El esteviósido y sus compuestos relacionados: Los beneficios terapéuticos más allá de la dulzura Varanuj Chatsudthipong, Chatchai Muanprasat Department of Physiology, Faculty of Science, Mahidol University, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand Fuente: Pharmacology & Therapeutics 121 (2009) 41–54 RESUMEN El Steviosido, un componente abundante de la hoja de Stevia rebaudiana, se ha hecho famoso por su intenso dulzor (250-300 veces más dulce que la sacarosa) y está siendo usado como un dulcificante no calórico en diferentes países. Varios estudios han sugerido que, además del dulzor, el steviosido junto con sus compuestos relacionados, entre los que se incluyen rebaudiosido (el segundo componente más abundante de la hoja de S. rebaudiana), steviol e isosteviol (componentes metabólicos del steviosido) también ofrecen beneficios terapéuticos, debido a que contienen anti-hiperglicemicos, anti-hipertensivos, anti-inflammatorios, antitumorales, anti-diarreicos, diuréticos, y acciones inmunomoduladoras. Cabe resaltar que sus efectos a nivel de la glucosa en el plasma y tensión arterial sólo son observados cuando estos parámetros son más altos de lo normal. Puesto que el steviol puede actuar como transportadores de moléculas, se propone como un modulador de fármacos. Este artículo resume el conocimiento común de las acciones farmacológicas, aplicaciones terapéuticas, farmacocinética y seguridad del steviosido y sus compuestos relacionados con él. Aunque la mayoría del progreso ha sido realizado acerca de sus efectos biológicos y farmacológicos, preguntas acerca de la pureza química y la seguridad permanecen no resueltas. Estas cuestiones son tratadas aquí con la intención de ayudar a dirigir futuras investigaciones.  

1. Introducción

1.1. Fuente natural

Los dulcificantes naturales que pueden substituir a la sacarosa han obtenido una gran atención debido al creciente aumento de la obesidad y la diabetes. Mucha de esta atención se ha centrado en el steviosido, un glicosido dulce extraído de Stevia rebaudiana Bertoni. Esta planta es un pequeño arbusto originariamente cultivado en Sudamérica, en particular en Brasil y Paraguay donde es conocido como Stevia u hoja de miel, Kaa-he-e (Hanson & De Oliveira, 1993). Los nativos de Sudamérica han estado usando extracto de stevia como dulcificante y medicina tradicional durante varios cientos años (Kinghorn & Soejarto, 2002). Debido al dulzor y a las supuestas propiedades terapéuticas de la su hoja, S. rebaudiana Bertoni ha atraído intereses económicos y científicos. Japón fue el primer país en Asia en comerciar con el steviosido como un dulcificante en la comida y en la industria de los medicamentos. Desde entonces, el de esta planta se ha expandido a varios países en Asia, entre los que se incluyen China, Malasia, Singapur, Corea del Sur, Taiwán, y Tailandia. También ha sido cultivado con éxito en los Estados Unidos de América, Canadá, y Europa (Brandle et al., 2000). El uso de éstos compuestos edulcorantes ha aumentado drásticamente debido a los

problemas de salud relacionados con uso de la sacarosa, como son la caries dental, la obesidad y la diabetes. 1.2. Estructura química y propiedad de dulzor

El steviosido es un glicósidos diterpénico, comprendiendo una aglycona de steviol y tres moléculas de glucosa. Además de steviosido, varios compuestos dulces, como el steviobiosido, rebaudiosido A, El B, C, D, E y el dulcosido A han sido aislados de la hoja S. rebaudiana Bertoni. Todos éstos glicósidos diterpénicos aislados, tienen las misma estructura vertebradora (steviol) pero se diferencian en las cadenas de hidrato de carbono en las posiciones C13 y C19 (Shibata et al., 1995). Los componentes principales de la hoja son el steviosido (el 5-10 % del peso seco total), el rebaudiosido A (El 2-4 %), el rebaudiosido C (el 1-2 %) y dulcosido (el 0.4-0.7 %) (Madera et al., 1955). Las estructuras químicas de steviosido y sus componentes relacionados incluidos el steviol, el rebaudiosido A, isosteviol y dihy-droisosteviol se muestran en Fig. 1.

Steviosido Rebaudiosido A

Steviol Isoesteviol Dihidroisosteviol El dulzor de estos glicosidos comparado con la sacarosa es: dulcosido un 50-120, rebaudiosido A un 250-450, rebaudiosido B 300-350, rebaudiosido C 50-120, rebaudiosido D 250-450, rebaudiosido E 150-300, steviobiosido 100-125, y steviosido 300 (Crammer & Ikan,1986). El steviosido es hidrolizado por bacterias en el tracto gastrointestinal para ceder steviol y glucosa (Wingard et al., 1980; Hutapea et al., 1997; Koyama et al., 2003a). Junto con el dulzor, el steviosido posee un poco de amargura y regusto indeseable (Jakinovich et al., 1990). Sin embargo, este problema puede ser solucionado por modificación enzimática del steviosido mediante pullanase, isomaltase (Lobov et al., 1991), β-galactosi- aturdimiento (Kitahata et al., 1989), o dextrina saccharase (Yamamoto et al.,1994). Se considera al Steviosido como un sustituto del azúcar y como un dulcificante comercial, ambos en forma de steviosido y de extracto de stevia (Kinghorn Soejarto, 1985; Brandle & Rosa, 1998). Se

usan en variedad de alimentos y productos, como verduras en escabeche, mariscos desecados, salsa de soja, bebidas, dulces, chicles, yogur y helado, también en pasta de dientes y productos para el lavado bucal. El extracto de Stevia y el steviosido son oficialmente aprobados como aditivos de comida en Brasil, Corea y Japón (Choi y al., 2002; Mizutani & Tanaka, 2002) y en los Estados Unidos, se permiten como un suplemento alimenticio. En 2006, el encuentro de la Junta del Comité de Expertos de la FAO/WHO sobre aditivos alimentarios (JECFA) evaluó ciertos aditivos e ingredientes, condimentos constituyentes naturales de los alimentos, anunciando aceptar un consumo diario (IDA) de steviosido de hasta 5.0 mg./kilogramo de peso corporal (JECFA,2006). Además de su dulzor, el extracto de stevia extracto y el steviosido han sido usados por la población local en Sudamérica durante siglos. Los beneficios terapéuticos de estos componentes serán discutidos en las siguientes secciones. 1.3. Extracción y purificación Procedimientos para aislamiento de steviosido de las hojas de S.rebaudiana a nivel práctico sobre todo implican la extracción líquida con solventes como metano del cloroformo, glicerol, y propilen-glicol, seguido por el refinado, lo que implica la extracción en un solvente orgánico polar, decolorización, coagulación, cambio iónico cromatografía y cristalización (Kinghorn y Soejarto, 1985; Pasquel et al., 2000). La purificación del steviosido también puede ser realizada por la cromatografía de intercambio iónico, la cual ha sido aceptada como la mejor técnica. Entonces el extracto acuoso es precipitado de nuevo y filtrado con un rendimiento del 90% de steviosido puro. Recientemente, Pol et al. (2007) han desarrollado un método de extracción por agua caliente presurizada para el steviosido de S. rebaudiana Bertoni estableciendo así un método "verde" de aislamiento. 2. Farmacocinética del steviosido.

La farmacocinética describe del destino del steviosido administrado a organismos vivos en términos de absorción, distribución, metabolismo y la excreción (ADME), esto tiene particular importancia cuando nos aporta entendimiento del grado y la cinética de exposición sistémica al steviosido o a sus productos metabólicos. Estos datos son necesarios para evaluación dela seguridad del steviosido. 2.1. Absorción

El steviosido, siendo un diterpenoid glicosido hidrifílico con un peso molecular relativamente alto (804.9) tiene muchas probabilidades de no ser absorbido en el intestino. Además, los jugos gástricos y las enzimas digestivas de los animales y de los humanos no degradan bien el steviosido (Wingard et al.,1980; Hutapea et al., 1997; Koyama et al., 2003a). Sin embargo, la flora intestinal bacteriana de ratas (Wingard et al., 1980), ratones (Hutapea et al.,1997), cerdos (Geuns et al., 2003a) y humanos (Gardana et al., 2003; Koyama et al., 2003a) son capaces de convertir el steviosido en steviol aglycona, Bacteroides sp. es el responsable de esta conversión en la parte más baja del tracto intestinal tanto de la rata como de los humano (Gardana et al., 2003). Los estudios en voluntarios humanos mostraron que después de 3 días tras el consumo de steviosido (750 mg./día), no fue encontrada cantidad alguna mensurable de steviosido en las heces de todos los sujetos, mientras que sí se encontró steviol libre (Geuns, 2007). Los estudios

experimentales usando saco intestinal evertido de rara demostraron que el transporte absortivo de steviol es mucho más alto que el de steviosido (Geuns et al., 2003a). Del mismo modo, la administración oral de steviol a ratas resultó en un rápido incremento de steviol en sangre con un pico de concentración de aproximadamente 15 minutos (Koyama et al., 2003b). Investigaciones sobre las propiedades de transporte del steviosido y el steviol en líneas celulares de Caco-2 en el intestino humano, un modelo estándar para el estudio de absorción de medicamentos, indicó que el transporte de steviosido es muy bajo ( coeficiente de permeabilidad Papp de 0.16×10−6 cm/s), mientras que el de transporte de steviol es mucho más rápido y a favor de una dirección de absorción (Papp de 44.5×10−6 cm/s para absorción y Papp de 7.93×10−6 cm/s para secreción) (Geuns et al., 2003a). Además, el mecanismo de absorción del steviol implica tanto la difusión pasiva como mediado por una proteína de transporte de la membrana celular por medio del transportador de monocarboxilicos. En su conjunto, estos datos indican que en una ingestión oral de steviosido, es el steviol el que absorbido por el intestino hacia la sangre. 2.2. Distribución El perfil de distribución del steviol en órganos específicos permite predecir de sus efectos sistémicos y preocupaciones toxicológicas del consumo de steviosido. La distribución de steviol en órganos vitales tales como el cerebro y el corazón serían considerados desfavorables ya que el steviol o sus metabolitos pueden inducir reacciones adversas en estos órganos. Para objetivos terapéuticos, la acumulación preferente de steviol en el órgano objetivo es considerada como deseable. Nakayama et al. (1986) fue el primero en determinar la farmacocinética del steviosido después de una sola dosis de administración oral de 3H-stevioside (BW de 125 mg./kilogramos) en machos de ratas Wistar. El máximo el nivel de radiactividad en la sangre (4.8 �g/ml) fue encontrado 8 h después de haber administrado el steviosido con un período de vida media de eliminación de 24 h. Análisis de los niveles de radiactividad en órganos claves y tejidos manifestaron una preferente acumulación en entrañas pequeñas y grandes. Después de la inyección intravenosa del radiactivo 131 I-steviosido en ratas macho Wistar, la radioactividad en corazón, estómago, testículos y músculo es menos del 1.8 % de la dosis inyectada durante todo experimento de 24h (Cardoso et al., 1996). Sin embargo, una cantidad significante de la radiactividad fue descubierta en el hígado, intestino y riñones. La acumulación en el hígado es la máxima 10 minutos después de la inyección. Una radioactividad significante está presente en la bilis después de 120 minutos, con una cantidad acumulativa del 52 % de la dosis inyectada. Su presencia es máxima en los intestinos gruesos y delgados después de 120 y 240 minutos tras la inyección de steviosido, respectivamente. El análisis de la bilis por medio de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) mostró al steviol como el metabolito mayoritario. Mientras que, el análisis de orina reveló la presencia de steviosido como componente principal con mucha menos cantidad de un metabolito desconocido que también fue encontrado en la bilis. Estos resultados indican que la conversión metabólica del steviosido y el steviol en ratas ocurre en el hígado y existen dos rutas de excreción de steviosido, vía bilis y vía orina. Además, el steviol puede someterse a la circulación enterohepatica donde el steviol es excretado a la bilis y absorbido de nuevo a la circulación. Sin embargo, la presencia de steviol en sistema venoso portal no se documenta en el estudio. 2.3. Metabolismo Steviol parece ser el metabolito principal del steviosido que se muestra en la circulación sanguínea después de la ingesta oral. En consecuencia, se ha puesto especial atención a su metabolismo en el

