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ASIGNATURA:

TÉCNICAS AVANZADAS EN MICROBIOLOGÍA

Comparación de secuencias, Identificación y Tipificación

Curso 2009-10 NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________

Profesores: Dra. María Jesús García García (mariaj.garcia@uam.es) Dra. Mª del Carmen Menéndez Gómez (carmen.menendez@uam.es) Dpt. Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología Facultad de Medicina. UAM. Ext.: 2753 / 5491

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Índice

Página

1. Introducción 3

2. Cronograma 4

3. Material 5

3.1 Reactivos utilizados 5

3.2 Direcciones de Internet 5

4 Identificación de especies bacterianas 6

4.1 Preparación de las muestras 6

4.2 Preparación de la mezcla de reacción 7

4.3 Reacción de amplificación 7

4.4 Visualización del resultado de PCR 8

4.5 Digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción 8

4.6 Visualización y análisis de los patrones de RFLP 10

5 Tipificación de cepas bacterianas 11

5.1 Preparación de las muestras 11

5.2 Preparación de la mezcla de la reacción 11

5.3 Reacción de amplificación 13

5.4 Visualización y análisis de resultados 13

6 Comparación de secuencias 14

6.1 Búsqueda de secuencias en Bases de Datos 14

6.2 Alineamiento de secuencias: por pares y múltiple 15

6.3 Construcción de árboles filogenéticos 18

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1. Introducción La identificación de las bacterias presentes en una muestra se ha favorecido del desarrollo de métodos de biología molecular, permitiendo la detección e identificación de bacterias de forma más sensible, rápida y específica. Los componentes de una muestra dada, pueden identificarse a distintos niveles taxonómicos. En la mayoría de los casos, se considera que la identificación a nivel de especie informa sobre la variedad de taxones existentes; siendo este nivel el que permite dar un diagnóstico de certeza cuando se trata de muestras de origen clínico. En ciertas circunstancias, es necesario determinar niveles inferiores, e identificar si los aislados corresponden a la misma o a diferentes cepas; esta identificación es la que se requiere en el caso de sospechar la presencia de un brote epidémico, o para determinar una contaminación alimentaria. Existe una amplia variedad de métodos que se utilizan con el propósito de identificar los componentes bacterianos de una muestra. Las metodologías a utilizar en cada caso pueden ser de aplicación general o bien se han desarrollado para resolver la detección de ciertos grupos bacterianos o de ciertas características del grupo en particular. En estas prácticas vamos a aplicar métodos moleculares bien caracterizados en la identificación de bacterias del género Mycobacterium. Este género comprende bacterias del grupo de los Actinomycetales ampliamente distribuido en la naturaleza, pero que también incluye especies patógenas importantes del hombre y los animales; como por ejemplo M. tuberculosis y M. leprae, agentes causales en el hombre la Tuberculosis y la Lepra respectivamente; o M. marinum y M. avium subsp. paratuberculosis, que causan infecciones importantes en animales. Sin duda el mayor avance en Bioinformática ha sido la automatización de la secuenciación de genomas microbianos completos y el desarrollo de Bases de Datos y su accesibilidad a través de Internet. La disponibilidad de cientos de secuencias de genomas de microorganismos, representando no solo a distintas especies, sino también a múltiples cepas de la misma especie en Bases de datos públicas, y la posibilidad de su análisis ha facilitado el conocimiento del gen y de la función genómica. Muchos genes hipotéticos son ahora conocidos por existir ortólogos (genes que comparten el último ancestro común y cuya divergencia se debe a la especiación y que muestran la mayor identidad posible en otros genomas microbianos) que también han sido secuenciados. La evolución es el resultado de mutaciones puntuales, duplicaciones, inserciones y delecciones génicas, transferencia horizontal génica, reordenamientos cromosómicos, etc… Adicionalmente la interacción con el medio ambiente establece cual de todos estos cambios son aceptables y viables, seleccionado cada uno de ellos, estableciéndose finalmente la relación entre las distintas cepas o especies. El avance de las herramientas bioinformáticas ha posibilitado la investigación en diversos campos, utilizándose en Medicina forense, Epidemiología, Biología molecular o en Evolución y filogenia.

