Archivos de Medicina Veterinaria Vol 42 No3 2010

Comité Editor

Presidente: Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D. Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D. Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet. Rubén Pulido F., M.V., Mg.Sc., Ph.D.

Asistente Editorial: Claudia Cárdenas A., Ing. Agr.

ISSN 0301-732xISSN 0717-6201

Archivos de Medicina VeterinariaVOL. 42, Nº 3, 2010

Universidad Austral de ChileFacultad de Ciencias Veterinarias

Casilla 567 - Valdivia, Chile

Comité Editor Asesor

Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, ChileCarmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canada

Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC, Dr. habil. - University of London, UKOscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canada

Raúl Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, España Claudia Muñoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA

Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepción, Chile Sergio Recabarren, Lic. Biología, M.Sc. - Universidad de Concepción, Chile

Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USAPedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile

Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USAGerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

VOLUMEN 42, Nº 3, 2010

CONTENIDOS

EDITORIAL

REVISIONES BIBLIOGRÁFICAS

Uso de lactonas macrocíclicas para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el ganado bovino.RI Rodríguez-Vivas, RJ Arieta-Román, LC Pérez-Cogollo, JA Rosado-Aguilar, GT Ramírez-Cruz, G Basto-Estrella ...... 115

Rol de la mitocondria y el estrés oxidativo en el bloqueo del desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro.AM Tarazona, M Olivera-Angel, YY Lenis ........................................................................................................................... 125

Una actualización sobre el meteorismo espumoso bovino.G Bretschneider ..................................................................................................................................................................... 135

ARTÍCULOS ORIGINALES

Crecimiento y características de canal en corderos Pelibuey puros y cruzados F1 con razas Dorper y Katahdin en confinamiento.U Macías-Cruz, FD Álvarez-Valenzuela, J Rodríguez-García, A Correa-Calderón, NG Torrentera-Olivera, L Molina-Ramírez, L Avendaño-Reyes ................................................................................................................................................. 147

Efecto antihelmíntico in vitro de extractos de plantas sobre larvas infectantes de nematodos gastrointestinales de rumiantes.FC Moreno, IJ Gordon, AD Wright, MA Benvenutti, CA Saumell ...................................................................................... 155

Adaptación de Haemonchus contortus a los taninos condensados: ¿puede ser posible?JA Calderón-Quintal, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, MA Alonso, H Hoste, A Aguilar-Caballero ..................... 165

Patrón electroforético de proteínas séricas en caballos con babesiosis.R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza .............................................................................................................. 173

Almacenamiento en frío de espermatozoides de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss): Efectos en la motilidad, superóxido intracelular, integridad de la membrana plasmática y potencial de membrana mitocondrial.O Berríos, I Valdebenito, F Treulén, A Ubilla ....................................................................................................................... 179

Efecto del confinamiento sobre las variables sanguíneas y calidad de carne de Salmón Atlántico (Salmo salar L.).MC Gatica, GE Monti, TG Knowles, CB Gallo ................................................................................................................... 187

COMUNICACIONES

Estudio preliminar del comportamiento de potros raza Caballo Fino Chilote con acceso restringido a agua y espacio durante el verano.TA Tadich, RG Pulido ........................................................................................................................................................... 195

Características de manejo y conducta en caballos estabulados en el sur de Chile: Estudio preliminar.C Márquez, A Escobar, T Tadich .......................................................................................................................................... 203

Uso de concentrados autólogos de plaquetas como tratamiento de una fractura escapular y una lesión del plexo braquial producidas por un disparo en un caballo.C López, JU Carmona, I Samudio ........................................................................................................................................ 209

Descripción clínico-patológica de fístulas perianales y dermatitis interdigital en un perro como posible diagnóstico de lupus eritematoso sistémico.J Ojeda, M Moroni, E Paredes, MA Vidal, C Figueroa, M Concha ..................................................................................... 215

Hematología y título de aglutinación después de inmunización polivalente y desafío con Aeromonas hydrophila a tilapias del Nilo (Oreochromis niloticus).RL Bailone, ML Martins, JLP Mouriño, FN Vieira, FS Pedrotti, GC Nunes, BC Silva ....................................................... 221

VOLUME 42, Nº 3, 2010

CONTENTS

EDITORIAL

REVIEW ARTICLES

Use of macrocyclic lactones to control the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus.RI Rodríguez-Vivas, RJ Arieta-Román, LC Pérez-Cogollo, JA Rosado-Aguilar, GT Ramírez-Cruz, G Basto-Estrella ..... 115

Mitochondrial rol and oxidative stress in the developmental blockade of in vitro produced bovine embryos. AM Tarazona, M Olivera-Angel, YY Lenis ......................................................................................................................... 125

An update on frothy bloat in cattle.G Bretschneider .................................................................................................................................................................... 135

ORIGINAL ARTICLES

Growth and carcass traits in pure Pelibuey lambs and crosses F1 with Dorper and Katahdin breeds in confinement.U Macías-Cruz, FD Álvarez-Valenzuela, J Rodríguez-García, A Correa-Calderón, NG Torrentera-Olivera, L Molina- Ramírez, L Avendaño-Reyes ................................................................................................................................................. 147

In vitro anthelmintic effect of plant extracts against infective larvae of ruminants gastrointestinal nematode parasites.FC Moreno, IJ Gordon, AD Wright, MA Benvenutti, CA Saumell ...................................................................................... 155

Adaptation of Haemonchus contortus to condensed tannins: can it be possible?JA Calderón-Quintal, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, MA Alonso, H Hoste, A Aguilar-Caballero ..................... 165

Electrophoretic pattern of serum proteins in horses with babesiosis.R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza .............................................................................................................. 173

Cold storage of sperm of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Effect on motility, intracellular superoxide, plasma membrane integrity and mitochondrial membrane potential.O Berríos, I Valdebenito, F Treulén, A Ubilla ....................................................................................................................... 179

Effects of crowding on blood constituents and flesh quality variables in Atlantic salmon (Salmo salar L.)MC Gatica, GE Monti, TG Knowles, CB Gallo ................................................................................................................... 187

COMMUNICATIONS

Preliminary behavioural study of Caballo Fino Chilote stallions with restricted access to space and water during summer.TA Tadich, RG Pulido ........................................................................................................................................................... 195

Husbandry and behaviour characteristics in stabled horses in the south of Chile: A preliminary study.C Márquez, A Escobar, T Tadich .......................................................................................................................................... 203

Use of autologous platelet concentrates as treatment for a scapular fracture and brachial plexus nerve injury produced by a gunshot in a horse.C López, JU Carmona, I Samudio ........................................................................................................................................ 209

Canine perianal furunculosis and interdigital lesions: Probable systemic lupus erythematosus.J Ojeda, M Moroni, E Paredes, MA Vidal, C Figueroa, M Concha ...................................................................................... 215

Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent challenge with Aeromonas hydrophila in Nile tilapia (Oreochromis niloticus).RL Bailone, ML Martins, JLP Mouriño, FN Vieira, FS Pedrotti, GC Nunes, BC Silva ...................................................... 221

Arch Med Vet 42, V (2010)

Editorial

La revista Archivos de Medicina Veterinaria, de septiembre a la fecha, ha implementado la plataforma electrónica eQuipu, como una forma de agilizar y simplificar los procesos de edición. Esta plataforma electrónica permite el envío de artículos on-line como asimismo la realización del proceso editorial, incluyendo el seguimiento del estado de los artículos por parte de los autores y el envío y recepción de los arbitrajes. El Comité Editorial ha establecido un período de marcha blanca de 6 meses, durante el cual se continuarán recibiendo trabajos por las vías tradicionales (correo electrónico o postal). Sin duda, esta plataforma es un gran avance que esperamos pueda ser bien recibido por los autores, especialmente porque tendrán la posibilidad de revisar on-line el estado en que se encuentra su trabajo. Sin embargo, como toda nueva informatización de procesos, durante la marcha blanca se contempla ir realizando ajustes de acuerdo a los problemas que se vayan suscitando.

Durante el mes de septiembre, finalizó su período como editora y además presidenta del Comité Editor de la revista la Dra. Carmen Gallo. La Dra. Gallo estuvo en la presidencia del Comité Editor durante los últimos 3 años, período que ha sido importante en relación a la modernización de la revista, que ha permitido implementar la plataforma electrónica eQuipu. El Comité Editor agradece el esfuerzo y dedicación para mejorar la calidad de la revista. Como nuevo integrante del Comité Editor se incorpora el Dr. Rubén Pulido, quien sin duda otorgará continuidad y fortalecerá los procesos editoriales de Archivos de Medicina Veterinaria.

115

Arch Med Vet 42, 115-123 (2010)

REVISIóN BIBLIOGRÁFICA

Aceptado: 18.11.2009.

* km 15.5 carretera Mérida - Xmatkuil, CP 97 100, Mérida, Yucatán, México; [email protected]

Uso de lactonas macrocíclicas para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el ganado bovino

Use of macrocyclic lactones to control the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus

RI Rodríguez-Vivas*, RJ Arieta-Román, LC Pérez-Cogollo,JA Rosado-Aguilar, GT Ramírez-Cruz, G Basto-Estrella

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán, Yucatán, México.

SUMMARY

An overview of the macrocyclic lactones (ML), with recent results and their effect on the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, is presented in this paper. This review describes in detail the chemistry, pharmacokinetics and dose presentation, security and time withdrawal and environmental safety of the groups belonging to ML: avermectins (ivermectin, doramectin, eprinomectin, abamectin) and milbemycin (moxidectin). There is also a discussion on their efficacy and the problem of resistance of R. (B.) microplus to ML. Finally, it is concluded that due to their high lipid solubility ML are widely distributed in tissues, being effective in the control of R. (B.) microplus in cattle. The efficacy of short-acting ivermectin, doramectin, eprinomectin, abamectin and moxidectin are similar (> 90% effective after four weeks post treatment, PT) to control adult stages of R. (B.) microplus, however, in long-acting LM are available the market and present efficiency of > 95% with persistence up to 70 days PT.

Palabras clave: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, lactonas macrocíclicas, control, bovinos.

Key words: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, macrocyclic lactones, control, cattle.

INTRODUCCIóN

Uno de los principales problemas económicos en la ganadería bovina de las regiones tropicales y subtropi-cales de Centro y Sudamérica, África y Australia son las garrapatas y las enfermedades que éstas transmiten. Por su importancia económica y sanitaria la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es uno de los prin-cipales ectoparásitos que causan graves problemas en la ganadería de pastoreo. Su efecto directo está relacionado con el daño a las pieles por acción de las picaduras, pér-dida de sangre y el efecto de sus toxinas, lo cual incide negativamente sobre la ganancia de peso y producción de leche de animales infestados, mientras que su efecto indi-recto está dado por la transmisión de agentes patógenos: Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale, los cuales a su vez producen baja en la condición física, mortalidades y altos costos para su control (Rodríguez-Vivas y col 2005).

Los métodos de control de garrapatas se clasifican en químicos (ixodicidas o garrapaticidas) y no químicos (vacunas y control biológico). El método más utilizado para el control de R. (B.) microplus es el uso de productos

químicos tales como organofosforados, piretroides, amidi-nas, fenilpirazolonas y lactonas macrocíclicas (LM) (FAO 1987, Rodríguez-Vivas y col 2005). Sin embargo, a través del tiempo, el uso irracional de estos químicos ha genera-do el desarrollo de resistencia a los diferentes ixodicidas (Fragoso y col 1999, Rodríguez-Vivas y col 2006a,b), lo que ha propiciado la búsqueda de métodos alternativos de control de esta plaga en la industria bovina, tales como la selección de razas resistentes, control biológico (hongos entomopatógenos, depredadores y plantas), uso de vacunas (Jongejan y Uilenberg 1994, De la Fuente y col 1999, Kaaya y Hassan 2000, Willadsen 2001, Tedonkeng y col 2005) y el uso de lactonas macrocíclicas (LM) (Lanusse y col 1997). Las LM son endectocidas eficientes en el control de endo y ectoparásitos (Lanusse y col 1997). Las avermectinas (ejemplos: ivermectina, IVM; doramectina, DRM; eprinomectina, EPM; abamectina, ABM) y milbe-micinas (ejemplo: moxidectina, MXD) son activas para el control de nematodos y artrópodos a dosis bajas en la mayoría de los animales domésticos (Sumano y Ocampo 2006). Se absorben por todas las vías debido a su alta liposolubilidad y se distribuyen ampliamente en los teji-dos, tales como la luz intestinal, grasa y piel (Entrocasso y col 1996, Sumano y Ocampo 2006). Las LM producen su efecto antiparasitario al incrementar la permeabilidad de la membrana celular por los iones de cloro (Cl-), con la consecuente hiperpolarización y parálisis de la musculatura faríngea y somática de los parásitos (Mudd y Parker 1995, Lifschitz y col 2002). El objetivo de la presente revisión

116

RI RODRÍGUEZ-VIVAS Y COL

es presentar información relevante de libros, tesis, con-gresos, seminarios y revistas con comité editorial sobre el uso de las principales LM (IVM, DRM, MXD, EPM, ABM) para el control de la garrapata R. (B.) microplus en el ganado bovino.

LACTONAS MACROCÍCLICAS

FAMILIAS Y MECANISMOS DE ACCIóN

Las LM pertenecen a dos grandes familias según sea el actinomiceto de cuya fermentación provienen: avermectinas y milbemicinas (figura 1).

La compleja estructura química de estos fármacos corresponde a una lactona macrocíclica de 16 miembros similar a la de los antibióticos macrólidos (pero sin efecto bacteriano), unida a un grupo benzofurano (C2 a C8) y a un anillo espiroquetal (C17 a C25). Son moléculas de gran tamaño con peso molecular entre 600 kDa (milbemicinas) y 800 kDa (avermectinas) (Lifschitz y col 2002).

Las LM comparten algunas propiedades fisicoquímicas generales; pequeñas diferencias en la estructura química entre avermectinas y milbemicinas o aun dentro de las avermectinas determinan cambios en el comportamiento farmacocinético, lo cual repercute sobre la eficacia y la persistencia antiparasitaria de las mismas (Lifschitz y col 2002). En parásitos susceptibles, la IVM se une a un receptor de alta afinidad, lo que provoca un incremento en la permeabilidad de los iones Cl-, con el consiguiente desprendimiento del parásito por una parálisis flácida.

La identificación del receptor específico al cual se unen las LM ha sido objeto de controversia. Los primeros estudios describieron que la IVM producía una liberación de ácido gama-aminobutírico (GABA) desde los sinaptosomas del

cerebro de rata, así como una modulación de los receptores gabérgicos que aumentaba la afinidad por el neurotrans-misor. Por otro lado, dependiendo de las concentraciones de IVM a las que se exponen los parásitos, la entrada de Cl- podría o no estar mediada por un mecanismo gabérgico. Los datos actuales sugieren que la acción parasiticida de la avermectinas y milbemicinas viene dada por la interacción de las mismas con los canales de Cl- ligados a un receptor de glutamato en el parásito diana, lo cual daría lugar al fenómeno de hiperpolarización descrito (Mudd y Parker 1995, Lifschitz y col 2002).

Utilizando el nematodo de vida libre Canorhabditis elegans como modelo, se han podido caracterizar las subunidades de este receptor, observándose que a bajas concentraciones, las avermectinas potencian la acción del glutamato y a elevadas concentraciones producen direc-tamente la apertura del canal de Cl-. Este receptor se ha localizado en la faringe de C. elegans y Ascaris suum y la estimulación del mismo inhibe la musculatura faríngea necesaria para la alimentación del parásito (Lifschitz y col 2002).

La información disponible hasta el momento sugiere que las milbemicinas comparten mecanismo de acción con las avermectinas, aunque no se descarta que existan diferencias farmacodinámicas muy sutiles entre ambos grupos (Lifschitz y col 2002).

La falta de actividad de las avermectinas y milbemi-cinas sobre trematodos y cestodos se debe a la ausencia, o al menos a una menor trascendencia, de la transmisión mediada por ese tipo de canales de Cl- en la coordinación neuromuscular de estos parásitos en comparación con nematodos o artrópodos (Sumano y Ocampo 2006).

IVERMECTINA

Descripción. La IVM es el resultado de la fermentación bacteriana del Streptomyces avermitilis, obtenido por pri-mera vez en el año 1979. Es un fármaco muy liposoluble y poco hidrosoluble, por lo que se puede aplicar por todas las vías, siendo las más recomendadas la SC, intramuscular (IM) y tópica (“pour-on”) (Lifschitz y col 2002).

Composición química. Es un análogo semisintético de la abamectina, conteniendo un 80% de 22,23-dihidroavermecti-na B1a y no más de un 20% de 22,23, dihidroavermectina B1b (Lifschitz y col 2002).

Farmacocinética. La IVM es la LM de mayor difusión y utilización en las diferentes especies de animales en todo el mundo; por lo tanto, es la molécula que más se ha estudiado con respecto a sus características farmacodiná-micas y farmacocinéticas. Las propiedades fisicoquímicas de la IVM incluyen un alto peso molecular y una elevada lipofilicidad, las que le confieren características farmaco-cinéticas de un alto volumen de distribución, con una gran afinidad por la grasa corporal y prolongada persistencia de

AbamectinaIvermectinaDoramectinaEprinomectinaSelamectina

Avermectinas

Streptomycesavermitilis

Streptomycescyaneogriseus

Milbemicina

NemadectinaMoxidectinaMilbemicina B41 DStreptomyceshygroscopicusMilbemicina 5-Oxima

Figura 1. Origen y clasificación de las lactonas macrocíclicas: avermectinas y milbemicinas (Tomado de Lifschitz y col 2002). Origen and classification of macrocyclic lactones: avermectins and milbemycins (From Lifschitz et al 2002).