hígado. Después de haber incubado steviol con microsomas hepáticos de ratas y humanos, se ha observada la oxidación (monohidroxida e dihidroxida) de los metabolitos de steviol (Koyama et al., 2003b). Este proceso requiere NADPH-generado por el sistema, sugiriendo un metabolismo de fase I de steviol por citocromo P450. Sin embargo, como antes se encontraron conjugados de steviol desconocidos en la bilis en los estudios en vivo en ratas (Nakayama et al., 1986), la conjugación del metabolismo de la fase II de steviol metabolitos puede suceder. Recientemente, Roberts y Renwick (2008) han informado que el steviosido y el rebaudiosido A son metabolizados en steviol glucuronido en ratas. Antes Geuns et al. (2006) encontró steviol glucuronido en orina humana después de haber administrado steviosido. En siguientes estudios sobre sujetos humanos que habían recibido una dosis oral de 750mg/día durante 3 días, el steviol glucuronido fue el único metabolito encontrado tanto en sangre como en orina, mientras que no se detectó ni steviosido ni steviol. El análisis de las heces mostro únicamente steviol libre y no steviosido o steviol glucuronido sugiriendo una ruta adicional para la eliminación del steviol. En un reciente estudio cruzado, del tipo aleatorio doble ciego, la farmacocinética del steviol glucurónido, y steviol libre en 8 individuos macho adultos, recibiendo un dosis oral individual de rebaudiosido A (5mg/Kg de peso corporal) o steviosido (4,2 mg/Kg de peso corporal) mostraron un nivel de steviol de 121 ng/ml en sangre transcurridas 6h desde la administración (Wheeler et al.,2008). El steviol glucurónido esta presente en el plasma de todos los sujetos administrados oralmente con steviosido, con una media de tiempo para alcanzar el máximo de concentración de 8 horas, siendo este máximo de 1,89 μg/ml. En orina, la mayor parte del steviol encontrado fue en forma de conjugados glucurínidos (62% de la dosis) con un nivel muy inferior del steviol libre (0,04% de la dosis). Así, parece que, además de a la fase I del metabolismo, el steviol se somete a la fase II, en la cual la mayor parte del steviol es conjugado como glucorinido antes de ser eliminado mediante la orina. Este estudio también sugiere la participación de un camino metabólico similar para el rebaudiosido A. 2.4. Excreción El entendimiento de la excreción por la que el steviosido y sus productos metabólicos son eliminados del cuerpo es crucial para las consideraciones toxicológicas del consumo de steviosido. Esta determina la duración y la cantidad de steviosido o sus metabolitos presentes en el cuerpo tras la ingesta. Por ello, se han estudiado los mecanismos excretores del steviosido en humanos y ratas. El steviol glucuronido es comúnmente el mayor metabolito encontrado en circulación en ambos, humanos y ratas. Los tractos biliar y urinario parecen ser las mayores rutas para la excreción del steviol glucuronido. Sin embargo, las extensiones por la que este metabolito es excretado por estas dos rutas son diferentes entre humanos y ratas. En estas últimas, la ruta principal es la excreción por vía biliar del steviol glucuronido en heces (Wingard et al.1980; Nakayama et al., 1986; Roberts & Renwick, 2008). En humanos, la excreción urinaria parece ser la que juega el papel predominante en la excreción del steviol glucurónido (Cardoso et al., 1996; Geuns et al., 2006, 2007;Wheeler et al., 2008). Un estudio metabólico reciente en humanos mostró que 72h después de la ingesta oral del steviosido, el steviol glucurónido y steviol libre en heces era de un 62% y un 5,2% de la dosis de steviosido administrada respectivamente (Wheeler et al.,2008). Esta diferencia entre humanos y ratas en el camino de la excreción del steviol glucuronido se debe a la diferencia entre el umbral de peso molecular para humanos y ratas de excreción de aniones orgánicos. Los aniones orgánicos con masa molecular mayor de 600 Da en humanos y 325 Da en ratas son excretados por la bilis en vez

de pasar por la filtración glomerular del riñón (Renwick, 2008a). Así el steviol glucurónido, con peso molecular de 512.9 Da, es preferentemente eliminado por vía biliar en heces en ratas. 3. Efectos biológicos y potenciales aplicaciones terapéuticas del steviosido y sus

componentes relacionados. 3.1. Efecto anti-hiperglicémico En el presente, se ha incrementado la incidencia de la diabetes de tipo 2 y de la obesidad como resultado del envejecimiento, los hábitos dietéticos y la disminución de las actividades físicas. Estos síndromes metabólicos se han convertido en un problema de salud pública en los países industrializados y más desarrollados. La diabetes mellitus de tipo 2 es un desorden metabólico crónico resultado de defectos en la secreción de insulina de las células β y en la acción de la insulina (DeFronzo, 1988). Además de esto, también contribuyen la disfunción de las células α del páncreas y el exceso relativo de glucagón (Unger, 1997). La hiperglicemia postprandial observada en la diabetes de tipo 2 esta normalmente debida a un incremento de la producción de glucosa hepática basal y una disminución de glucosa periférica. Por lo tanto, la corrección de este desequilibrio bien sea a la entrada o la salida de la glucosa plasmática debe ayudar a corregir esta afección patológica. En la actualidad, es común el uso de hierbas y medicina alternativa para el tratamiento de la diabetes. En realidad, el extracto de S. rebaudiana ha sido utilizada en tratamientos para la diabetes (Kinghorn & Soejarto, 2002). Además, el steviosido, el mayor componente del extracto, tiene altos niveles de dulzor sin calorías y sólo una pequeña cantidad de este es necesaria con el propósito de edulcorar. 3.1.1. Efecto en la absorción de glucosa El steviosido en dosis altas (5mM) no tiene efecto inhibitorio sobre la absorción de glucosa. Sin embargo, 1mM de steviol inhibe la absorción de glucosa aproximadamente un 40%. El Steviol causa una disminución de la acumulación de la glucosa en el tejido intestinal. Además el steviol altera la morfología de las células de absorción intestinales. Estos resultados sugieren que el lugar de la acción inhibidora del steviol podría ser en la parte de la mucosa y/o en los orgánulos intracelulares de las células de absorción intestinales (Toskulkao et al., 1995a). Estudios del mismo grupo de investigación (Toskulkao et al.,1995b) demostraron que el steviosido en dosis de 1 a 5 mM no inhiben la absorción intestinal de la glucosa en hámsteres, mientras que 1mM de steviol inhibe la absorción de la glucosa sobre el 30% pero no afecta a la actividad intestinal Na+-K+-ATPasa Los investigadores sugirieron que al inhibición de la absorción de la glucosa por el steviol se debe a la reducción del contenido de ATp en la mucosa intestinal, lo que es una consecuencia de la disminución de las actividades enzimáticas mitocondriales en el intestino al nivel de fosforilación y alteraciones morfológicas de las células de absorción intestinales. De hecho, la inhibición por steviol de la absorción de glucosa en células intestinales podría resultar en una bajada del nivel de glucosa plasmática, lo que sería indeseable en individuos sanos. De todas formas, la ingesta diaria aceptable (IDA) de steviosido (5mg/Kg de peso corporal/día) tendría un rendimiento máximo de concentración de steviol de aproximadamente 20 μM si el steviosido se convierte por completo en steviol (JECFA,2006). Esta concentración de steviol esta muy por debajo de la cantidad estudiada para inhibir la absorción de glucosa intestinal.

3.1.2. Efecto sobre la secreción de insulina y la sensibilidad La mayor incidencia de diabetes en el mundo es la de tipo 2, diabetes mellitus (Kolterman et al., 1980). Bajo esta condición, la reducción de la sensibilidad en tejidos periféricos hace decrecer la eficiencia de la utilización de la glucosa conduciendo al desarrollo de hiperglucemia. Así, el rol del steviosido para incrementar la sensibilidad a la insulina ha sido estudiado en ratas alimentadas con comida rica en fructosa (Chang et al., 2005). La habilidad de la insulina para estimular la disposición de glucosa esta marcadamente afectada en estas ratas, indicando un descenso de la sensibilidad a la insulina en tejidos periféricos asociado a una resistencia a la insulina. Estos modelos de ratas representan el desarrollo de la obesidad acompañado del síndrome de resistencia a la insulina. El Steviosido (5,0mg/kg de peso corporal) administrado oralmente a las ratas alimentadas con comida rica en fructosa aumenta en de gran manera la sensibilidad a la insulina indicado por el índice glucosa-insulina. Repetido el tratamiento de steviosido 3 veces al día retrasa el desarrollo de la resistencia a la insulina respondiendo al tolbutamido. La ingesta aguda de steviosido (500mg/kg de peso corporal) en ratas diabéticas incrementa la sensibilidad a la insulina del cuerpo en su totalidad, como ha determinado el valor del índice glucosa-insulina, lo que indica sensibilidad a la insulina o acción de la insulina en la tasa de eliminación de la glucosa. Además, se ha estudiado in vitro, el efecto directo del steviosido en la actividad de transporte de glucosa en los músculos esqueléticos, lugar de mayor concentración de glucosa. Se ha comprobado que una baja concentración de steviosido (0,01 a 0,1 mM) puede aumentar el efecto de la insulina en el transporte de glucosa de dichos músculos tanto en ratas flacas como en las obesas, sugiriendo como lugar potencial de acción del steviosido el sistema de transporte de glucosa de los músculos esqueléticos. Así, los efectos del steviosido en la estimulación de la secreción de insulina (Jeppesen et al., 2000) y así como en el aumento de la sensibilidad a la insulina (Lailerd et al., 2004) subrayan sus efectos beneficiosos sobre el metabolismo de la glucosa. En realidad, se observó una reducción en la glucosa plasmática y los glucagones junto con un incremento de la secreción de insulina, en las ratas diabéticas de tipo 2 de Goto-Kakizaki después de una ingesta oral de steviosido de 25mg/kg de peso corporal/día durante 6 semanas (Jeppesen et al., 2003). De todas formas, más adelante, deben hacerse estudios sobre la administración prolongada tanto de steviosido como de steviol. Sin embargo, estos resultados aumenta la preocupación sobre si la ingesta de steviosido en ayunas puede conducir a la hipoglucemia, como en el la situación de sulfonilurea, que estimula la liberación de insulina, constituyendo así, una amenaza potencial para sujetos diabéticos Para contestar esta cuestión, se ha administrado steviosido a ratas GK y Wistar en ayunas, con una concentración normal y baja de glucosa plasmática (3,3 mM o menos), y no se encontró acción insulinotrópica (Jeppesen et al., 2002). De hecho, el steviosido estimula la liberación de insulina sólo en algunos casos aislados de ratones con altas concentraciones de glucosa (> 8,3 mM) (Jeppesen et al., 2000). De ahí, es probable que el steviosido muestre su efecto beneficioso estimulando la liberación de insulina sólo en estado diabético. Se han realizado un número limitado de estudios experimentales para evaluar el efecto del extracto de stevia y del steviosido en humanos. Un comida estándar suplementada con 1 g de steviosido administrada a 12 sujetos diabéticos de tipo 2, es capaz de reducir los niveles de glucosa postprandial en sangre sobre un 18% (Gregersen et al., 2004). Se observó un leve incremento en la circulación de insulina y un descenso en los niveles de glucagones. El índice insulinogénico indicó que tras el tratamiento con steviosido se incrementó un 40% la secreción de insulina. No se observó

