Sabas que existen microorganismos que no hemos podido cultivar?

Humberto Gonzalez y Reyna Fierro

Recibido: 26 de noviembre de 2008Aceptado: 18 de febrero de 2009

La vida en la tierra tiene muchas manifestaciones,desde animales y plantas de gran tamano, hasta mi-croorganismos. Todos juegan un papel muy impor-tante en la naturaleza. Si se toma una muestra de tie-rra, se coloca en agua esteril, se agita y se inocula me-dio de cultivo rico en nutrientes, se esperara que to-das las bacterias y hongos presentes, se desarrolla-ran en ese medio. Sin embargo, esto no es as, ya quepor medio de tecnicas de biologa molecular, parti-cularmente la Reaccion en Cadena de la Polimera-sa (PCR), se ha descubierto la existencia de microor-ganismos que no se desarrollan en los medios de cul-tivo comunmente utilizados y que, hasta la fecha, nose han podido cultivar en el laboratorio. A estos mi-croorganismos se les ha dado el nombre de micro-organismos no cultivables [8, 14].

Estos microorganismos no cultivables viven, se desa-rrollan y se dividen en condiciones muy particulares,y no se han podido cultivar en el laboratorio!. En es-te trabajo se describe como se descubrio que exis-ten estos microorganismos y se discute por que nose han podido cultivar en en laboratorio.

En general, para obtener muestras del DNA de cual-quier organismo, se requiere una cantidad considera-ble de material; para obtener dicho material, se cul-tiva al organismo y se colectan las celulas por cen-trifugacion, a este paso se le llama enriquecimien-to. Con el avance de la tecnologa, se ha logrado ais-lar DNA de: muestras de aire filtrado a traves de ta-mices que logran detener microorganismos; esto seha realizado en una diversidad de suelos que no tie-nen senales de vida, del interior de plantas y de aguasoceanicas o de fuentes termales, sin pasar por el pa-so de enriquecimiento, o sea sin cultivar a los mi-croorganismos. Este DNA se usa como molde pa-ra la amplificacion, por PCR, de los genes riboso-males existentes en la muestra. Esta tecnica se rea-liza con una DNA-polimerasa termoestable y oligo-nucleotidos complementarios (primers, o cebadoresuniversales) con las regiones conservadas de los ge-

nes ribosomales que se encuentran en todas las bac-terias. Los fragmentos sintetizados se pueden clonaren vectores o se determina su secuencia nucleotdi-ca directamente. Las secuencias obtenidas de los ge-nes del RNA ribosomal se comparan con las existen-tes en los bancos de datos (ej. Ribosomal Databa-se Project [6]), hay mas de 30,000 secuencias exis-tentes de un numero casi igual de especies bacte-rianas. Con este enfoque, se ha revelado una diver-sidad de microorganismos que no es posible detec-tar con los metodos de microbiologa tradicional [4,13, 21]. Tambien existen programas (tanto libres co-mo comerciales) para verificar que las secuencias ob-tenidas de ADN ambientales no sean artefactos oquimeras (hbridos de genes de diferentes microor-ganismos) [11]. Si las secuencias no se parecen a lade ningun microorganismo existente en mas de un97%, es posible que se trate de una bacteria nue-va, tal vez aun no cultivada. La secuencia obteni-da permite tambien identificar fragmentos de secuen-cia que no se encuentran en ninguna otra especie re-portada, o sea que son exclusivos de esta especie. Es-tas secuencias particulares pueden sintetizarse mar-cadas con nucleotidos fluorescentes y pueden utili-zarse en las muestras originales para ver al micros-copio de epifluorescencia o confocal, el tipo y dis-tribucion de las bacterias que presentan los genesmarcados.

Visualizar a las bacterias es un paso hacia su ais-lamiento, pero cultivar a muchas de las que han si-do detectadas de este modo, ha sido difcil. White-sides en 1997 logro cultivar bacterias del genero Vi-brio de un estado no cultivable, aunque es importan-te resaltar que el desarrollo de estas bacterias se inhi-be con altas concentraciones de nutrientes [20], y es-tos resultados se prestaron a controversia [4]. Asmis-mo, se logro desarrollar un Bacillus a partir de espo-ras de aproximadamente 250 millones de anos [18].Encontrar las condiciones para cultivar bacterias nocultivables continua siendo un reto para los micro-biologos [7].

Se ha acordado que a las bacterias no cultivablesdetectadas solo por su secuencia de genes riboso-

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Figura 1. Cultivo en placa de Streptococcus thermophilus.

males se les designe como candidatos. Algunosejemplos de estas son las bacterias magnetotacticasacuaticas (obtenidas de un lago en Alemania) quese caracterizan por pegarse a imanes, y son llama-das Magnetobacterium bavaricum [17]; o el candi-dato Liberobacter, un patogeno de ctricos [9] quees cercano a bacterias simbiontes beneficas del gene-ro Mesorhizobium que crecen con facilidad en el la-boratorio. La posicion filogenetica de las bacteriasno cultivables se ha empezado a estudiar recien-temente. Ademas, no solo se han detectado bacte-rias no cultivables sino tambien hongos, en particu-lar, los que forman endo-micorrizas asociados a mu-chas plantas [2, 16].