117

RHIPICEPHALUS (BooPHILUS) MICRoPLUS, LACTONAS MACROCÍCLICAS, CONTROL, BOVINOS

sus concentraciones en el organismo (Sumano y Ocampo 2006).

El tiempo de liberación de la IVM es de sólo siete días después del tratamiento SC en bovinos. En un estudio se encontró que la IVM-3,15% (0,63 mg/kg pv) inoculada a bovinos permanece en concentraciones plasmáticas > 2 ng/ml-1 a los 50 días PT (Lifschitz y col 2007). Los parámetros farmacocinéticos promedios de la IVM obtenidos en plasma después de ser administrados por vía SC a razón de 0,2 mg/kg pv en bovinos se presentan en el cuadro 1.

Presentación y dosificación. Las presentaciones comerciales que tiene la IVM son en solución oral, tópica e inyectable en el ganado bovino. La solución oral e inyectable son formulaciones acuosas, que contienen propilenglicol y solubilizantes, mientras que la tópica tiene únicamente el vehículo (McKellar y Benchaoui 1996). La dosis para la vía oral e inyectable es de 0,2 mg/kg pv. Sin embargo, actualmente se dispone de IVM de larga acción al 3,15%, que se aplica vía SC a dosis de 0,63 mg/kg pv (Bridi y col 2001).

Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. El uso de IVM en el ganado bovino es seguro. Dosis de 4 mg/kg pv producen ataxia que se atribuyen a acciones sobre el sistema nervioso central. En general y con alguna variación según los diferentes países, la carne de animales tratados no debe destinarse al consumo humano durante períodos de 35-45 días (Lifschitz y col 2002).

Seguridad ambiental. Las elevadas concentraciones de IVM que se eliminan por las heces mantienen su actividad biológica y ejercen su poder insecticida sobre un gran número de especies de dípteros y coleópteros que colonizan la materia fecal de los bovinos. Nichols y col (2008) men-cionan que la IVM produce la muerte de varias especies de escarabajos coprófagos (paracópridos, telecópridos, endocópridos) que utilizan las heces de los bovinos para su anidación, reproducción y alimentación. La principal función de estos coleópteros radica en la incorporación de las heces al suelo al brindar servicios ecológicos de gran valor en los ecosistemas de pastizales, ya que la produc-ción forrajera depende estrechamente del reciclaje de la materia orgánica producida y de la cantidad de elementos minerales disponibles (Suárez y col 2009).

La IVM se encuentra fuertemente unida a las partículas de heces bovinas, y sólo en una mínima proporción es arras-trada por el agua. La IVM tiene una vida media variable en mezclas de materia fecal y suelo, que va desde los 14 días en los meses de verano hasta los 240 días a 22 ºC en condiciones de laboratorio (Lifschitz y col 2002). Wardhaugh y Mahon (1998) reportan que los residuos de IVM en heces de bovinos tratados previnieron el desarrollo de Musca vettustissima, Musca domestica y Haematobia irritans durante 35 días en el ambiente. Asimismo, Guglielmone y col (1998) reportaron una eficacia de la IVM contra fases adultas de H. irritans en aproximadamente dos semanas.

DORAMECTINA

Descripción. La DRM se obtiene de Streptomyces avermitilis y es una avermectina de estructura y espectro similares a la IVM; sin embargo, tiene algunas diferencias que le confieren disponibilidad plasmática por un período más prolongado que la IVM (Sumano y Ocampo 2006).

Composición química. Es una avermectina de estructura y espectro similares a la ivermectina. Su nombre químico es 25-ciclohexil-5-O-demetil-25-(1-metilpropil)-avermectina A1a (Lifschitz y col 2002).

Farmacocinética. La DRM cuando se administra por vía SC tiene buena disponibilidad y eficacia contra nematodos y ectoparásitos. Se concentra más que otras ivermectinas en la luz intestinal. Al administrar en bovinos una dosis de 0,2 mg/kg pv por vía IM, se logra una concentración de 33,1 ng/ml, y por vía SC se logran concentraciones varia-bles que van de 27,8 a 37,5 ng/ml (Lanusse y col 1997). Cuando se administra por vía IM se requiere un tiempo de cuatro días para alcanzar las concentraciones plasmáticas máximas y de seis días cuando se administra por vía SC (Lanusse y col 1997). La mayor parte del fármaco admi-nistrado por vía IM o SC no se metaboliza, y de tres a 21 días después de la administración se encuentra DRM sin cambios en un 58-70% como residuo en tejidos, con 91% en grasa. Después de 14 días de su administración

Cuadro 1. Valores farmacocinéticos promedios obtenidos para la IVM, DRM y MXD en plasma después de ser administradas por vía SC a razón de 0,2 mg/kg pv en bovinos (Tomado de Lanusse y col 1997). Mean pharmacokinetic values in plasma of IVM, DRM and MXD after a SC injection at 0.2 mg/kg in bovines (From Lanusse et al. 1997).

Parámetros cinéticos Ivermectina Doramectina Moxidectina

T_ab (días) 39,20 56,40 1,32

Cmax (ng/mL) 42,80 37,50 39,40

Tmax (días) 4,00 6,00 0,32

ABCtotal (ng.d/mL) 459,00 627,00 217,00

TMR (días) 7,35 9,09 14,60

Vdss/F (L/kg) 3,35 2,92 13,60

ClB/F (mL/d/kg 457,00 322,00 938,00

T_ab: Tiempo medio de absorción; Cmax: Máxima concentración plasmática; Tmax: Tiempo en que se alcanza la Cmax: ABCtotal: área bajo la curva de concentración frente a tiempo extrapolada al infinito; TMR: Tiempo medio de residencia; Vdss/F: Volumen de distribución en el estado estacionario; ClB/F: Aclaramiento corporal total. Vdss y Cl representan sus verdaderos valores en relación a la fracción absorbida del fármaco.

118


por vía SC se encuentra 87% en heces y sólo 1% en orina (Lifschitz y col 2007). Los parámetros farmacocinéticos promedios de la DRM obtenidos en plasma después de ser administrados por vía SC a razón de 0,2 mg/kg pv en bovinos se presentan en el cuadro 1.

Presentación y dosificación. Las presentaciones comercia-les que tiene la DRM en el ganado bovino son tópicas e inyectables. La dosis para la vía inyectable es de 0,2 mg/kg pv (Lifschitz y col 2002).

Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. El uso de DRM en el ganado bovino es seguro. La DRM se tolera razonablemente; una dosis por vía SC a razón de 0,6 mg/kg pv aplicada entre los días 12 y 55 de gestación no provoca efectos adversos en desarrollo embrionario, mantenimiento de la gestación, parto o supervivencia del producto, y en los machos no afecta la calidad del semen. Al igual que la IVM-1%, la carne de animales tratados no debe destinarse al consumo humano durante períodos de 35-45 días (Lifschitz y col 2002).

Seguridad ambiental. En un estudio realizado por Suárez y col (2009) se aplicaron MXD (SC, “pour-on”) y DRM (SC) a bovinos y se evaluó el efecto de la excreción de los fármacos en heces sobre la sobrevivencia de artrópodos benéficos. En este estudio se concluyó que la DRM tiene mayor efecto adverso sobre artrópodos que la MXD. Asimismo, Anziani y col (2001) evaluaron la actividad de la DRM en bovinos tratados contra nes de campo de H. irritans y observaron que en las heces no emergían adultos durante 35 días después del tratamiento.

MOXIDECTINA

Descripción. La MXD es una LM sintetizada en 1990 en Japón, es muy activa contra nematodos y artrópodos a dosis bajas en la mayoría de los animales domésticos (Sumano y Ocampo 2006). Es un fármaco que puede usarse con 4 a 5 veces la dosis terapéutica en ovinos sin observarse reacciones negativas. En bovinos no se han observado reacciones negativas incluso con dosis 10 veces mayores a las recomendadas (Sumano y Ocampo 2006). Las dosis terapéuticas usadas son 0,2 a 1,0 mg/kg pv con resultados satisfactorios. Su espectro abarca fases adultas e inmaduras, asimismo reduce la capacidad reproductiva de las garrapatas (Caracostantogolo y col 1993, Sibson 1994).

Composición química. El nombre químico es [6R,23E,25S(E) 5-0-desmetil-28-dioxi-25-(1-butenil)-6,28 epoxi-23-(metoximino) milbemicina B; cuenta con un peso molecular de 639,8 kDa y su fórmula condensada es C37 H53 NO8. Es un derivado semisintético de la nemadectina, que es un anillo lactona macrocíclico producido por fermentación de Streptomyces cyanogriseus. La estructura química se relaciona con las milbemicinas y avermectinas, con las que comparte

además de la similitud de su molécula el tipo de absorción y la farmacocinética (Sumano y Ocampo 2006).

Farmacocinética. El fármaco se absorbe por todas las vías debido a que es muy liposoluble; se considera más lipofílica e hidrofóbica que la IVM, se distribuye ampliamente en los tejidos, pero por su ciclo enterohepático se acumula sobre todo en la luz intestinal, grasa y piel, lo que permite su uso como ixodicida con buenos resultados. La vida media en bovinos es de 9 a 11 días en promedio, con un efecto residual de tres meses, lo cual permite programar con mayor intervalo el calendario de desparasitación (Entrocasso y col 1996).

Lifschitz y col (1999) utilizando MXD-1% a dosis de 0,2 mg/kg pv encontraron que la concentración máxima de MXD en plasma se alcanzó al día 1 PT (84,2 ng/ ml-1) y durante los primeros ocho días PT la concentración de la droga en plasma fue de 9 ng/g-1. La concentración de la MXD en la piel declinó gradualmente con el paso del tiempo, aunque en otros tejidos fue detectada hasta por 58 días (> 0,2 ng/ ml-1). Estas concentraciones altas de MXD y su presencia prolongada en la piel la hacen ser una droga eficaz contra diferentes ectoparásitos en rumiantes.

En un estudio realizado en Francia por Dupuy y col (2007) utilizando MXD-10% a dosis de 1 mg/kg pv en bovinos se detectó por primera vez MXD en plasma una hora PT (2,00 ± 1,52 ng/ml-1) y dos días PT en pelo a concentración de (446,4 ± 193,26 ng/g-1). El tiempo en que se encontraron concentraciones en plasma y pelo por encima de 2 ng/ml-1 o 2 ng/g-1 fue de 120 y 100 días, respectivamente. Los parámetros farmacocinéticos promedios de la MXD obtenidos en plasma después de ser administrados por vía SC a razón de 0,2 mg/kg pv en bovinos se presentan en el cuadro 1.

Presentación y dosificación. Las presentaciones comerciales que tiene la MXD son en solución oral, inyectable y epi-cutánea. La solución oral e inyectable son formulaciones acuosas, que contienen propilenglicol y solubilizantes; mientras que la forma epicutánea tiene únicamente un vehículo (Aguilar-Tipacamú y Rodríguez-Vivas 2002). La dosis para la vía oral e inyectable es de 0,2 mg/kg pv y la presentación tópica es utilizada a dosis de 0,5 mg/pv (Geurden y col 2004). Sin embargo, actualmente se dispone de una MXD de larga acción al 10%, que se aplica vía SC dosis de 1 mg/kg pv.

Seguridad y tiempo de retiro. No ocurre muerte de bovinos cuando son inyectados por vía SC hasta 10 veces la dosis recomendada (2,0 mg/kg pv). Cuando fue aplicada tres veces la dosis recomendada (0,6 mg/kg pv), no se observaron efectos sobre la reproducción de toros, vacas gestantes y vaquillas cuando fue inyectada en cada trimestre de la gestación (Rae y col 1994). Cuando la MXD se administra por vía SC, es posible detectar el fármaco y siete de sus metabolitos en diferentes tejidos, heces y bilis. Si se maneja

119


un tiempo de retiro de 30 días se pueden encontrar hasta 2 ppb en algunos tejidos (Sumano y Ocampo 2006).

Seguridad ambiental. El estiércol de animales tratados con MXD produce menor efecto adverso que la DRM e IVM en contra de artrópodos benéficos que se encuen-tran en las heces de bovinos tales como los escarabajos coprófagos (ejemplo: Sulcophanaeus, Digitonthophagus o Canthidium) (Suárez y col 2009). Aunque los residuos en heces de bovinos tratados con MXD inyectable no tuvieron efectos significativos sobre larvas de M. vettustissima y M. domestica (Wardhaugh y col 1996), otros experimen-tos muestran que la MXD en las heces de bovinos tiene actividad contra las fases inmaduras de H. irritans (Suárez y col 2009).

EPRINOMECTINA

Descripción. La EPM es una molécula que se obtiene a partir de la fermentación del Streptomyces avermitilis (Blagburn y Lindsay 2001). La sustitución de un grupo epi-acetilamino en la posición 4” es la diferencia con las otras avermectinas B1 (Lifschitz y col 2002).

Composición química. Es un miembro del grupo de las avermectinas biosintéticas. También se le conoce como MK-397. Es un sólido cristalino cuyo nombre químico es (4”R)-4” -epi-(acetilamino)-4”-desoxiavermectina B1 (Blagburn y Lindsay 2001, Sumano y Ocampo 2006).

Farmacocinética. La EPM ha sido desarrollada para su ad-ministración en forma epicutánea, conservando su actividad contra endo y ectoparásitos. Debido a que son compuestos muy liposolubles su distribución es muy buena, presentando un elevado porcentaje de unión a proteínas plasmáticas, con-centrándose principalmente en grasa e hígado. Su absorción, una vez colocada sobre el animal, comienza inmediatamente y se mantiene en un buen nivel hasta 10 días después de la administración. Es muy poco metabolizada y como las otras avermectinas se elimina en forma activa por heces. Lo más interesante de este nuevo compuesto es que su uso en vacas lecheras no requiere tiempo de retiro en leche (Dupuy y col 2001). Esto se debe a una combinación de factores: por un lado, la EPM presenta un perfil residual bajo, por otro, su límite máximo de residuos es más elevado que las otras avermectinas. Su metabolización se lleva a cabo en el hígado y se elimina principalmente en heces; menos del 1% se elimina en la orina (Sumano y Ocampo 2006).

Presentación y dosificación. La presentación comercial que tiene la EPM es epicutánea en el ganado bovino. La dosis por la vía tópica es de 0,5 mg/kg pv (Lifschitz y col 2002, Sumano y Ocampo 2006).

Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. Estudios realizados en bovinos y cerdos, incluyendo hembras en

diversos estados de gestación y machos reproductores, han demostrado un amplio margen de seguridad cuando es administrado a la dosis recomendada (Lifschitz y col 2002). No debe administrarse por vía oral o intravenosa. Los bovinos toleran por vía percutánea dosis hasta tres veces mayores que la indicada. Una de las ventajas que tiene la EPM comparada con otras LM es que al aplicarla (0,5 mg/kg pv) en vacas lactantes los residuos de la droga en la leche son bajos, por lo que se puede usar para el consumo humano (Alvinerie y col 1999, Blagburn y Lindsay 2001, Lifschitz y col 2002). Sin embargo, en Nueva Zelanda se recomiendan hasta 14 días de retiro con las mismas indi-caciones de aplicación (Sumano y Ocampo 2006).

Seguridad ambiental. Las avermectinas incluyendo la EPM tienen una semivida variable en mezclas de materia fecal y suelo, que va desde los 14 días en los meses de verano hasta los 240 días a 22 ºC en condiciones de laboratorio (Lifschitz y col 2002). En la actualidad no existen estudios del efecto de la EPM sobre poblaciones de artrópodos a nivel de campo.

ABAMECTINA

Descripción. También se le denomina avermectina B1 (Mrozik 1994). Se encuentra en forma de cristales blanco-amarillentos y es inodora. Es un producto natural que se obtiene también de la fermentación de Streptomyces aver-mitilis, del cual se forman dos homólogos, la avermectina B1 y la B2, que se diferencian por un grupo metilo. El compuesto es similar a la ivermectina, de la que solamente difiere por la presencia de una doble ligadura en los carbonos 22 y 23 (Mrozik 1994, Lifschitz y col 2002).

Composición química. Su nombre químico es 5-O-dimetilavermectina A1a y 5-O-dimetil-25-des (1-metilpropil)-25-(1-metiletil) avermectina A1a (4:1); avermectina B1 a/b. Su fórmula molecular es C48H72O14; C47H70O14 (Sumano y Ocampo 2006).

Farmacocinética. Los procesos de absorción están rela-cionados con la vía de administración del fármaco. Su distribución es muy amplia; se acumula principalmente en hígado y tejido adiposo, pero llega con facilidad a la piel. Los procesos de metabolismo se sujetan a la hidroxilación del producto, y la excreción se realiza principalmente por las heces, la orina y una mínima proporción en leche. Es importante señalar que si se acelera el tránsito intestinal, ésta y otras avermectinas serán menos biodisponibles (Sumano y Ocampo 2006).

Presentación y dosificación. En todos los casos se administra una sola dosis y se pueden utilizar, según la presentación, las vías oral, tópica y SC (Mrozik 1994, Lifschitz y col 2002); en esta última se informa ligera inflamación a los 10 días. La ABM se ha utilizado con bastante éxito en el control de

120


las parasitosis con nematodos gastrointestinales del ganado en dosis de 0,2 mg/kg pv por vía subcutánea (Sumano y Ocampo 2006).