pérdida de glucosa urinaria por el consumo de steviosido, esto implica que el steviosido puede tener un efecto directo en la disposición de la insulina periférica inducido por la insulina responsable del descenso en los niveles en sangre de glucosa postprandial. Esto puede incluir un aumento en el almacenamiento de glucógeno en el hígado. En contraste con lo anterior, Barriocanal et al. (2008), ha expuesto que el consumo prolongado de steviosido (> 92% pureza) de 250 mg 3 veces/día durante 3 meses, cantidad similar a la usada como dulcificante, no tiene efectos farmacológicos en individuos diabéticos tanto de tipo 1 como de tipo 2 así como en sujetos normotensos o hipotensos. No se encontró menos glucosa en sangre o presión sanguínea. Se desconoce la explicación a esta carencia de efecto del steviosido, pero se debe señalar que el steviosido parece tener la habilidad de bajar los niveles de glucosa en plasma y la presión sanguínea sólo cuando estos parámetros son anormalmente elevados. Estos resultados son consecuentes con aquellos obtenidos previamente a corto plazo sobre los efectos en individuos sanos (Geuns et al., 2007). El segundo componente más abundante de la hoja de stevia es el rebaudiosido A, que se diferencia del steviosido porque tiene una mitad de glucosa adicional. Esto eleva la posibilidad de que el rebaudiosido A pueda poseer efectos hipoglucémicos similares a los del steviosido y el extracto de stevia. De hecho, rebaudiosido A estimula la liberación de insulina considerablemente en ratones en presencia de grandes concentraciones de glucosa (>6,6 mM) (Abudula et al., 2004). Inesperadamente, un estudio de tratamiento a largo plazo de ratas GK con rebaudiosido A fracasó en el estímulo de secreción de insulina (Dyrskog et al., 2005). De manera parecida, el consumo a largo plazo de rebaudiosido A durante 16 semanas por parte de sujetos con diabetes mellitus tipo 2 no ha tenido efecto en la homeostasis de la glucosa, ni en la presión sanguínea (Maki et al., 2008). Basado en estudio en células, animales y humanos, steviosido y sus compuestos relacionados (steviol y rebaudiosido A) afectan a la glucosa plasmática mediante la modulación de la secreción de insulina y la sensibilidad, lo que mejora la eliminación de glucosa en el plasma. También inhiben la absorción de glucosa intestinal y la generación de glucosa por el hígado alterando la actividad de varias enzimas claves envueltas en la síntesis de la glucosa reduciendo así el aporte de glucosa plasmática. Los posibles efectos anti-hiperglycémicos del steviosido y sus componentes relacionados se muestran en la figura 2. Es interesante resaltar que los efectos del steviosido dependen enormemente de los niveles de glucosa plasmática, siendo observados sólo cuando estos son elevados. Así, parece ser totalmente seguro para individuos sanos. De todas formas, el mecanismo de este efecto no se conoce.

Figura 2. Posibles efectos anti-hiperglicémicos del steviosido y sus componentes relacionados 3.2. Efecto Anti-hipertensivo La presión arterial sanguínea media (mABP) varía directamente con el tono del sistémico vascular o con las resistencia periferal total (TPR) y el volumen de sangre. Cambios en cualquiera de estos parámetros afectan la mABP. La hipertensión arterial es resultado de una inapropiada relación entre la capacidad vascular /resistencia y el volumen de sangre. Estudios previos tanto en animales como en humanos han demostrado que el steviosido y el extracto de stevia disminuyen la mABP induciendo la vasodilatación (reduce TPR), lo que lleva a reducir el volumen plasmático (Melis, 1995; Melis & Sainati, 1991a, 1991b). El efecto anti-hipertensivo del extracto de stevia crudo (2,67 g de hoja seca/día) tomado oralmente es dependiente del tiempo y requiere una administración prolongada. Esto se deduce de observar que tras administrar el extracto oralmente a ratas hipertensivas, no existen cambios significativos en la presión sanguínea durante los primeros 20 días. Pero sí se pudo constatar un efecto hipotensivo del extracto pasados 40 y 60 días tras la administración (Melis, 1996). Por otra parte, la infusión de steviosido por vía intravenosa reduce la presión sanguínea en ambas ratas, normales e hipertensivas

sin ningún retraso (Melis, 1992c). Así, el efecto hipotensivo agudo del steviosido puede ser observado sólo cuando es administrado directamente en el sistema circulatorio. Estudios en humanos han mostrado el efecto del steviosido en el sistema cardiovascular. Steviosido causa bradicardia e hipotensión (Humboldt & Boech, 1977). Similarmente, un leve efecto hipotensivo ha sido observado en sujetos humanos que recibieron té de S. rebaudiana (extracto de stevia) diariamente durante 30 días (Boeckh & Humboldt, 1981). En estos estudios, también se sugirió que el steviosido tiene un efecto inotrópico de reducción de la duración de la sístole. Esto reduce la mABP. Así, tanto el steviosido como el extracto de stevia parecen tener un efecto anti-hipertensivo. Los resultados de los ensayos clínicos a largo plazo en humanos con leve y moderado nivel de hipertensión demostraron que un consumo continuado de steviosido (750mg/día) por un año, reduce ambas ,la presión sanguínea sistólica y diastólica, mientras que no se han observado efectos secundarios significantes o alteración en lípidos (Chan et al., 2000). Subsiguientes estudios hasta 2 años con un incremento de la dosis de steviosido (1500mg/día) se vio una reducción significativa de ambas presiones sanguíneas sin cambios significativos en el índice de masa corporal, n en los valores bioquímicos de la sangre, ni en el índice de masa ventricular (Hsieh et al., 2003). Además, se ha podido comprobar que la calidad de vida es significantemente mejor con steviosido en comparación con el placebo. Estos resultados refuerzan el papel hipotensivo del steviosido en humanos. Los investigadores concluyeron que el consumo de steviosido a largo plazo es bien tolerado y debe ser considerado como alternativa o suplemento en terapias con pacientes hipertensivos. Sin embargo, se ha informado de una carencia de efecto mesurable del steviosido en la mABP (Ferri et al., 2006). La administración oral durante 6 semanas de mezcla bruta de steviosido/rebaudiosido A (15mg/Kg de masa corporal/día) en pacientes con leve hipertensión no ha producido cambios significativos en la presión sanguínea. Esto puede ser consecuencia de valores bajos de presión sanguínea basal en estos sujetos junto con diferecencias en las frecuencias y duración de las tomas de steviosido en comparación con los estudios previos (Chan et al., 2000). Otra posibilidad puede ser la pureza o la composición de la mezcla cruda de steviosido/ rebaudiosido A que puede interferir en el efecto del steviosido. De todas formas, no se observaron otros efectos clínicos adversos. Geuns et al. (2007) demostró que la administración oral de steviosido (750mg/day) durante 3 días no causa cambios significativos en mABP en 9 sujetos con presión sanguínea normal. Esto indica que la ingesta oral de steviosido crudo es segura. En resumen, el steviosido reduce el mABP interviniendo tanto el volumen plasmático como la resistencia vascular como se muestra en la Fig 3. Sin embargo, parece no tener un impacto significativo en la presión sanguínea en humanos con niveles normales de presión sanguínea. La capacidad del steviosido de disminuir la presión sanguínea se observa sólo en sujetos huipertensivos. Así, el riesgo de desarrollar hipotensión en sujetos humanos sanos, es relativamente baja.

Fig. 3. Anti-hypertensive actions of stevioside. Stevioside inhibits Ca2+ influx in vascular smooth muscle, which causes vasodilation and consequentially reduction of total peripheral resistance. Stevioside also produces diuresis and natriuresis resulting in reduction of extracellular fluid volume. Thus, the underlining mechanism of anti-hypertensive action of stevioside is via its ability to reduce both factors that determine mean arterial blood pressure (mABP). 3.3. Efectos antinflamatoria y anticancerigeno La inflamación es una reacción inmune innata de los tejidos vasculares a estímulos nocivos, tales como células patógenos, heridas o irritaciones. Las células satélites tales como células del sistema inmune, epiteliales y endoteliales de forma interactiva participa en este proceso para eliminar los estímulos nocivos y poner en marcha el proceso de curación. Sin embargo, la inflamación está también asociada con una variedad de trastornos, tales como enfermedades autoinmunes (Atassi & Casali, 2008), enfermedades de inflamación intestinal (Bamias & Cominelli, 2007; Cho, 2008) y cáncer (Niessner et al., 2007). Además, en algunos casos patológicos, las consecuencias de la inflamación puede ser devastador y se asocian con el deterioro funcional de los órganos afectados. Por ejemplo, en el caso de la enfermedad inflamatoria intestinal, esta puede conducir a daño de la pared mucosa o incluso todo el intestino, lo que resulta diarrea con sangre y la mala absorción (Kelly, 1999). Cualquier sustancia con efecto anti-inflamatorio por lo tanto, será útil en la prevención de la inflamación asociada a estas indeseables eventos. Hay evidencias de una amplia muestra que el esteviósido posee un efecto antiinflamatorio tanto in vitro como in vivo. Inicialmente, se ha demostrado que la inflamación inducida por la piel a nivel

