Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 1 (2002): 1-10

INTRODUCCIN

El anlisis de la regulacin de los genes en clulasde animales es una de los temas centrales de la Biolo-ga Molecular actual. Por esta y otras razones, los pro-cedimientos para introducir genes manipulados en di-chas clulas, donde la regulacin pueda ser ensaya-da, han sido objeto de intensa investigacin. Ha habi-do una gran diversidad de enfoques de las mismascomo son: la microinyeccin directa de ADN en el n-cleo de los oocitos de anfibios, en huevos fertilizados

Artculo reseaEXPRESIN DE GENES RECOMBINANTES EN CLULAS DE

MAMFEROS

Marln Gonzlez y Laura Coroas

Grupo Biologa Molecular. Direccin Microbiologa. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA),Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba

RESUMEN: Las mayores contribuciones de la investigacin del ADN recombinante han estadoindudablemente dentro de la propia biologa molecular, y en combinacin con otras tcnicas, ha hechoposible potencialmente el anlisis estructural detallado de cualquier gen, tanto de organismos eucariotascomo procariotas. La relacin de la estructura de los genes con la regulacin de la expresin y la funcinde las protenas que codifican, puede ser analizada reintroduciendo las secuencias manipuladas en clulasvivas. Con la utilizacin de esta estrategia bsica, el progreso en muchos campos de la biologa moleculares muy rpido y continuar siendo una aplicacin mayoritaria de la tecnologa del ADN recombinantedurante muchos aos futuros.(Palabras clave: ADN recombinante; expresin)

EXPRESSION OF RECOMBINANT GENES IN MAMMALIAN CELLS

ABSTRACT: The greatest contributions of recombinant DNA research has been in molecular biology itself,and in combination with other techniques, it has made potentially possible the structural analysis in detailsof any gene including eukaryote and prokaryote organisms. The relationship between gene structure withthe regulation of the expression and encoded protein functions could be analyzed inserting again themanipulated sequences in living cells. Using this strategy, the progress in several fields of molecularbiology is very fast and it will be the majority application of the recombinant DNA technology for a longtime in the future.(Key words: recombinant DNA; expression)

de Xenopus, en ratn o en embriones jvenes deDrosophila, as como mtodos para introducir ADNexgeno en cultivos celulares de mamferos (34).

La expresin de genes heterlogos o recombinantesen clulas de mamferos ha surgido como una herra-mienta esencial para el estudio de mltiples aspectos delas clulas eucariotas. El desarrollo de mtodos detransfeccin de genes, basados en vectores altamenteeficientes, ha facilitado el desarrollo de investigacionescon posibilidades ilimitadas en el uso de productosproteicos derivados de cultivos celulares de mamferos.

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Se han desarrollado un gran nmero de vectoresde expresin, algunos de ellos son ms apropiadospara la introduccin y anlisis de genes de formatransiente, mientras que otros son mejores para laexpresin estable y continua de ADN heterlogos enlas clulas.

De igual forma, los mtodos de transfeccin pue-den ser categorizados de los ms efectivos por el cor-to perodo del anlisis de la expresin y los ms apro-piados para seleccionar lneas celulares que expre-sen de forma estable. La identificacin de los produc-tos recombinantes se ha desarrollado desde las prue-bas radiactivas hasta las tcnicas inmunolgicas yluminiscentes.

Transfeccin celularEl desarrollo de mtodos de sobreexpresin de pro-

tenas en sistemas heterlogos ha tenido una gran re-percusin en la evolucin reciente de la biologamolecular.

Si bien los sistemas de expresin bacterianos apor-tan ventajas importantes, entre las que se encuentransu facilidad de utilizacin y los elevados niveles deexpresin que se obtienen, tambin es preciso indicarque presentan desventajas que se deben tener en con-sideracin. Entre estas ltimas se pueden destacar losproblemas en el plegamiento de algunas protenas, ascomo alteraciones en el procesamiento proteoltico,glicosilacin, secrecin, ensamblaje de subunidades,etctera. Por todas estas razones se han desarrolladosistemas de expresin eucariticos que permiten ob-tener niveles adecuados de protenas heterlogas (17).