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Global phylogeny of fully sequenced organisms. Ciccarelli et al, Science 311: 1283 (2006). 2. Cronograma Este grupo de prácticas se estructura en tres partes. Las dos primeras partes se componen de una sesión inicial de introducción teórica seguida de sesiones prácticas de laboratorio, terminando con una sesión de análisis y discusión de resultados. La tercera parte trata del uso de bases de datos y programas informáticos básicos aplicables en análisis evolutivos o de comparación de microorganismos. Primera parte: Identificación de especies bacterianas (PCR-RFLP del gen hsp65) Preparación de las muestras de DNA Preparación de las reacciones de PCR Realización de la amplificación Digestión de los amplicones con Enzimas de Restricción Análisis de los patrones Segunda parte: Tipificación de bacterias (Amplificación al azar [RAPD]) Preparación de las muestras de DNA Preparación de las reacciones de PCR Realización de la amplificación Visualización y análisis de los resultados

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Tercera parte: Comparación de secuencias (BLAST, Clustal X y Mega 4) Búsqueda de secuencias en bases de datos. Alineamiento de secuencias por pares: BLAST Alineamiento múltiple de secuencias: Clustal X v 2.0.5 Construcción de árboles filogenéticos: Mega v.4 3. Material 3.1 Reactivos necesarios

Agarosa SEAKEM Agarosa bajo punto de fusión SeaPLAQUE NuSieve 1Kb plus DNA ladder Gibco BRL 100bp DNA Ladder Gibco BRL Bromuro de etidio SIGMA Azul de Bromofenol Bio-Rad dNTPs APPLIED BIOSYSTEM BSA PROMEGA BstEII PROMEGA HaeIII PROMEGA Taq-polimerasa ROCHE Cloruro de Magnesio APPLIED BIOSYSTEM Glicerol MERCK Tritiplex III (EDTA) MERCK Tris-Trizma Base SIGMA Dodecilsulfato sódico (SDS) MERCK Oligonucleótidos ROCHE

3.2 Direcciones de Internet Bancos de datos (secuencias, genomas, bibliografía, etc…) NCBI (National Center for Biotechnology Information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute) http://www.ebi.ac.uk DDBJ (DNA Data Bank of Japan) http://www.ddbj.nig.ac.jp Sanger Institute: http://www.sanger.ac.uk TIGR (The Institute for Genomic Research) http://www.tigr.org GOLD (Genomes OnLine Database) http://www.genomesonline.org Comparación de secuencias: Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ClustalX, Multiple Sequence Alignment Programs: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/clustalw2/ Mega4, Molecular Evolutionay Genetics Análisis: http://www.megasoftware.net/mega.html Comparación de genomas: Mauve Genome Alignment: http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve/ Comparison prokaryotes genomes: http://www.microbesonline.org/ Otros Identificación de micobacterias (Patrones de PRA): http://app.chuv.ch/prasite/index.html

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REALIZA LAS ACTIVIDADES QUE HAY A LO LARGO DEL GUIÓN

EN EL ANEXO, EN LOS SITIOS ESTABLECIDOS PARA ELLO. 4. Primera parte. Identificación de especies bacterianas Objetivo: Aplicar el análisis de genes conservados en la diferenciación de especies bacterianas.

PCR-RFLP del gen hsp65 Procedimiento descrito por Telenti et al (1993). Es un método sencillo y rápido que permite diferenciar especies del género Mycobacterium. Desde su descripción se utiliza con frecuencia en el diagnóstico de aislados clínicos, y es un procedimiento empleado para la descripción de especies nuevas. Más recientemente se ha descrito que la secuencia completa del gen podría tener interés en ciertos grupos (Turenne et al. 2006). El gen hsp65 codifica para una proteína de choque término de secuencia conservada. Generalmente existe una única copia del gen por genoma bacteriano. En el proceso se amplifica un fragmento interno del gen, con oligonucleótidos de zonas conservadas (PCR) realizando después digestión del producto amplificado con enzimas de restricción y separación de los fragmentos resultantes en geles de agarosa (RFLP). Se amplifica un fragmento de 441 pb, que se digiere con los enzimas: BstEII (G GTNACC) y HaeIII (GG CC). Se utilizan los oligos Tb11 y Tb12: Oligo Tb11: 5’ ACCAACGATGGTGTGTCCAT 3’ Oligo Tb12: 5’ CTTGTGGAACCGCATACCCT 3’ Estos oligonucleótidos, amplifican un fragmento interno de la ORF entre los nucleótidos 398-836 (441 pb) IMPORTANTE Realizar precauciones usuales en el procedimiento de PCR (usar guantes, trabajar en cabina pre-tratada con luz ultravioleta) en particular NUNCA manipular los DNAs y los reactivos de PCR EN LA MISMA HABITACION ni con los mismos guantes. Cuando el procedimiento se utilice en diagnóstico, estas medidas son OBLIGATORIAS, incluyendo el cambio de bata para cada fase del proceso. 4.1. Preparación de las muestras Descongelar en hielo agua ultrapura (milliq) y los DNAs de las cepas a analizar y de las cepas de referencia. Se utilizan como cepas de referencia las cepas-tipo de las especies: M. tuberculosis, M. avium y M. chelonae. Se han seleccionado estas cepas por los tamaños que rinden tras la digestión con los enzimas, sirviendo de control (Leao et al, 2005). Los DNAs descongelados deben mezclarse bien con micropipeta y centrifugarse después unos segundos. Para la amplificación se usan 100ng (aproximadamente) de DNA-template, que se ajusta a un volumen de 10μl con agua, incluyéndose un tubo sin DNA como control negativo.