local por la 12-O-tetradecanoilforbol- 13-acetato (TPA) fue inhibida por los steviol glicósidos incluido el steviósido (Yasukawa et al., 2002). Además, el efecto antitumoral de esteviósido se investigó como TPA también es conocido por inducir la formación de células cancerígenas en mamíferos (Nakamura et al., 1995). El esteviósido inhibe la TPA inducida por la promoción de tumores en un modelo de cáncer de piel en segunda fase de carcinogénesis en ratones. Mizushina et al. (2005) mostró que el isosteviol inhibe las ADN polimerasas y la topoisomerasa II de ADN en humanos, los objetivos celulares para el tratamiento farmacológico del cáncer, así como enfermedades inflamatorias. Por otra parte, el isosteviol también retarda el crecimiento de tres tipos diferentes de células cancerígenas humanas e inhibe la inflamación inducida por TPA. Boonkaewwan et al. (2006) midió la liberación de un ser humano de la línea celular monocítica THP1 de citocinas proinflamatorias (TNF-α y IL-1β) y el óxido nítrico, todos conocidos por participar en el desarrollo de un número de enfermedades inflamatorias, y encontraron que el esteviósido (1 mM) moderado estimula la liberación de las células no estimuladas por THP1 y la interacción con los receptores toll-like-4, (un receptor principal de lipopolisacárido (LPS) de bacterias gram-negativas). En este nivel de estimulación de los monocitos, el esteviósido puede ser beneficioso en individuos sanos como resultado de su efecto en la mejora de la inmunidad innata. Por otro lado, en las células THP1 estimuladas por LPS, la misma concentración de esteviósido suprime la liberación de TNF-α, IL 1β y NO al interferir con la vía de señalización de NF-kB, un factor de transcripción que controla la expresión de citoquinas inflamatorias en las células del sistema inmune. El esteviol no tiene ningún efecto sobre la liberación de estas citoquinas proinflamatorias en ninguno de los dos casos: sin estimular y estimuladas con células LPS-THP1. Por lo tanto, en el caso de un huésped infectado, el esteviósido puede ser útil debido a su capacidad para prevenir los efectos indeseables de la respuesta inflamatoria, y en el individuo sano, puede ofrecer un beneficio relacionados con la inmunidad, ya que puede aumentar los monocitos la actividad. El esteviósido y el esteviol ejercen efectos anti-inflamatorios en las células epiteliales del colon. Bajo una regulación fisiológica, no sólo los colonocitos función para formar una barrera a través de la cual los líquidos y electrolitos pueden ser transportados, sino también sirve como un sensor inmune innato de los microbios organismos patógenos y comensales (Sartor, 2008). Las funciones de los colonocitos en las reacciones inflamatorias se basan principalmente en una interacción específica entre los receptores tipo toll en colonocitos y antígenos patógenos derivados. Esta interacción huésped-patógeno conduce a la activación de la vía NF-kB de señalización y posterior inducción de la expresión de citoquinas proinflamatorias, con la IL-8, un atrayente de neutrófilos utilizado en quimioterapia, tal vez el más importante. Recientemente, Boonkaewwan et al. (2008) evaluaron los efectos de los esteviósidos y del esteviol en la liberación de IL-8 en la línea celular del cólon de un ser humano. La liberación máxima de IL-8 inducida por el TNF-α requiere de un período de tiempo menor que la inducida por LPS, TNF-α, que fue utilizado como un estimulador. Utilizando dosis no tóxicas de esteviósido (<2 mM ) y esteviol (<0.2 mM), TNF-α fue inducida por IL-8 mostrando que la liberación no se ve afectada por el esteviósido, pero se suprime por esteviol. El análisis por inmunotransferencia mostró que esteviol reduce la expresión de NF-kB. Como el esteviósido se degradada completamente a steviol por la microflora residente (Wingard et al., 1980; Hutapea et al.,1997; Gardana et al., 2003; Geuns 2003), sería de especial interés evaluar la capacidad de esteviósido oral para reducir la inflamación o la transformación de diversos tipos de cáncer en un modelo animal de colitis.

Se han demostrado recientemente actividades inmunomoduladoras en vivo de esteviósido (Sehar et al., 2008). El esteviósido (6,25, 12,5 y 25 mg / kg de peso corporal) en ratones alimentados promueven las funciones fagocíticas, como se indica, por un aumento del índice de fagocitosis de la prueba de carbono de compensación y aumento de la respuesta inmune humoral, medida debido a un aumento del número de anticuerpos a la prueba del antígeno. En experimentos in vitro también se demostraron los efectos estimulantes de los esteviósidos en la actividad fagocítica y la proliferación de células B y T estimuladas por LPS y concanavalin A, respectivamente. Estos resultados apoyan aún más la suposición de que el consumo oral de esteviósido puede ser útil en la promoción de la inmunidad contra la infección por microorganismos. 3.4. Aplicaciones potenciales como agentes terapéuticos contra la diarrea La diarrea se define como un aumento en el contenido acuoso o la frecuencia de deposiciones, generalmente más de 3 veces/día (Binder, 1990). La causa más común de esta patología son las infecciones intestinales por bacterias y virus (Petri et al., 2008). Estos patógenos pueden causar un daño directo debido a la invasión en el intestino o trastornado las funciones intestinales, resultando los síntomas de la diarrea. Hasta el día de hoy la diarrea se clasifica en cuatro tipos: secretora, osmótica, relacionados con la motilidad y diarrea exudativa (Binder, 1990). En la actualidad el tratamiento más generalizado es la terapia de rehidratación y tratamiento antibiótico. Sin embargo, el primero es principalmente de apoyo y éste no puede ser eficaz en situaciones en las que existe resistencia a los antibióticos. Por lo tanto, es necesario todavía descubrir nuevas farmacoterapias específicas para las enfermedades diarreicas. La identificación de potenciales fármacos contra la diarrea de medicamentos tradicionales representa una estrategia atractiva, así como su eficacia y seguridad que ya han sido apoyadas por las experiencias humanas. La potencial aplicación del esteviósido en el tratamiento contra la diarrea fue sugerido originalmente a partir de observaciones de actividades bactericidas y antirotavirales en la extracción con agua caliente de hoja secas de Stevia rebaudiana. Tomita et al. (1997) fueron los primeros en reportar un efecto bactericida de este extracto contra una amplia gama de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos, incluyendo la enterohemorrágica Esherichia coli, que se sabe que causan hemorragia severa / diarrea exudativa. Este extracto de stevia también inhibe el crecimiento de rotavirus, un virus de ARN cuya infección causa la gastroenteritis en los niños, al interferir con la unión contra el rotavirus de las células huésped (Takahashi et al., 2001). Un polisacárido que contienen compuestos de gran tamaño molecular (peso de 9.800 Da) se aisló y fue sugerido de ser responsable de el efecto inhibidor viral. Sin embargo, otras fracciones extraídas de hojas secas de Stevia rebaudiana también se encontraron que producían propiedades similares anti-rotavirus. Como el esteviósido es el mayor constituyente de este extracto de stevia es posible que los glucósidos relacionados con el esteviósido y otros contribuyeran a combatir los efectos de la diarrea. El esteviósido tiene un efecto inhibidor en la contracción sobre el músculo liso intestinal, y esta estimulación es lo que se traduce en hipermotilidad asociada a la diarrea (Shiozaki et al., 2006). A una concentración de 1 mM, el esteviósido inhibe CaCl2 (10 mM) inducido en la contracción del íleon en un 40% probado conejillo de indias aisladas. El mecanismo se cree que está relacionado con su efecto inhibitorio sobre el flujo de Ca2 + en las células musculares. Por lo tanto, el esteviósido puede ser útil en el tratamiento de la diarrea que resulta de enfermedades infecciosas intestinales de hipermotilidad, como el síndrome del intestino irritable e inflamatorias como la

enfermedad intestinal. Otros estudios en modelos animales son necesarios para demostrar in vivo la eficacia contra la diarrea del extracto de stevia obtenido con agua caliente en la diarrea hemorrágica y del esteviósido en la diarrea hipermotilidad. Además, estos estudios indican la baja potencia de esteviósido y más optimización se requiere para obtener los compuestos derivados de mayor potencial. Se ha demostrado un gran potencial terapéutico del steviol y de sus análogos (dihydroisosteviol) en el tratamiento de la diarrea secretora, que sobre todo se refleja en los resultados de la secreción excesiva de líquido intestinal (Pariwat et al., 2008). En general, la secreción de fluidos en el intestino es impulsado por la fuerza osmótica generada por la secreción activa de aniones, especialmente cloruro, en el lumen intestinal (Field, 2003). La enterotoxina bacteriana es capaz de estimular la secreción de cloro activo, seguido por el transporte celular de sodio y agua (Field, 1979). Esta respuesta de hipersecreción de enterotoxina mediada conduce a una pérdida masiva de líquido intestinal y deshidratación en el caso de la diarrea secretora (Field, 2003). Un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), es un canal de cloro activado por AMPc, y constituye la principal ruta para la secreción de cloruro en la mayoría de los tipos de diarrea secretora (Thiagarajah & Verkman, 2003). En la línea celular T84 intestinal de un ser humano, el steviol inhibe el AMPc activando la secreción de cloruro con un IC50 de 100 M (Pariwat et al., 2008). La síntesis de esteviol análogos ha llevado a la identificación de las series de los compuestos más activos, como el dihydroisosteviol que es el más potente y que inhibe de manera reversible AMPc y activa la secreción de cloruro en las células T84 con una IC50 de 10 mM (Pariwat et al., 2008). Análisis electrofisiológicos y enzimático indican que el dihydroisosteviol elimina directamente CFTR. Este compuesto no es tóxico y específico para la secreción de cloruro estimulado por AMPc, pero no por el calcio. En experiencias in vivo de de cólera mostró que la secreción de fluidos intestinales estimuladas por Vibrio enterotoxina del cólera se reduce notablemente por dihydroisosteviol. Por otra parte, administración intraperitoneal de esteviol es eficaz en la reducción de la secreción de fluidos intestinales en los modelos in vivo(Muanprasat, C.,observación no publicada). Estos resultados son consistentes con anteriores estudios farmacocinéticos sugiriendo la circulación enterohepática del esteviol (Nakayama et al., 1986; Cardoso et al., 1996). Los compuestos relacionados con el steviol han sido comparados favorablemente con los inhibidores de CFTR en desarrollo (Ma et al., 2002; Muanprasat et al., 2004; Sonawane et al., 2005; Sonawane et al., 2006; Muanprasat et al., 2007; Sonawane et al., 2007; Sonawane et al., 2008), y por lo tanto representan una nueva opción en el desarrollo de inhibidores de CFTR antidiarreicos. Se debe realizar todavía una mayor optimización de los análogos de steviol, incluyendo estudios de mecánica, evaluación de la toxicidad y la eficacia in vivo en modelos animales de gran tamaño. 4. Aspectos de seguridad: Toxicidad, carcinogénesis y teratogénesis Debido a su uso popular como sustituto del azúcar no calórico, han sido estudiadas de manera intensiva las propiedades toxicológicas del steviosido y el steviol tanto en condiciones in vitro como en animales experimentales. Además, se han evaluado los potenciales carcinogénicos y teratogénicos así como los efectos en la reproducción. 4.1. Estudios toxicológicos En estudios de vitro que implican varias líneas de célula diferentes de riñón e intestino indicaron que steviosido en una concentración tan alta como 2 mM tienen que ser expuestos a células para afectar la viabilidad de célula, pero 0.2 mM de steviol reduce significantemente la viabilidad de la