Ha sido conocida durante muchos aos la capaci-dad de las clulas de mamferos para tomar ADNexgenamente y para expresar los genes incluidos enese ADN. El procedimiento mediante el cual se intro-duce un ADN forneo en una clula eucaritica se hadenominado transfeccin celular.

Existen dos tipos de transfecciones que son utiliza-das rutinariamente en sistemas de mamferos: lastransientes y las estables o permanentes. En una ex-presin transiente pueden ser analizadas la transcrip-cin o la replicacin de genes transfectados entre 1 y4 das despus de la introduccin del ADN, general-mente cosechando las clulas transfectadas; mientrasque en la expresin estable o permanente, es til enlos experimentos donde se requiere la formacin delneas celulares que contengan genes que se integrenen el ADN cromosomal (34).

Szybalska y Szybalski (59) fueron los primeros quedescribieron la transferencia mediada por ADN.Transfectaron clulas humanas mutantes deficientesde hipoxantina guanina fosforribosil transferasa(HGPR-) a HGPR+ al utilizar ADN total nuclear huma-no, no clonado, como fuente del gen tipo silvestre.Desde esa fecha a la actualidad, esta metodologa hahecho posible realizar el anlisis de secuencias de ADNde Eucariotes, lo que ha posibilitado descubrir a nivelmolecular los mecanismos de regulacin de la expre-sin gnica. Por otra parte, en la actualidad muchasprotenas recombinantes necesitan ser producidas enclulas eucariticas, debido a modificacionespostransduccionales que presentan y que slo en estetipo de clula puede ser posible.

Como primera fase de estos experimentos se rea-liza el clonaje del gen de inters en una bacteria, fre-cuentemente E.coli, para lo cual se utilizan vectoresdiseados para la expresin en clulas eucariticas,que incluyan promotores virales o eucariticos (7, 16).

La transfeccin celular es de importancia para elestudio de la funcin de genes virales a travs de lageneracin de mutantes virales (7), adems es un pasonecesario para la generacin de virus recombinantesque incorporen en su genoma genes forneos para lageneracin de vacunas virales recombinantes.

Debido a la importancia de esta metodologa sehace necesario establecer las condiciones experimen-tales que permitan obtener el mayor nmero de clu-las transfectadas.

Existen cuatro tcnicas para introducir ADN en c-lulas eucariotas:

- Transfeccin con Fosfato de Calcio (17).

- Transfeccin con DEAE dextrano (17) (25).

- Transfeccin mediada por Liposomas (9, 6).

- Electroporacin (68).

Cada una de estos procedimientos tiene su propioespectro de ventajas y desventajas, incluyendo eficien-cia, citotoxicidad, complejidad tcnica y equipamientorequeridos en su aplicacin.

Los primeros dos mtodos consisten en la unindel ADN a la superficie celular. El ADN es endocitadopor un mecanismo no conocido. Los parmetros parala transfeccin de clulas por estas tcnicas varan paracada tipo de clula y por tanto necesitan seroptimizados cuidadosamente.

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De acuerdo al objetivo final del experimento puedeser seleccionada la tcnica de transfeccin, por ejem-plo, si se quiere expresar una protena de forma tran-sitoria es frecuente utilizar la tcnica de la formacindel complejo de ADN-DEAE dextrano. El mecanismopor el cual tiene lugar la introduccin del ADN en clu-las de mamferos con el uso de esta tcnica es pococonocido. Convencionalmente se asume que el com-plejo que contiene tanto el ADN con el DEAE-dextrano,se adhiere a la superficie de la clula y de alguna for-ma entra por endocitosis. Lopata et al. (40) modifica-ron el protocolo tradicional por adicin de un shockadicional con dimetilsulfxido o glicerol a las clulas,demostrando que tanto la concentracin de DEAE-dextrano como la de ADN y la duracin de latransfeccin son las variables crticas que deben seroptimizadas para cada tipo de clula.

