad tambin proporciona pro-


20

FRECUENTES INFRECUENTES

Fig. 2. Diagrama de asociaciones frecuentes (lado izquierdo) e infrecuentes (lado derecho) entre complejos en las mues-

tras de placa subgingival.


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teccin frente a las fuerzas de atricin y aumenta ladificultad de limpieza (17). La formacin de la placadental, por ejemplo, comienza en hendiduras, ranu-ras e irregularidades de la superficie dental, donde lasbacterias de colonizacin inicial se encuentran pro-tegidas. Adems, se ha demostrado que la formacinde la placa supragingival, una vez que se ha produ-cido la colonizacin inicial, se lleva a cabo de formams rpida en superficies rugosas (158).

La composicin qumica de una superficie tambinrepercute en la colonizacin bacteriana, ya que puedecontener componentes beneficiosos o dainos. Porejemplo, metales como el latn (una aleacin de co-bre y cinc) presentan propiedades antimicrobianas de-bido a la liberalizacin de cinc y a las propiedades an-timicrobianas del cobre. El cloruro de polivinilo, porotra parte, contiene carbono, hidrgeno y cloruro, quepueden estimular el crecimiento bacteriano (164). Los

biofilms acondicionados, como la pelcula dental, pue-den cubrir la superficie e influir en la colonizacin.An no est claro el papel de los biofilms acondicio-nados en la adhesin microbiana, pero se ha propuestoque la fuerza del biofilm depende ms de la cohesindel biofilm acondicionado que del contacto bacterianodirecto con la superficie desnuda (17). El medio l-quido que rodea la superficie, por ejemplo la salivaque rodea al diente, tambin influye en la adhesinbacteriana y en la morfologa del biofilm (183). La ve-locidad de flujo de este medio influye en la adhesinbacteriana y en la morfologa del biofilm. Los biofilmsque crecen en condiciones de flujo laminar (cargasbajas) se desarrollan como microcolonias desigualesy consisten en grupos de clulas circulares rugosas se-paradas por vacos intersticiales. Los biofilms que cre-cen en condiciones de flujo turbulento tambin sondesiguales, pero consisten en grupos de rizos y ser-pentinas alargados que oscilan en el flujo (181). Losvacos interticiales, que actan como canales de trans-porte, disminuyen a medida que el biofilm se desa-rrolla, reduciendo las caractersticas del transporte demasa y, finalmente, controlando el ndice de creci-miento del biofilm, debido a la reduccin de los nu-trientes y, posiblemente, a la disponibilidad de ox-

geno (23). Como se describir posteriormente, estadisminucin en el ndice de crecimiento puede afec-tar la resistencia antibitica.

Problemas mdicos debidosa los biofilms

Costerton y cols. (43) indicaron que una ampliagama de infecciones humanas se deben a los biofilms.Entre ellas se incluyen caries dentales, enfermedadesperiodontales, otitis media, infecciones musculos-quelticas, fascitis necrosante, infeccin del aparatobiliar, osteomielitis, prostatitis bacteriana, endocardi-

tis de vlvula nativa, meloidosis y neumona fibrosaqustica. Caractersticas de estas infecciones son supersistencia y cronicidad, as como la dificultad de suerradicacin. Por ejemplo, se ha demostrado que lapresencia continua de P. aeruginosa en los pulmonesde pacientes con fibrosis qustica constituye unafuente enorme de malestar para el paciente y un de-safo frustrante para el mdico. Revisten particular in-ters para los investigadores dentales los biofilms de-sarrollados en dispositivos implantados, ya quecomparten la propiedad con los biofilms dentales quese han formado en una superficie descubierta. Ambostipos de biofilms pueden alcanzar gran complejidaden su composicin microbiana y un tamao conside-rable. Los dentistas, al igual que los mdicos, utilizanimplantes que proporcionan superficies no cubiertaspara la colonizacin potencial de biofilms (98, 114,139, 191).

En la ltima dcada ha aumentado el uso de dis-positivos mdicos implantables confeccionados conbiomateriales y, por lo tanto, se ha incrementado elnmero de infecciones bioflmicas asociadas conestos dispositivos (8). Tales infecciones son particu-larmente difciles de tratar, a pesar de que muchas in-fecciones de implantes estn causadas por microor-ganismos habitualmente considerados no patgenospara el hombre. Existen tres tipos de dispositivos im-plantables: los que se implantan totalmente (articu-laciones de caderas y rodillas, marcapasos, vlvulascardacas, etc.), los que se implantan parcialmente(como los catteres venosos centrales y los implantesdentales) y los que no se implantan (muchos catte-res y prtesis de voz), que no requieren ciruga parasu implantacin o eliminacin. En la primera catego-ra, la infeccin es mayor en el momento de la im-plantacin quirrgica. En la segunda y la tercera ca-tegoras, la infeccin est relacionada con la duracindel perodo de implantacin. Algunas especies de es-tafilococos, en particular S. epidermidis, son los agen-tes causales ms comunes de la mayora de las in-fecciones, produciendo con frecuencia infeccionestardas debido a su patogenicidad de bajo grado.Staphylococcus aureus, P. aeruginosa y otros bacilos