célula (Srimaroeng et al., 2005b;Boonkaewwan et al., 2008). Este efecto tóxico puede ser consecuencia de una interrupción del metabolismo mitocondrial como se ha sugerido en estudios anteriores (Toskulkao et al., 1997; Srimaroeng et al., 2005b). En evaluaciones de toxicidad agudas y crónicas de ingestión steviosido investigado en ratones, ratas y hámsteres, con un consumo de steviosido tan elevado como 15g/Kg de peso corporal no produce toxicidad aguda alguna (Akashi & Yokoyama, 1975;Mitsuhashi, 1976; Medon et al., 1982; Xili et al., 1992; Toskulkao et al.,1997). Sin embargo, la administración oral de steviol es letal con un LD50 de 5-20 g/kg de peso corporal, dependiendo de la especie animal, siendo los hámsteres más susceptibles a la toxicidad del steviol que las ratas o los ratones (Toskulkao et al.,1997). El examen histológico del tratamiento con steviol en hámsteres ha revelado la degeneración de la célula tubular del proximal, la extensión de la cual esta relacionada con el la subida en el suero sanguíneo del nitrógeno de urea y la creatinina, indicadores del deterioro de la función renal. Así pues, la causa de muerte en hámsteres tratados con steviol es un fallo renal agudo. La ingesta de steviosido (750mg/día durante 3 mese) en individuos sanos o con enfermedades subyacentes como la diabetes mellitus e hipertensión, no produce efectos adversos o anormalidades en el hígado o en la función renal (Hsieh et al.,2003; Barriocanal et al., 2008). De acuerdo con estudios farmacocinéticos previos en humanos, después de la administración oral de una dosis individual de 4,2 mg de steviosido por Kg de peso corporal, supone la máxima concentración de steviol glucorinido y steviol libre en plasma de 1,89 µg/ml (3,7 µM) y 0,19 µg/ml (0,38 µM) respectivamente (Wheeler et al., 2008). Este nivel de steviol, no debería ser tóxico para las células humanas, y parece que el steviol glocorónido no se convierte de nuevo en steviol. 4.2. Evaluación carcinogénica El potencial carcinogénico del steviol es una preocupación particular y varias investigaciones usando diferentes modelos experimentales han sido realizadas para evaluar los efectos mutagénicos del steviosido y el steviol. Análisis genéticos bacterianos han revelado que el steviosido no es mutagénico (Pezzuto et al., 1985; Pezzuto et al., 1986; Suttajit et al.,1993; Matsui et al., 1996a; Klongpanichpak et al., 1997) sin embargo, varios ensayos mutagénicos sobre el potencial genotóxico del steviol permanecen inconclusos. En ensayos de mutación usando Salmonella typhimurium TM677, el steviol mostró toxicidad genética después de la activación metabólica por homogenato de hígado (Pezzuto et al., 1985; Matsui et al., 1989; Matsui et al.,1996a; Temcharoen et al., 1998; Terai et al., 2002). Los mecanismos mutagénicos de steviol activado metabólicamente se mostraron a través de transición, transversión, duplicación y borrado de material genético. Además, estudios usando E. coli (Nunes et al., 2006) y células mamarias cultivadas (Matsui et al., 1996a) sugirieron que el steviol puede producir lesiones genéticas que pueden derivar en la formación de cáncer. Sin embargo, otros ensayos mutagénicos de bacterias, como la mutación inversa, Ames y ensayos rec fracasaron en la demostración de la actividad mutagénica del steviol (Matsui et al., 1996a; Klongpanichpak et al.,1997). Además, linfocitos cultivados de donantes humanos, no mostraron alteraciones cromosómicas tras la exposición a steviosido o steviol (Suttajit et al., 1993; Temcharoen et al., 2000). En pruebas en vivo sobre el potencial carcinogénico del steviosido ha sido llevado a cabo en ratones y ratas. El steviosido administrado oralmente no aumenta la incidencia de cáncer en ratas

(Yamada et al., 1985; Hagiwara y 1984., Al-; Xili y 1992., Al-; Toyoda y 1997., Al-; Sekihashi et al., 2002). No se han obtenido evidencias de carcinogénesis en estudios in vivo con ratones (Matsui et al., 1996a; Yasukawa et al., 2002). En realidad, el steviosido suprime el fomento de tumor por 12-O-tetradecanoylphorbol- 13 acetato en la piel de los ratones (Yasukawa et al., 2002). En 2006, JECFA declaró que no existen evidencias de que el steviosido induzca a la genotoxicidad tanto in vivo con in vitro. En dosis de hasta 2,0 g/Kg de peso corporal (varones) y 2,4 g/Kg de peso corporal (mujeres), el steviol no promovió ninguna incidencia de cáncer. 4.3. Fertilidad y evaluación teratogénica. La preocupación sobre los efectos antifertilidad y teratogénicos del steviosido incrementaron después de ver q las decocciones de stevia disminuyen el ritmo de nacimiento en ratas (Planas & Kuc, 1968), pero estos resultados no han podido ser reproducidos (Shiotsu, 1996). Varios estudios han demostrado que el steviosido oral no tiene efectos sobre la fertilidad en ratones (Akashi & Yokoyama, 1975), ratas (Mori et al., 1981; Xili et al., 1992) o hámsteres (Yodyingyuad & Bunyawong, 1991). Las ratas alimentadas con comida conteniendo un 1% (peso/peso) de steviosido no mostraron cambios en la espermatogénesis o en las células intersticiales de proliferación (Yamada et al., 1985). Sin embargo, cuando se alimentan con una dosis inusualmente altas (2,6g/día) de extracto de stevia durante 2 meses las ratas pueden manifestar un descenso en la fertilidad (Melis, 1999). Sin embargo, esto podría deberse a la presencia de componentes minoritarios que son tóxicos en estas cantidades elevadas de extracto de stevia. La mayoría de estudios están de acuerdo en que el steviosido oral, en una ingesta aceptable de (5mg/kg de peso corporal) es seguro y no carcinogénico o teratogénico. BIBLIOGRAFÍA Abudula, R., Jeppesen, P. B., Rolfsen, S. E.D., Xiao, J.,&Hermansen, K. (2004). Rebaudioside A potently stimulates insulin secretion from isolated mouse islets: studies on the dose-, glucose-, and calcium-dependency. Metabolism 53(10), 1378−1381. Abudula, R., Matchkov, V. V., Jeppesen, P. B., Nilsson, H., Aalkjær, C., & Hermansen, K. (2008). Rebaudioside A directly stimulates insulin secretion from pancreatic beta cells: a glucose-dependent action via inhibition of ATP-sensitive K+-channels. Diabetes Obes Metab 10(11), 1074−1085. Akashi, H., & Yokoyama, Y. (1975). Security of dried-leaf extracts of stevia: toxicological tests. Food Industry 18, 34−43. Anderson, J. W., Johnstone, B. M., & Cook-Newell, M. E. (1995). Meta-analysis of the effects of soy protein intake on serum lipids. N Engl J Med 333(5), 276−282. Anzai, N., Jutabha, P., Enomoto, A., Yokoyama, H., Nonoguchi, H., Hirata, T., et al. (2005). Functional characterization of rat organic anion transporter 5 (Slc22a19) at the apical membrane of renal proximal tubules. J Pharmacol Exp Ther 315(2), 534−544. Ashcroft, F.M., Proks, P.,Smith, P. A.,Ammala, C., Bokvist, K.,&Rorsman, P. (1994). Stimulussecretion coupling in pancreatic beta cells. J Cell Biochem55(Suppl), 54−65.

Atassi, M. Z., & Casali, P. (2008). Molecular mechanisms of autoimmunity. Autoimmunity 41(2), 123−132. Babu, E., Takeda, M., Narikawa, S., Kobayashi, Y., Yamamoto, T., Cha, S. H., et al. (2002). Human organic anion transporters mediate the transport of tetracycline. Jpn J Pharmacol 88(1), 69−76. Bamias, G., & Cominelli, F. (2007). Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease: current concepts. Curr Opin Gastroenterol 23(4), 365−369. Barriocanal, L. A., Palacios, M., Benitez, G., Benitez, S., Jimenez, J. T., Jimenez, N., et al. (2008). Apparent lack of pharmacological effect of steviol glycosides used as sweeteners in humans. A pilot study of repeated exposures in some normotensive and hypotensive individuals and in Type 1 and Type 2 diabetics. Regul Toxicol Pharmacol 51(1), 37−41. Binder, H. J. (1990). Pathophysiology of acute diarrhea. Am J Med 88(6A), 2S−4S. Boeckh, E. M. A., & Humboldt, G. (1981). Efeitos cardiocirculatorios do extrato aquoso total em individuos normais e do esteviosideo em ratos. Cienc Cult 32, 208−210. Boonkaewwan, C., Ao, M., Toskulkao, C., & Rao, M. C. (2008). Specific immunomodulatory and secretory activities of stevioside and steviol in intestinal cells. J Agric Food Chem 56(10), 3777−3784. Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., & Vongsakul, M. (2006). Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. J Agric Food Chem 54(3), 785−789. Brandle, J. E., & Rosa, N. (1998). Heritability for yield, leaf: stem ratio and stevioside content estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana. Retrieved June 28, 2000, from http://res2.agr.ca/london/pmrc/faq/cjps-ste.html. Brandle, J. E., Starratt, A. N., & Gijzen, M. (2000). Stevia rebaudiana: its biological, chemical and agricultural properties. Retrieved June 28, 2000, from http://res2.agr. ca/london/pmrc/faq/stevia_rev.html. Burckhardt, G., Bahn, A., & Wolff, N. A. (2001). Molecular physiology of renal p-aminohippurate secretion. News Physiol Sci 16, 114−118. Burckhardt, B. C., & Burckhardt, G. (2003). Transport of organic anions across the basolateral membrane of proximal tubule cells. Rev Physiol Biochem Pharmacol 146, 95−158. Cardoso, V. N., Barbosa, M. F., Muramoto, E., Mesquita, C. H., & Almeida, M. A. (1996). Pharmacokinetic studies of 131I-stevioside and its metabolites. Nucl Med Biol 23(1), 97−100. Cha, S. H., Sekine, T., Fukushima, J. I., Kanai, Y., Kobayashi, Y., Goya, T., et al. (2001). Identification and characterization of human organic anion transporter 3 expressing predominantly in the kidney. Mol Pharmacol 59(5), 1277−1286. Cha, S. H., Sekine, T., Kusuhara, H., Yu, E., Kim, J. Y., Kim, D. K., et al. (2000). Molecular