Seguridad y tiempo de retiro en bovinos. No se recomienda administrarla en bovinos menores de cuatro meses de edad. La aplicación parenteral ha causado lesiones sépticas por Clostridium sp y miositis, incluso fatales. Los ensayos en animales de laboratorio muestran que la abamectina B1a no se absorbe por vía oral en mamíferos y se elimina por completo en las heces en dos días. Para bovinos el tiempo de retiro es de 30-45 días, dependiendo de la presentación farmacéutica que se haya aplicado, en cambio para ovinos es de 14 a 21 días (Sumano y Ocampo 2006). Palma y col (2006) realizaron un estudio para determinar los ni-veles de residuos de ABM y triclobendazol (TCBZ) en tejidos comestibles de bovinos tratados con la formulación comercial que contiene la asociación de ambos fármacos para administración vía oral en bovinos. Se utilizaron 16 bovinos con un peso promedio de 232 ± 37,5 kg, los cuales fueron tratados con la asociación ABM-TCBZ a una dosis de 0,2 mg de ABM/kg pv y 10 kg de TCBZ/kg pv. Los animales fueron sacrificados en grupos de tres a cuatro animales por semana desde el día siete hasta el día 42 posterior al tratamiento. No se registraron concentraciones detectables de ABM en grasa, riñón y músculo a los 14, 28 y 42 días postratamiento. Las mayores concentraciones residuales de ABM fueron observadas en las muestras de hígado (4,02 ng/g), las que persisten por un período de 14 días. Estos hallazgos se pueden atribuir a la alta lipofilicidad de ABM que le confiere mayor afinidad por el tejido hepático.

Seguridad ambiental. La ABM se degrada rápidamente en la superficie del suelo, donde sufre fotodegradación, y se han informado vidas medias desde 8 h hasta un día. Cuando se aplica en la superficie del suelo y no se protege del sol, la vida media en el suelo es de aproximadamente una semana. Bajo la oscuridad y en condiciones aeróbi-cas, ese valor es de dos semanas a dos meses. La ABM se degrada rápidamente en el agua. Su vida media en agua superficial estancada es de cuatro días, y en sedimento estancado, de dos a cuatro semanas. La ABM sufre una rápida fotodegradación y tiene vida media en el agua de 12 h. Las plantas no absorben la ABM a partir del suelo. El fármaco se degrada rápidamente cuando está presente en forma de una capa delgada (superficie de las hojas); en un laboratorio bajo estas condiciones y en presencia de luz, su vida media fue de 4 a 6 h (Sumano y Ocampo 2006).

La ABM es atóxica para las aves, la DL50 en codorni-ces es > 2000mg/kg. En organismos acuáticos la ABM es altamente tóxica para los peces y extremadamente tóxica para invertebrados acuáticos. Aunque la ABM es altamente tóxica para los organismos acuáticos, las concentraciones encontradas en aguas superficiales adyacentes a áreas tratadas suelen ser bajas (Sumano y Ocampo 2006).

EFICACIA DE LAS LACTONAS MACROCÍCLICAS PARA EL CONTROL DE GARRAPATAS EN BOVINOS

En el cuadro 2 se presentan las eficacias, vías de aplicación y persistencia de IVM, DRM, MXD, EPM y ABM a diferentes dosificaciones contra la garrapata R. (B.) microplus.

Por un lado, en otros estudios se compararon IVM contra MXD (0,2 mg/kg pv) por vía SC, obteniendo una eficacia del 99% la IVM y del 99,1% la MXD sobre la reducción de hembras que alcanzaron la repleción; y sobre la reducción de la oviposición de hembras adultas que alcanzaron la repleción. Por otra parte, también se evaluó la eficacia de ambas LM contra larvas de R. (B.) micro-plus en bovinos infestados en condiciones controladas a las semanas uno y cuatro PT, reportándose eficacias para IVM del 82,4% (1 sem) a 0,0% (4 sem) y para MXD del 92,4% (1 sem) a 19,5% (4 sem) (McKellar y Benchaoui 1996, Davey y col 2005).

Bridi y col (1992) evaluaron la eficacia de la ABM para el control de R. (B.) microplus en bovinos usando 0,1, 0,2 y 0,3 mg/kg pv vía subcutánea y encontraron una reducción en el índice de reproducción de las garrapatas de 90, 94 y 96% respectivamente, no observándose diferencia significativa en las distintas dosis evaluadas.

RESISTENCIA DE RHIPICEPHALUS (BooPHILUS) MICRoPLUS A LAS LACTONAS MACROCÍCLICAS

La alta liposolubilidad de las LM le confiere características farmacocinéticas de alto volumen de distribución, con una gran afinidad por la grasa corporal. Debido a estas caracte-rísticas y a la disponibilidad en el mercado de LM de larga acción (IVM-3,15%, IVM-4%, MXD-10%), estos fármacos al ser aplicados a los bovinos persisten en sangre, grasa y piel por períodos prolongados, exponiendo a las garrapatas a concentraciones letales o subletales que pudieran generar en el futuro poblaciones de garrapatas resistentes.

La resistencia a LM ha sido mundialmente descrita en algunas especies de nematodos. Casos de nematodos gastrointestinales resistentes a la IVM han sido reportados en Argentina, Brasil, Venezuela, Estados Unidos, Nigeria, India, Bangladesh, Australia y Nueva Zelanda (Fashanu y Fagbemi 2003, Soutello y col 2007). Sin embargo, sólo se han reportado garrapatas R. (B.) microplus resistentes a la IVM en la ganadería bovina de Brasil (Martins y Furlong 2001, Klafke y col 2006). Debido al uso cada vez más frecuente de las LM en los ranchos bovinos para el control de endo- y ectoparásitos en México (Soberanes 2007) y algunos reportes de ganaderos sobre la baja eficacia de las LM cuando son aplicadas, es necesario realizar monitoreos constantes de la susceptibilidad de R. (B.) microplus a las LM para poder detectar tempranamente casos de resistencia que permitan establecer oportunamente las medidas de control pertinentes.

121


CONCLUSIONES

Se concluye que las LM por su alta liposolubilidad se distribuyen ampliamente en los tejidos, siendo eficaces para el control de R. (B.) microplus en el ganado bovino. La eficacia de la IVM, DRM, MXD, EPM y ABM de corta acción es similar (> 90% de eficacia a las cuatro semanas PT) para el control de fases adultas de R. (B.) microplus; sin embargo, existen en el mercado LM de larga acción que presentan eficacia > 95% con persistencia hasta 70 días PT. Los resultados de las investigaciones demuestran que las LM son una buena alternativa de control de garrapatas en el ganado bovino. Debido a la elevada persistencia de las LM (en especial las de larga acción) en los tejidos de bovinos tratados y al contacto constante de las garrapatas a estos fármacos podrían en el futuro promover la generación de poblaciones de garrapatas resistentes. Por tal motivo, el monitoreo constante de la susceptibilidad de R. (B.) microplus a las LM se hace necesario con la intención de detectar casos tempranos de resistencia y establecer los programas de control pertinentes.

RESUMEN

En esta revisión se describe en detalle la composición química, farmacocinética, presentación y dosis, seguridad y tiempo de retiro y la

seguridad ambiental de los grupos que componen a las LM: avemectinas (ivermectina, doramectina, eprinomectina, abamectina) y milbemicinas (moxidectina). Además se presenta una discusión sobre su eficacia y el problema de resistencia de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a las LM. Se concluye que las LM por su alta liposolubilidad se distribuyen ampliamente en los tejidos, siendo eficaces para el control de R. (B.) microplus en el ganado bovino. La eficacia de la ivermectina, doramectina, eprinomectina, abamectina y moxidectina de corta acción es similar (> 90% de eficacia a las cuatro semanas postratamiento, PT) para el control de fases adultas de R. (B.) microplus; sin embargo, existen en el mercado LM de larga acción que presentan eficacia > 95% con persistencia hasta 70 días PT.

REFERENCIAS

Aguilar-Tipacamu G, RI Rodríguez-Vivas. 2002. Uso de la moxidec-tina para el tratamiento de los parásitos internos y externos de los animales. Rev Bioméd 13, 43-51.

Aguilar-Tipacamu G, RI Rodríguez-Vivas. 2003. Effect of moxidectin against natural infestation of the cattle tick Boophilus microplus (Acarina: Ixodidae) in the Mexican tropics. Vet Parasitol 111, 211-216.

Aguirre DH, AB Gaido, MM Cafrune, ME Castelli, AJ Mangold, AA Guglielmone. 2005. Eprinomectin pour-on for control of Boophilus microplus (Canestrini) ticks (Acari: Ixodidae) on cattle. Vet Parasitol 127, 157-163.

Alvinerie M, JF Sutra, P Galtier, C Mage. 1999. Pharmacokinetics of eprinomectin in plasma and milk following topical administration to lactating dairy cattle. Rev Vet Sci 67, 229-232.

Anziani OS, SG Flores, AA Guglielmone. 2001. Activity of injectable doramectin against Haematobia irritans in cattle. Rev Bras Parasitol Vet 9, 115-118.

Cuadro 2. Eficacia y persistencia de las lactonas macrocíclicas sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Efficacy and persistence of macrocyclic lactones on Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Principio activo Dosis(mg/kg/pv) Vía de aplicación Eficacia (%) Persistencia

(días PT) Autor

Ivermectina 0,5% 0,5 Tópica 85 23 Davey and George 2002

Ivermectina 0,5% 0,20,51,0

TópicaTópicaTópica

508591

353535

Cramer y col 1988

Ivermectina 1% 0,2 Subcutánea 99 28 McKellar y Benchaoui 1996, Davey y col 2005

Ivermectina 1% 0,2 Subcutánea 80 35 Cramer y col 1988

Ivermectina 3,15% 0,63 Subcutánea 87 63 Borges y col 2008

Ivermectina 3,15% 0,63 Subcutánea 95 56 Arieta-Román 2008

Moxidectina 0,5% 0,5 Tópica 79 23 Davey y George 2002

Moxidectina 1% 0,2 Subcutánea 95-99 28 Aguilar-Tipacamu y Rodríguez-Vivas 2003,Remington y col 1997, Coracostantogolo 1993

Moxidectina 10% 1,0 Subcutánea >95 70 CNACSA 2007, Arieta-Román y col 2008

Doramectina 0,5% 0,5 Tópica 89 21 George y Davey 2004

Doramectina 1% 0,2 Subcutánea 94 21 George y Davey 2004

Doramectina 1% 0,2 Subcutánea 91-99 28 Muniz y col 1995

Eprinomectina 0,5% 0,5 Tópica 88 23 Davey y George 2002

Eprinomectina 0,5% 0,51,0

TópicaTópica

9098

3535

Aguirre y col 2005

Ivermectina 2,25%+ Abamectina 1,25%

0,45 + 0,25 Subcutánea 91 63 Borges y col 2008

Abamectina 1% 0,2 Subcutánea 80 21 Pereira 2009

122


Arieta-Román RJ, RI Rodríguez-Vivas, JA Rosado-Aguilar, GT Ramírez-Cruz, G Basto-Estrella. 2008. Moxidectina (10%) e Ivermectina (3,15%): evaluación de su eficacia y persistencia contra infestaciones naturales de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en bovinos del trópico mexicano. VI Seminario Internacional de Parasitología Animal, Boca del Río Veracruz, México.

Blagburn BL, DS Lindsay. 2001. Ectoparasiticides. In: Adams HR (ed). Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 8th ed. Blackwell Publishing, USA, Pp 1017-1039.

Borges FA, HC Silva, C Buzzulini, VE Soares, E Santos, GP Oliveira, AJ Costa. 2008. Endectocide activity of a new long-action formu-lation containing 2.25% ivermectin+1.25% abamectin in cattle. Vet Parasitol 155, 299-307.

Bridi A, L Carvalho, L Cramer, S Gross, J Cruz, N Amaral. 1992. Efficacy of abamectin against the cattle tick Boophilus microplus Acarina, Ixodidae. Rev Brasil Parasitol Vet 1, 35-40.

Bridi A, L Carvalho, L Cramer, R Barrick. 2001. Efficacy of a long formulation of ivermectin against Psoroptes ovis (Hering 1838) on cattle. Vet Parasitol 97, 277-283.

Caracostantogolo J, CS Eddi, GM Bulman, ME Morley, A Noaco. 1993. Moxidectin: efficacy and dose titration in cattle experimentally infected with Boophilus microplus in Argentina. Proc. 14th Ibt. Conference WAAVP, Cambridge, England.

CNSCSA, Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. 2007. Evaluación de establo de la moxidectina al 10% para el control de Boophilus microplus. Prueba de constatación. SAGARPA-SENASICA, Jiutepec, Morelos, México.

Cramer LG, LA Carvalho, AA Brida, NK Amaral, RA Barrik. 1988. Efficacy of topically applied ivermectin agains Boophilus microplus (Canestrini, 1887) in cattle. Vet Parasitol 29, 341-349.

Davey RB, JE George. 2002. Efficacy of macrocyclic lactone endec-tocides against Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) infested cattle using different pour-on application treatment regimes. J Med Entomol 39, 763-769.

Davey RB, JA Miller, JE George, RJ Miller. 2005. Therapeutic and persistent efficacy of a single injection treatment of ivermectin and moxidectin against Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on infested cattle. Exp Appl Acarol 35, 117-129.

De la Fuente J, Rodríguez M, Montero C. 1999. Vaccination against ticks (Boophilus microplus): the experience with the Bm86-based vaccine GavacTM. Cuba. Gen Anal 15, 143-148.

Dupuy J, C Chartier, JF Sutra, M Alvinerie. 2001. Eprinomectin in dairy goats: dose influence on plasma levels and excretion in milk. Parasitol Res 87, 294-298.

Dupuy J, FJ Sutra, M Alvinerie. 2007. Pharmacokinetics assessment of moxidectin long-acting formulation in cattle. Vet Parasitol 147, 252-257.

Entrocasso D, D Parra, D Vottero, M Farías, LF Uribe, WG Ryan. 1996. Comparison of the persistent activity of ivermectin, abamectin, doramectin and moxidectin in cattle. Vet Rec 138, 91-92.

FAO, Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1987. Control de las garrapatas y de las enfermedades que trasmiten. Manual práctico de campo, FAO 1, 5-20.

Fashanu SO, BO Fagbemi. 2003. A preliminary investigation of resist-ance to anthelmintics in strongyles of cattle in Shaki, Nigeria. Afr J Biomed Res 6, 111-112.

Fragoso SH, EM Ortiz, V De Labra, NN Ortiz, M Rodríguez, M Redondo, J De la Fuente, PV Hernández. 1999. Evaluación de la vacuna contra la garrapata Bm86 (Gavac) para el control de Boophilus microplus. En: García VZ, Fragoso SH (eds) IV seminario Internacional de Parasitología control de la resistencia en garrapatas y moscas de importancia veterinaria y enfermedades que trasmiten. Puerto Vallarta, Jalisco, México, Pp 47-50.

George JE, RB Davey. 2004. Therapeutic and persistent efficacy of a single application of doramectin applied either as a pour-on or injec-tion to cattle infested with Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol 41, 402-407.

Geurden T, E Claerebout, E Deroover, J Vercruysse. 2004. Evaluation of the hemoprophylactic efficacy of 10% long acting injectable moxidectin against gastrointestinal nematode infections in calves in Belgium. Vet Parasitol 120, 331-338.

Guglielmone AA, MM Volpogni SG Flores, GM Bulman, OS Anziani, JC Lamberti, OA Mancebo. 1998. Evaluación de una formulación de ivermectina al 1% p/p inyectable para el control de infestaciones naturales de bovinos por Haematobia irritans (Lineo, 1758) (Diptera: Muscidae) en Santa Fe (Argentina). Vet Argent 15, 170-175.

Jongejan E, G Uilenberg. 1994. Ticks and control methods. Sci Technol Integ Epizotiol 13, 1201-1226.

Kaaya GP, S Hassan. 2000. Entomogenous fungi as promising biopes-ticides for tick control. Exp Appl Acarol 24, 913-926.

Klafke GM, G Sabatini, T De Albuquerque, JR Martins, D Kemp, RJ Miller, T Schumaker. 2006. Larval immersion tests with ivermectin populations of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) from State of São Paulo, Brazil. Vet Parasitol 142, 386-390.

Lanusse C, A Lifschitz, G Virkel, L Alvarez, S Sánchez, JF Sutra, P Galtier, M Alvinerie. 1997. Comparative plasma disposition kinetics of ivermectin, moxidectin and doramectin in cattle. J Vet Pharmacol Ther 20, 91-99.

Lifschitz A, G Virkel, P Imperiale, C Galtier, C Lanusse, M Alvinerie. 1999. Moxidectin in cattle: correlation between plasma and target tissues disposition kinetics. J Vet Pharmacol Ther 22, 266-273.

Lifschitz A, G Virkel, F Imperiale, A Pis, C Lanusse. 2002. Fármacos endectocidas: avermectinas y milbemicinas. En: Botana LM, Landoni F, Matín-Jiménez T (eds). Farmacología y Terapéutica Veterinaria. McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, España, Pp 545-558.

Lifschitz A, G Virkel, M Ballent, J Sallovitz, F Imperiale, A Pis, C Lanusse. 2007. Ivermectin (3.15%) long-acting formulations in cattle: absorption pattern and pharmacokinetic considerations. Vet Parasitol 147, 303-310.