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VIAL MUESTRA (ng/μl) DNA (μl) H2O (μl)

1 M. chelonaeT 2 M. aviumT 3 M. tuberculosisT 4 Aislado 1 5 Aislado 2 6 Aislado 3 7 Control negativo ---- 10 μl

4.2 Preparación de la mezcla de reacción Con guantes limpios colocar a descongelar los reactivos de la mezcla de reacción: buffer; Cl2Mg; dNTPs; glicerol; oligos. Cada uno de los reactivos debe usarse a una concentración determinada:

CONCENTRACIÓN REACTIVO Solución stock Solución trabajo

Buffer 10 X 1 X Cl2Mg 25mM 1.5mM dNTPs (mezcla de los 4) 100mM 0.8mM (0.2mM c/u) Glicerol 100% 10 % Primers (Tb11+Tb12) 20μM 0.4 μM (0,2μM c/u) Taq Polimerasa gold 5 U/μl 1,5 U

Para preparar la mezcla de reacción (mx), el cálculo se hace multiplicando la cantidad de cada reactivo requerido por prueba (a la concentración indicada en la “solución de trabajo”), por el número total de pruebas que se van a correr, incluyendo una más para compensar errores de pipeteo. El volumen final a añadir a cada tubo conteniendo DNA-template es de 40 μl por reacción, lo que da un volumen final en cada reacción de 50 μl:

REACTIVO Cantidad por muestra Cantidad total Buffer 10X 5 μl Cl2Mg 3 μl dNTPs (mezcla de los 4) 0.4 μl Glicerol 5 μl Primers (Tb11+Tb12) 1 μl Taq Polimerasa gold 0.3 μl H2O 25.3 μl

VOLUMEN FINAL 40 μl El agua es SIEMPRE lo primero que se añade. El enzima es SIEMPRE lo último que se añade. Una vez preparada la mezcla, se guardan todos los reactivos antes de manipular de nuevo los tubos con el DNA-template preparado. 4.3 Reacción de amplificación Mezclar bien el volumen total de mx preparada, y centrifugar unos segundos para bajar todo el contenido del tubo. A cada tubo con DNA se le añaden 40 μl de la mx preparada. Mezclar cada tubo y llevar al termociclador. Se utilizan las siguientes condiciones de reacción:

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Fase inicial Fase de amplificación Fase final

Temperatura 95ºC 95ºC 60ºC 72ºC 72ºC

Duración 5 min 1min 10 min

Número de ciclos

1 45 1

Las muestras se mantienen en un ciclo final a 4ºC hasta su procesamiento. 4.4 Visualización del resultado de PCR Se prepara un gel de agarosa al 1% en Buffer de electroforesis standard y Bromuro de Ethidio (0,1 μl/ml). Se toman 5 μl del producto amplificado a los que se añaden 2 μl de mezcla de carga (Glicerol 50%, EDTA 125mM y Azul de Bromofenol 0.05%). Se colocan las muestras en los pocillos, incluyendo 2 μl de un marcador de tamaños (1 Kb plus DNA Ladder) en el primer pocillo. Un ejemplo del resultado esperable se muestra en la siguiente figura:

441 pb

L- Ladder 1- control positivo (M. avium) 2-22- muestras problema 23- control negativo

Debe amplificarse un fragmento algo mayor de 400 pb tanto en las muestras como en los controles de referencia, no debiéndose ver ninguna banda en el control negativo. 4.5 Digestión de los productos de PCR con enzimas de restricción. Se marcan dos series de tubos limpios, una por cada ER a utilizar (BstEII y HaeIII) incluyendo un tubo con una mezcla proporcional de las tres cepas de referencia. En cada tubo habrá un volumen final de 15 μl de producto amplificado para digerir con enzimas.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