El DEAE-dextrano es muy txico a la clula y des-pus de este procedimiento, la misma pierde la capa-cidad de multiplicacin (17). Sin embargo, si se quiereobtener una lnea celular que exprese la protena deinters de forma continua (expresin estable) o un vi-rus manipulado genticamente a travs de estos pro-cedimientos, es necesario utilizar las otras tcnicas,tales como formacin del coprecipitado de ADN-fosfatode Calcio (17), complejo ADN-liposomas (9) o la intro-duccin del ADN a travs de la utilizacin de un cam-po elctrico (electroporacin) (68).

De estos ltimos procedimientos, la formacin delcoprecipitado de ADN-fosfato de Calcio, requierereactivos ms baratos y de uso frecuente, adems deun equipamiento tradicional para un laboratorio dedi-cado al trabajo con lneas celulares, a diferencia delprocedimiento de electroporacin, que s requiere deun equipamiento especial o del de utilizacin deliposomas catinicos que utiliza reactivos muy carospara su realizacin (6).

El procedimiento de formacin del coprecipitado deADN-fosfato de Calcio es menos reproducible por sudependencia de varios factores, como son concentra-cin de clulas, concentracin de ADN plasmdico,tiempo de exposicin y composicin de los medios decultivo a utilizar, los cuales necesitan ser optimizadossegn el tipo de clula a utilizar. El xito de la transfe-rencia de ADN en estos experimentos depende de laformacin de un coprecipitado del ADN con el fosfatode calcio que es insoluble y debe formarse bajo condi-ciones estrictas de pH, se recomienda un rango muyestrecho de variabilidad del mismo (pH=7.00 apH=7.12) cuando se prepara la mezcla de transfeccin(9). Se conoce que este precipitado depende en granmedida de la concentracin de ADN en la mezcla, en-

contrndose una a la cual puede ser obtenida la ma-yor eficiencia de transfeccin (9). Se ha descubiertoque este precipitado es txico a las clulas, por lo cuales necesario determinar el tiempo ptimo de exposi-cin al mismo (9, 34) y por lo general, los cultivos pri-marios celulares tienden a ser ms sensibles a este(9).

Aparentemente los grnulos de ADN-fosfato decalcio son fagocitados por las clulas, por lo que laeficiencia de transfeccin de las mismas depende dela superficie de exposicin al mismo; en aquellos culti-vos que no han alcanzado la confluencia, esta superfi-cie es mucho mayor que en aquellos confluentes y lapropiedad de la monocapa celular est determinadapor el nmero de clulas depositadas, por la composi-cin del medio de cultivo utilizado y por el tiempo delcultivo (34).

Lo anteriormente expuesto avala la necesidad deestablecer las condiciones experimentales que ase-guren una mayor eficiencia de transfeccin, entre es-tos parmetros se encuentran la concentracin de c-lulas, suero fetal bovino, y ADN plasmdico, as comoel tiempo de exposicin al precipitado (28).

Una vez transfectada la clula, una pequea por-cin del ADN se integra establemente en el genomanuclear de la clula receptora. El precipitado del fosfatode calcio proporciona un mtodo general para introdu-cir cualquier ADN en clulas Eucariotidas. Puede seraplicado a una cantidad relativamente grande de clu-las en placa de cultivo, pero est limitado por la pro-porcin variable y frecuentemente muy baja (1-2%) declulas que toman ADN exgeno. Solo una subfraccinde estas clulas sern transfectadas establemente.

Aunque tampoco se ha esclarecido el mecanismopor el cual los liposomas, con lpidos neutros ocatinicos, permiten la penetracin del ADN a las c-lulas, la aplicacin de este mtodo ha facilitado estu-dios de asociacin entre la glicoprotena CD4 de lamembrana plasmtica y la protena Tirosina kinasaasociada a la misma, el ensamblaje de virus y lainteraccin entre la glicoprotena 160 del VIH y la CD4.

La seleccin de una mezcla particular de Liposomasdepende de la lnea celular que va a ser transfectada.Comercialmente existen dos mezclas de liposomas:la Lipofectina y TransfectACE, que son efectivos enun amplio rango de lneas celulares, y aunque esteltimo es menos costoso, puede no ser tan efectivo entodos los tipos celulares como el primero (66). Para laoptimizacin de este mtodo se debe tener en cuentala concentracin total de lpidos y ADN y el tiempo deincubacin, ya que a menudo pequeas cantidades de

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ADN son suficientes para promover altas frecuenciasde transfecciones, y por otra parte, altas concentracio-nes de ADN o liposomas pueden ser txicas.