Martins J, J Furlong. 2001. Avermectin resistance of the cattle tick Boophilus microplus in Brazil. Vet Rec 149, 64.

McKellar QA, H Benchaoui. 1996. Avermectins and milbemycins. J Vet Pharmacol Therap 19, 331-35.

Mrozik H. 1994. Advances in research and development of avermectins. In: Hedin PA, Menn JJ, Hollingworth RM (eds). ACS Symposium Series No. 551, Natural and Engineered Pest Management Agents, American Chemical Society, Washington DC, USA, Pp 54-73.

Mudd AJ, LD Parker. 1995. Use of the new molecule moxidectin for the control of parasites in sheep. Proceed Sheep Vet Soc 18, 139-143.

Muniz RA, F Hernández, O Lombardero, RC Leite, J Moreno, J Errecalde, LC Gonçalves. 1995. Efficacy of injectable doramectin against natural Boophilus microplus infestations in cattle. Am J Vet Res 56, 460-463.

Nichols E, S Spectora, J Louzadab, T Larsenc, S Amezquitad, ME Favilad. 2008. Ecological functions and ecosystem services provided by Scarabaeinae dung beetles. Biol Conserv 141, 1461-1474.

Palma C, C Godoy, M Arboix, R Pérez. 2006. Determinación de re-siduos de abamectina-triclabendazol en tejidos bovinos. Arch Med Vet 38, 265-271.

Pereira JR. 2009. The efficiency of avermectins (abamectin, doramectin and ivermectin) in the control of Boophilus microplus, in artificially infested bovines kept in field conditions. Vet Parasitol 162, 116-119.

Rae DO, RE Larsen, GT Wang. 1994. Safety assessment of moxidectin 1% injectable on reproductive performance in beef cows. Am J Vet Res 55, 251-253.

Remington B, P Kieran, R Coob, D Bodero. 1997. The application of moxidectin formulations for control of the cattle tick (Boophilus microplus) under Queensland field conditions. Aust Vet J 75, 588-591.

Rodríguez-Vivas RI, AF Quiñones, SH Fragoso. 2005. Epidemiología y control de la garrapata Boophilus en México. En: Rodríguez-Vivas, RI (ed) Enfermedades de importancia económica en producción animal. McGraw-Hill-UADY. México D.F., México, Pp 571-592.

123


Rodríguez-Vivas RI, MA Alonso-Díaz, F Rodríguez-Arévalo, H Fragoso-Sánchez, VM Santamaría, R. Rosario-Cruz. 2006a. Prevalence and potential risk factors for organophosphate and pyrethroid resistance in Boophilus microplus ticks on cattle ranches from the state of Yucatan, Mexico. Vet Parasitol 136, 335-442.

Rodríguez-Vivas RI, F Rodríguez-Arévalo, MA Alonso-Díaz, H Fragoso-Sánchez, VM Santamaría, R Rosario-Cruz. 2006b. Prevalence and potential risk factors for amitraz resistance in Boophilus microplus ticks in cattle farms in the state of Yucatan, Mexico. Prev Vet Med 75, 280-286.

Sibson GJ. 1994. The effects of moxidectin against natural infestation of cattle (Boophilus microplus). Aust Vet J 71, 22-23.

Soberanes CN. 2007. El papel de la industria farmacéutica veterinaria en los programas de control de garrapatas y enfermedades transmitidas por garrapatas. Simposium Internacional: garrapatas, babesiosis y anaplasmosis. Tamaulipas, México, Pp 151-156.

Soutello RGV, MCZ Seno, AFT Amarante. 2007. Anthelmintic resis-tance in cattle nematodes in northwestern São Paulo State, Brazil. Vet Parasitol 148, 360-364.

Suárez VH, AL Lifschitz, JM Sallovitz, CE Lanusse. 2009. Effects of faecal residues of moxidectin and doramectin on the activity of arthropods in cattle dung. Ecotoxicol Environ Safety 72, 1551-1558.

Sumano LH, CL Ocampo. 2006. Farmacología Veterinaria. 3ra ed. MacGraw-Hill Interamericana, México D.F., México, Pp 481-482.

Tedonkeng PE, F Tedonkeng, JR Kana, PV Khan, JB Boukila. 2005. A study of the acaricidal properties of an essential oil extracted from the leaves of Ageratum houstonianum. Cameroon. Vet Parasitol 128, 319-323.

Wardhaugh KG, P Holter, WA Whitby, K Shelley. 1996. Effect of drugs residues in the faeces of cattle treated with injectable formulations of ivermectin and moxidectin on larvae of the fly, Musca vettustissima and the house fly Musca domestica. Aust Vet J 74, 370-374.

Wardhaugh KG, RJ Mahon. 1998. Comparative effects of abamectin and two formulations of ivermectin on the survival of larvae of dung breeding fly. Aust Vet J 76, 270-272.

Willadsen P. 2001. The molecular revolution in the development of vac-cines against ectoparasites. Vet Parasitol 101, 353-367.

125

Arch Med Vet 42, 125-133 (2010)


Rol de la mitocondria y el estrés oxidativo en el bloqueo del desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro

Mitochondrial rol and oxidative stress in the developmental blockade of in vitro produced bovine embryos

AM Tarazonaa*, M Olivera-Angelb, YY Lenisb

aGrupo de Investigación BIOGÉNESIS, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Colombia.

bBIOGÉNESIS, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

SUMMARY

One of the biggest obstacles in the in vitro embryo production for basic research, commercial purposes, or conservation, is the blockade of the early cleavage, which occurs on a species-specific manner in a particular stage of development. To explain this phenomenon some causative factors have been postulated such as: disturbances in chromatin, cytoskeleton rearrangement, oxidative stress and mitochondrial damage. The latter has received considerable attention because mitochondrion is a source of reactive oxygen species (ROS), and oxidative stress is a critical mediator of physiological and pathological states. Over the past years it has been shown that hydrogen peroxide (H2O2) is a pivoting molecule able to trigger cell death by different mechanisms that may or may not involve the transcription factors such as NFκB-p53, and is executed by effector caspases. It is believed that mitochondria may play an important role as a producer or as a target of H2O2, and as a mediator in apoptotic death of embryos. The purpose of this review is to present the state of the art about apoptosis triggered by oxidative stress and mediated by mitochondria in in vitro produced bovine embryos, as part of the explanation for the low efficiency in this process.

Palabras clave: apoptosis, NFκB, potencial transmembranal mitocondrial, p53.

Key words: apoptosis, NFκB, mitochondrial transmembranal potential, p53.

INTRODUCCIóN

Un fenómeno comúnmente observado durante la pro-ducción de embriones in vitro es el bloqueo del desarrollo temprano, el cual ocurre en una etapa concreta del clivaje para cada especie. Se han postulado diferentes hipótesis que explican este fenómeno, las cuales involucran desór-denes en la cromatina, reorganización del citoesqueleto, estrés oxidativo y daños mitocondriales (Meirelles y col 2004).

En la última década se han desarrollado múltiples trabajos en torno al papel de la mitocondria durante el desarrollo temprano, especialmente su relación con la pro-ducción de especies reactivas de oxígeno (EROs) (Brookes 2005). Ya se ha demostrado que la cadena respiratoria de la membrana interna mitocondrial produce peróxido de hidrógeno (H2O2), molécula capaz de desencadenar muerte celular mediada principalmente por NFκB y p53 y ejecutada por caspasas efectoras; esta ruta se ha estudiado en linfocitos como modelo de estrés oxidativo

en enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson (Jiménez Del Río y col 2003) y en embriones bovinos (Vélez y col 2007). Aunque el H2O2 ha sido asociado con el detenimiento del desarrollo embrionario temprano, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales ocurre el detenimiento se desconocen. En este contexto, se sabe que la mitocondria está jugando un papel importante como productora o blanco del H2O2 y como mediadora de la muerte por apoptosis (Vélez y col 2007).

Durante el desarrollo temprano la apoptosis es un mecanismo importante para el mantenimiento de un número adecuado de células funcionales y sanas; sin embargo, existen umbrales mínimos y máximos para la presentación de apoptosis asegurando la homeostasis. Si el índice apoptótico es elevado la presencia masiva de células muertas podría dañar la homeostasis del embrión y consecuentemente detener su desarrollo y morir (Fabian y col 2005b). No obstante, el umbral de apoptosis que es detrimental para el desarrollo temprano aún no se ha establecido en las diferentes especies. Se sabe que los embriones no competentes no culminan el clivaje exi-tosamente y se bloquea su desarrollo entes de alcanzar el estadío de blastocisto, mientras que los competentes regulan la presentación de apoptosis y alcanzan los es-tadíos preimplantatorios.Aceptado: 10.03.2010.

* Calle 59ª#63-20, Medellín, Bloque 50 oficina 316, Colombia; [email protected]

126

AM TARAZONA Y COL

BLOQUEO DEL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO

Los sistemas de producción de embriones in vitro simulan las condiciones del ambiente oviductal y uterino, buscando igualar las tasas de desarrollo embrionario in vivo hasta estadíos preimplantatorios (Meirelles y col 2004). Se calcula que en promedio los laboratorios pierden entre el 60 y el 70% de los oocitos madurados in vitro, debido a que posterior a la fertilización el cigoto es incapaz de sobrellevar el clivaje exitosamente y se bloquea antes de alcanzar el estadío de blastocisto (Lequarre y col 2003). El detenimiento en el desarrollo que comúnmente sufren los embriones producidos in vitro ocurre en un estadío específico según la especie (quinto ciclo celular en conejo, cuarto en gatos, tercero en humanos, segundo en ratón); para el caso de los bovinos el detenimiento ocurre durante el cuarto ciclo celular (Memili y First 2000), es decir, en el paso del embrión de 8 a 16 células, momento que coincide además con la activación completa del genoma embrionario (De Sousa y col 1998).

Se plantea que el bloqueo de los embriones es conse-cuencia de la incapacidad para activar genes importantes para el desarrollo (p53, p21, Bax, Bcl-2) y del estrés pro-ducido por el ambiente alterado al cual están sometidos (temperatura, humedad, pH, gases, etc.) (Greenwood y Gautier 2005). Por otra parte, Meirelles y col (2004) su-gieren que el bloqueo no es un fenómeno pasivo, sino que requiere la participación activa de rutas de señalización que demandan la activación del genoma embrionario. La pregunta central de cuál es la causa del bloqueo se man-tiene sin una respuesta clara y el fenómeno aún no está bien entendido. Sin embargo, cabe cuestionarse si este fenómeno podría estarse presentando bajo las condicio-nes in vitro como un mecanismo biológico para eliminar aquellos embriones que no cumplan con ciertos criterios de calidad embrionaria.

Una hipótesis es que las condiciones in vitro podrían estar afectando la dinámica de distribución y función de las mitocondrias y éstas a su vez desencadenarían apoptosis y generarían el bloqueo de los embriones bovinos (Serrano y Olivera-Angel 2003).

PAPEL DE LA MITOCONDRIA EN EL DESARROLLO TEMPRANO

Las mitocondrias son importantes para el funcionamiento celular porque producen adenosintresfosfato (ATP), regulan el ciclo de Krebs, el metabolismo de ácidos grasos, urea y ciertas hormonas, median procesos de muerte celular, regulan el balance iónico y almacenan cofactores impor-tantes para la homeostasis (Tarazona y col 2006). En los oocitos y los embriones, las mitocondrias son esenciales para la realización de muchas de sus funciones. Acerca del desarrollo temprano el papel de las mitocondrias ma-ternas domina sobre las paternas, ya que las mitocondrias

espermáticas son ubiquitinadas y eliminadas cuando el espermatozoide ingresa al ooplasma (Jansen y col 2004). Se sabe que durante el desarrollo del oocito el número de mitocondrias varía desde unas pocas (aproximadamente 10) en las células germinales premigratorias alcanzando 200 en el estadío de oogonia. Los oocitos primarios con-tienen aproximadamente 6.000 mitocondrias y durante la maduración citoplásmica el número se incrementa hasta más de 100.0000 (Cummins 2004) con una o dos copias de mtADN cada una, con pocas crestas y algunas vacuo-las. Después de la fertilización y durante el desarrollo temprano, las mitocondrias maduran formando nuevas crestas y además pueden aparecer en diferentes estadíos de maduración (Bavister y Squirrell 2000), sugiriendo la existencia de varias poblaciones con distintos niveles de actividad y diferentes fases de maduración (Tarazona y col 2006).

En la actualidad se han descrito algunos patrones de distribución y actividad mitocondrial en diferentes esta-díos del desarrollo embrionario, y se considera que este es un importante parámetro para evaluar la competencia potencial de los oocitos y los embriones. Según Cummins (2004), se deben considerar dos aspectos en la evaluación, mitocondrial: cualitativo y cuantitativo, aspectos que han sido poco estudiados a través del desarrollo temprano de los embriones de diferentes especies como ratón (Van Blerkom y col 2002), hamster (Barnett y col 1996), bovino (Stojkovic y col 2001), primate (Bavister y Squirrell 2000) y humano (Wilding y col 2001). Hasta el momento existe solo un reporte sobre la dinámica mitocondrial completa de la actividad a través de todo el desarrollo temprano desde el oocito hasta el blastocisto en el modelo bovino in vitro (Tarazona y col 2006).

En el trabajo de Tarazona y col (2006) se evaluaron 1.816 embriones bovinos en diferentes estadíos, al igual que oocitos inmaduros y maduros, demostrando que sola-mente unos pocos oocitos inmaduros muestran actividad mitocondrial, debido posiblemente a que la mayoría de mitocondrias están todavía inmaduras (Wilding y col 2001) y la mayor parte de la energía es suplida “pasivamente” por las células de granulosa. También se encontró que des-pués de la maduración in vitro de los oocitos la actividad mitocondrial aumenta y la distribución se torna difusa en el ooplasma. Aparentemente altos niveles de actividad mitocondrial son necesarios para los eventos celulares involucrados en la maduración, los cuales son dependientes de generación de ATP, tal como la maduración nuclear y la competencia meiótica, maduración del citoplasma (Picton y col 1998), rearreglo del citoesqueleto (Wang y Lessman 2002) y la acumulación de ARNms necesarios para el desarrollo temprano antes de la activación completa del genoma embrionario (Trounson y col 2001). La secuen-cia correcta de estos eventos y sus mecanismos no son claros aún, pero esta actividad ha sido también reportada previamente por Bavister y Squirrell (2000). Se sabe que, aunque existen otras vías para la producción de energía, el

127

APOPTOSIS, NFκB, POTENCIAL TRANSMEMBRANAL MITOCONDRIAL, P53

ATP producido por fosforilación oxidativa (OXPHOS) en la mitocondria es esencial para la supervivencia, pero el papel de las mitocondrias y los mecanismos de regulación de la actividad metabólica mitocondrial no son claros aún (Turcotte 2003).

En los embriones la segregación de mitocondrias en todos los estadíos es asimétrica, excepto en el estadío de dos células (Tarazona y col 2006). Se sabe poco de la im-portancia de la distribución subcelular de las mitocondrias, pero la literatura es controversial, ya que se han descrito diferentes patrones: difuso y pericitoplásmico (Tarazona y col 2006); esta descripción es contraria a la descrita por Abe y col (2002) quienes reportaron un patrón de distribución perinuclear en el desarrollo temprano, este último patrón también fue descrito por Tarazona y col (2006) pero sola-mente en los blastocistos expandidos. Probablemente este patrón se asocia con una actividad nuclear aumentada para la producción de ARNs, necesarios en la preparación del citoplasma para la posterior implantación embrionaria en los estadíos subsiguientes. Bowerman (2000) ha sugerido que las blastómeras pueden especializarse o polarizarse precozmente con diferentes demandas energéticas y esto explicaría los diversos patrones de distribución y segre-gación observados, posiblemente relacionados con los ejes de clivaje embrionario y la posterior diferenciación celular (Sardet y col 2004).

Posterior a la eclosión la distribución de las mitocon-drias en las blastómeras del trofoectodermo cambia de perinuclear a pericitoplásmico, mientras que en las células de la masa interna la distribución se mantiene sin cambio (Tarazona y col 2006). Esta diferencia podría ser explicada por el hecho de que las células trofoblásticas comienzan la expresión de proteínas de adhesión y otras moléculas importantes para el reconocimiento materno-embrionario (Lu y col 2002). La reorganización citoplasmática de las blastómeras trofoectodérmicas para el reconocimiento materno-embrionario y la adhesión consume grandes cantidades de ATP y posiblemente esto contribuye a la migración de las mitocondrias cerca de la membrana plas-mática, demandando más energía las células trofoblásticas que las células de la masa interna.