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BstEII HaeIII Tubo Control B Tubo Control H

Aislado 1 Tubo 1B 15 μl Tubo 1H 15 μl Aislado 2 Tubo 2B 15 μl Tubo 2H 15 μl Aislado 3 Tubo 3B 15 μl Tubo 3H 15 μl

Se preparan dos mezclas de reacción, una por cada ER, con una concentración de reactivos como se indica en la Tabla:

CONCENTRACIÓN REACTIVO Solución stock Solución trabajo

Buffer C 10 X 1 X HaeIII 10 U/μl 5 U Buffer D 10 X 1 X BstEII 10 U/μl 5 U BSA 10 mg/ml 1 mg/ml

El volumen final de cada mezcla va a depender del número de muestras a analizar. De nuevo se considera una muestra más para compensar los errores de pipeteo. El cálculo está representado en la siguiente Tabla:

BstEII HaeIII REACTIVOS

1 reacción X reacciones 1 reacción X reacciones

H2O destilada 8 8

Buffer C ---------- ----------- 3

Buffer D 3 ----------- -----------

BSA 3 3

HaeIII 0.5 0.5

BstEII 0.5 0.5

VOLUMEN FINAL 15 μl 15 μl En cada tubo con 15 μl de producto de PCR se añaden 15 μl de la correspondiente mezcla de reacción (mezcla BstEII en la serie B; mezcla HaeIII en la serie H) mezclando adecuadamente el contenido (Volumen final 30 ul). La digestión se realiza durante 2 horas. Los tubos de la serie “B” se incuban a 60ºC; y los tubos de la serie “H” se incuban a 37ºC. Se agrega a cada tubo una gota de aceite mineral para evitar evaporaciones en los tubos de la serie “B”.

5 μl M. chelonae 5 μl M. avium 5 μl M.tuberculosis

5 μl M. chelonae 5 μl M. avium 5 μl M.tuberculosis

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4.6 Visualización y análisis de los patrones de RFLP. Preparar un gel con agarosa de bajo punto de fusión al 3% y Bromuro de Ethidio (0,1 μl/ml de gel). Recoger los 30 μl de la digestión en tubos limpios (con cuidado no llevarse el aceite) y añadir 3 μl de buffer de carga en cada muestra (ver 4.4). Aplicar en el gel, en el pocillo precedente a cada serie de digestiones, 7 μl del marcador de tamaños (100bp DNA Ladder) y el resto de las muestras en los pocillos siguientes, comenzando con el tubo de los DNAs controles de cada enzima. Correr el gel a 50V durante 3-4 horas. Fotografiar y calcular el tamaño de las bandas resultantes de las digestiones. El primer tubo (tubo CONTROL) debe dar los siguientes fragmentos (tamaños en pares de bases): Digestión con HaeIII: 200/150/130/105/70/60/55 Digestión con BstEII: 320/235/210/130/120/85 Calcular el tamaño de las bandas de las muestras problema, tomando como referencia el marcador de tamaños (ladder) y el control (mezcla de DNAs de patrones conocidos). Determinar la especie de cada muestra comparando los patrones obtenidos con los patrones que aparecen en la base de datos (http://app.chuv.ch/prasite/index.html). Un ejemplo se muestra en la siguiente figura: Indica y comenta tus resultados en el Apartado 4 del documento Anexo.

Bst EII Hae IIIL M Av In 1 2 3 4 5 6 L M Av In 1 2 3 4 5 6

L – marcador de tamaños M – mezcla cepas de referencia Av: M. avium In: M. intracellulare 1-6: Aislados clínicos

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5. Segunda parte. Tipificación de bacterias Objetivo: Determinar si varios aislados de una misma especie pertenecen o no a una misma cepa (uso de marcadores moleculares en epidemiología) En bacterias en las cuales se desconoce gran parte de su secuencia genética, puede emplearse el método RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) para la diferenciación de cepas (Persing DH et al (Eds.) Molecular Microbiology. Diagnostic principles and practice. ASM Press. 2004). Se trata de un método sencillo, basado en la amplificación del genoma completo con iniciadores inespecíficos, permitiendo que la unión en las dianas del genoma sea al azar al utilizar condiciones poco restrictivas en el anillamiento durante la reacción de PCR. El producto de dicha amplificación es un patrón de bandas diferente de acuerdo con el contenido genético de la cepa, siendo en general idéntico para aislados de la misma cepa. El método se ha utilizado en una amplia gama de géneros y especies bacterianos. Las condiciones de la amplificación deben ajustarse para las bacterias que se vayan a estudiar. En esta práctica se va a utilizar en la tipificación de aislados de bacterias del género Mycobacterium. En este género los oligonucleótidos que se han utilizado más frecuentemente, y van a emplearse son:

5.1 Preparación de las muestras Descongelar en hielo agua ultrapura (milliQ) y los DNAs de las cepas a analizar. Los DNAs descongelados deben mezclarse bien con micropipeta y centrifugarse después unos segundos. Para la amplificación se usan 100ng (aproximadamente) de DNA-template, que se ajusta a un volumen de 10μl con agua, incluyéndose un tubo sin DNA como control negativo.