cloning and characterization of multispecific organic anion transporter 4 expressed in the placenta. J Biol Chem 275(6), 4507−4512. Chan, P., Tomlinson, B., Chen, Y. J., Liu, J. C., Hsieh, M. H., & Cheng, J. T. (2000). A doubleblind placebo-controlled study of the effectiveness and tolerability of oral stevioside in human hypertension. Br J Clin Pharmacol 50(3), 215−220. Chan, P., Wong, K. L., Liu, I. M., Tzeng, T. F., Yang, T. L., & Cheng, J. T. (2003). Antihyperglycemic action of angiotensin II receptor antagonist, valsartan, in streptozotocin-induced diabetic rats. J Hypertens 21(4), 761−769. Chan, P., Xu, D. Y., Liu, J. C., Chen, Y. J., Tomlinson, B., Huang,W. P., et al. (1998). The effect of stevioside on blood pressure and plasma catecholamines in spontaneously hypertensive rats. Life Sci 63(19), 1679−1684. Chang, J. C., Wu, M. C., Liu, I. M., & Cheng, J. T. (2005). Increase of insulin sensitivity by stevioside in fructose-rich chow-fed rats. Horm Metab Res 37(10), 610−616. Chatsudthipong,V.,&Jutabha, P. (2001). Effect of steviol onpara-aminohippurate transport by isolated perfused rabbit renal proximal tubule. J Pharmacol Exp Ther 298(3), 1120−1127. Chatsudthipong, V., Lungkaphin, A., & Kaewmokul, S. (2003). The interaction of steviol with rabbit OCT1 and OCT2. FASEB J 17, A476. Chatsudthipong, V., & Thongouppakarn, P. (1995). Effects and mechanism of stevioside on rat renal function. FASEB J 9, A917. Chen, T. H., Chen, S. C., Chan, P., Chu, Y. L., Yang, H. Y., & Cheng, J. T. (2005). Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside, a glycoside of Stevia rebaudiana. Planta Med 71(2), 108−113. Cho, J. H. (2008). The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nat Rev Immunol 8(6), 458−466. Choi, Y. H., Kim, I., Yoon, K. D., Lee, S. J., Kim, C. Y., Yoo, K. P., et al. (2002). Supercritical fluid extraction and liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric analysis of stevioside from Stevia rebaudiana leaves. Chromatographia 55(9–10), 617−620. Clarkson, T. B. (2002). Soy, soy phytoestrogens and cardiovascular disease. J Nutr 132(3), 566S−569S. Crammer, B., & Ikan, R. (1986). Sweet glycosides from the stevia plant. Chem Br 22(10), 915−917. Curi, R., Alvarez, M., Bazotte, R. B., Botion, L. M., Godoy, J. L., & Bracht, A. (1986). Effect of Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans. Braz J Med Biol Res 19(6), 771−774. Dantzler, W. H., & Wright, S. H. (2003). The molecular and cellular physiology of basolateral organic anion transport in mammalian renal tubules. Biochim Biophys Acta 1618(2), 185−193. DeFronzo, R. A. (1988). The triumvirate: beta-cell, muscle, liver. A collusion responsible

for NIDDM. Diabetes 37(6), 667−687. Dyrskog, S. E., Jeppesen, P. B., Colombo, M., Abudula, R., & Hermansen, K. (2005). Preventive effects of a soy-based diet supplemented with stevioside on the development of the metabolic syndrome and type 2 diabetes in Zucker diabetic fatty rats. Metabolism 54(9), 1181−1188. Elliott, S. S., Keim, N. L., Stern, J. S., Teff, K., & Havel, P. J. (2002). Fructose, weight gain, and the insulin resistance syndrome. Am J Clin Nutr 76(5), 911−922. FDA, Food and Drug Administration (2007). Letter Department of Health and Human Services.Washington, DC: Food and Drug Administration to Hain Celestial Group Inc. from www.fda.gov/foi/warning_letters/s6500c.htm. Ferreira, E. B., DeAssis RochaNeves, F.,DuarteDa Costa,M. A., AlvesDo Prado,W.,DeAraujo Funari Ferri, L., & Bazotte, R. B. (2006). Comparative effects of Stevia rebaudiana leaves and stevioside on glycaemia and hepatic gluconeogenesis. Planta Med 72(8), 691−696. Ferri, L. A. F., Alves-Do-Prado,W., Yamada, S. S., Gazola, S., Batista, M. R., & Bazotte, R. B. (2006). Investigation of the antihypertensive effect of oral crude stevioside in patients with mild essential hypertension. Phytother Res 20(9), 732−736. Field, M. (1979). Modes of action of enterotoxins from Vibrio cholerae and Escherichia coli. Rev Infect Dis 1(6), 918−926. Field, M. (2003). Intestinal ion transport and the pathophysiology of diarrhea. J Clin Invest 111(7), 931−943. Gardana, C., Simonetti, P., Canzi, E., Zanchi, R., & Pietta, P. (2003). Metabolism of stevioside and rebaudioside A from Stevia rebaudiana extracts by human microflora. J Agric Food Chem 51(22), 6618−6622. Geuns, J. M. (2003). Stevioside. Phytochemistry 64(5), 913−921. Geuns, J.M., (2007). Comments to the paper by Nunes et al., (2007), Analysis of genotoxic potentiality of stevioside by comet assay, Food Chem Toxicol 45 (2007) 662–666. Food Chem Toxicol, 45(12), 2601–2602; author reply 2603–2604. Geuns, J. M., Augustijns, P., Mols, R., Buyse, J. G., & Driessen, B. (2003). Metabolism of stevioside in pigs and intestinal absorption characteristics of stevioside, rebaudioside A and steviol. Food Chem Toxicol 41(11), 1599−1607. Geuns, J. M., Bruggeman, V., & Buyse, J. G. (2003). Effect of stevioside and steviol on the developing broiler embryos. J Agric Food Chem 51(17), 5162−5167. Geuns, J.M.C., Buyse, J.,Vankeirsbilck,A., & Temme, E. H.M. (2007).Metabolismof stevioside by healthy subjects. Exp Biol Med 232(1), 164−173. Geuns, J.M. C., Buyse, J., Vankeirsbilck, A., Temme, E. H. M., Compernolle, F., & Toppet, S. (2006). Identification of steviol glucuronide in human urine. J Agric Food Chem 54(7), 2794−2798. Giffin, B. F., Drake, R. L., Morris, R. E., & Cardell, R. R. (1993). Hepatic lobular patterns of phosphoenolpyruvate carboxykinase, glycogen synthase, and glycogen phosphorylase

in fasted and fed rats. J Histochem Cytochem 41(12), 1849−1862. Gregersen, S., Jeppesen, P. B., Holst, J. J., & Hermansen, K. (2004). Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects. Metabolism 53(1), 73−76. Gribble, F. M., & Reimann, F. (2002). Pharmacological modulation of KATP channels. Biochem Soc Trans 30(2), 333−339. Hagiwara, A., Fukushima, S., & Kitaori, M. (1984). Effects of the three sweeteners on rats urinary bladder carcinogenesis initiated by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann 75, 763−768. Hanson, J. R., & De Oliveira, B. H. (1993). Stevioside and related sweet diterpenoid glycosides. Nat Prod Rep 10(3), 301−309. Hong, J., Chen, L., Jeppesen, P. B., Nordentoft, I., & Hermansen, K. (2006). Stevioside counteracts the α-cell hypersecretion caused by long-term palmitate exposure. Am J Physiol Endocrinol Metab 290(3), E416−E422. Hosoyamada, M., Sekine, T., Kanai, Y., & Endou, H. (1999). Molecular cloning and functional expression of a multispecific organic anion transporter from human kidney. Am J Physiol 276(1 Pt 2), F122−128. Hsieh, M. H., Chan, P., Sue, Y. M., Liu, J. C., Liang, T. H., Huang, T. Y., et al. (2003). Efficacy and tolerability of oral stevioside in patients with mild essential hypertension: a two-year, randomized, placebo-controlled study. Clin Ther 25(11), 2797−2808. Hubler, M. O., Bracht, A., & Kelmer-Bracht, A. M. (1994). Influence of stevioside on hepatic glycogen levels in fasted rats. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 84(1), 111−118. Humboldt, G., & Boech, E. M. (1977). Efeito do edulcorante natural (stevioside) e sinte' tico (sacarina) sobre o ritmo cardiaco em ratos. Arq Bras Cardiol 30, 257−277. Hutapea, A. M., Toskulkao, C., Buddhasukh, D., Wilairat, P., & Glinsukon, T. (1997). Digestion of stevioside, a natural sweetener, by various digestive enzymes. J Clin Biochem Nutr 23(3), 177−186. Jakinovich, W., Moon, C., Choi, Y. H., & Kinghorn, A. D. (1990). Evaluation of plant extracts for sweetness using the Mongolian gerbil. J Nat Prod 53(1), 190−195. JECFA, Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,, (2006). Steviol Glycosides [Addendum to stevioside]. In: Safety Evaluation of Certain Food Additives: Sixtythird Meeting of the Joint FAO/WHO Expert on Food Additives, June 8–17, 2005, Geneva. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO)/World Health Organization (WHO); Geneva, WHO Food Additives Series, No. 54, pp. 117–144&638. Jeppesen, P. B., Gregersen, S., Alstrup, K. K., & Hermansen, K. (2002). Stevioside induces antihyperglycaemic, insulinotropic and glucagonostatic effects in vivo: studies in the diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats. Phytomedicine 9(1), 9−14. Jeppesen, P. B., Gregersen, S., Poulsen, C. R., & Hermansen, K. (2000). Stevioside acts directly on pancreatic β cells to secrete insulin: actions independent of cyclic

adenosine monophosphate and adenosine triphosphate-sensitive K+-channel activity. Metabolism 49(2), 208−214. Jeppesen, P. B., Gregersen, S., Rolfsen, S. E. D., Jepsen, M., Colombo, M., Agger, A., et al. (2003). Antihyperglycemic and blood pressure-reducing effects of stevioside in the diabetic Goto-Kakizaki rat. Metabolism 52(3), 372−378. Jeppesen, P. B., Kyrskog, S. E., Aggersen, X. J., & Hermansen, K. (2006). Can stevioside in combination with a soy based dietary supplement be a new useful treatment of type 2 diabetes? An in vivo studies in the diabetic Goto-Kakizaki Rat. Rev Diabet stud 3(4), 189−199. Jutabha, P., Toskulkao, C., & Chatsudthipong, V. (2000). Effect of stevioside on PAH transport by isolated perfused rabbit renal proximal tubule. Can J Physiol Pharmacol 78(9), 737−744. Kelly, D. G. (1999). Nutrition in inflammatory bowel disease. Curr Gastroenterol Rep 1(4), 324−330. Kinghorn, A. D., & Soejarto, D. D. (1985). Current status of stevioside as a sweetening agent for human use. In H. Wagner, H. Hikino, & N. R. Farnsworth (Eds.), Economic and medical plant research Vol. 1 (pp. 1–52). London: Academic Press. Kinghorn, A. D., & Soejarto, D. D. (2002). Discovery of terpenoid and phenolic sweeteners from plants. Pure Appl Chem 74(7), 1169−1179. Kitahata, S., Ishikawa, H., Miyata, T., & Tanaka, O. (1989). Production of rubusoside derivatives by transgalactosylation of various β-galactosidases. Agric Biol Chem 53 (11), 2923−2928. Klongpanichpak, S., Temcharoen, P., Toskulkao, C., Apibal, S., & Glinsukon, T. (1997). Lack of mutagenicity of stevioside and steviol in Salmonella typhimurium TA 98 and TA 100. J Med Assoc Thai 80(Suppl 1), S121−S128. Kobayashi, Y., Ohbayashi, M., Kohyama, N., & Yamamoto, T. (2005). Mouse organic anion transporter 2 and 3 (mOAT2/3[Slc22a7/8]) mediates the renal transport of bumetanide. Eur J Pharmacol 524(1–3), 44−48. Kolterman, O. G., Insel, J., Saekow, M., & Olefsky, J. M. (1980). Mechanisms of insulin resistance in human obesity. Evidence for receptor and postreceptor defects. J Clin Invest 65(6), 1272−1284. Koyama, E., Kitazawa, K., Ohori, Y., Izawa, O., Kakegawa, K., Fujino, A., et al. (2003). In vitro metabolism of the glycosidic sweeteners, stevia mixture and enzymatically modified stevia in human intestinal microflora. Food Chem Toxicol 41(3), 359−374. Koyama, E., Sakai, N., Ohori, Y., Kitazawa, K., Izawa, O., Kakegawa, K., et al. (2003). Absorption and metabolism of glycosidic sweeteners of stevia mixture and their aglycone, steviol, in rats and humans. Food Chem Toxicol 41(6), 875−883. Lailerd, N., Saengsirisuwan, V., Sloniger, J. A., Toskulkao, C., & Henriksen, E. J. (2004). Effects of stevioside on glucose transport activity in insulin-sensitive and insulinresistant rat skeletal muscle. Metabolism 53(1), 101−107.