gramnegativos aerobios tienden a asociarse con in-fecciones ms graves y con una presentacin agudams temprana. La vlvulas cardacas son infectadas,con frecuencia, de forma tarda, por estreptococos ora-les. Se ha conseguido aislar Propionibacterium acnesde ms del 50 % de las prtesis de cadera eliminadas(193), mientras que la especie Candida fue el princi-pal agente infeccioso de las prtesis de voz (142). Lasinfecciones bioflmicas de dispositivos mdicos, par-ticularmente los de la categora 1, estn constituidascasi siempre por una especie simple. Las infeccionesrelacionadas con el biomaterial se caracterizan por sucronicidad, persistencia y falta de sensibilidad a losantimicrobianos. Los grmenes acceden a los dispo-


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sitivos, habitualmente, durante la implantacin qui-rrgica, ya que la mayora de las especies infecciosasson incapaces de invasin, aunque pueden producirseinfecciones posteriores debido a bacteriemia. Staphy-lococcus aureus es capaz de llevar a cabo una invasina partir de una herida insignificante. La cavidad orales una fuente de infecciones de estafilococos y es-treptococos de vlvulas cardacas implantadas.

Las bacterias raras veces se adhieren a la superficiedesnuda de la prtesis, sino que lo hacen a un biofilmacondicionado derivado del husped, como compo-nentes sanguneos o vlvulas cardacas. La tensin deoxgeno reducida dentro del biofilm puede cambiarlas propiedades de las bacterias infecciosas. Por ejem-plo, S. aureusque crece en un ambiente con tensinde oxgeno baja es capaz de producir toxinas!. La ten-sin de oxgeno reducida tambin puede conducir auna limitacin de nutrientes y a la seleccin de va-

riantes de colonias pequeas en las que las clulaspresentan pleomorfismo y se confunden con fre-cuencia con los cultivos mixtos. El crecimiento mi-crobiano tambin se ralentiza, y la sntesis de la pa-red de clulas y protenas disminuye. El potencial demembrana bajo conduce a la ausencia de sensibili-dad a los aminoglucsidos, a protenas microbicidasde plaquetas y a otras sustancias bacterianas que de-penden de la energa microbiana para alcanzar su ob-jetivo intracelular (156). As pues, las variantes de co-lonias pequeas son capaces de eludir la respuestainflamatoria y el sistema inmunolgico, y no se venafectadas por concentraciones teraputicas de anti-microbianos. Se ha sugerido que las variantes de co-lonias pequeas representan el verdadero fenotipo debiofilm que se encuentra en dispositivos mdicos im-plantados.

La investigacin en busca de medios efectivos detratamiento de infecciones relacionadas con los bio-materiales es muy activa, debido a sus elevados cos-tes, tanto econmicos como en trminos de morbili-dad y calidad de vida. Resulta poco probable que losagentes antimicrobianos en dosis habituales sean efi-caces para el tratamiento de infecciones relacionadascon los biomateriales. La concentracin inhibitoria

mnima de vancomicina para un microorganismo enestado planctnico podra ser de 1 g/ml, mientrasque en el modo de biofilm sera de 1.000 g/ml. Im-plantes de cadera infectados se han tratado con unacombinacin de ciprofloxacino y rifampicina. Los ca-sos tratados con xito se diagnosticaron pocas sema-nas despus de la ciruga, y los antibiticos se admi-nistraron durante 3-6 meses.

Estudios actuales estn evaluando el aumento de laactividad antimicrobiana utilizando microcorrientes(efecto bioelctrico) (38). El uso a largo plazo de an-tibiticos con fines, profilcticos no es, convenientepara los dispositivos de las categoras 2 y 3, aunquese ha demostrado que la aplicacin oral diaria de un

medicamento anti-Candidaen personas con disposi-tivos de categora 3 disminuye la infeccin por Can-dida (113). Adems, el empleo de dispositivos bio-adhesivos de liberacin lenta que contienen micona-zol tambin ha sido eficaz (198). Se ha demostrado queel uso de surfactantes producidos por lactobacilos dela dieta y Streptococcus thermophilus in vitro reducelos biofilms de Candida(195). De esta forma, el yogurnatural puede retrasar la colonizacin de Candida.

Otros estudios estn evaluando los efectos de la in-corporacin de agentes antimicrobianos en los ma-teriales de los dispositivos. Se ha demostrado que lamezcla de polvo antibitico con cemento seo inme-diatamente antes de su uso produce una disminucinsignificativa de los ndices de recada cuando se uti-liza en pacientes con prtesis de cadera ya infectadas(186). El recubrimiento de materiales de implante conagentes antimicrobianos ha producido resultados va-

riados, ya que estos recubrimientos son eluidos de lassuperficies y borrados de forma fcil por el biofilmacondicionado (79, 94, 135, 159, 171). Se han obtenidomejores resultados mediante la impregnacin de ma-teriales de dispositivos con agentes antimicrobianos,especialmente minociclina y rifampicina. Se demos-tr que los catteres impregnados prevenan infeccio-nes durante 8 das (46). Las derivaciones de lquidocefalorraqudeo impregnadas con agentes antimicro-bianos que protegen las superficies externas e inter-nas brindaron proteccin durante 2 meses (9).