Los patrones de actividad mitocondrial medidos como el potencial de membrana interna están muy relacionados con la producción de EROs. En el estudio de Tarazona y col (2006) se encontró que los embriones hasta las 168 horas postinseminación (hpi) mantienen un nivel medio de actividad mitocondrial. Hasta las 50 hpi la mayoría de los embriones (~92%) tuvieron un nivel intermedio de actividad y solamente unos pocos (~8%) tuvieron muy poca actividad, pero a las 72 y 168 hpi hubo un cambio dramático hacia una mayor proporción de embriones exhibiendo muy bajos niveles de actividad (29% a 72 hpi, y 69%, a 168 hpi). No se encontraron embriones con alto nivel de actividad y una posible explicación ha sido recientemente propuesta, en la cual los oocitos y embriones necesitan un umbral de OXPHOS para sobrevivir y que

este umbral cambia durante el movimiento del embrión hacia el útero, donde la tensión de oxígeno es menor que en el oviducto (Cummins 2004). Además Lane y Gardner (1998) sugirieron que los embriones tempranos dependen del ATP producido por la mitocondria vía lactato piruvato, pero que esta actividad disminuye después de la activación del genoma embrionario (72 hpi); durante este periodo la mayor ruta metabólica usada es la glicólisis anaeróbica (Turcotte 2003), hipótesis sustentada en parte por los hallazgos de Tarazona y col (2006) donde la actividad mitocondrial se mantuvo en un nivel “medio” hasta la activación del genoma embrionario y posteriormente disminuyó. Las mitocondrias no se dividen durante los estadíos tempranos del desarrollo embrionario, pero lo hacen después de la expansión del blastocisto, siendo estas las que proveen la energía necesaria para el clivaje temprano, manteniendo el umbral medio de actividad hasta que nuevas rutas metabólicas comiencen a operar.

Esta actividad intermedia encontrada en los embriones competentes antes de la activación del genoma posiblemente está relacionada con un sistema de protección adaptativa contra las EROs producidas por el metabolismo mitocondrial (Nohl 2005). Estas moléculas son controladas por enzimas como el glutatión o peroxidasas que han sido producidas y almacenadas durante la maduración del oocito o por transcripción permisiva durante los estadíos tempranos (Lonergan y col 2004). Así si la actividad mitocondrial fuera alta en los clivajes tempranos, el embrión moriría a causa de no poder controlar la excesiva producción de EROs.

Por lo tanto, una posible explicación para la no competencia de algunos embriones podría ser que son deficientes en su capacidad para eliminar EROs, porque no hubo acumulación o transcripción permisiva suficiente de barredores. Se evidencia la necesidad de realizar estudios de las relaciones causa-efecto por técnicas no invasivas que permitan seguir una misma muestra a través de todos los estadíos del desarrollo temprano.

Después de la activación del genoma al ingresar al útero, el embrión encuentra una concentración de oxígeno más baja, la ruta de glicólisis anaeróbica es preferida y la producción de EROs es controlada (Thompson y col 2000), lo cual es acorde con los reportes de activi-dad mitocondrial después de las 72 hpi cuando inicia la transcripción (Tarazona y col 2006). Otros autores también han reportado que la glicólisis anaeróbica es la principal ruta usada en el desarrollo del blastocisto (Turcotte 2003).

Estas investigaciones sugieren que durante los estadíos iniciales de desarrollo la competencia de los embriones depende de la producción mitocondrial de ATP como fue descrito por Lane y Gardner (1998), ya que los embriones no competentes tienen baja actividad mitocondrial y su clivaje es bloqueado antes de la activación del genoma. Esto evidencia un importante papel de la energía produ-cida por la mitocondria en el proceso de activación del

128

AM TARAZONA Y COL

genoma. La energía en los estadíos tempranos es produ-cida vía aminoácidos, lactato y piruvato, mientras que el exceso de producción de energía por la ruta glucolítica es nociva en estos estadíos; al parecer se requiere de un umbral mínimo de actividad mitocondrial para suplir las demandas de las blastómeras (Tarazona y col 2006). Esto está aparentemente en desacuerdo con Van Blerkom y col (2000), quienes sugirieron que los embriones no dependen solamente del ATP mitocondrial; sin embargo, estos autores no propusieron otras posibles fuentes de energía y la duda permanece sin esclarecerse.

Los embriones no competentes son incapaces de superar el bloqueo ya sea porque no logran el umbral mínimo de actividad y sus mitocondrias son insuficientes al inicio del desarrollo (Cummins 2001), o porque a pesar de que sus mitocondrias son normales, sus niveles de barredores son insuficientes para eliminar los EROs producidos por la cadena respiratoria.

Ya que la mitocondria está involucrada en la producción de EROs por la cadena respiratoria para la producción de energía, está también asociada con el balance del estado REDOX del citoplasma de las blastómeras embrionarias, pudiendo de esta forma alterar la competencia para el desarrollo temprano. Es posible que la regulación de la distribución y segregación pueda estar involucrada en la complejidad de los ejes de segmentación durante los clivajes tempranos (Sardet y col 2004).

REGULACIóN REDOX Y DESARROLLO TEMPRANO

El uso de oxígeno como sustrato para la producción de energía en los sistemas aeróbicos resulta también en la producción de EROs, particularmente el anión superóxido y el radical hidroxilo. Las EROs son aceptores de electrones altamente activos y son capaces de capturar electrones de otras moléculas transformándolas en radicales libres. El peróxido de hidrógeno (H2O2) no es un radical per se, pero es un producto de una reacción de tipo catálisis por ión metálico del anión superóxido; tanto el H2O2 como el anión superóxido pueden formar el radical hidroxilo, el cual es muy reactivo (Harvey 2002).

Las EROs son producidas principalmente a través de la cadena de transporte de electrones en la membrana interna mitocondrial, pero también son producidas en el citoplasma por la NADPH-oxidasa unida a membrana, por la enzima citocromo p450 y por el sistema xantina-xantina oxidasa (Mostefai y col 2008). Las células poseen diversos meca-nismos para contrarrestar el efecto de las EROs, entre los cuales se encuentran los sistemas de catalasas, peroxidasas y superóxido dismutasas dependientes de Cu, Zn y Mn, algunas de las cuales presentan transcripción permisiva durante el desarrollo temprano previo a la activación del genoma (Harvey 1995).

Se sabe que tanto el estado de oxidorreducción celular como el metabolismo son cambiantes a lo largo

del desarrollo embrionario temprano y es diferente entre las especies. Durante el paso hacia el estadío de blastocisto ocurre un cambio de fosforilación oxidativa a glicólisis anaeróbica como fuente de ATP, indicando que los estadíos preimplantatorios requieren un estado más oxidado que reducido, favoreciendo la adapta-ción al medio uterino, el cual es más hipóxico que el oviductal (Harvey 2002). Las altas tensiones de O2 (aproximadamente 20%) en los cultivos in vitro podrían estar ocasionando una excesiva producción de EROs y la muerte embrionaria temprana. El papel de las EROs durante el desarrollo temprano es controversial, debido a que los resultados han sido diversos cuando se induce la producción de EROs o se aplican antioxidantes en los medios (Thompson y col 1996).

Las mitocondrias generan EROs en la cadena respiratoria pero el mecanismo exacto aún no se ha dilucidado. Una hipótesis sugiere que el primer sitio de producción es el complejo I, que puede generar el radical superóxido vía reducción del oxígeno por el centro hierro-azufre (N2) del complejo y H2O2 de una forma independiente del potencial de membrana. Otro sitio de producción sería el citocromo oxidasa del complejo III, que puede generar radical super-óxido vía ubisemiquinona y H2O2 solamente si el potencial de membrana es alto (Nohl y col 2005). Otra hipótesis es que el flavinmononucleótido (FMN) en el complejo I sería la fuente de H2O2. El sitio exacto de generación de EROs por la mitocondria se mantiene aún sin esclarecer, ya que el superóxido producido por la cadena transportadora de electrones es transformado inmediatamente a H2O2 por la superoxidodismutasa Mn (Mn SOD), este último es el que se mide como indicador de la producción de EROs (Kowaltowski y col 2001). Las EROs cumplen funciones como participar en rutas de señalización, pero también pueden generar estados patológicos o conducir a la muerte celular (Liu y col 2002).

APOPTOSIS DURANTE EL DESARROLLO TEMPRANO

El término apoptosis hace referencia a un proceso de muerte celular programada que se reconoce por una morfología nuclear específica que la diferencia de la ne-crosis (Kerr y col 1972). La apoptosis se caracteriza por: contracción y aumento en la densidad celular, cromatina picnótica y empaquetada en fragmentos distribuidos en la periferia nuclear, el ADN se hidroliza en fragmentos de aproximadamente 185 pb debido al clivaje específico ejecutado entre los nucleosomas y es un proceso bajo control genético (Majno 1995).

La apoptosis en los embriones se ha convertido en una temática importante de investigación, debido a que se ha planteado su posible papel en la respuesta celular al estrés ambiental y las condiciones subóptimas para el desarrollo in vitro (Betts y col 2001). Sin embargo, esta ocurre de forma fisiológica durante el desarrollo temprano

129


(Milligan y Schwartz 1997) y su principal función es la de eliminar las células defectuosas y controlar la pobla-ción celular (Jacobson y col 1997, Fabian y col 2005a). Un conocimiento detallado de las características de la apoptosis durante el desarrollo temprano es necesario para implementar medidas que conduzcan al mejoramiento de la calidad y supervivencia de los embriones producidos in vitro, debido a que el aumento en el índice apoptótico es un indicador de manejo inadecuado de las condiciones in vitro (Rubio y col 2005).

Las posibles causas de apoptosis durante el desarrollo temprano son: anormalidades cromosomales y nuclea-res (Hardy 1999), inapropiado potencial de desarrollo (incompetencia), desbalance hormonal y de factores de crecimiento (Fabian y col 2005a) y exposición a factores nocivos como EROs (Yang y col 1998), irradiación UV (Zhou y Steller 2003) o choque térmico (Paula-Lopesa y Hansen 2002).

El proceso apoptótico puede desencadenarse por dos vías: la extrínseca que involucra receptores de muerte y la intrínseca mediada por la mitocondria. Durante la apoptosis la permeabilidad de la membrana mitocondrial se incrementa, permitiendo la salida del citocromo c para la formación del complejo apoptosoma que conllevan a la cascada de activación de caspasas 3, 9 y efectoras que conducen a la muerte celular (Little y Mirkes 2002). Aparte del papel pivotante de la mitocondria en la ejecución de la apoptosis, las EROs producidas por la cadena respiratoria podrían estar involucradas en la inducción de la misma (Fleury 2002).

MODELO DE APOPTOSIS MEDIADO POR EROs

Debido a que el estrés oxidativo es un factor importante en el bloqueo del desarrollo temprano in vitro y que el pe-róxido es producido endógenamente por los embriones, la ruta apoptótica inducida por H2O2 podría explicar en parte el detenimiento del ciclo celular que sufren los embriones bovinos (Tarazona y col 2006) (figura 1).

Se ha comprobado que el H2O2 media la apoptosis en linfocitos de sangre periférica por un mecanismo que puede estar mediado por factores de transcripción como NFκB, p53 y c-Jun (Jiménez del Río y col 2002). Se sabe que hay una proteína tirosina quinasa SyK que activada por H2O2 es la responsable de la fosforilación que provoca la inhibición de IkBα, a su vez responsable de mantener inactivo a NFκB en el citoplasma (Takada 2003) (figura 1). Sin embargo, este modelo no aplica para los embriones bovinos, donde el H2O2 media apoptosis de forma independiente de estos factores de transcripción (Vélez y col 2007).

Tanto p53 como NFκB son factores de transcripción importantes en la regulación de la apoptosis. Al parecer existe una comodulación entre ambos factores de trans-cripción, pudiendo mutuamente aumentar o disminuir su actividad.

FACTOR DE TRANSCRIPCIóN P53

El factor p53 es una molécula ubicua que participa en diversas funciones celulares como: regulación del ciclo celular, diferenciación, reparación del ADN, envejecimiento, recombinación y apoptosis (Favetta y col 2004). Aunque es un factor de transcripción cuenta con una actividad propia para mediar rutas como la apoptosis intrínseca (Jiménez del Río y Vélez 2002). Se sabe que es capaz de activar o represar por lo menos 100 genes estudiados, sin embargo, los análisis de bioinformática sugieren que la cifra podría superar los 4.000 (Lu 2005). Esto indica la gran importancia de este factor para el mantenimiento de una relación mitosis/apoptosis adecuada.

Para cumplir con sus múltiples funciones el p53 es regulado a nivel de transcripción y traducción, también sufre varias modificaciones postransduccionales como fosforilación, acetilación, metilación y glicosilación. Como mediador de la reparación del ADN el p53 favorece la transcripción de GADD 45, p48, p53R2, APE1 y pol-β, influyendo así en la reparación por excisión de bases (Hofseth 2004).

Como regulador de la muerte celular programada puede participar tanto en la vía apoptótica extrínseca (mediando transcripción de receptores de muerte) como en la vía apoptótica intrínseca (mediando transcripción de factores pro y antiapoptóticos o induciendo directamente la aper-tura del poro de transición mitocondrial) (Vousden 2002) (figura 1). Por ser guardián del ciclo celular se considera fundamental en los procesos de desarrollo temprano. Las mutaciones sobre p53 lo pueden convertir en un oncogen, favoreciendo la replicación celular no controlada (Lu 2005), lo mismo ocurre cuando es bloqueado de forma irreversible (Vélez y col 2007).

FACTOR DE TRANSCRIPCIóN NFκB

El NFκB está presente en estado de reposo en el cito-plasma de todas las células, consiste de una familia de proteínas que contienen el dominio Rel y a su vez están inhibidas por una familia de proteínas que contienen un dominio de anclaje, entre estas últimas se encuentran IκBα, IκBβ, IκBγ y IκBε (Shishodia 2004).

El NFκB se considera un factor de transcripción que puede actuar en dos vías antagónicas, ya que la dirección de sus efectos dependerá del momento en el ciclo celular, el grado del estímulo y el ambiente intra y extracelular (Shishodia 2004). Participa en la regulación del ciclo celular produciendo factores de proliferación como citoquinas y también en la muerte celular produciendo factores tanto proapoptóticos (c-myc, Fas) como antiapoptóticos (IAP, proteínas de la familia Bcl-2) (figura 1).

La expresión de NFκB durante el desarrollo temprano indica que este se requiere para responder a estímulos ambientales o estrés intracelular, se ha sugerido que la

130

AM TARAZONA Y COL

Figura 1. Ruta de señalización de apoptosis mediada por estrés oxidativo y mitocondria. (Adaptado y modificado de Parone y col 2002, Fleury y col 2002, Susin y col 1996). Anti: factores antiapoptóticos; C: citocromo c; EIM: espacio intermembranal; Fe: Hierro; GPO: glutatión peroxidasa oxidado; GR: glutatión reducido; GSH: glutatión; GSSG: glutatión oxidado; H2O2: peróxido de hidrógeno; I, II, III, IV: complejos de la cadena respiratoria; MEM: membrana externa mitocondrial; MIM: membrana interna mitocondrial; NFκB: factor de transcripción nuclear kappa B; P53: factor de transcripción p53; Pro: factores proapoptóticos; SOD: Superoxidodis-mutasa; UQ: ubiquinona. El peróxido producido por la mitocondria puede desencadenar apoptosis por varios mecanismos que pueden involucrar o no la activación de factores de transcripción, capaces de regular la viabilidad celular a través de la expresión de genes tanto pro como antiapoptóticos. Sea cual sea la vía, el citocromo c sale de la membrana externa mitocondrial y forma el complejo apoptosoma junto con la procaspasas-9 y el Apaf-1, finalmente la apoptosis es desencadenada y ejecutada por caspasas efectoras. Apoptosis signaling pathway mediated by oxidative stress and mitochondria. (Adapted from Parone y col 2002, Fleury y col 2002, Susin y col 1996). The peroxide produced by mitochondria can trigger apoptosis by several mechanisms that may or may not involve the activation of transcrip-tion factors, they are able to regulate cell viability through gene expression of both pro, and antiapoptotic. Whatever the way, cytochrome c are released from mitochondrial outer membrane and forms the apoptosome complex with procaspase-9 and Apaf-1, then apoptosis is triggered and executed by effector caspases.

activación de NFκB en el estadío de una célula en los embriones de ratón es necesaria para el progreso en la segmentación y desarrollo de los estadíos subsiguientes. En embriones bovinos el uso de bloqueadores de NFκB demostró que es esencial en la regulación del clivaje (Vélez y col 2007). La relación de NFκB con las EROs es incierta, pero se sabe que el estrés oxidativo es capaz de mediar su activación como factor de transcripción (Jiménez del Río y col 2002).

APOPTOSIS POR H2O2 EN EMBRIONES BOVINOS

Existe asociación entre la acumulación de H2O2 y la presentación de apoptosis en los embriones bovinos. Sin embargo, los embriones no competentes muestran un potencial transmembranal mitocondrial (PTM) muy bajo como para producir el peróxido vía mitocondrial (Vélez y col 2007). Con relación a estos resultados, se han generado dos hipótesis para explicar este fenómeno:

131


1) El H2O2 es producido por el alto potencial mito-condrial (Nohl y col 2005) durante la maduración del oocito, y aquellos embriones que son capaces de barrer el H2O2 progresan en el clivaje sincrónicamente (embriones competentes), aquellos que no son capaces de barrerlo lo acumulan y se bloquean en el cuarto ciclo celular (em-briones no competentes); 2) Los altos índices de H2O2 que presentan los embriones no competentes pueden produ-cirse de una forma independiente del PTM por fallas en la cadena respiratoria (Cadenas y Davies 2000). De esta forma el H2O2 acumulado por los embriones no compe-tentes podría ser una de las causas del bloqueo temprano y de la presentación de apoptosis.