Lee, C. N.,Wong, K. L., Liu, J. C., Chen, Y. J., Cheng, J. T., & Chan, P. (2001). Inhibitory effect of stevioside on calcium influx to produce antihypertension. Planta Med 67(9), 796−799. Lobov, S. V., Kasai, R., Ohtani, K., Tanaka, O., & Yamasaki, K. (1991). Enzymic production of sweet stevioside derivatives: transglucosylation by glucosidases. Agric Biol Chem 55(12), 2959−2965. Ma, T., Thiagarajah, J. R., Yang, H., Sonawane, N. D., Folli, C., Galietta, L. J., et al. (2002). Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest 110(11), 1651−1658. Maki, K. C., Curry, L. L., Reeves, M. S., Toth, P. D., McKenney, J. M., Farmer, M. V., et al. (2008). Chronic consumption of rebaudioside A, a steviol glycoside, in men and women with type 2 diabetes mellitus. Food Chem Toxicol 46(7 Suppl 1), S47−53. Matsui, M., Matsui, K., Kawasaki, Y., Oda, Y., Noguchi, T., Kitagawa, Y., et al. (1996). Evaluation of the genotoxicity of stevioside and steviol using six in vitro and one in vivo mutagenicity assays. Mutagenesis 11(6), 573−579. Matsui, M., Matsui, K., Nohmi, T., Mizusawa, H., & Ishidate, M. (1989). Mutagenicity of steviol: an analytical approach using the Southern blotting system. Eisei Shikenjo Hokoku 107, 83−87. Matsui, M., Sofuni, T., & Nohmi, T. (1996). Regionally-targeted mutagenesis by metabolically-activated steviol: DNA sequence analysis of steviol-induced mutants of guanine phosphoribosyltransferase (gpt) gene of Salmonella typhimurium TM677. Mutagenesis 11(6), 565−572. Medon, P. J., Pezzuto, J. M., Havanec-Brown, J. M., Nanayakkara, N. P., Soejarto, D. D., Kamath, S. K., et al. (1982). Safety assessment of some Stevia rebaudiana sweet principles. Fed Proc 41, 1568−1982. Melis, E. (1997). Effects of steviol on renal function and mean arterial pressure in rats. Phytomedicine 3, 349−352. Melis, M. S. (1992). Influence of calcium on the blood pressure and renal effects of stevioside. Braz J Med Biol Res 25(9), 943−949. Melis, M. S. (1992). Renal excretion of stevioside in rats. J Nat Prod 55(5), 688−690. Melis, M. S. (1992). Stevioside effect on renal function of normal and hypertensive rats. J Ethnopharmacol 36(3), 213−217. Melis, M. S. (1995). Chronic administration of aqueous extract of Stevia rebaudiana in rats: renal effects. J Ethnopharmacol 47(3), 129−134. Melis, M. S. (1996). A crude extract of Stevia rebaudiana increases the renal plasma flow of normal and hypertensive rats. Braz J Med Biol Res 29(5), 669−675. Melis, M. S. (1999). Effects of chronic administration of Stevia rebaudiana on fertility in rats. J Ethnopharmacol 167, 157−161. Melis, M. S., & Sainati, A. R. (1991). Effect of calcium and verapamil on renal function of rats during treatment with stevioside. J Ethnopharmacol 33(3), 257−262.

Melis, M. S., & Sainati, A. R. (1991). Participation of prostaglandins in the effect of stevioside on rat renal function and arterial pressure. Braz J Med Biol Res 24(12), 1269−1276. Melis, M. S., Sainati, A. R., & Maciel, R. E. (1986). Effects of two concentrations of stevioside on renal function and mean arterial pressure in rats. IRCS Medical Science 14(10), 973. Mikkaichi, T., Suzuki, T., Onogawa, T., Tanemoto, M., Mizutamari, H., Okada, M., et al. (2004). Isolation and characterization of a digoxin transporter and its rat homologue expressed in the kidney. Proc Natl Acad Sci U S A 101(10), 3569−3574. Mitsuhashi, H., (1976). Safety of stevioside. In Tama Biochemical Co. Ltd., Report on Safety of Stevia (pp. 1–20). Mizushina, Y., Akihisa, T., Ukiya, M., Hamasaki, Y., Murakami-Nakai, C., Kuriyama, I., et al. (2005). Structural analysis of isosteviol and related compounds as DNA polymerase and DNA topoisomerase inhibitors. Life Sci 77(17), 2127−2140. Mizutani, K., & Tanaka, O. (2002). Use of Stevia rebaudiana sweeteners in Japan. In A. D. Kinghorn (Ed.), Stevia, the Genus steviaMedicinal and Aromatic Plants Industrial Profile Vol. 19 (pp. 178–195). London: Taylor and Francis. Mori, N., Sakanoue, M., Takcuchi, M., Shimpo, K., & Tanabe, T. (1981). Effect of stevioside on fertility in rats. J Food Hyg Soc Jpn 22, 409−414. Motohashi, H., Sakurai, Y., Saito, H., Masuda, S., Urakami, Y., Goto, M., et al. (2002). Gene expression levels and immunolocalization of organic ion transporters in the human kidney. J Am Soc Nephrol 13(4), 866−874. Muanprasat, C., Kaewmokul, S., & Chatsudthipong, V. (2007). Identification of new small molecule inhibitors of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein: in vitro and in vivo studies. Biol Pharm Bull 30(3), 502−507. Muanprasat, C., Sonawane, N. D., Salinas, D., Taddei, A., Galietta, L. J., & Verkman, A. S. (2004). Discovery of glycine hydrazide pore-occluding CFTR inhibitors: mechanism, structure-activity analysis, and in vivo efficacy. J Gen Physiol 124(2), 125−137. Nakamura, Y., Sakiyama, S., & Takenaga, K. (1995). Suppression of syntheses of high molecular weight nonmuscle tropomyosins in macrophages. Cell Motil Cytoskeleton 31(4), 273−282. Nakayama, K., Kasahara, D., & Yamamoto, F. (1986). Absorption, distribution, metabolism and excretion in rats. J Food Hyg Soc Jpn 27, 1−8. Niessner, A., Goronzy, J. J., & Weyand, C. M. (2007). Immune-mediated mechanisms in atherosclerosis: prevention and treatment of clinical manifestations. Curr Pharm Des 13(36), 3701−3710. Nordentoft, I., Jeppesen, P. B., Hong, J., Abudula, R., & Hermansen, K. (2008). Isosteviol increases insulin sensitivity and changes gene expression of key insulin regulatory genes and transcription factors in islets of the diabetic KKAy mouse. Diabetes Obes

Metab 10(10), 939−949. Nunes, A. P., De Mattos, J. C., Ferreira-Machado, S. C., Nunes, R. M., Asad, N. R., Dantas, F. J., et al. (2006). Biological effects of stevioside on the survival of Escherichia coli strains and plasmid DNA. Mol Cell Biochem 293(1–2), 187−192. Nunes, A. P., Ferreira-Machado, S. C., Nunes, R. M., Dantas, F. J., De Mattos, J. C., & Caldeira-de-Araujo, A. (2007). Analysis of genotoxic potentiality of stevioside by comet assay. Food Chem Toxicol 45(4), 662−666. Oliveira-Filho, R. M., Uehara, O. A., Minett, C. A. S. A., & Valle, L. B. S. (1989). Chronic administration of aqueous extracts of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni in rats: endocrine effects. Gen Pharmac 20, 187−191. Panichkul, T., Glinsukon, T., Buddhasukh, D., Cheuychit, P., & Pimolsri, U. (1988). The plasma levels of urea nitrogen, creatinine and uric acid and urine volume in rats and hamsters treated with stevioside. Thai J Toxicol 4, 47−52. Panten, U., Schwanstecher, M., & Schwanstecher, C. (1996). Sulfonylurea receptors and mechanism of sulfonylurea action. Exp Clin Endocrinol Diabetes 104(1), 1−9. Pariwat, P., Homvisasevongsa, S., Muanprasat, C., & Chatsudthipong, V. (2008). A natural plant-derived dihydroisosteviol prevents cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Pharmacol Exp Ther 324(2), 798−805. Pasquel, A., Meireles, M. A. A., Marques, M. O. M., & Petenate, A. J. (2000). Extraction of stevia glycosides with CO2+water, CO2+ethanol, and CO2+water+ethanol. Braz J Chem Eng 17(3), 271−282. Petri, W. A., Jr., Miller, M., Binder, H. J., Levine, M. M., Dillingham, R., & Guerrant, R. L. (2008). Enteric infections, diarrhea, and their impact on function and development. J Clin Invest 118(4), 1277−1290. Pezzuto, J. M., Compadre, C. M., Swanson, S. M., Nanayakkara, D., & Kinghorn, A. D. (1985). Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside, is mutagenic. Proc Natl Acad Sci U S A 82(8), 2478−2482. Pezzuto, J. M., Nanayakkara, N. P., Compadre, C. M., Swanson, S. M., Kinghorn, A. D., Guenthner, T. M., et al. (1986). Characterization of bacterial mutagenicity mediated by 13-hydroxy-ent-kaurenoic acid (steviol) and several structurally-related derivatives and evaluation of potential to induce glutathione S-transferase in mice. Mutat Res 169(3), 93−103. Planas, G. M., & Kuc, J. (1968). Contraceptive properties of Stevia rebaudiana. Science 162 (3857), 1007. Pol, J., Varadova Ostra, E., Karasek, P., Roth, M., Benesova, K., Kotlarikova, P., et al. (2007). Comparison of two different solvents employed for pressurised fluid extraction of stevioside from Stevia rebaudiana: methanol versus water. Anal Bioanal Chem 388(8), 1847−1857. Pritchard, J. B., & Miller, D. S. (1993). Mechanisms mediating renal secretion of organic anions and cations. Physiol Rev 73(4), 765−796.