VIAL MUESTRA (100 ng/μl) DNA H2O 1 Aislado 1 2 Aislado 2 3 Aislado 3 4 Aislado 4 5 Control negativo ---- 10 μl

5.2 Preparación de la mezcla de reacción Con guantes limpios colocar a descongelar los reactivos de la mezcla de reacción: buffer; Cl2Mg; dNTPs; glicerol; oligos.

OPA2 5' TGCCGAGCTG 3' (Kauppinen J, 1994)

OPA18 5' AGGTGACCGT 3' (Kauppinen J, 1994)

INS2 5' GCGTAGGCGTCGGTGA 3' (Linton CJ, 1994)

M13 5' TTATGTAAAACGACGGCCAGT 3' (Welsh J, 1990)

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Se utiliza un único iniciador por reacción, que ocurrirá únicamente cuando el anillamiento de una pareja esté en la orientación adecuada. Cada uno de los reactivos debe usarse a una concentración determinada:

CONCENTRACIÓN REACTIVO Solución stock Solución trabajo

Buffer 10 X 1 X Cl2Mg 25mM 1.5mM dNTPs (mezcla de los 4) 100mM 0.2mM (cada uno) Glicerol 100% 10 % Primer 25p moles/ μl 100 pmoles Taq Polimerasa gold 5 U/μl 2 U

Para preparar la mezcla de reacción, el cálculo se hace multiplicando la cantidad de cada reactivo requerido por prueba, por el número total de pruebas que se van a correr, incluyendo una más para compensar errores de pipeteo. El volumen final a añadir a cada tubo conteniendo DNA-template es de 40 μl por reacción, lo que da un volumen final en cada reacción de 50 μl. Cada grupo de aislados de una misma especie debe analizarse al menos con dos oligonucleótidos diferentes.

REACTIVO oligo 1 Cantidad por muestra Cantidad total Buffer 10X 5 μl Cl2Mg 3 μl dNTPs (mezcla de los 4) 0.5 μl Glicerol 5 μl Oligo 1 4 μl Taq Polimerasa gold 0.5 μl H2O 22 μl

VOLUMEN FINAL 40 μl

REACTIVO oligo 2 Cantidad por muestra Cantidad total Buffer 10X 5 μl Cl2Mg 3 μl dNTPs (mezcla de los 4) 0.5 μl Glicerol 5 μl Oligo 2 4 μl Taq Polimerasa gold 0.5 μl H2O 22 μl

VOLUMEN FINAL 40 μl El agua es SIEMPRE lo primero que se añade. El enzima es SIEMPRE lo último que se añade. Una vez preparada la mezcla, se guardan todos los reactivos antes de manipular de nuevo los tubos con el DNA-template preparado. 5.3 Reacción de amplificación

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Mezclar bien el volumen total de mezcla preparada, y centrifugar unos segundos para bajar todo el contenido del tubo. A cada tubo con DNA se añaden 40 μl de la mezcla preparada. Mezclar cada tubo y llevar al termociclador. Se utilizan las siguientes condiciones de reacción:

Fase inicial Fase de amplificación Fase final

Temperatura 95ºC 95ºC 40ºC 72ºC 72ºC

Duración 5 min 1min 10 min

Número de ciclos

1 40 1

Las muestras se mantienen en un ciclo final a 4ºC hasta su procesamiento. 5.4 Visualización y análisis de resultados Se prepara un gel de agarosa al 2% en Buffer de electroforesis standard y Bromuro de Ethidio (0,1 μl/ml de gel). Se toman 25 μl del producto amplificado a los que se añaden 3 μl de mezcla de carga (Glicerol 50%, EDTA 125mM y Azul de Bromofenol 0.05%). Se colocan las muestras en los pocillos, incluyendo 2 μl de un marcador de tamaños (1 Kb plus DNA Ladder) en el primer pocillo.

El resultado se compara visualmente. Indica y comenta tus resultados en el Apartado 5 del documento Anexo.