Los embriones no competentes acumulan H2O2 y muestran los más bajos niveles de PTM, además presentan un elevado índice de caspasas activas que conducen a la apoptosis y al bloqueo del desarrollo (Tarazona y col 2006, Vélez y col 2007). Esto sugiere que la apoptosis es me-diada por el H2O2 acumulado y es ejecutada por caspasas. Contrariamente, los embriones competentes no presentan acumulación de H2O2, probablemente porque el H2O2 pro-ducido por los niveles intermedios de PTM es barrido por los limpiadores producidos y de esta forma controlado, y así, se presenta un índice apoptótico que se supone normal para la formación del blastocele y el control de calidad de células defectuosas (Tarazona y col 2006, Vélez y col 2007). Lo anterior demuestra una clara diferencia en la actividad mitocondrial y producción de H2O2 entre los embriones competentes y no competentes (Tarazona y col 2006).

Se ha comprobado que el H2O2 es capaz de inducir la activación de NFκB como factor de transcripción proapoptótico (Takada y col 2003). Sin embargo, para el caso de los embriones bovinos, se ha demostrado que el bloqueo de este factor de trascripción es detrimental para el desarrollo embrionario, lo que sugiere que durante el desarrollo temprano el NFκB tiene otras funciones diferentes al inicio de la muerte celular programada por apoptosis (Vélez y col 2007). Esta hipótesis se sustenta en los hallazgos realizados por Nishikimi y col 1999, quienes reportaron que una de las subunidades del NFκB, el REL A, se expresa en los oocitos y embriones de ratón durante todo el desarrollo temprano, pero su ubicación nuclear solo se demostró en el estadío de cigoto. Las cé-lulas trofoblásticas expresan tanto p52/p100 como RelA (subunidades del NFκB), lo que indica una diferencia de expresión dependiente del estadío de desarrollo y del tipo celular (Torchinsky y Toder 2004).

Los hallazgos de Vélez y col (2007) sugieren un papel más complejo del NFκB durante el desarrollo temprano, ya que al bloquearlo los embriones presentaron una segmen-tación asimétrica que difiere del patrón de segmentación de los mamíferos que es simétrico rotacional, pero que no correspondió con proliferación ni con muerte celular excesivas.

En el caso de p53 que también está involucrado en la mediación de apoptosis por H2O2, cuando este es bloqueado

en los embriones estos comprometen su viabilidad e inician un proceso de división descontrolada (Vélez y col 2007). Aunque uno de los papeles más conocidos de p53 es su función clave dentro de las rutas de respuesta a condiciones de estrés celular, en los embriones bovinos parece no estar involucrado en el proceso de detenimiento del ciclo celular. En la hipótesis planteda por Vélez y col (2007), el H2O2 generaría apoptosis ejecutada por caspasas; sin embargo, cuando se bloqueó la caspasa 3 de forma irreversible se observó una segmentación acelerada de los embriones. Previos estudios han demostrado que la inhibición ge-neralizada de las caspasas es nociva para el desarrollo embrionario temprano y recientemente se ha planteado que las caspasas podrían tener otras funciones diferentes a su bien conocida función como ejecutoras de la muerte celular por apoptosis; sin embargo, aún no es claro cuáles podrían ser esas funciones (Zakeri y col 2005).

CONCLUSIóN

A pesar de que la técnica de producción de embriones bovinos in vitro lleva más de dos décadas, las tasas de producción y la calidad de los embriones aún no son lo suficientemente altas para cubrir las necesidades en los campos de la investigación y la reproducción asistida. El detenimiento del clivaje durante el desarrollo temprano del embrión es la principal causa de esta baja eficiencia. Esta revisión muestra que el estrés oxidativo es uno de los mediadores del bloqueo y que la mitocondria es la organela directamente implicada en este proceso. Un nivel mínimo de actividad mitocondrial podría regular la competencia embrionaria para alcanzar el estadío de blastocisto, lo que evidencia que la mitocondria es la principal organela para la regulación del balance REDOX y por ende fundamen-tal en los procesos fisiológicos que regulan el desarrollo embrionario temprano. Las fallas en la funcionalidad mitocondrial conllevan a que los embriones produzcan y acumulen H2O2 que desencadenaría la muerte celular por apoptosis y los haría no competentes para alcanzar el estadío de blastocisto. Esta apoptosis es ejecutada por caspasas de una forma independiente de NFκB y p53 a diferencia de otros modelos celulares, lo que sugiere que los embriones cuentan con mecanismos de regulación alternativos para la supervivencia o muerte celular. El estrés oxidativo por H2O2 es una de las causas del detenimiento y muerte de los embriones bovinos producidos in vitro. Sin embargo, se evidencian múltiples vacíos en el conocimiento de las rutas celulares y moleculares de regulación del desarrollo embrionario temprano y de muerte o supervivencia, por lo cual se sugiere realizar nuevas investigaciones encaminadas a dilucidar estos vacíos y se permita una mayor comprensión de la complejidad de estos fenómenos biológicos.

A la luz de los resultados mostrados en la literatura, se sugiere evaluar los protocolos de producción de embriones y modificarlos de tal manera que se favorezca la capacidad del embrión para contrarrestar los efectos nocivos del ambiente

132

AM TARAZONA Y COL

oxidante, y les permita lograr la competencia morfológica y funcional necesarias para alcanzar los estadíos preim-plantatorios. Aunque se han realizado estudios enfocados a la resolución de este problema, los resultados son con-troversiales y poco satisfactorios, por lo que se evidencia la necesidad de nuevas investigaciones en esta área.

RESUMEN

Uno de los mayores obstáculos en la producción de embriones in vitro con fines de investigación básica, comerciales, o de conservación, es el detenimiento temprano del clivaje que ocurre de forma específica en una etapa del desarrollo. Para explicar este fenómeno se han postulado diferentes factores causales como: desórdenes en la cromatina, rearreglos del citoesqueleto, estrés oxidativo y daños mitocondriales. Esta última propuesta ha recibido gran atención, debido a que la mitocondria es fuente de especies reactivas de oxígeno (EROs) y el estrés oxidativo es un mediador crítico de procesos fisiológicos y estados patológicos. Durante los últimos años se ha demostrado que el peróxido de hidrógeno (H2O2) es una molécula pivotante capaz de desencadenar muerte celular por diferentes mecanismos que pueden involucrar o no a los factores de transcripción: NFκB - p53, y es ejecutado por caspasas efectoras. Se cree que la mitocondria podría estar jugando un papel importante como productora o como blanco del H2O2, y como mediadora en la muerte por apoptosis de los embriones. El objetivo de esta revisión es mostrar el estado del arte en cuanto a la apoptosis desencadenada por estrés oxidativo y mediada por la mitocondria en los embriones bovinos producidos in vitro, como parte de la explicación del bloqueo del clivaje y la baja eficiencia que aún se tiene en este proceso.

REFERENCIAS

Abe H, S Matsuzaki, H Hoshi. 2002. Ultrastructural differences in bovine morulae classified as high and low qualities by morphological evaluation. Theriogenology 57, 1273-1283.

Barnett DK, J Kimura, BD Bavister. 1996. Translocation of active mitochondria during hamster preimplantation embryo development studied by confocal laser scanning microscopy. Dev Dynam 205, 64-72.

Bavister BD, JM Squirrell. 2000. Mitochondrial distribution and function in oocytes and early embryos. Hum Reprod 15, 189-198.

Betts DH, WA King. 2001. Genetic regulation of embryo death and senescence. Theriogenology 55, 171-191.

Bowerman B. 2000. Embryonic polarity: Protein stability in asimmetric cell division. Curr Biol 10, 637-641.

Brookes P. 2005. Mitochondrial H (+) leak and ROS generation: an odd couple. Free Radic Biol Med 38, 12-23.

Cadenas E, K Davies. 2000. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med 29, 222-230.

Cummins J. 2001. Cytoplasmic inheritance and its implications for animal biotechnology. Theriogenology 55, 1381-1399.

Cummins J. 2004. The role of mitochondria in the establishment of oocyte functional competence. Eur J obstet Gynecol Reprod Biol 115, 23-29.

De Sousa PA, AJ Watson, RM Schultz. 1998. Transient expression of a translation initiation factor is conservatively associated with embryonic gene activation in murine and bovine embryos. Biol Reprod 4, 969-977.

Fabian D, J Koppel, P Maddox-Hyttel. 2005a. Apoptotic processes during mammalian preimplantation development. Theriogenology 64, 221-231.

Fabian D, JO Gjorret, F Berthelot, F Martinat-Botte, P Maddox-Hyttel. 2005b. Ultrastructure and cell death of in vivo derived and vitrified porcine blastocysts. Mol Reprod Dev 70, 155-165.

Favetta L, C Robert, W King, D Betts. 2004. Expression profiles of p53 and p66shc during oxidative stress-induced senescence in fetal bovine fibroblasts. Exp Cell Res 299, 36-48.

Fleury C, B Mignotte, J Vayssiere. 2002. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signalling. Biochimie 84, 131-141.

Gary DS. 2001. In vitro maturation of oocytes. Current Women's Health Reports, 143-151.

Greenwood J, J Gautier. 2005. From oogenesis through gastrulation: developmental regulation of apoptosis. Semin Cell Dev Biol 16, 215-224.

Hardy K. 1999. Apoptosis in the human embryo. Reviews of Reproduction 4, 125-134.

Harvey M, M Arcellana-Panlilio, X Zhang, G Schultz, A Watson. 1995. Expression of genes encoding antioxidants enzymes in preimplantation mouse and cow embryos and primary bovine oviduct cultures employed for embryo coculture. Biol Reprod 53, 532-540.

Harvey A, K Kind, J Thompson. 2002. REDOX regulation of early embryo development. Reproduction 123, 479-486.

Hofseth LJ, SP Hussain, CC Harris. 2004. p53: 25 years after its discovery. Trends Pharmacol Sci 25, 177-181.

Jacobson MD, M Weil, MC Raff. 1997. Programmed cell death in animal development. Cell 88, 347-354.

Jansen R, G Burton. 2004. Mitochondrial dysfunction in reproduction. Mitochondrion 4, 577-600.

Jiménez M, C Vélez. 2002. Monoamine neurotoxins-induced apoptosis in lymphocytes by a common oxidative stress mechanism: involvement of hydrogen peroxide (H2O2), caspase-3, and nuclear factor kappa-B (NFκB), p53, c-Jun transcription factors. Biochemical Pharmacology 63, 667-688.

Kerr J, A Wyllie, A Currie. 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26, 239-257.

Kowaltowski A, R Castilho, A Vercesi. 2001. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress. FEBS letters 495, 12-15.

Lane M, DK Gardner. 1998. Amino acids and vitamins prevent culture-induced metabolic perturbations and associated loss of viability of mouse blastocysts. Human Reprod 13, 991-997.

Lequarre AS, J Marchandise, B Moreau, A Massip, I Donnay. 2003. Cell cycle duration at the time of maternal zygotic transition for in vitro produced bovine embryos: effect of oxygen tension and transcription inhibition. Biol Reprod 69, 1707-1713.

Little SA, PE Mirkes. 2002. Teratogen-induced activation of caspase-9 and the mitochondrial apoptotic pathway in early postimplantation mouse embryos. Toxicol Appl Pharmacol 181, 142-151.

Liu Y, G Fiskum, D Schubert. 2002. Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain. J Neurochem 80, 780-787.

Lonergan P, A Adan, B Pintado, T Fair, F Ward, JD Fuente, M Boland. 2004. Relationship between time of first cleavage and the expresion of the IGF-1 growth factor, its receptor and two housekeeping genes in bovine two cell embryos and blastocyst produced in vitro. Mol Reprod Dev 57, 146-152.

Lu DP, L Tian, C O'Neill, NJ King. 2002. Regulation of cellular adhesion molecule expression in murine oocytes, peri-implantation and post-implantation embryos. Cell Res 12, 373-383.

Lu X. 2005. p53: a heavily dictated dictator of life and death. Curr opin Genet Dev 15, 27-33.

Majno G, I Joris. 1995. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 146, 3-15.

Meirelles FV, AR Caetano, YF Watanabe, P Ripamonte, SF Carambula, GK Merighe, SM Garcia. 2004. Genome activation and developmental block in bovine embryos. Anim Reprod Sci 82, 13-20.

Memili E, NL First. 2000. Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species. Zygote 8, 87-96.

Milligan CE, LM Schwartz. 1997. Programmed cell death during animal development. Brit Med Bull 53, 570-590.

133


Mostefai H, A Agouni, N Carusio, M Mastronardi, C Heymes, D Henrion, R Andriantsitohaina, C Martínez. 2008. Phosphatidylinositol 3-Kinase and xanthine oxidase regulate nitric oxide and reactive oxygen species productions by apoptotic lymphocyte microparticles in endothelial cells. The Journal of Immunology 180, 5028-5035.

Nishikimi A, J Mukai, M Yamada. 1999. Nuclear translocation of nuclear factor Kappa B in early 1-cell mouse embryos. Biol Reprod 60, 1536-1541.

Nohl H, L Gille, K Staniek. 2005. Intracellular generation of reactive oxygen species by mitochondria. Biochem Pharmacol 69, 719-723.

Parone P, D James, J Martinou. 2002. Mitochondria: regulating the inevitable. Biochimie 84,105-111.

Paula-Lopesa FF, PJ Hansen. 2002. Heat shock-induced apoptosis in preimplantation bovine embryos is a developmentally regulated phenomenon. Biol Reprod 66, 1169-1177.

Picton H, D Briggs, R Gosden. 1998. The molecular basis of oocyte growth and development. Mol Cell Endocrinol 145, 27-37.

Pomar F, K Teerds, A Kidson, B Colenbrander, T Tharasanit, B Aguilar, B Roelen. 2005. Differences in the incidence of apoptosis between in vivo and in vitro produced blastocysts of farm animal species: a comparative study. Theriogenology 63, 2254-2268.

Sardet Ch, F Prodon, G Prulière, J Chenevert. 2004. Polarisation des œufs et des embryons: principes communs. Médecine/Science 20, 414-423.

Serrano C, M Olivera-Angel. 2003. Detenimiento en el ciclo celular de embriones bovinos producidos in vitro. Taurus 5, 20-35.

Shishodia S, B Aggarwal. 2004. Nuclear factor-kB: a friend or a foe in cancer? Biochem Pharmacol 68, 1071-1080.

Stojkovic M, SA Machado, P Stojkovic, V Zakhartchenko, P Hutzler, PB Goncalves, E Wolf. 2001. Mitochondrial distribution and adenosine triphosphate content of bovine oocytes before and after in vitro maturation: correlation with morphological criteria and developmental capacity after in vitro fertilization and culture. Biol Reprod 64, 904-909.

Susin S, N Zamzami, G Kroemer. 1996. The cell biology of apoptosis: Evidence for the implication of mitochondria. Apoptosis 1, 231-242.

Takada Y, A Mukhopadhyay, G Kundu, G Mahabeleshwar, S Singh, B Aggarwal. 2003. Hydrogen peroxide activates NFκB through tyrosine phosphorylation of IkBα and serine phosphorylation of p65. J Biol Chem 278, 24233-24241.

Tarazona AM, JI Rodríguez, LF Restrepo, M Olivera-Angel. 2006. Mitochondrial activity, distribution and segregation in bovine oocytes and in embryos produced in vitro. Reprod Dom Anim 41, 5-11.

Thompson JG, RJ Partridge, FD Houghton, CI Cox, HJ Leese. 1996. Oxigen uptake and carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J Reprod Fertil 106, 299-306.

Thompson JG, C McNaughton, B Gasparrini, LT McGowan, HR Tervit. 2000. Effect of inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation during compaction and blastulation of bovine embryos cultured in vitro. J Reprod Fertil 118, 47-55.

Torchinsky A, V Toder. 2004. To die or not to die: the function of the transcription factor NF-kappaB in embryos exposed to stress. J Reprod Immunol 51, 138-143.

Trounson A, C Anderiesz, G Jones. 2001. Maturation of human oocytes in vitro and their developmental competence. Reproduction 121, 51-75.

Turcotte L. 2003. Mitochondria: biogenesis, structure, and function- Symposium introduction. Med Sci Sports Exerc 35, 82-85.

Van Blerkom J, P Davis, S Alexander. 2000. Differential mitochondrial distribution in human pronuclear embryos leads to disproportion. Hum Reprod 15, 2621-2633.

Van Blerkom J, P Davis, V Mathwing, S Alexander. 2002. Domains of high-polarized and low-polarized mitochondria may occur in mouse and human oocytes and early embryos. Hum Reprod 17, 393-406.

Vélez-Pardo C, A Morales, M Del Río, M Olivera-Angel. 2007. Endogenously generated hydrogen peroxide induces apoptosis via mitochondrial damage independent of NF-kB and p53 activation in bovine embryos. Theriogenology 67, 1285-1296.

Vousden KH, X Lu. 2002. Live or let die: the cell's response to p53. Nat Rev Cancer 2, 594-604.

Wang T, CA Lessman. 2002. Isoforms of soluble alpha-tubulin in oocytes and brain of the frog (genus Rana): changes during oocyte maturation. Cell Mol Life Sci 59, 2216-2223.

Wilding M, B Dale, M Marino, L di Matteo, C Alviggi, ML Pisaturo, L Lombardi, G De Placido. 2001. Mitochondrial aggregation patterns and activity in human oocytes and preimplantation embryos. Hum Reprod 16, 909-917.

Yang HW, KJ Hwang, HC Kwon, HS Kim, KW Choi, KS Oh. 1998. Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos. Hum Reprod 13, 998-1002.