Mecanismos de aumentode resistencia a los antibiticos de losmicroorganismos en los biofilms

Como se analizar ms adelante en este volumen,los antibiticos se han utilizado y siguen utilizndosede forma eficaz en el tratamiento de infecciones pe-riodontales. Sin embargo, el uso indiscriminado deagentes antimicrobianos y biocidas entraa el riesgode provocar un desarrollo de bacterias resistentes (55,116, 148). Tambin se ha sugerido que la resistencia aun tipo de antimicrobiano como un biocida puede

transmitirse a un tipo diferente de antimicrobiano,como un antibitico (116). Por ello, es importante com-prender los factores que conducen a la resistencia an-timicrobiana en los biofilms como la placa dental.

Se ha reconocido durante perodos de tiempo con-siderables que los microorganismos que crecen en losbiofilms son ms resistentes a los antibiticos quelos de la misma especie que crecen en un estado (noadherido) planctnico (4, 5, 21, 39-41, 85, 86, 144, 145).Aunque los mecanismos de resistencia a los antibiti-cos de los microorganismos que crecen en biofilms noestn totalmente claros (24), se han descrito ciertosprincipios generales. Casi sin excepcin, los microor-ganismos que crecen en biofilms son ms resistentes


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a los antibiticos que las mismas clulas que crecenen un estado planctnico. Se estima que la resistenciade las clulas que crecen en biofilms es de 1.000 a 1.500veces mayor que la de las clulas que crecen de formaplanctnica (37), aunque algunos investigadores con-sideran que estas estimaciones son demasiado eleva-das (180). Los mecanismos de aumento de resistenciaen los biofilms difieren entre especies, entre antibiti-cos y entre biofilms que crecen en hbitats diferentes.Un mecanismo importante de resistencia parece ser elnivel ms lento de crecimiento de las especies bacte-rianas en los biofilms, lo que las hace menos sensiblesa muchos antibiticos, aunque no a todos (6, 19, 43,219). En muchos estudios se ha demostrado que la re-sistencia de las bacterias a los antibiticos, biocidas obacteriostaticos es afectada por su estado nutricional,nivel de crecimiento, temperatura, pH y exposicionesprevias a concentraciones subeficaces de agentes an-

timicrobianos (20, 22, 211). Las variaciones en algunosde estos parmetros pueden conducir a una respuestavariada a los antibiticos dentro de un biofilm. La ma-triz lleva a cabo una funcin homeosttica, de modoque las clulas en el interior del biofilm experimentancondiciones, como la concentracin de iones hidr-geno o potenciales de oxidorreduccin, diferentes delas de las clulas de la periferia del biofilm o de las delas clulas que crecen de forma planctnica. Los ndi-ces de crecimiento de estas clulas ms profundas dis-minuirn, permitindoles sobrevivir mejor que las c-lulas de crecimiento ms rpido de la periferia cuandoestn expuestas a agentes antimicrobianos. Adems,las bacterias de crecimiento ms lento sobrepasan losmecanismos de defensa inespecficos, como las pro-tenas del shock y las bombas de flujo de multimedi-camentos (arcAB), y presentan un aumento de la sn-tesis de exopolmeros (65).

Aunque la matriz exopolmera de un biofilm no esper seuna barrera importante para la difusin de an-tibiticos, posee ciertas propiedades que pueden re-trasar la difusin. Por ejemplo, agentes reactivos qui-micamente o altamente cargados pueden no alcanzarlas zonas ms profundas del biofilm porque ste ac-ta como una resina de intercambio de iones que eli-

mina tales molculas de la solucin (65). Adems, lasenzimas extracelulares, como las beta-lactamasas, laformaldehdo-liasa y la formaldehdo-deshidrogenasapueden quedar atrapadas y concentrarse en la matrizextracelular, inactivando de esta forma los antibiti-cos hidrfilos, sensibles, que de forma caractersticatienen carga positiva. Algunos antibiticos como losmacrlidos, que llevan carga positiva pero hidrfoba,no son afectados por este proceso. Por ello, la capaci-dad de la matriz para actuar como una barrera fsicadepende del tipo de antibitico, de la unin de la ma-triz con ese agente y de los niveles del agente emplea-do (143). Dado que la reaccin entre el agente y lamatriz reducir los niveles del agente, un biofilm con

una masa mayor disminuir el agente ms fcilmente.Adems, los fenmenos hidrodinmicos (47) y la ve-locidad de recambio (turnover) de las microcoloniastambin afectar a la eficacia de los antibiticos (107).