Resultado de RAPD- PCR utilizando el oligonucleótido INS2 . L, ladder; 1-24 aislados clínicos.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 L

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6. Tercera parte. Métodos básicos de comparación de secuencias Objetivo: Nociones en la búsqueda de secuencias a partir de bases de datos, alineamiento de las mismas y construcción de árboles filogenéticos. URLs útiles: Comparación de secuencias: Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Multiple Sequence Alignment Programs: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/clustalw2/ Molecular Evolutionay Genetics Análisis Software: http://www.megasoftware.net/mega.html Comparación de genomas: Mauve Genome Alignment Software: http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve/ Comparison prokaryotes genomes: http://www.microbesonline.org/ 6.1 Búsqueda de secuencias en Bases de Datos (NCBI) El desarrollo de las Bases de Datos ha facilitado el avance en los estudios filogenéticos. Hoy en día las secuencias son enviadas a diferentes bases de datos: EMBL, GeneBank (NCBI), o DDBJ, donde quedan registradas con un Nº de accesión no solo las secuencias sino también todas y cada una de las características de dicha secuencia (marcos de lectura abierta, producto, sitios de inicio de la transcripción, región Shine-Dalgarno,…). A partir de aquí podemos: (i) acceder a todos los datos registrados de dicho gen o proteína, (ii) enviar una secuencia propia a comparar con toda las secuencias en la Base de Datos o (iii) recopilar secuencias para realizar posteriores alineamientos y estudios filogenéticos. Utilizaremos para la práctica el GenBank (Base de Datos del NCBI). Práctica: Búsqueda de secuencias (nucleótidos y proteínas) por distintos criterios de búsqueda y observar cuales son los datos de interés que nos proporcionan respecto a una secuencia de proteínas y respecto a una secuencia de nucleótidos:

• Nombre del producto (por ejemplo “catalase”). Los nombres siempre han de escribirse en inglés.

• Género bacteriano (por ejemplo “Mycobacterium”)

• Nombre del gen (por ejemplo sodA) y

• Nº de accesión.

Para realizar esta parte de la práctica, abre, por favor, la página del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ en el navegador. Completa la tabla correspondiente del Anexo con los datos buscados en la base de datos.

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6.2 Alineamiento de secuencias: por pares (BLAST) y múltiple (ClustalX) Existen diversas razones para comparar secuencias. En el caso de que dichas secuencias sean proteínas la comparación nos permite conocer la función de las mismas, sus dominios o centros activos, predecir la estructura 3D,…En el caso de que las secuencias sean de ADN, la comparación de secuencias nos permite la búsqueda de genes, estudios poblacionales, etc… En bacterias, las secuencias correspondientes al 16S ARNr son las más utilizadas para la distinción de especies, además de otros genes denominados “house keeping”, genes esenciales. La comparación de secuencias puede realizarse por pares (alineamiento de dos secuencias, búsqueda de secuencias homólogas) como resultado de la búsqueda en Bases de Datos como BLAST o mediante alineamiento múltiple (alineación de muchos homólogos al mismo tiempo) utilizando programas como por ejemplo Clustal-W, Mega4… en cuyo caso nos indica también que posiciones pueden ser importantes, dominios proteicos, etc... El objetivo final de la comparación es localizar el alineamiento que con mayor probabilidad muestre qué cambios se han producido evolutivamente. Alineamiento por pares: Enviaremos secuencias resultantes de la búsqueda anterior al banco de datos para su comparación mediante el programa BLAST (NCBI) utilizando diversos criterios de comparación:

• blastn (compara secuencias de nucleótidos), • blastp (compara secuencias de proteínas), • y diferentes combinaciones de comparaciones como: blastx, tblastn, tblastx.

Basic BLAST

Choose a BLAST program to run.

nucleotide blast

Search a nucleotide database using a nucleotide query Algorithms: blastn, megablast, discontiguous megablast

protein blast Search protein database using a protein query Algorithms: blastp, psi-blast, phi-blast

blastx Search protein database using a translated nucleotide query tblastn Search translated nucleotide database using a protein query

tblastx Search translated nucleotide database using a translated nucleotide query

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ATENCIÓN: el formato FASTA, es el tipo de formato que más se utiliza y el más solicitado por programas de alineamiento. Consiste en: >Nombre SECUENCIA Práctica: Para realizar esta parte de la práctica, abre por favor, la página del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ en el navegador. El procedimiento que vamos a utilizar para comparar secuencias en esta práctica es el siguiente:

1. Escoge 2-3 nº de accesión pertenecientes a las secuencias de la práctica anterior para realizar tu comparación por BLAST. Escoge al menos una secuencia de aminoácidos y otra de núcleotidos.