Zakeri Z, R Lockshin, L Criado-Rodríguez, C Martínez-A. 2005. A generalized caspase inhibitor disrupts early mammalian development. Int J Dev Biol 49, 43-51.

Zhou L, H Steller. 2003. Distinct pathways mediate UV-induced apoptosis in Drosophila embryos. Dev Cell 4, 599-605.

135

Arch Med Vet 42, 135-146 (2010)


Aceptado: 03.12.2009.

# Sanfe03 Proyecto Lechero. Acciones para el desarrollo territorial de la Provincia de Santa Fe, Argentina.

* Área de Investigación en Producción Animal, INTA EEA-Rafaela, Santa Fe, C.C. 22 (2300), Argentina; [email protected]; [email protected]

Una actualización sobre el meteorismo espumoso bovino#

An update on frothy bloat in cattle

G Bretschneider*

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Estación Experimental Agropecuaria (EEA)-Rafaela, Santa Fe, Argentina.

SUMMARY

Frothy bloat is a digestive disorder that limits productivity in dairy and beef cattle. Many factors are involved in the sudden onset of bloat, however, in some cases, there is a lack of supporting evidence for their implication in the development of this disorder. To date, it is unknown what triggers the rapid oncoming of frothy bloat and, as a result, there are no completely effective control measures. This article analyzes the factors that are best characterized and that are most relevant for the development of frothy bloat. Current control measures available for cattle are also reviewed.

Palabras clave: Meteorismo espumoso, empaste, pH ruminal, proteólisis ruminal.

Key words: frothy bloat, cattle management, ruminal pH, ruminal proteolysis.

INTRODUCCIóN

Gran parte de los sistemas de producción de carne y leche basan su cadena forrajera en el uso de pasturas cul-tivadas. Las leguminosas, puras o asociadas, representan un componente importante de las mismas, tanto por su calidad alimenticia como por su capacidad restauradora de la fertilidad de los suelos; sin embargo, en algunas épocas del año su aprovechamiento se encuentra restringido a causa de su efecto meteorizante sobre el ganado bovino (Latimori y col 1992).

El meteorismo espumoso (ME) es una alteración di-gestiva caracterizada por la distensión del retículo-rumen como consecuencia de la acumulación de gas proveniente de la fermentación microbiana del alimento, el cual es atrapado en pequeñas burbujas de gran estabilidad. Esto impide su normal eliminación mediante la eructación y ocasiona alteraciones circulatorias y respiratorias que pueden producir la muerte del animal (Howarth 1975).

Además de las pérdidas asociadas a mortandad de ani-males, existen pérdidas subclínicas que se manifiestan en la disminución de la producción de carne y leche en los animales afectados por un grado moderado del trastorno digestivo (Laby 1991). La producción de leche puede disminuir hasta un 7% cuando los animales sufren un trastorno digestivo leve, mientras que cuando el ME es severo, el descenso

en la producción láctea puede alcanzar el 11% (Stockdale 1976). El ME también resulta una limitante en el proceso de adopción tecnológica, como la utilización de variedades de alfalfa sin latencia invernal y la implementación de pastoreos intensivos (Latimori y col 1992).

El ME ocurre principalmente cuando los animales pastorean leguminosas como alfalfa (Medicago sativa L.), trébol blanco (Trifolium repens L.) o trébol rojo (Trifolium pratense L.) puras o asociadas con otras especies (Howarth 1975, Majak y Hall 1990). Se ha descrito también la presen-tación de ME en bovinos que pastorean trigo como verdeo de invierno (Howarth y Horn 1984). Entre las forrajeras no meteorizantes pueden citarse el trébol de cuernitos (Lotus corniculatus L.), astrágalo (Astragalus cicer L.), esparceta (onobrychis viciifolia Scop.) (Hall y col 1994) y la mayoría de las gramíneas (Fay y col 1992).

La susceptibilidad al ME varía entre razas y entre individuos de una misma raza (Howarth 1975). Factores hereditarios influirían en la susceptibilidad al mismo (Wilkins y Morris 1992). Probablemente, las diferencias en susceptibilidad racial sean similares a las diferencias observadas entre animales de una misma raza (Howarth 1975). Se ha demostrado que la mortalidad por ME puede ser hasta tres veces menor en vacas lecheras adultas que en vaquillonas (Carruthers y col 1987, Laby 1991). Las vacas lecheras de mayor producción serían más propensas a meteorizarse debido al mayor consumo diario de materia seca (MS) (Colucci y Sienra 1982). La tasa de mortalidad para la raza Jersey fue tres veces superior a la descrita para la raza Holstein (Laby 1991). Según Carruthers y col (1987) la tasa de mortalidad por ME en vacas lecheras fue mayor durante la primavera (0,68% promedio de tres años) que en los meses de otoño (0,23%, promedio de dos años).

136

G BRETSCHNEIDER

Reid y col (1975) sostienen que no existen diferencias en el consumo total de forraje entre un animal susceptible y otro no susceptible al ME. Phillips y col (1996) registraron una “adaptación” de los animales al ME después de un período de pastoreo de dos semanas.

El ME ocurre típicamente durante las primeras horas de comenzado el pastoreo (Hall y Majak 1989). Este hecho se asoció a la “teoría de la velocidad de digestión inicial”, la cual señala que las leguminosas meteorizantes presentan mayor fragilidad en su pared celular que las leguminosas no meteorizantes (Howarth y col 1978). Lees y col (1981) indican que la resistencia de la pared celular determina la velocidad de ruptura celular. Ante una menor resistencia, el proceso de masticación y el posterior ataque microbiano al material vegetal (Howarth y Horn 1984) provocan una rápida liberación ruminal de los constituyentes intracelulares, fundamentalmente hidratos de carbono solubles y proteínas solubles, que tienen un rol principal en el desarrollo del ME. Dichos componentes se acumulan en cantidades que resultan críticas para la formación de espuma (Howarth y col 1978). Posteriormente, Fay y col (1981) postularon que las hojas de las leguminosas meteorizantes liberaban sustancias solubles quimiotácticas (hidratos de carbono y aminoácidos) a través de sus estomas, las cuales favorecerían la atracción microbiana hacia esos sitios. Esto se consideró como otro factor determinante de la mayor velocidad inicial de digestión de las leguminosas meteorizantes.

El gas generado durante el ME proviene de la fermen-tación del alimento y de la acidificación del bicarbonato ruminal debido a la producción de ácidos grasos volátiles (AGV) (Waghorn 1991a). Cangiano y Fay (1994) indican que entre los componentes alimenticios, los hidratos de carbono solubles son, inicialmente, la principal fuente de producción de gas debido a su rápida fermentación a nivel ruminal.

Leedle y col (1982) sugirieron que la solubilidad de los hidratos de carbono del forraje y las vías de fermen-tación microbianas utilizadas después de la alimentación determinan la velocidad de fermentación de los diferentes carbohidratos del alimento. En este sentido, los autores indican que la tasa de fermentación sería máxima para los hidratos de carbono solubles, intermedia para el almidón y mínima para la celulosa y hemicelulosa.

Las proteínas solubles son los principales constituyen-tes de la espuma y a su vez responsables de los cambios en la viscosidad y tensión superficial del licor ruminal (Walgenbach y Marten 1980). Las proteínas solubles de las hojas de alfalfa fueron clasificadas en dos fracciones: la fracción I (Ribulosa difosfato carboxilasa), de alto peso molecular, y la fracción II, compuesta por diferentes pro-teínas de bajo peso molecular (Jones y Lyttleton 1969). Ambas fracciones están involucradas en el desarrollo del ME (Howarth y col 1977). El 65% de las proteínas solubles del forraje se liberan durante el proceso de masticación, conduciendo a un aporte inmediato de componentes es-tabilizadores de la espuma a nivel ruminal (McArthur y

Miltimore, 1969). Según Majak y col (1995) la producción de espuma en los animales propensos a sufrir ME podría ser atribuida a una menor tasa de pasaje de la fase líquida del contenido ruminal a regiones posteriores del tracto digestivo.

Waghorn (1991a) sostiene que la tasa de producción de gas puede afectar la formación de espuma estable, aunque la ocurrencia de ME dependería de la presencia de los componentes capaces de estabilizar la espuma. El bajo contenido de fibra y la elevada concentración de proteínas solubles de las leguminosas inmaduras, asociados a un flujo salivar reducido generan un contenido ruminal viscoso, donde el gas queda retenido (Reid y col 1984, Majak y col 1995). En cambio, Moate y col (1997) concluyeron que el ME se originaría por una alteración en el proceso de eructación y señalaron que la producción de gas y la presencia de espuma persistente no serían factores des-encadenantes del trastorno digestivo.

La disminución en la frecuencia de las contracciones del rumen no es un factor etiológico del ME (Frost y col 1978, Colvin y Backus 1988); por el contrario, las contracciones ruminales incrementan su frecuencia durante el comienzo del mismo, especialmente la onda B, la cual está relacionada con la eructación, y sólo en el estadío final del trastorno digestivo la motilidad ruminal puede cesar totalmente (Colvin y Horn 1984). Según Waghorn (1991b), un incremento en las contracciones del rumen sería incapaz de facilitar la eructación una vez que la espuma está presente.

Hall y col (1988) señalaron que los animales reducen el consumo de forraje entre un 18 y un 25% antes de ma-nifestar el primer signo clínico de ME. Majak y col (1995) sugirieron que los disturbios gástricos generados por la espuma pueden ser los responsables de la disminución en el consumo, aun en ausencia de sintomatología clínica.

Durante el ME clínico se produce un cese en el consumo de forraje (Clarke y Reid 1974, McArthur y Miltimore 1969). Dougherty y col (1992) propusieron que el cese del consumo y de la actividad de pastoreo estarían asociados a la estimulación de los receptores mecánicos de la pared del retículo-rumen, por efecto de la espuma. El mecanismo físico generado por la distensión del tracto gastrointestinal también puede estar involucrado en la disminución del consumo (Allen 1996). Colvin y Backus (1988) indicaron que el intenso malestar que manifiesta el animal debido a la distensión ruminorreticular puede ser el responsable de muchas de las manifestaciones clínicas.

Las pectinas, saponinas y algunos minerales también se mencionan como causales del ME (Clarke y Reid 1974). Asimismo, diversos factores inherentes al animal, al clima y al manejo jugarían roles importantes en su presentación (Howarth y col 1991).

En Argentina, si bien se reconoce la importancia del ME principalmente en los sistemas de invernada y de produc-ción lechera, aún no se ha determinado la magnitud de las pérdidas totales originadas por este trastorno. Asimismo,

137

METEORISMO ESPUMOSO, EMPASTE, PH RUMINAL, PROTEóLISIS RUMINAL

a nivel mundial, no existen evaluaciones actualizadas de las pérdidas económicas ocasionadas por el ME. Por otro lado, debido a que únicamente se contabilizan las pérdidas asociadas a la muerte y el remplazo de los animales, las mismas subestiman los efectos negativos del ME sobre la rentabilidad de los sistemas ganaderos (Clarke y Reid 1974).

AMBIENTE RUMINAL

Majak y col (1982) establecieron que la susceptibilidad de los animales al ME está relacionada con las condiciones del rumen previo al pastoreo. Esta predisposición estaría principalmente asociada a la actividad y composición de la comunidad microbiana ruminal. Entre otros factores, el pH (Jones y Lyttleton 1972) y la actividad proteolítica ruminal (Fay y col 1986) también se asociaron a la pre-sentación del ME.

POBLACIONES MICROBIANAS RUMINALES

La población de microorganismos ruminales, depen-diendo de su ubicación en el rumen, se divide en tres grupos (Cheng y col 1980): 1) microorganismos asociados a la pared del rumen; 2) microorganismos libres en el fluido ruminal y 3) microorganismos asociados a las partículas de alimento. El grupo adherido al material particulado puede clasificarse a su vez en dos subgrupos según su fuerza de unión a las partículas alimenticias (fuertemente y débilmente adheridas) (McAllister y col 1994); éstas re-presentarían el 70-80% de los microorganismos ruminales (Craig y col 1987). Los grupos 2 y 3 interactúan con las partículas en digestión (McAllister y col 1994).

La cantidad de microorganismos asociados al material particulado se incrementa en respuesta a la alimentación, alcanzando un pico máximo en las primeras horas post-alimentación para luego disminuir progresivamente (Craig y col 1987). Como consecuencia de la colonización micro-biana del alimento, Leedle y col (1982) demostraron que se produce una reducción del 40 al 60% en el número de microorganismos viables asociados al fluido ruminal luego del consumo. La unión de los microorganismos al forraje ingerido ocurre generalmente dentro de los primeros cinco minutos postingestión (McAllister y col 1994).

Bretschneider y col (2001) demostraron una menor capacidad fermentativa de los licores ruminales de los animales suplementados con ensilaje de maíz previo al pastoreo de alfalfa. Este hallazgo se interpretó como una consecuencia de la reducción de los microorganismos libres disponibles (grupo 2) para actuar sobre las legu-minosas meteorizantes, inmediatamente después de la suplementación con ensilaje de maíz. Sin embargo, y en contraposición a esta primera interpretación, Bretschneider y col (2007) indicaron que la menor presentación y seve-ridad del ME observada con esta medida de manejo no estaría necesariamente asociada a la hipótesis anteriormente

planteada. No obstante, los mismos autores destacan que la metodología que se utilizó para medir los grupos de microorganismos ruminales no era apropiada para evaluar dicha hipótesis. En este sentido, los autores sostienen que la medición de la masa total de microorganismos libres (vivos y muertos) no refleja el verdadero número de microorganismos viables y disponibles para fermentar la alfafa inmediatamente después de la suplementación con ensilaje de maíz.

PH RUMINAL

Hall y Majak (1989) determinaron que el pH ruminal del ganado alimentado con alfalfa en estado vegetativo varía de 5,5 a 6,0, mientras que en un animal con ME el pH ruminal se encontraría en valores de entre 5,2 a 6,0. La máxima estabilidad de la espuma se produce a valores de pH próximos superiores al punto isoeléctrico de las proteínas solubles (Jones y Lyttleton 1972) cuando las cargas eléctricas de las proteínas se acercan a cero (no hay repulsión) y tienden a una máxima cohesión entre ellas (mayor viscosidad de la espuma) (Buckingham 1970). Este último autor así como Jones y Lyttleton (1972) indican que la agregación y precipitación de las proteínas solubles ocurre cuando el pH de la solución es igual o inferior a su punto isoeléctrico. Bajo condiciones de máxima fuerza de unión entre las proteínas solubles y máxima viscosidad de la espuma, la agitación del medio en el cual se encuentran genera la agregación de las proteínas en solución y con-duce a su precipitación debido a la pérdida de solubilidad (McArthur y Miltimore 1969).

El punto isoeléctrico de la fracción proteica I (18S) de las hojas de alfalfa se alcanza a valores de pH de 5,4 a 5,6 (McArthur y Miltimore 1969), mientras que para la fracción II el pH que conduce a una máxima estabilidad es más amplio (4,5 a 6,0), lo cual demuestra que existen diferentes puntos isoeléctricos para los distintos constituyentes proteicos de la fracción II (Jones y Lyttleton 1972).

Bretschneider y col (2007) establecieron la existencia de una asociación positiva entre el pH ruminal y la severidad del ME; sin embargo, aunque estadísticamente significativo (P < 0,05), el coeficiente de correlación fue muy bajo (r = 0,31). Por lo tanto, al igual que lo indicado por Mendel y Boda (1961), Moate y col (1997) y Bretschneider y col (2001), los autores sugirieron que el pH ruminal podría no ser un factor importante en el desarrollo del ME.

ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA MICROBIOTA RUMINAL

La degradación de las proteínas en el medio ruminal genera amonio y AGV como productos finales. Este pro-ceso involucra diversas actividades microbianas como la hidrólisis de la proteína mediante proteasas, la degradación de péptidos por peptidasas y, finalmente, la desaminación y fermentación de la cadena carbonada (Cotta y Hespell 1984).

138

G BRETSCHNEIDER

Según Nolan (1993), un 30 a 50% de las especies bacterianas ruminales comúnmente aisladas presentan actividad proteolítica. Los protozoarios e inclusive los hongos (que constituyen una pequeña proporción de la biomasa ruminal) también presentan una elevada actividad proteolítica. La actividad proteolítica de las bacterias es 6 a 10 veces mayor que la de los protozoarios (Brock y col 1982), siendo las bacterias Gram negativas las que presentan mayor actividad (Kopecny y Wallace 1982). Sus enzimas proteolíticas están asociadas principalmente a la superficie celular, tanto sobre la cubierta celular como en el espacio periplásmico (Cotta y Hespell 1984); mientras que las bacterias Gram positivas liberan sus enzimas al medio ruminal (Allison 1969).

La localización de las proteasas en la superficie celular implica que la adsorción rápida e irreversible de las proteínas solubles a la superficie bacteriana (Wallace y Cotta 1988) sea el primer paso de su proceso degradativo (Broderick y col 1991). Nolan (1993) sostiene que la máxima solubilidad de las proteínas no siempre conduce a una mayor degrada-bilidad, debido a que la estructura proteica también juega un rol importante en su susceptibilidad a la degradación. Por otro lado, las proteínas insolubles no requieren de la solubilización previa para ser degradadas ya que es la bacteria la que se une a las mismas; esto determina que la susceptibilidad de las diferentes proteínas a la hidrólisis microbiana esté relacionada con su afinidad de adsorción (Broderick y col 1991).