Existen diversas opiniones en torno al problema deno poder cultivar microorganismos de los cuales seha documentado su existencia. Se ha pensado queestos pueden requerir nutrientes particulares quesolo se encuentran en condiciones naturales. Algu-nos nutrientes tal vez sean proporcionados por mi-croorganismos asociados.

En la naturaleza, es comun encontrar comunida-des bacterianas en las que coexisten varias espe-cies y generos de bacterias. En estas comunidadespueden existir dependencias metabolicas complejas.El enfoque de la microbiologa tradicional tiene co-mo primer paso el obtener cultivos puros de bacte-rias (axenicos) y, tal vez, esto ocasiona que solo sedesarrollen parte de los miembros de la comunidad.Otro factor que puede influir, es que los medios tpi-cos de crecimiento son demasiado ricos en nutrien-tes, aun los medios mnimos tienen un exceso de car-bono, de nitrogeno o de fosforo, y podran inhibir

el crecimiento de microorganismos que, en condicio-nes naturales, viven precariamente; a estos micro-organismos se les ha designado como oligotrofos.Los microorganismos con comportamiento opues-to, que pueden vivir en medios ricos, se designancopiotrofos [10].

Entre hongos y bacterias se han identificado oligotro-fos [1, 12, 19]; estos poseen sistemas de transportede nutrientes de alta afinidad que les permiten to-marlos del medio aun en concentraciones muy ba-jas, practicamente sin nutrientes. Estos microorga-nismos pueden crecer sobre vidrio, en agua desti-lada, sobre plasticos, o bien tomando las trazas decompuestos volatiles del ambiente.

Algunas bacterias oligotrofas toman trazas de amo-nio de la atmosfera pero no fijan nitrogeno. Se hacalculado que en los laboratorios y hospitales exis-ten concentraciones de amonio suficientes para man-tener el crecimiento de oligotrofos (debido a agen-tes limpiadores o vapores de orina). Los oligotro-fos deben considerarse como posibles agentes pa-ra la biorremediacion, ya que se ha observado que,una vez que los contaminantes alcanzan concentra-ciones bajas, algunas bacterias no pueden tomar-los ni degradarlos. Los oligotrofos, con alta afinidadpor los contaminantes, tal vez pudieran finalizar lalimpieza [3, 5, 15].

Figura 2. Reactivos para preparar medios de cultivo.

En resumen, existen bacterias y hongos que no sehan logrado cultivar en el laboratorio. Estos microor-ganismos se detectaron amplificando parte de los ge-nes ribosomales que son variables en todos los orga-nismos. Una buena parte de la investigacion en mi-crobiologa se dedica actualmente a encontrar me-

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dios de cultivo adecuados para estos organismos nocultivables para conocer mas acerca de la gran va-riedad de formas de vida que habitan en la Tierra?

Glosario

Biorremediacion. Limpieza de contaminantes me-diante agentes biologicos como bacterias.

Confocal. Sistema de microscopa en donde la fuen-te luminosa es un laser que ilumina la muestra ba-rriendo zonas muy pequenas y que es analizado porcomputadora.

DNA-polimerasa. Enzima que sintetiza DNA apartir de un molde y desoxinucleotidos, requiere uncebador o primer complementario a una parte delmolde.

Epifluorescencia. Sistema de microscopa en don-de se ilumina la muestra con un haz de luz ultravio-leta que pasa por el ocular y se analiza la fluorescen-cia que produce la muestra.

Filogenetica. Es la disciplina encargada de la re-construccion de la historia evolutiva de los taxo-nes es decir, los grupos de la clasificacion de losseres vivos, que se representa en forma de arbolfilogenetico.

Genes ribosomales. informacion genetica codifi-cada en el DNA que dirige la sntesis del RNAribosomal.

PCR. reaccion en cadena de la polimerasa, sntesisdel mismo fragmento de DNA varias veces ( 30), ti-po produccion en cadena. Para esto se requiere unaenzima polimerasa de DNA que sea resistente a tem-peraturas elevadas (95C) para que pueda desnatu-ralizarse el DNA antes de cada sntesis.

Primers. cadenas cortas de residuos de nucleotidos(normalmente 20 para PCR) que presentan un ex-tremo 3 OH en donde la DNA polimerasa puede em-pezar la sntesis de DNA.

Vectores. vehculos geneticos en donde puede clo-narse un fragmento de DNA y amplificarse o expre-sar la protena que tiene codificada.

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Figura 3. La familia de lo vivo se ha agrupado en tres dominios (grupos muy grandes). Las ramas que estan alejadasno son muy similares, las que estan mas cercanas son grupos relacionados. Se han descrito aproximadamente 1.75millones de especies en la tierra. Todava se describen nuevas especies, entre ellas muchas de los microorganismosno cultivables. Los grupos son: Archaea: microorganismos procariontes muy primitivos; Bacteria: Procariontes que sesepararon de los primeros muy temprano en la evolucion; Eukarya: Todas las formas de eucariontes incluyendo plantasy animales.

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