2. Seleccionar BLAST en el menú principal del NCBI en la parte superior y elige “Nucleotide” (blastn), “Protein” (blastp), u otros programas de elección (blastx, tblastn, tblastx) según el tipo de búsqueda a realizar.

3. Compara genes/proteínas en cada apartado.

Te sugiero comiences las comparaciones con blastn/blastp y continúes tu aprendizaje con blastx, tblastn,…para que te vayas familiarizando (ver la tabla que muestra la página Web del NCBI-BLAST). Haz un BLAST con alguna de las secuencias de nt y aminoácidos. Indica en la tabla correspondiente del anexo los Nº de accesión escogidos. Describe en el apartado correspondiente del Anexo los datos e información que obtienes de las búsquedas anteriores así como de las opciones que el Banco de datos te proporciona. Elimina y/o Duplica alguna zona interna de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos y vuelve a compararla en el BLAST. Observa los nuevos alineamientos con la nueva inserción y/o delección. Describe los datos e información que obtienes en el apartado correspondiente del Anexo.

Comparación de dos secuencias por identidades

Idénticas Divergencia

Delección Insercción

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Explora diferentes bases de datos Existen otras bases de datos que os pueden interesar, donde existe información sobre genomas completamente secuenciados o en fase de secuenciación, y donde también puedes realizar búsquedas y comparaciones. Explóralas: GOLD: http://www.genomesonline.org/ TIGR: http://www.tigr.org/ SANGER Institute: http://www.sanger.ac.uk/ EMBL-EBI: http://www.ebi.ac.uk DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp Alineamiento múltiple: Para el alineamiento múltiple utilizaremos el programa ClustalX el cual es de libre acceso. Construye una matriz de distancias y posibilidad de utilizar el algoritmo de Neirborn Joining. El programa requiere que:

• Todas las secuencias que se vayan a comparar han de tener caracteres iguales y han de ser de la misma longitud.

• Las secuencias han de tener suficiente longitud, diferencias y similitudes Se utilizarán listados de secuencias previamente determinadas que cumplan los requisitos. Práctica: Selecciona un bloque de 30-40 o más secuencias de tu interés utilizando los Nº de accesión tomados de la lista asignada. Escoge 15-20 secuencias pertenecientes al grupo de Micobacterias de crecimiento rápido y 15-20 de crecimiento lento dentro del mismo gen. Anota en la parte correspondiente del Anexo el/los gen-es de tu búsqueda y a que especie pertenecen. El procedimiento a seguir será el siguiente:

1. Seleccionar las secuencias de nucleótidos (de la misma zona del gen). Los secuencias de la LISTA 1 ya presentan esta característica.

2. Hay que comprobar que las secuencias son del mismo tamaño y tienen la suficiente homología y divergencia como para que el alineamiento sea posible.

3. Salvar las secuencias en “texto sin formato” y en formato FASTA una a continuación de la otra en el mismo fichero.

NOTA: Cuando se ha de poner en formato FASTA la forma es la siguiente:

>Especie bacteriana SECUENCIA/secuencia

Todas las secuencias a alinear han de estar seguidas una detrás de la otra, como sigue:

>secuencia1 accccggtaaagggacaccacca >secuencia2 tacccccggtaaagggacagtcca …

4. Proceder al alineamiento siguiendo el esquema del programa indicado en el

recuadro. 5. Se guardan los ficheros correspondientes al ---.dnd (dendograma) y al ---.aln

(alineamiento)

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6. Puedes guardar el alineamiento como “postscript” (.ps) en la opción “File” del Menu y posteriormente pasarlo a .pdf.

Para la actividad guarda los archivos: “.aln” y si es possible el postscript (“.ps”) para cumplimentar el anexo a este manual. Rellena las tablas con los datos e incorpora los alineamientos múltiples seleccionados en la parte correspondiente del documento Anexo. Comenta también que conclusiones sacas a la vista de los resultados obtenidos: 6.3 Construcción de árboles filogenéticos (MEGA v.4)

La relación evolutiva se muestra a menudo en forma de un árbol filogenético, el cual podríamos definir como un diagrama que nos indica las relaciones entre las diversas especies o genes presentes así como la distancia evolutiva que existe entre ellas. De este modo, se denominan nodos externos a las distintas entidades en estudio y de nodos internos a los ancestros de las anteriores. También podemos hablar de ramas internas o externas del árbol. Un árbol filogenético puede o no presentar raiz. El árbol filogenético puede hacerse a partir de diferentes datos como por ejemplo secuencias, sitios de restricción, etc… Existen dos tipos de reconstrucción filogenético dependiendo de si están basados en distancias o en caracteres.