Cada vez se le presta mayor atencin a la alteracindel genotipo y/o fenotipo de las clulas que crecendentro de la matriz de un biofilm. Las clulas que cre-cen en un biofilm expresan genes que no se observanen las mismas clulas que crecen en estado planct-nico, y pueden incluso mantener esta resistencia du-rante algn tiempo tras ser liberadas del biofilm. Porejemplo, Brooun y cols. (19) demostraron que las c-lulas de P. aeruginosaliberadas de los biofilms eranconsiderablemente ms resistentes a la tobramicinaque las clulas planctnicas y sugirieron que las c-lulas se volvan intrnsecamente ms resistentescuando crecan en un biofilm y mantenan parte desu resistencia incluso fuera del biofilm. Utilizando cl-

culos de transferencia de masa y medidas de pene-tracin (mediante un espectroscopio de infrarrojostransformado de Fournier de reflejo total atenuado)se ha demostrado que la resistencia antibitica puededeberse no slo a la incapacidad de algunos agentesmicrobianos para penetrar en el biofilm, sino tambina la resistencia celular (187). Pseudomonas aeruginosaque crece en estados fijos y planctnicos difiere enuna serie de genes que podran explicar el aumentode resistencia de una especie en el biofilm (145). Losestudios que han investigado los patgenos dentalesen estado planctnico deberan realizarse de nuevoutilizando microorganismos fijos, cuyas envolturasbacterianas contienen productos gnicos que puedenser completamente diferentes. Este reconocimientotiene consecuencias tanto para el uso de antibiticoscomo para el desarrollo de vacunas.

La presencia de un glicocliz, un nivel de crecimientoms lento y el desarrollo de un fenotipo de biofilm nopuede proporcionar una explicacin total del fenmenode la resistencia antibitica. Estas caractersticas pro-bablemente retrasan la eliminacin de las bacteriasdiana, permitiendo que se produzcan otros aconteci-mientos de seleccin (65). Recientemente, se ha pro-puesto la nocin de una subpoblacin de clulas su-

perresistentes dentro de un biofilm. Tales clulaspodran explicar los elevados niveles de resistencia aciertos antibiticos descritos en la bibliografa. Broouny cols. (19) examinaron la contribucin de las bombasde resistencia de multimedicamentos a la resistenciaantibitica de microorganismos que crecen en biofilms.Estas bombas pueden expulsar agentes antimicro-bianos no relacionados qumicamente. Como la ex-pulsin sita los antibiticos fuera de la membranaexterna, el proceso ofrece proteccin frente a los anti-biticos que tienen como objetivo la sntesis de la pa-red celular. Los investigadores estudiaron la relacinentre la respuesta de destruccin y la dosis en dos ce-pas de P. aeruginosa en un sistema in vitro. Una de las


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cepas era una mutacin por delecin que no posea labomba, mientras que la otra era una mutacin super-productiva. El ofloxacino fue 50 a 100 veces ms efec-tivo en la destruccin de la mutacin por delecin (sinbomba) que en la de la cepa superproductiva en con-centraciones antibiticas bajas. Sin embargo, para sor-presa de los autores, a medida que se incrementaba laconcentracin de antibiticos, la diferencia en la ca-pacidad de eliminacin de las dos cepas disminua, demodo que, con concentraciones >10 g/ml, no haba

diferencia alguna en el ndice de destruccin. Los in-vestigadores postularon la presencia de una subpobla-cin de clulas superresistentes en ambas cepascuando crecan como biofilms. Esta subpoblacin re-presentaba alrededor de 105 de las 108 clulas en losbiofilms originales. No se detect ninguna subpobla-cin superresistente cuando las mismas variedadescrecieron de forma planctnico. En estado planctnico,las mutaciones de delecin se destruyeron mucho msrpidamente que las mutaciones sobreproductivas conlos intervalos de concentracin de antibiticos estu-diados. El ciprofloxacino mostr patrones similares dedestruccin para las mutaciones de delecin y de so-breproduccin en estado planctnico. Sin embargo, no

hubo diferencias en el ndice de destruccin de las dosmutaciones cuando crecan como biofilms. Se detectuna meseta de eliminacinpara ambas cepas cuandocrecan en biofilms, que sugiri la existencia de clulassuperresistentes.

Evidentemente, la deteccin de un aumento de laresistencia a antibiticos en las clulas dentro de losbiofilms debe llevar a replantearse los procedimien-tos clnicos y de investigacin. Si las clulas de los bio-films difieren en su resistencia a los antibiticos de lasclulas que crecen en estado planctnico, cmo seinterpretan los datos de sensibilidad antibitica invitro proporcionados por los laboratorios de micro-biologa dental y mdica? Cuando se elaboran los me-dicamentos antimicrobianos, las pruebas deben lle-varse a cabo en clulas desarrolladas en biofilms o enclulas planctnicas? Tienen algn papel los anti-biticos en el tratamiento de las infecciones perio-

dontales?