El mtodo de electroporacin, por su parte, da comoresultado una elevada frecuencia de clulastransfectadas con una buena eficiencia de expresintransciente de los genes, por esta razn su uso se haido incrementando. La diferencia fundamental entre laElectroporacin y el resto de los mtodos, consiste enque se puede regular la cantidad de ADN que se inte-gra a la clula. En este caso la membrana de la clulaes sometida a un alto voltaje, dando como resultado laformacin de poros, que permite la entrada o salida delas macromolculas y la recuperacin de la membra-na ocurre de forma natural.

Los parmetros a tener en cuenta para lograr unaelectroporacin eficiente son la amplitud y longitud delpulso elctrico, el ltimo estar determinado por lacapacidad de la fuente de voltaje. Esta tcnica ha sidogeneralizada a todos los tipos celulares con efectivi-dad (34).

Para la realizacin de los diferentes mtodos detransfecciones es necesario contar con ADN de altogrado de pureza, lo cual puede ser logrado a travs dela purificacin de los vectores en gradientes de clorurode cesio (38), precipitacin con polietielenglicol (48) opurificaciones al utilizar juegos comerciales basadosen el uso de resinas (14).

Genes Reporteros.La va ms simple para optimizar los parmetros

de transfeccin es usando un gen reportero. Este per-mite optimizar la eficiencia de la transfeccin y medirindirectamente la actividad del promotor, de maneraque no es necesario analizar los niveles de ARN y laestructura del ARN producido a partir del gentransfectado.

Los genes reporteros codifican para protenas queposeen una actividad enzimtica nica, o que son f-cilmente distinguibles en una mezcla de protenas intrao extracelulares. Los ms utilizados son: el gen quecodifica para la -galactosidasa (LacZ) (65), el genque codifica la cloranfenicol acetil transferasa (CAT)(29), y el gen bacteriano que codifica para la guanosinafosforibosil transferasa (GPT) (19).

Estos genes reporteros son utilizados para probarelementos promotores funcionales, para lo cual el po-sible promotor es primeramente ligado a la regincodificante de un gen reportero para generar un gen,en el cual los elementos regulatorios en estudio con-trolan la expresin del mismo. Para comprobar la exis-

tencia de elementos estimuladores funcionales (loscuales por definicin pueden aumentar la transcripcincuando son localizadas antes o despus y en una orien-tacin relativa al promotor) el ADN puede ser ligadoantes o despus de un gen reportero. La capacidadtranscripcional del ADN testado es estimadacuantitativamente por la actividad in vitro del productodel gen reportero (1) en el medio de cultivo o en ex-tractos derivados de tejidos o clulas; o es determina-da cualitativamente por tincin histoqumica de la c-lula intacta. Aunque la actividad o cantidad del produc-to del gen reportero es una medida indirecta de laspropiedades transcripcionales del ADN testado, gene-ralmente la actividad del gen reportero es directamen-te proporcional a la actividad transcripcional (24).

La -Galactosidasa como gen reportero.En el genoma de E. coli, en el opern de utilizacin

de la lactosa, se encuentra el gen LacZ el cual codificala -galactosidasa, enzima utilizada para la degrada-cin de la lactosa en glucosa y galactosa; esta enzimapresenta un peso molecular de 125 KDa.

Este gen se ha utilizado frecuentemente en los tra-bajos de biologa molecular, para la identificacin declones recombinantes de E .coli (1, 38), identificacinde virus recombinantes (49) y para la optimizacin delas transfecciones celulares (28; 56).

La -Galactosidasa es un control interno muy tilpara normalizar la variabilidad en la actividad de la pro-tena reportera debido a la eficiencia de transfeccin opreparacin de extractos celulares (23).