Árbol enraizado

Árbol no enraizado

Multiple alignment Mode

File

Load sequence file (worpad, formato fasta)

Alignment

Alignment parameters

Multiple alignment parameters:gap opening = 100gap extension =0.5delay divergent sequence = 90%OK

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Do complete alignment:---.dnd (árbol visible con el Programa Treeview)---.aln (alineamiento)

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Los árboles filogenéticos basados en distancias se asientan en un alineamiento múltiple, utilizando dicho alineamiento para calcular la distancia entre secuencias mediante una matriz de distancias y construyendo el árbol a partir de dichas distancias. Entre estos métodos nos encontramos con: • UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means) (Agrupamiento pareado no ponderado utilizando media aritmética): Es un método sencillo que asume la existencia de un reloj evolutivo. Consiste en un algoritmo de agrupamiento o “clustering” a partir del cual se genera una matriz de distancias construyendo un árbol filogenético. Produce árboles enraizados y todas las ramas terminan a la misma altura. • Neighbor Joining: Es también un algoritmo de agrupamiento pero no asume la existencia de un reloj molecular. Una vez que la matriz de distancias entre las secuencias ha sido definida, genera un árbol que minimiza su longitud. Genera árboles sin raiz, por lo que generalmente se incluye un grupo externo o “out group”, definido como un punto de referencia externo que nos permite conocer en que parte del árbol se sitúa el ancestro común. Es un método rápido que suele dar buenos resultados.

Métodos de reconstrucción filogenética

Basados en distanciasMétodos muy rápidos

UPGMA: Reloj molecular (cambio es constante

y proporcional al tiempo). Árbol con raiz

Neighbor-joining: No asume reloj evolutivo.

Mínima evolución. Árbol sin raiz

Basados en caracteresMáxima parsimonia (Sitios informativos)

Máxima verosimilitud

Métodos bayesianos

A - ACTTGACCCTTACGAT…B - AGCTGGCCCTGATTAC…C - AGTTGACCATTACGAT…D - AGCTGGTCCTGATGAC…

-727D

7-72C

27-7B

727-A

DCBA

-727D

7-72C

27-7B

727-A

DCBA

Árbol?

“Out-group”: secuencia

perteneciente a un grupo

taxonómico distinto o a una familia

de proteínas diferente, para

averiguar el lugar de

enraizamiento apropiado.

Neighbor-joining:

Raíz

Outgroup

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Los árboles filogenéticos basados en caracteres utilizan cada posición del alineamiento múltiple como pista para buscar la mejor opción de árbol que encaje todos los datos. Entre estos métodos nos encontramos con: • Máxima parsimonia: Mantiene que la hipótesis más sencilla es la más probable. • Máxima verosimilitud • Métodos bayesianos Práctica: Utilizaremos los alineamientos realizados con el programa ClustalX (fichero NOMBRE.aln), que deberán ser convertidos al formato MEGA. La elaboración de los árboles filogenéticos se realizará con el programa Mega v. 4. El programa Mega v.4 es de acceso libre en Internet. Observa los distintos tipos de árbol y las diferentes formas de comparar las secuencias. El procedimiento a seguir será el siguiente:

1. Hay que convertir el fichero ---.aln del formato Clustal al formato Mega como indica el recuadro.

2. Se han de corregir los errores: hay ocasiones que el programa duplica las secuencias o coloca al final del fichero ---.meg signos que después no reconoce. Todos estos errores hay que eliminarlos.

3. Tras seleccionar de nuevo el fichero el formato ---.meg para analizar procedemos a calcular la matriz de distancias como indica el diagrama.

4. Realizaremos el árbol filogenético.

Incluye los árboles obtenidos en los apartados correspondientes del Anexo y comenta que conclusiones sacas a la vista de los dichos resultados, compara la información de ambos árboles.

MEGA 3File

Convert to Mega format

Select file and format:---.aln (fichero del ClustalX)OK

Corregir errores

Save as: ---.meg

Click me to activate a data file

Choose a data file to analyse (---.meg)

Input data nucleotide sequences OK

Distances

Compute pairwise

Analysis preferences compute distances only compute

Phylogeny

Neighbourn Joining Test philogeny bootstrap =1000OK

Matriz de distancias

Árbol filogenético