Biofilms orales que conducena enfermedades periodontales

El extenso apartado previo sobre la biologa del bio-film proporciona una base que ayuda a comprender laecologa de la compleja comunidad de microorganis-mos que coloniza la superficie del diente y que pro-duce las enfermedades periodontales. La fotografa cl-nica de la figura 3 corresponde a un individuo con malahigiene dental, en la que se observan manchas en lassuperficies de los dientes, posiblemente causados portabaco, caf o t. Un motivo de preocupacin es la apa-ricin de un fino biofilm de placa bacteriana en mu-chas de las superficies dentales, junto con la forma-cin bastante evidente de placa en regiones como lassuperficies bucales mesiales de los caninos superiorizquierdo e inferior derecho. Estas regiones bioflmi-cas (placa) estn destacadas en la figura 4, que mues-tra los mismos dientes despus de teirlos con una so-lucin reveladora. Los biofilms finos como las de losincisivos inferiores pueden constar de comunidadesde biofilms de 50 a 100 clulas de grosor. Las placas

ms gruesas, como la de los caninos superior izquierdoe inferior derecho, pueden contener de biofilms de 300capas de clulas de grosor o ms. El nmero de mi-croorganismos que reside en la superficie mesial delos caninos superior izquierdo e inferior derecho su-pera, probablemente, los 300 millones. Este nmero essignificativo, ya que supera la poblacin total de Esta-dos Unidos (incluidos los votantes no censados de Flo-rida). Estas comunidades microbianas son muy com-plejas. Se han detectado en torno a 500-600 especiesbacterianas en muestras de la cavidad oral. Esta esti-macin se basa en la deteccin de alrededor de 350 es-pecies cultivadas y de ms de 200 especies no cultiva-das (Floyd Dewhirst y Bruce Paster, comunicacin


24

Fig. 3. Fotografa clnica de un individuo que presenta tin-

cin de los clientes y placa dental supragingival.

Fig. 4. Fotografa clnica del indivduo de la figura 3 tras la

aplicacin de una solucin reveladora.


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personal). Se han detectado especies no cultivadas me-diante secuenciacin de fragmentos 16S ARNr que fue-ron amplificados directamente de muestras de placasy clonados en E. coli. Afortunadamente, el nmero deespecies puede establecerse entre 550 y 600, ya que espoco frecuente encontrar nuevas especies en estudiossobre especies no cultivadas en muestras de placa (Pas-ter y Dewhirst, comunicacin personal). En una mues-tra de placa dada, no es extrao detectar 30 especiesbacterianas o ms. Por lo tanto, los biofilms que colo-nizan la superficie de los dientes pueden encontrarseentre los biofilms ms complejos que existen en la na-turaleza. Esta complejidad se debe en gran medida ala superficie no cambiante del diente, que permite lacolonizacin persistente y da la oportunidad de desa-rrollarse a ecosistemas muy complejos. Adems, laabundancia de nutrientes y la gran capacidad de lasespecies orales para coagregarse entre s, como se ha

descrito anteriormente, pueden aumentar esta com-plejidad.

La figura 5 muestra un corte de una placa dental su-pragingival desarrollada en una corona epxica de unvoluntario (122-124). En l se observan muchas de lascaractersticas de los biofilms descritas con anteriori-dad. Las especies bacterianas se adhirieron a la su-perficie slida, se multiplicaron y, en este coste, for-maron microcolonias en forma de columna. Laheterogeneidad de las especies colonizadoras es evi-dente incluso desde el punto de vista morfolgico ysera an ms notable si las clulas del corte se hu-bieran caracterizado mediante tcnicas moleculares ode cultivo. La superficie del biofilm presenta morfoti-pos que no son evidentes en las capas ms profundasy pone de manifiesto el papel de la coagregacin en eldesarrollo de los biofilms. En este corte no se aprecianlos canales de agua de los biofilms descritos anterior-mente. Ello puede deberse a artefactos de preparacino fijacin (40) o a que la placa es tpica de un modelobacteriano denso. Se han observado canales de aguaen placas desarrolladas en la cavidad oral humana me-diante el microscopio confocal (216). Este biofilm den-tal posee todas las propiedades de los biofilms de otroshbitats de la naturaleza. Posee un sustrato slido, en

este caso una corona epxica, pero lo ms habitual esque el diente, posea microcolonias mixtas desarrolla-das en un glicocliz y una interfaz de fluido grueso pro-porcionado por la saliva.

En la figura 6 se muestra un segundo ecosistema bio-flmico. Se trata de un corte de la placa subgingival hu-mana, a menor aumento que en la figura 5 para per-mitir visualizar las regiones en el interior del biofilm. Sepuede apreciar la placa adherida a la superficie del dienteen la parte superior izquierda del corte. Este biofilm aso-ciado al diente constituye una extensin del biofilm en-contrado sobre el margen gingival y puede ser bastantesimilar en cuanto a su composicin microbiana. Se ob-serva un segundo biofilm, posiblemente asociado a c-


25

Fig. 5. Corte histolgico de la placa supragingival humana

teida con azul azul-metileno de toluidina. Se permiti que

la placa supragingival se desarrollara durante 3 das en una

corona epxica de un voluntario humano. La superficie de

la corona se encuentra a la izquierda, y la interfaz de sa-

liva, hacia la derecha (cortesa de Max Listgarten, Univer-

sidad de Pennsylvania).