Su presencia es determinada a travs de un ensa-yo fotomtrico muy simple basado en la hidrlisisenzimtica del sustrato ONPG (o-Nitrofenil-B-D-Galactopiranosido) por la -galactosidasa, la que ori-gina un cambio de coloracin desde incoloro hacia uncolor amarillo, cuya intensidad puede ser valorada auna densidad ptica de 420nm. La actividad b-galactosidasa puede ser determinada en extractos li-bres de clulas, obtenido por el lisado de las mismasen presencia de NP-40 (29).

La actividad de la -galactosidasa tambin puedeser monitoreada histoqumicamente por descomposi-cin del sustrato X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3-indolil BDGalactopiranosido). Este sustrato es hidrolizado a unindol el cual se oxida a un indonil que forma un com-plejo derivado del azul-ndigo (24).

Algunas clulas de mamfero poseen -galactosidasa endgena, que es predominantementelisosomal y activa a pH bajos. Una tincin positiva fal-sa puede ser minimizada por tincin a pH entre 7,5-8.

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Las reacciones controles, que consisten en clulas notransfectadas o aparentemente transfectadas, debenser ejecutadas. Si la tincin es debido a un falso posi-tivo y persiste an ajustando pH, se debe usar un an-ticuerpo anti -Gal de E. coli, el cual puede ser usadopara distinguir la enzima celular de la procariota (1).

Cultivos paralelos de clulas transfectadas puedenser teidos, de igual forma, al usar X-gal y visualizadospara determinar la eficiencia de la transfeccin y la es-pecificidad o preferencia de las clulas a la infeccin,y cuantitativamente evaluado usando ONPG para de-terminar el nivel de expresin del promotor. Se puederealizar una comparacin directa entre el nmero declulas transfectadas y la intensidad del promotor. Estava de entrada puede ser usada para la identificacinde clulas especficas que expresen la construccinpromotor-gen LacZ dentro de una poblacinheterognea de clulas primarias (1).

La cloranfenicol acetil transferasa (CAT) como genreportero.

La enzima bacteriana cloranfenicol acetiltransferasa cataliza la transferencia del grupo acyl delacetil CoA (o cualquiera de los cofactores de AcilCoA)a cloranfenicol. Las formas aceltiladas y no acetiladasposeen diferentes solubilidades en solventes orgni-cos, por lo que pueden ser distinguibles porcromatografa de capa fina de slica gel (TCL), es esteel mtodo ms frecuente para la evaluacin de la acti-vidad CAT (1,57).

El gen que codifica para esta enzima no ha sidoencontrado en eucariota, por lo que no existe activi-dad endgena en las clulas normales de mamfero.Esta caracterstica, unido a la facilidad y sensibilidaddel ensayo por la actividad CAT, han hecho de estegen uno de los ms ampliamente utilizados para estu-dios de expresin de genes de mamferos. Este genfue adaptado por primera vez por Gorman et al. (29),fusionado al vector SV40.

Vectores de expresinLa gran mayora de los plsmidos utilizados como

vectores comparten las mismas caractersticas que losvectores que se emplean para realizar experimentosde expresin transitoria con lneas celulares in vivo.

Esto incluye: (a) un origen de replicacin para ob-tener altos rendimientos del plsmido en clulas de E.coli; (b) un gen de resistencia a antibitico para reali-zar la seleccin en E.coli (generalmente ampicillina);(c) un lugar mltiple de clonaje donde insertar el cDNA;(d) un promotor-potenciador fuerte; as como (e) se-

ales de poliadenilacin y terminacin de la transcrip-cin para asegurar la finalizacin adecuada del ARNmensajero expresado (23, 24).

Frecuentemente en estos vectores se utilizan comopromotores virales aquellos procedentes del virusSV40, los cuales permiten la expresin en un ampliorango de clulas, pero tiene las caractersticas de serun promotor dbil, o sea, que a partir de l solo pue-den obtenerse bajos niveles de protena recombinantesen clulas transfectadas (23).

El promotor ms utilizado procede decitomegalovirus (CMV) debido a que este induce nive-les de expresin muy elevados en un amplio rango detipos celulares (12). Ambos promotores incluyen se-cuencias estimuladoras de la expresin, lo cual haceque el nivel de expresin sea aun superior a aquellosque contengan promotores sin estas secuencias. Acontinuacin se sita una secuencia denominada intrnA que es utilizada para incrementar los niveles de ex-presin (4).