Proks, P., Reimann, F., Green, N., Gribble, F., & Ashcroft, F. (2002). Sulfonylurea stimulation of insulin secretion. Diabetes 51(Suppl 3), S368−S376. Renwick, A. G. (2008). Toxicokinetics [section on elimination: excretion via the gut]. In W. Hayes (Ed.), Principles and Methods of Toxicology (pp. 188)., 5th ed. Philadelphia, PA: Taylor & Francis/CRC Press. Renwick, A. G. (2008). The use of a sweetener substitution method to predict dietary exposures for the intense sweetener rebaudioside A. Food Chem Toxicol 46(7 Suppl 1), S61−69. Roberts, A., & Renwick, A. G. (2008). Comparative toxicokinetics and metabolism of rebaudioside A, stevioside, and steviol in rats. Food Chem Toxicol 46(7 Suppl 1), S31−39. Sartor, R. B. (2008). Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 134(2), 577−594. Sasaki, Y. F., Sekihashi, K., Izumlyama, F., Nishidate, E., Saga, A., Ishida, K., et al. (2000). The comet assay with multiple mouse organs: comparison of comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from carcinogenicity database. Critical Rev Toxicol 45, 662−666. Sehar, I., Kaul, A., Bani, S., Pal, H. C., & Saxena, A. K. (2008). Immune up regulatory response of a non-caloric natural sweetener, stevioside. Chem Biol Interact 173(2), 115−121. Sekihashi, K., Saitoh, H., & Sasaki, Y. (2002). Genotoxicity studies of stevia extract and steviol by the comet assay. J Toxicol Sci 27(Suppl 1), 1−8. Shennan, N. M., Godsland, I. F., & Wynn, V. (1987). Derivation of a quantitative measure of insulin sensitivity from the intravenous tolbutamide test using the minimal model of glucose dynamics. Diabetologia 30(5), 314−322. Shibata, H., Sawa, Y., Oka, T., Sonoke, S., Kim, K. K., & Yoshioka, M. (1995). Steviol and steviol-glycoside: glucosyltransferase activities in Stevia rebaudiana Bertoni — purification and partial characterization. Arch Biochem Biophys 321(2), 390−396. Shiotsu, S. (1996). Fertility study of Stevia decoction in rats. Tech J Food Chem. Chemicals 4, 108−113. Shiozaki, K., Fujii, A., Nakano, T., Yamaguchi, T., & Sato, M. (2006). Inhibitory effects of hot water extract of the Stevia stem on the contractile response of the smooth muscle of the guinea pig ileum. Biosci Biotechnol Biochem 70(2), 489−494. Sonawane, N. D., Hu, J., Muanprasat, C., & Verkman, A. S. (2006). Luminally active, nonabsorbable CFTR inhibitors as potential therapy to reduce intestinal fluid loss in cholera. FASEB J 20(1), 130−132. Sonawane, N. D., Muanprasat, C., Nagatani, R., Jr., Song, Y., & Verkman, A. S. (2005). In vivo pharmacology and antidiarrheal efficacy of a thiazolidinone CFTR inhibitor in rodents. J Pharm Sci 94(1), 134−143. Sonawane, N. D., Zhao, D., Zegarra-Moran, O., Galietta, L. J., & Verkman, A. S. (2007). Lectin conjugates as potent, nonabsorbable CFTR inhibitors for reducing intestinal

fluid secretion in cholera. Gastroenterology 132(4), 1234−1244. Sonawane, N. D., Zhao, D., Zegarra-Moran, O., Galietta, L. J., & Verkman, A. S. (2008). Nanomolar CFTR inhibition by pore-occluding divalent polyethylene glycolmalonic acid hydrazides. Chem Biol 15(7), 718−728. Srimaroeng, C., Chatsudthipong, V., Aslamkhan, A. G., & Pritchard, J. B. (2005). Transport of the natural sweetener stevioside and its aglycone steviol by human organic anion transporter (hOAT1; SLC22A6) and hOAT3 (SLC22A8). J Pharmacol Exp Ther 313(2), 621−628. Srimaroeng, C., Jutabha, P., Pritchard, J. B., Endou, H., & Chatsudthipong, V. (2005). Interactions of stevioside and steviol with renal organic anion transporters in S2 cells and mouse renal cortical slices. Pharm Res 22(6), 858−866. Susuki, H., Kasai, T., & Sumihara, M. (1977). Effects of oral administration of stevioside on level of blood glucose and liver glycogen of intact rats. Nippon Nogei Kagaku kaishi 51, 171−173. Suttajit, M., Vinitketkaumnuen, U., Meevatee, U., & Buddhasukh, D. (1993). Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside, a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni. Environ Health Perspect 101(Suppl 3), 53−56. Takahashi,K.,Matsuda,M.,Ohashi, K., Taniguchi,K., Nakagomi,O., Abe, Y., et al. (2001). Analysis of anti-rotavirus activity of extract from Stevia rebaudiana. Antiviral Res 49(1), 15−24. Takeda, M., Khamdang, S., Narikawa, S., Kimura, H., Hosoyamada, M., Cha, S. H., et al. (2002). Characterization of methotrexate transport and its drug interactions with human organic anion transporters. J Pharmacol Exp Ther 302(2), 666−671. Temcharoen, P., Pimbua, J., Glinsukon, T., Rojanapo, W., & Apibal, S. (1998). Mutagenic activity of steviol to Salmonella typhimurium TM677: comparison of the activity of S9 liver fractions from five laboratory animal species. Bull Health Sci & Tech 1, 38−45. Temcharoen, P., Suwannatrai, M., Klongpanichpak, S., Apibal, S., Glinsukon, T., & Toskulkao, C. (2000). Evaluation of the effect of steviol on chromosomal damage using micronucleus test in three laboratory animal species. J Med Assoc Thai 83 (Suppl 1), S101−108. Terai, T., Ren, H., Mori, G., Yamaguchi, Y., & Hayashi, T. (2002). Mutagenicity of steviol and its oxidative derivatives in Salmonella typhimurium TM677. Chem Pharm Bull (Tokyo) 50(7), 1007−1010. Thiagarajah, J. R., & Verkman, A. S. (2003). CFTR pharmacology and its role in intestinal fluid secretion. Curr Opin Pharmacol 3(6), 594−599. Tomita, T., Sato, N., Arai, T., Shiraishi, H., Sato, M., Takeuchi, M., et al. (1997). Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from Stevia rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and other food-borne pathogenic bacteria. Microbiol Immunol 41(12), 1005−1009. Toskulkao, C., Chaturat, L., Temcharoen, P., & Glinsukon, T. (1997). Acute toxicity of stevioside, a natural sweetener, and its metabolite, steviol, in several animal

species. Drug Chem Toxicol 20(1–2), 31−44. Toskulkao, C., Deechakawan, W., Leardkamolkarn, V., Glinsukon, T., & Buddhasukh, D. (1994). The low calorie natural sweetener stevioside: nephrotoxicity and its relationship to urinary enzyme excretion in the rat. Phytother Res 8(5), 281−286. Toskulkao, C., Deechakawan, W., Temcharoen, P., Buddhasukh, D., & Glinsukon, T. (1994). Nephrotoxic effects of stevioside and steviol in rat renal cortical slices. J Clin Biochem Nutr 16(2), 123−131. Toskulkao, C., Sutheerawattananon, M., & Piyachaturawat, P. (1995). Inhibitory effect of steviol, a metabolite of stevioside, on glucose absorption in everted hamster intestine in vitro. Toxicol Lett 80(1–3), 153−159. Toskulkao, C., Sutheerawatananon, M., Wanichanon, C., Saitongdee, P., & Suttajit, M. (1995). Effects of stevioside and steviol on intestinal glucose absorption in hamsters. J Nutr Sci Vitaminol 41(1), 105−113. Toyoda, K., Matsui, H., Shoda, T., Uneyama, C., Takada, K., & Takahashi, M. (1997). Assessment of the carcinogenicity of stevioside in F344 rats. Food Chem Toxicol 35(6), 597−603. Tucker, S. J., & Ashcroft, F. M. (1998). A touching case of channel regulation: the ATPsensitive K+ channel. Curr Opin Neurobiol 8(3), 316−320. UKPDS Group(UK Prospective Diabetes Study Group). (1998). Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet 352(9131), 837−853. UKPDS Group(UK Prospective Diabetes Study Group). (1998). Tight blood pressure control and risk of macrovascular and microvascular complications in type 2 diabetes: UKPDS 38. UK Prospective Diabetes Study Group. Br Med J 317(7160), 703−713. Unger, R. H. (1997). How obesity causes diabetes in Zucker diabetic fatty rats. Trends Endocrinol Metab 8(7), 276−282. Wasuntarawat, C., Temcharoen, P., Toskulkao, C., Mungkornkarn, P., Suttajit, M., & Glinsukon, T. (1998). Developmental toxicity of steviol, a metabolite of stevioside, in the hamster. Drug Chem Toxicol 21(2), 207−222. Wheeler, A., Boileau, A. C., Winkler, P. C., Compton, S. C., Prakash, J., Jiang, X., et al. (2008). Pharmacokinetics of rebaudioside A and stevioside after single oral doses in healthy men. Food Chem Toxicol 46, S54−S60. Wingard, R. E., Jr., Brown, J. P., Enderlin, F. E., Dale, J. A., Hale, R. L., & Seitz, C. T. (1980). Intestinal degradation and absorption of the glycosidic sweeteners stevioside and rebaudioside A. Experientia 36(5), 519−520. Wong, K. L., Lin, J. W., Liu, J. C., Yang, H. Y., Kao, P. F., Chen, C. H., et al. (2006). Antiproliferative effect of isosteviol on angiotensin-II-treated rat aortic smooth muscle cells. Pharmacology 76(4), 163−169.

Wood, H. B., Jr., Allerton, R., Diehl, H. W., & Fletcher, H. G., Jr. (1955). Stevioside. I. The structure of the glucose moieties. J Org Chem 20, 875−883. Xili, L., Chengjiany, B., Eryi, X., Reiming, S., Yuengming, W., Haodong, S., et al. (1992). Chronic oral toxicity and carcinogenicity study of stevioside in rats. Food Chem Toxicol 30(11), 957−965. Yamada, A., Ohgaki, S., Noda, T., & Shimizu, M. (1985). Chronic toxicity of dietary stevia extracts. J Food Hyg Soc Jpn 26, 169−183. Yamamoto, K., Yoshikawa, K., & Okada, S. (1994). Effective production of glycosylsteviosides by α-1,6 transglucosylation of dextrin dextranase. Biosci Biotechnol Biochem 58(9), 1657−1661. Yasukawa, K., Kitanaka, S., & Seo, S. (2002). Inhibitory effect of stevioside on tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Biol Pharm Bull 25(11), 1488−1490. Yodyingyuad, V., & Bunyawong, S. (1991). Effect of stevioside on growth and reproduction. Hum Reprod 6(1), 158−165. Youngblood, G. L., & Sweet, D. H. (2004). Identification and functional assessment of the novel murine organic anion transporter Oat5 (Slc22a19) expressed in kidney. Am J Physiol Renal Physiol 287(2), F236−244.