Fig. 6. Corte histolgico de la placa subgingival humana te-

ida con azul azul-metileno de toluidina. La superficie del

diente se encuentra hacia la izquierda, y la lnea epitelial

de la bolsa periodontal, hacia la derecha. En la zona supe-

rior izquierda del corte se aprecia la placa bacteriana ad-

herida a la superficie del diente, se observa una segunda

zona de microorganismos bordeando la pared de la bolsa

periodontal (cortesa de Max Listgarten, Universidad dePennsylvania).


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26

Sanos

Periodon

titis

Sanos

Periodontitis

San

os

Periodontitis

Recuentos(105)

22

11

0

11

22

RecuentosconsondadeADN(%)

26

13

0

13

26

Sitioscolonizados(%)

100

50

0

50

100

PLACASUPRA

GINGIVAL

A.gerencseriae

A.

israe

lli

A.naeslun

dii

1

A.naeslun

dii

2

A.o

don

toly

ticus

V.parvu

la

S.gordonii

S.

intermed

ius

S.m

itis

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lis

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P.acnes

P.

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S.ang

inosu

s

S.nox

ia

T.socransk

ii


16/44

lulas epiteliales, que reviste la superficie epitelial de labolsa. Este biofilm contiene principalmente espiroque-tas y especies bacterianas gramnegativas (122-124). Seha detectado un nmero elevado de P. gingivalisy T.denticolaen la bolsa periodontal, biofilms asociadas aclulas epiteliales mediante inmunocitoqumica (96).Cabe suponer que el tercer miembro del complejo rojo(174), Bacteroides forsythus, tambin puede ser nume-roso en esta zona, especialmente porque se han halladoniveles elevados de esta especie, utilizando sondas deADN, en asociacin con las clulas epiteliales revistenla bolsa periodontal (54). Entre los biofilms asociados alas clulas epiteliales y los biofilms asociados a los dien-tes se observa una zona menos densa de microorga-nismos. stos pueden estar adheridos libremente opueden hallarse en estado planctnico. La caracters-tica fundamental de la figura 6 es que en la placa sub-gingival parece haber regiones asociadas a clulas epi-

teliales y regiones asociadas a los dientes, as como unaposible tercera zona dbil o no adherida de microorga-nismos. Resulta muy sospechoso que estas regiones di-fieran de forma significativa en la composicin micro-biana, en el estado fisiolgico y en su respuesta adiferentes tratamientos.

Composicin microbianade los biofilms supragingivalesy subgingivales

Las bacterias asociadas con enfermedades perio-

dontales residen dentro de los biofilms, sobre el mar-gen gingival y debajo de ste. El biofilm supragingivalse adhiere a la superficie del diente, y en la mayora delas muestras de placa predominaban las especies deActinomyces. En la figura 7 se indican los recuentos,proporciones y predominio (porcentajes de sitios co-lonizados) de 40 especies agrupadas de acuerdo conlos complejos microbianos (174) de las muestras deplaca supragingival de individuos sanos desde el puntode vista periodontal y de individuos con periodontitis

(217).Actinomycespredomina tanto en los individuossanos como en los enfermos, con independencia delmtodo de recuento. Adems, todas las especies exa-minadas se hallaron (en promedio) en ambos tipos deindividuos, enfermos y sanos, aunque los recuentos yproporciones de los agentes patgenos periodontaleseran significativamente ms elevados en los pacientescon enfermedad periodontal.

Como se ha descrito antes, la naturaleza de los bio-films subgingivales es ms compleja, ya que existen bio-films asociados a tejidos y a los dientes separados poruniones laxas o clulas planctnicas. En la figura 8 seindican los recuentos, proporciones y predominio de 40especies de muestras de placas subgingivales de indivi-duos con periodonto sano y de pacientes con enfer-medad periodontal (217). Al igual que en la placa su-pragingival, la especie predominante en la placasubgingival esActinomyces. Sin embargo, se hallaron re-

cuentos, proporciones y prevalencias significativamentems elevados de especies de los complejos rojo y na-ranja en las muestras de individuos con periodontitis.En la figura 9 se proporcionan los datos de las especiesdel complejo rojo, los cuales ponen de manifiesto losniveles, proporciones y prevalencias elevados de estasespecies tanto en la placa supragingival como en la sub-gingival de los pacientes con periodontitis en compa-racin con muestras similares de individuos sin enfer-medad periodontal. En la figura 10 se resumen lasprincipales diferencias en los complejos microbianos delas placas supragingival y subgingival de individuos sa-nos y con periodontitis. A medida que uno se desplazadel medio supragingival al subgingival y de individuossanos a enfermos, se constata una disminucin signifi-cativa de Actinomycesy un aumento de la proporcinde miembros del complejo rojo (B. forsythus, P. gingi-valisy T. denticola). El hecho de conocer las diferenciasentre individuos sanos y enfermos ayudara a los tera-peutas a definir los objetivos microbianos en el trata-miento de las infecciones periodontales.