En la actualidad ha sido comn la utilizacin de otrosvectores virales, por su capacidad de infectar un am-plio rango de clulas y aceptar un amplio rango deregiones forneas. Dentro de estos se encuentran lospoxvirus, que incorporan el gen en una regin no esen-cial de su genoma (3); baculovirus, que infectan clu-las de insecto (62); los retrovirus que pueden expresarde forma permanente un gen forneo en las clulas(20); y los adenovirus con sus verstiles aplicaciones,son generados con una mnima manipulacinenzimtica usando recombinacin homloga en bac-terias y en clulas eucariticas (30); entre otros.

Poxvirus como vectores de expresin.Los poxvirus comprenden una amplia familia de vi-

rus ADN que se transcribe y replica en el citoplasmacelular de su hospedero (36). Como uno de los prime-ros virus manipulados genticamente dentro de estafamilia, con vistas a su utilizacin como vector viral,podemos citar el virus vacunal o virus vaccinia, mode-lo representativo de la misma. Su estudio durante ladcada de los aos 80 permiti conocer sus ventajascomo vector de expresin, ya que presenta un genomalineal ADN de doble cadena, que codifica un sistemacompleto para el metabolismo de cidos nucleicos, en-tre los que se incluyen las enzimas necesarias para latranscripcin y replicacin de su genoma viral (51),adems de la estabilidad de sus preparaciones, fcilalmacenamiento, barata produccin y su bien definidabiologa molecular (18; 19).

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Debido al riesgo que ofrece el virus vaccinia de in-feccin al hombre, por su amplio rango de hospederosy la potencialidad que tiene de causar efectos secun-darios o enfermedades en otros animales, se hizo ne-cesario construir poxvirus recombinantes hospederosespecficos (44).

Uno de los candidatos ms ampliamente utilizadoses el virus de la viruela aviar. Se caracteriza por ser unvirus largo de doble cadena de ADN que se replica enel citoplasma de las clulas infectadas (11; 13; 36; 69)y ha sido ampliamente utilizado como portadorheterlogo, debido a sus caractersticas de ser hospe-dero especfico limitado a especies aviares, as se evi-ta el riesgo de efectos secundarios en otro animales yel hombre (36). Adems, presenta varias regiones noesenciales para la formacin de partculas infectivas(3, 5, 8, 50) y la capacidad de aceptar fragmentosforneos de ADN (15; 31; 36; 68), brindan la posibili-dad de obtencin de vacunas multivalentes para avesde corral (32; 55; 67) as como para especies no aviares(37, 42, 69) y humanos (33, 64).

En los ltimos aos se ha desarrollado la caracteri-zacin molecular de las cepas de Viruela Aviar, con elobjetivo de contar con un conocimiento ms profundode las cepas utilizadas con estos fines, ya que se re-quiere conocer la secuencia del fragmento de ADN queva a ser usado como sitio apropiado para la creacinde recombinantes (43, 50).

Desde el punto de vista de su utilizacin comovectores de expresin, los poxvirus presentan algu-nas caractersticas sobresalientes, tales como su enor-me capacidad para incorporar genes heterlogos (almenos 25 kpb) sin perder infectividad, su estabilidadgenmica y capacidad para replicar en un amplio ran-go de tipos celulares (45; 51; 58). Adems presentanun sitio de transcripcin propio que puede sintetizarARN mensajero funcional con su respectivo sistemade transcripcin, son capaces de perder gran parte dela informacin (genes no esenciales) sin que afecte sureplicacin in vitro y sintetizar los productos de losgenes forneos insertados procesados y glicosiladosde forma que se presenten las protenas en su confi-guracin nativa.

Estos virus involucran la recombinacin ADN ho-mlogo sitio-especfico para insertar los genes forneosen el genoma del virus vector, y a travs de este mto-do de recombinacin gentica se producen hasta un50% de recombinacin en la descendencia (61).

Todas estas caractersticas han resultado de granutilidad para el desarrollo de sistemas de expresinbasados en el uso de los poxvirus.