Patgenos periodontales

En los apartados precedentes se ha hecho hincapien la complejidad y naturaleza de las placas dentalessubgingivales. La pregunta clave es cules de estas nu-merosas especies son los agentes causales de las enfer-medades periodontales que conducen a la prdida delos tejidos de soporte. Durante ms de 100 aos, los mi-crobilogos orales han buscado los agentes causales delas enfermedades periodontales. Estos estudios se hanrevisado de forma extensa (70, 222), de modo que losdatos no volvern a revisarse aqu. Sin embargo, los es-tudios realizados mediante tcnicas predominante-mente de cultivo y microscopio para identificar las es-pecies bacterianas permitieron establecer un grupo deespecies consideradas clave en las enfermedades pe-


27

Fig. 7. Diagrama de barras de los recuentos ( 105), propor-

ciones y porcentajes de los sitios colonizados en las muestras

de placa supragingival tomadas de 22 individuos con perio-

donto sano y de 23 pacientes con periodontitis del adulto. Las

barras representan los valores medios, y las lneas, los errores

estndar de la media (EEM). Las muestras de placa supragin-

gival se tomaron de la superficie mesial de cada diente, con

excepcin de los terceros molares, y se trataron individual-

mente para determinar el contenido de 40 especies bacteria-

nas utilizando el anlisis tablero de ajedrez por hibridacin

DNA-DNA. Las barras de la izquierda representan a los indi-

viduos sanos y las de la derecha, a los enfermos. Las especies

estn organizadas en complejos microbianos descritos por

Socransky y cols. (174) y codificadas siguiendo un sistema de

colores.La significacin de las diferencias entre los indvidiuos

sanos y enfermos se determin mediante la prueba de Mann-Whitney adaptada para comparaciones mltiples (175).


17/44


28

Sanos

Periodo

ntitis

Sanos

Periodontitis

San

os

Periodontitis

Recuentos(105)

14

7

0

7

14

RecuentosconsondadeADN(%)

16

8

0

8

16

Sitio

scolonizados(%)

90

45

0

45

90

PLACASUBGINGIVAL

A.gerencseriae

A.

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A.naeslun

dii

1

A.naeslun

dii

2

A.o

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V.parvula

S.gordoni

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P.acnes

P.

Me

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ogen

ica

S.ang

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S.nox

ia

T.socrans

kii


18/44

riodontales destructivas. Los estudios compararon lasmicrofloras de localizaciones sanas y con periodontitis,lesiones progresivas activas y lesiones no progresivas,as como sitios tratados con xito y sin xito con dife-rentes tratamientos periodontales. Tres especies (A. ac-tinomycetemcomitas, P. gingivalis, y B. forsythus) esta-

ban estrechamente relacionadas con la enferme-dad periodontal, la progresin de la enfermedad y laterapia sin xito. Como tales, estas especies fueron de-signadas como patgenos periodontales en el WorldWorkshop of Periodontology de 1996 (30, 222). Otras es-pecies, como F. nucleatum, Campylobacter rectus, P. in-termedia, P. nigrescens, Eubacterium nodatum, P. micros

y varias espiroquetas, tambin pueden causar enfer-medades periodontales, aunque los datos sobre su pa-pel causal son menos claros (70). Ms tarde, se planteque los virus, como el citomegalovirus, el virus de Eps-tein-Barr, papilomavirus y el virus herpes simple, de-

sempean un papel en la produccin de enfermedadesperiodontales, posiblemente mediante el cambio de larespuesta del husped a la microflora subgingival local(31-35, 77, 149, 192, 202).

Estudios recientes han aportado ms datos que apo-yan el papel de muchas de estas especies con respectoa las enfermedades periodontales. Por ejemplo, la utili-zacin de la hibridacin ADN-ADN permiti el anlisis

de un gran nmero de especies de numerosas muestrasde placas (177). Estos datos se analizaron en cuanto arecuento, proporcin y prevalencia (porcentaje de sitioscolonizados) de varias especies en individuos con dife-rentes estados periodontales. Si bien las tres medidas decolonizacin microbiana son valiosas, la prevalencia de

las especies parece estar particularmente relacionadocon el estado de la enfermedad y la susceptibilidad a laenfermedad. En la figura 11 se indican los porcentajesde sitios colonizados y los recuentos de 40 especies sub-gingivales en individuos con periodontitis del adulto, conperiodontitis refractaria y con periodonto sano y en in-dividuos ancianos sin enfermedad periodontal (68). Cla-ramente, la principal diferencia entre los grupos fue laprevalencia de B. forsythus, P. gingivalisy T. denticola enlos individuos con enfermedad periodontal. Adems,otros patgenos supuestamente periodontales, entreellos F. nucleatum subespecie vincentii, C. rectusy P. in-termedia,

tambin eran predominantes en individuosrefractarios y con periodontitis.

Tratamiento de los biofilms periodontales

La informacin presentada anteriormente indicaque los biofilms que colonizan la superficie de losdientes y los tejidos blandos orales son complejos yque las bacterias residentes presentan misteriosas in-teracciones entre s y con las superficies que coloni-zan. Los datos indican que los microorganismos delos biofilms son dignos adversarios en cuanto a sucontrol y erradicacin. A los terapeutas que tratan in-fecciones bioflmicas dentales les preocupa que las es-


29

Fig. 8. Diagrama de barras de los recuentos ( 105), pro-

porciones y porcentajes de los sitios colonizados en las

muestras de placa subgingival tomadas de 22 individuos

con periodonto sano y de 23 pacientes con periodontitis

del adulto. El formato es el mismo descrito en la figura 7.

Fig. 9. Diagrama de barras de los recuentos ( 105), pro-

porciones y porcentajes de los sitios colonizados por las es-

pecies del complejo rojo, B. forsythu s, P. gingival i s y T. den-

ticola, en muestras de placa supragingival (supra) y

subgingival (sub) tomadas de 22 individuos con periodonto

sano y 23 pacientes con periodontitis del adulto. La signi-

ficacin de las diferencias entres individuos sanos y enfer-

mos se determin mediante la prueba de Mann-Whitney

adaptada para comparaciones mltiples (175).

4

2

0

5,0

2,5

0

54

27

0

Recuentos 105

supra

Sano Periodontitis

sub supra sub supra sub

Recuentos con sonda de ADN (%) Sitios colonizados (%)

B. for sy thus P.g i ngi val i s T. den t i co la

supra sub supra sub supra sub

B. fo r sy thus P. gi ngi val i s T. den t i co la

supra sub supra sub supra sub

B. fo rsythus P. gi ngi val i s T.den t i co la


19/44

pecies patgenas existan en cantidades muy elevadas,se distribuyan ampliamente en el interior de la cavi-dad oral y existan en estructuras comunitarias queconfieren proteccin frente a los mecanismos de de-

fensa del husped y los agentes microbianos. Por otraparte, los microorganismos pueden multiplicarsecomo mucha facilidad y presentan una gran capaci-dad para adherirse a las superficies nuevas del hus-ped o de otros microorganismos que ya se han adhe-rido al husped. Por ello, la expansin y recolonizacinson una amenaza constante. Dadas las capacidadesformidables de este oponente, es importante recordarque las terapias periodontales, por lo general, tienenefectos beneficiosos en cuanto a ralentizacin y de-tencin de la progresin de las enfermedades perio-dontales y mantenimiento del periodonto. La expre-sin por lo general indica que las terapias no siempretienen xito y que, en ocasiones, son fundamentales,


30

Sanos

Actinomyces

Otros

Periodontitis

Supragingival

Subgingival

Fig.10. Diagrama de circunferencias que muestra las propor-

ciones medias de los recuentos con sonda de ADN de grupos

microbianos en muestras de placa supragingival y subgingi-

val de 22 individuos con periodonto sano y de 23 pacientes

con periodontitis. Las especies se agruparon en siete grupos

microbianos basndose en la descripcin de Socransky y cols.

(174). Las zonas de las circunferencias se adaptaron con el fin

de reflejar los recuentos totales medios en cada una de las lo-

calizaciones de muestra. La significacin de las diferencias en

los porcentajes medios de los complejos supravingival y sub-

gingival de los individuos sanos y enfermos se determin me-

diante la prueba de Kruskal-Wallis. Las especies rojas, na-

ranjas y Actinomycesfueron significativamente diferentes a

nivel de P< 0,001, y las especies del complejo verde difirieron

a nivel de P< 0,05 tras adaptarlas para 7 comparaciones. La

categora otros est compuesta por especies que no enca-

jaban en ningn complejo, o que representaban sondas de

nuevas especies cuya relacin con otras especies an no se ha

establecido. Reproducido con autorizacin del Journ al of Cli-

ni cal Peri odontology(Ximenez-Fyvie y cols. [217]).

Fig.11. Diagrama de barras de la prevalencia (porcentaje de

los sitios colonizados) y los recuentos medios de 40 espe-

cies subgingivales evaluadas en 27 individuos con perio-

donto sano, 35 ancianos sin enfermedad periodontal, 115

individuos con periodontitis no tratada y 36 pacientes con

peridontitis refractaria. Las especies se ordenaron de

acuerdo con los complejos microbianos descritos por So-

cransky y cols. (174). Se determin el porcentaje de sitios

colonizados a diferentes niveles por cada una de las 40 es-

pecies examinadas en cada individuo y luego se promedia-

ron los porcentajes en los cuatro grupos. La significacin de

las diferencias en los recuentos y la prevalencia medios en-

tre los grupos se evalu mediante la prueba de Kruskal-Wa-

llis. Para los recuentos: *p< 0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001;

para la prevalencia, #p< 0,05; ##p< 0,01; ###p< 0,001 des-

pus de adaptarlos para comparaciones mltiples (175). Re-

producido con autorizacin de Journ al of Cli ni cal Peri o-

dontology(Socransky y cols. [176]).


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