La metodologa para la obtencin de virus vacciniarecombinantes se fundamenta en la recombinacinentre un plsmido que contiene promotores proceden-tes de poxvirus, el gen de inters clonado bajo el con-trol de este promotor en el sitio de clonaje diseado enel plsmido y un marcador de seleccin (19), todosellos insertados en un gen viral no esencial para lamultiplicacin, clonado en un plsmido bacteriano. Enlas clulas infectadas con el virus, mediantetransfeccin se introduce este plsmido, el cual a tra-vs de sus secuencias homlogas recombina con elgenoma viral y de esta forma el gen a expresar, pasa aformar parte del virus, obtenindose un recombinanteviral de expresin estable. En estos sistemas se pue-de adems realizar ensayos de expresin transitoriade genes (19).

Estos sistemas de expresin han ido perfeccionn-dose de manera creciente, actualmente se estn utili-zando mayoritariamente los sistemas virales hbridosen los que se encuentran elementos bacterianos yvirales de regulacin, debido a que se ofrecen mejo-res resultados en el control de la expresin de los genes(46). De esta forma, se han insertado en el genomaviral elementos de distinto origen, tales como el gen 1del bacterifago T7 que codifica para la ARNpolimerasa (27, 9), la secuencia 5 no traducida delvirus de la encefalomiocarditis situada a continuacindel promotor de la polimerasa del bacterifago T7 (21),as como componentes del opern lactosa de E. colique controlan directamente la citada polimerasa, yprovoca, de esta forma, que la transcripcin del gende inters quedara bloqueada en ausencia de un in-ductor (IPTG) (53; 2).

Aplicaciones y perspectivas de los poxvirusrecombinantes.

Los poxvirus han sido utilizados como vectores parala produccin de vacunas recombinantes vivas. Esteinters viene mediado, adems de por las caractersti-cas descritas anteriormente, por su gran eficacia paradirigir determinantes antignicos al sistema inmunitariodel hospedero y producir, a veces tras una nica inmu-nizacin, la induccin de una respuesta inmune (22).

Por todo ello, estos vectores suponen un sistemade vacunacin seguro para los potenciales recepto-res. As, animales de experimentacin inoculados convirus recombinantes que expresaban protenasheterlogas, quedaron protegidos frente a una grancantidad de patgenos de diferentes orgenes, estaproteccin est relacionada con la estimulacin del sis-tema inmune, tanto a nivel humoral como celular (10;26; 35; 46; 54).

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El empleo de poxvirus como vacunas vivas fue des-crito hace ms de 15 aos (44) y, desde entonces, sehan utilizado ampliamente para el desarrollo de vacu-nas contra diferentes tipos de enfermedades. Uno delos mejores ejemplos que sigue siendo utilizado ac-tualmente, est representado por la vacunarecombinante basada en el virus vaccinia recombinanteque expresa la glicoprotena del virus de la rabia (52).

La utilizacin de otros miembros de la familiaPoxviridae como vectores virales, presenta la ventajaadicional de proteger contra la enfermedad provocadapor el propio vector, tal como ocurre en el caso depoxvirus aviares recombinantes que protegen a lospollos contra una infeccin experimental con estirpesvirulentas (47).

Los poxvirus aviares han sido utilizados para lageneracin de vacunas recombinantes aviares, comoes el caso de la generacin de virus recombinantes dela viruela aviar que inserta en su genoma genes pro-cedentes de otros virus entre los que se encuentran:Newcastle (32, 49), Gumboro (31), Influenza (60) yMarek (39; 55); y permite obtener cepas bivalentes deimportancia para la generacin de vacunas aviares (32;41; 68). Adems han sido utilizados en el desarrollode vacunas recombinantes contra coccidiosis (63) yse han obtenido muy buenos resultados en la induc-cin de respuesta inmune, tanto humoral como celu-lar, de ratones inmunizados con el virus recombinantede la viruela aviar que expresa la protena E2 del virusde la diarrea viral bovina (BVDV) (42), lo que pone demanifiesto la amplia utilidad de este virus como vectorde expresin.

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(Recibido 7-11-2000; Aceptado 22-12-2000)