La velocidad y extensión de la degradación proteica depende de diversos factores que finalmente van a deter-minar el valor nutritivo de la proteína (Wallace y Cotta 1988). Nugent y Mangan (1981) demostraron que la degradación de la fracción proteica I (18S) de las hojas de alfafa es catalizada principalmente por proteasas bac-terianas y que la adsorción de esa fracción a la superficie bacteriana para su posterior proteólisis es inmediata. Los autores concluyeron que la hidrólisis inicial es el paso limitante en la proteólisis de la fracción I, más que la posterior degradación de los péptidos a aminoácidos libres. En este sentido, Fay y col (1986) propusieron que la reducción de la actividad proteolítica ruminal podría estar involucrada en el desarrollo del ME como consecuencia de una mayor persistencia de las proteínas solubles en el fluido ruminal.

Baintner (1981) demostró que la actividad proteolítica de los microorganismos ruminales es máxima con valores de pH cercanos a 6,5 y declina rápidamente a medida que el pH se reduce. Cotta y Hespell (1984) determinaron que el pH óptimo para las proteasas bacterianas se encuentra en el rango de 6 a 7. Tanto los pH ácidos como alcalinos extremos generan una completa inactivación de las proteasas ruminales (Baintner 1981). Esta inactivación está relacio-nada a un proceso de desnaturalización, donde se produce la pérdida de solubilidad y actividad catalítica (Lehninger 1991). Según Erfle y col (1982) una disminución del pH por debajo de 6 conduciría a una reducción en el número de

los microorganismos proteolíticos ruminales. En relación a esto, Bretschneider y col (2001, 2007) describieron una disminución en la actividad proteolítica y del pH ruminal cuatro horas después de iniciado el pastoreo. Los autores sugirieron que la proteólisis ruminal podría explicar por qué las proteínas solubles que atrapan el gas se acumulan rápidamente y en gran cantidad en el fluido ruminal al inicio del pastoreo.

Por otro lado, Ramírez y Mitchell (1960) y Chien y Mitchell (1970) mencionan la presencia de inhibidores de las proteasas (inhibidores de la tripsina) en harinas de alfalfa y Walker-Simmons y Ryan (1977) en hojas de alfalfa. Estos inhibidores también fueron identificados en el fluido intracelular de las hojas de trigo (Segarra y col 1997). Chang y col (1978) detectaron que la mayor concentración de los inhibidores de la tripsina se encuentra en las hojas de alfafa fresca en comparación con los tallos y la planta entera, y observaron que su concentración aumentaba a medida que la planta avanzaba en su estado fenológico. Hazlewood y col (1983) identificaron dos inhibidores de la tripsina asociados a la fracción proteica I de las hojas de alfalfa y propusieron que ambos podrían interferir con la proteólisis ruminal. También se identificaron enzimas ruminales con actividad semejante a la tripsina (Brock y col 1982). La posibilidad de que los inhibidores de la tripsina tengan alguna implicancia en el desarrollo del ME es sostenida por Hazlewood y col (1983).

MEDIDAS DE CONTROL

Se ha propuesto un conjunto de medidas para atenuar el potencial meteorizante de las especies forrajeras invo-lucradas en el desarrollo del ME, sin embargo, las mismas no son extrapolables de una situación a otra ni garantizan un cien por ciento de eficacia.

Latimori y col (1997) recomiendan la utilización com-binada de las diferentes alternativas disponibles con el fin de aumentar la eficacia en el control del ME.

Entre las medidas de control más reconocidas se pueden citar:

UTILIZACIóN DE LAS LEGUMINOSAS EN ESTADO

AVANZADO DE MADUREZ

La madurez de las leguminosas es uno de los facto-res más importantes a tener en cuenta en la prevención del ME (Howarth y col 1991). Según Howarth y Horn (1984), el incremento de la proporción de fibra en el forraje maduro y la mayor resistencia de la pared celular a la ruptura durante los procesos de digestión, reducirían el riesgo de ME.

La desventaja de esta medida de manejo es la menor calidad de las leguminosas pastoreadas en estado fenológico avanzado. Los rebrotes a nivel de la corona pueden ser un riesgo potencial a pesar de la madurez de las plantas (Latimori y col 1997).

139


UTILIZACIóN DE PASTURAS ASOCIADAS

La inclusión de gramíneas en una pastura de legumino-sas permite reducir el riesgo de ME; sin embargo, se han registrado casos de ME en pasturas con una proporción de leguminosas que no excede el 25-30% (Ferrari 1994). Por lo tanto, a pesar de que las leguminosas representen un bajo porcentaje de la composición botánica de la pastura, el riesgo de ME está presente, aunque probablemente con una intensidad y frecuencia menor.

MARCHITAMIENTO Y DESECAMIENTO DE LAS PASTURAS

Marchitamiento por corte. Los cortes se realizan en cada franja diaria a 5-7 cm del suelo, en estadíos del cultivo que varían entre botón floral y 10% de floración. Una vez cortado, el forraje es oreado (aireado) por 36-48 horas en otoño e invierno y por 12-24 horas en verano y primavera. El forraje se ofrece en la andana (hilera de forraje cortado); aunque también puede ofrecerse mediante el uso de un carro forrajero, fuera del lugar de corte. Con esta medida de control no solo se logró disminuir la presentación de ME, sino que también fue posible aumentar el consumo de MS/animal/día en aproximadamente un 25% con respecto al grupo de animales que consumían la pastura de alfalfa en pie (Guaita y Gallardo 1997).

En comparación con las hojas frescas, el oreado (du-rante 48 horas) de las hojas de alfalfa (Davies y col 1993) incrementó el porcentaje de MS en un 87% y disminuyó el porcentaje de proteína bruta (% PB) en un 11%. No en-contraron diferencias en los contenidos de materia orgánica (MO), pared celular (PC), carbohidratos no estructurales solubles (CNES) y digestibilidad in vitro de la MS (DIVMS) y de la materia orgánica (DIVMO). También observaron una menor producción de gas cuando las hojas oreadas se expusieron al ataque microbiano ruminal.

Esta técnica reduciría la presentación de ME debido a una menor velocidad de digestión inicial de las hojas de alfafa en el rumen y a una menor posibilidad de selección de las plantas o partes de las plantas debido a la forma en que el forraje es presentado al animal.

Desecamiento por herbicidas. Durante varios años se utilizó el paraquat (herbicida de contacto) a bajas dosis como herramienta para el control de ME en los sistemas de producción de carne. La dosis utilizada es de 0,200 a 0,250 L/ha (Gramoxone Super - producto comercial) con un volumen de agua de 80 litros y presión normal. Se debe aplicar 36-48 horas antes del pastoreo de los animales (Correa Luna y Damen 1997).

Los resultados en la prevención del ME son satisfacto-rios, aunque la respuesta productiva de los animales puede resultar afectada. Latimori y col (1992) observaron una reducción del 15% en la ganancia diaria de peso (GDP) de los animales que consumían forraje previamente tratado con paraquat. Esta menor GDP se atribuyó a una disminución

en la calidad y cantidad del forraje tratado debido a la caída de hojas que provoca el marchitamiento. A partir de experiencias in vitro, Roigé y col (1998) sugieren que el paraquat a dosis de 10 a 1.000 ppm interferiría con la actividad digestiva de los microorganismos ruminales.

En los tejidos de novillos alimentados con alfalfa tra-tada con paraquat no se detectaron residuos del herbicida según los límites máximos establecidos por el Códex Alimentario Internacional (Latimori y col 1992, Correa Luna y Damen 1997).

En experiencias realizadas durante tres años en los meses de primavera-verano el asperjado con paraquat no afectó los rebrotes ni la cantidad de plantas de alfalfa (Correa Luna y Damen 1997). Davies y col (1994) indicaron que, en comparación con hojas frescas, el tratamiento de las hojas de alfalfa con paraquat (48 horas de acción) incrementa el % MS en un 52% y la pared celular en un 16%, disminuyen la DIVMS y la DIVMO en un 7% y no afecta el contenido de MO, PB y CNES; también observaron que las hojas tratadas producían menos gas cuando eran atacadas por los microorganismos del rumen. La menor incidencia de ME podría ser consecuencia de una reducción en la velocidad inicial de digestión del forraje desecado.

Otros productos desecantes utilizados para prevenir el ME son el 2,4-D (herbicida sistémico), el diquat (herbicida de contacto) y el formol, aunque existe escasa información en cuanto a sus efectos sobre los animales (residuos en tejidos) y sobre las plantas (calidad, producción y persis-tencia) (Cangiano y Fay 1994).

AGENTES ANTIESPUMANTES

Entre los agentes antiespumantes más conocidos se pueden citar: siliconas (Ej. dimetilpolisiloxano), aceites vegetales, grasas animales emulsionadas y vaselina líquida. Los productos antiespumantes tienen una acción directa sobre la espuma, impidiendo su formación al mezclarse con los constituyentes que la generan (principalmente proteínas solubles) y disminuyendo sus propiedades es-pumantes (Fay y col 1992).

Estos productos pueden suministrarse en agua de bebida o rociados sobre las pasturas. Otra forma de aplicación sencilla, aunque poco efectiva, es el pincelado del producto en el flanco del animal. El éxito de esta medida depende de que el animal se lama el flanco antes de comenzar el pastoreo y/o ante el primer signo de ME. Evidencias empíricas indicarían que los animales aprenden a asociar el alivio del malestar con el acto de lamerse el flanco (Stockdale 1991).

PRODUCTOS TENSIOACTIVOS SINTÉTICOS

Los productos más conocidos son: los plurónicos (Ej. poloxaleno) y los alcoholes etoxilados (Ej. Terics). Según Laby (1991), los eventos que preceden el comienzo del ME incluyen la inactivación que naturalmente ocurre de los

140

G BRETSCHNEIDER

lípidos antiespumantes en el rumen y la reducción gradual de la densidad del contenido ruminal; de esta manera, las propiedades detergentes de los tensioactivos sintéticos permitirían la reactivación de los lípidos antiespumantes a través de la humectación de la superficie de los fragmentos del forraje en digestión y la suspensión o emulsificación de los lípidos vegetales en el fluido ruminal.

Dougherty y col (1992) demostraron que el poloxa-leno afecta el comportamiento ingestivo prolongando el tiempo de pastoreo, lo cual podría deberse en parte al alivio del ME. En este sentido, Laby (1991) indica que la mejor respuesta productiva observada con el uso de productos tensioactivos sintéticos puede deberse a un incremento en la densidad del contenido ruminal, lo cual permite aumentar la tasa de pasaje y el consumo de los animales.

A diferencia de los productos antiespumantes los agentes tensioactivos sintéticos poseen la ventaja de que con una dosis baja se logra una mayor potencia y persistencia en el rumen (Colucci y Sienra 1982). Entre los métodos más conocidos para la administración de los agentes tensioac-tivos sintéticos se pueden citar los siguientes:

Tomas individuales (“drenching”). Se considera el método más efectivo y confiable para la prevención del ME. Debido al tiempo de acción en el rumen (aproximadamente 12 horas para el poloxaleno) se deben administrar dos dosi-ficaciones al día. La administración se realiza en la sala de ordeña mediante la utilización de pistola dosificadora (Stockdale 1991).

Rociado sobre las pasturas. Es un método muy confiable si el proceso se realiza correctamente. Permite que los animales consuman la dosis diaria requerida del agente antimeteorizante durante el pastoreo. La principal limitante de este método está asociada a las condiciones climáticas que pueden afectar la distribución uniforme del produc-to. El viento y la lluvia son las variables climáticas más influyentes. La lluvia lava el producto antimeteorizante de la pastura y exige un nuevo rociado previo al ingreso de los animales a la parcela. El pastoreo puede realizarse inmediatamente después de la aplicación del producto ya que éste ejerce su efecto sobre el animal y no sobre la planta (Stockdale 1991).

Mezclado en la ración. Es un método efectivo y tan confia-ble como la administración del producto antimeteorizante mediante tomas indivuales (“drenching”), siempre que se asegure el consumo total del suplemento (Stockdale 1991). Es un método práctico para utilizar durante la suplementación en la sala de ordeña. Si se logra un con-sumo uniforme resultaría un método más sencillo que la administración por tomas diarias. Es el método más difundido en los establecimientos lecheros de Uruguay (Colucci y Sienra 1982). Debido a su baja palatabilidad se puede usar melaza para su administración.

Diluido en el agua de bebida. Es un método práctico pero poco confiable ya que el consumo de agua puede variar en cantidad (3 a 11% del peso vivo [PV]) y frecuencia (Stockdale 1991). Además, la elevada proporción de agua de las leguminosas potencialmente meteorizantes conduce a una disminución en el consumo de agua. Es necesario el empleo de dosificadores en el agua de bebida de manera que se respeten las concentraciones requeridas.

En bloques para lamer. Es un método muy poco confiable ya que no es posible asegurarse que todos los animales accedan a lamer los bloques (Stockdale 1991).

En conclusión, las formas de administración más confiables y seguras son aquellas en las cuales las dosis preventivas llegan al rumen de todos los animales antes que se presenten las condiciones que generan el ME. Tal es el caso de las tomas individuales, el rociado sobre las pasturas y el mezclado en la ración.

En los tambos de Nueva Zelanda y Australia el método más utilizado es la administración en tomas individuales durante el ordeñe1. Waghorn y Shelton (1994) indican que esta forma de prevención no es efectiva en todos los animales y que la variación en la respuesta puede deberse a diferencias en la estabilidad de la espuma y/o a una baja dispersión del producto debido a un mezclado inadecuado con el contenido ruminal, lo que implicaría que el producto se concentre en la zona craneal del retículo-rumen, pasando rápidamente al abomaso.

El uso de detergentes domésticos es inefectivo en la prevención del ME (Majak y col 1995).

IONóFOROS

Entre los ionóforos más utilizados en la prevención del ME se encuentran la monensina, cuyas propiedades están ampliamente descritas en la bibliografía, y la lasalocida. La monensina es un antibiótico comúnmente utilizado en las raciones del ganado de “feedlot” con el objetivo de aumentar la eficiencia de conversión del alimento, reducir el riesgo de acidosis y para la prevención y control de la coccidiosis (Vogel 1995). En condiciones de pastoreo, el empleo de monensina mejoró la GDP (Oliver 1975, Bretschneider y col 2008) y redujo la presentación de ME (Branine y Galyean 1990, Majak y col 1995).

Lowe (1991) atribuye la reducción en la incidencia de ME al efecto de la monensina sobre el patrón de fermentación ruminal, al generar un incremento en la proporción de ácido propiónico a expensas de una reducción en la proporción de ácido acético, lo cual determina una disminución en la producción de metano (CH4) y dióxido de carbono (CO2). Laby (1991) propone a la reducción de la proporción de CH4 en la mezcla de gases ruminales como la principal causa por la cual disminuye la presentación de ME debido

1 Ulyatt MJ, comunicación personal.

141


a que el CH4 presenta mayor capacidad estabilizante de la espuma que el CO2. La mayor solubilidad del CO2 en agua le permite atravesar más fácilmente las paredes de la burbuja, en cambio el CH4 quedaría retenido dentro de ésta. Por otro lado, Branine y Galyean (1990) atribuyen la reducción de la presentación de ME al aumento del pH ruminal que genera la monensina con respecto al pH < 6,0 que sería necesario para una máxima estabilidad de la espuma (McArthur y Miltimore 1969). Sin embargo, Moate y col (1997) no encontraron diferencias significativas (P > 0,05) en la composición del gas de fermentación ni en el pH ruminal de vacas lecheras dosificadas con bolos de liberación lenta de monensina. En consecuencia, el mecanismo por el cual la monensina reduce el ME es aún desconocido.

La eficacia de los ionóforos en el control del ME fue analizada por Majak y col (1995), quienes indicaron una reducción del 50% en la incidencia de ME. Estudios realizados en Australia y Nueva Zelanda con bolos de libe-ración lenta de monensina han demostrado una reducción de un 80% en la tasa de mortandad y en la incidencia de casos clínicos de ME (Moate y col 1997). Experiencias en Argentina han demostrado que mediante el uso de monensina se logró disminuir la incidencia de ME en un 50-80%; sin embargo, en condiciones de alto riesgo no se evitaría la aparición de casos agudos (Latimori y col 1997).

La monensina puede administrarse con los suplementos (por ejemplo, maíz, sorgo, etc.), los cuales actuarían como vehículo, o mediante el empleo de bolos de liberación lenta. Estos últimos, una vez administrardos, liberan el aditivo diariamente durante aproximadamente 100 días (Bretschneider y col 2008). Sin embargo, cuando es ad-ministrada mediante un vehículo, la monensina debe ser cuidadosamente dosificada y mezclada con el suplemento para prevenir sobredosis y toxicidad. Potter y col (1984) recomiendan que la monensina se dosifique a razón de 100 mg/animal/día durante los primeros cinco días de administración y 200 mg/animal/día durante el resto de la suplementación. Para una dosificación segura se reco-mienda una concentración máxima de monensina en el suplemento de 440 ppm (mg/kg).

MEDIDAS DE MANEJO DEL PASTOREO

Momento de ingreso a la nueva parcela. Se demostró que el pastoreo temprano en la mañana aumenta el riesgo de ME con respecto al pastoreo tarde en la mañana (aproxi-madamente a las 11:00-12:00 h) (Majak y col 1995). Esto indica que es aconsejable el cambio de parcela después del mediodía cuando el rocío o las heladas ya desapare-cieron (Hall y Majak 1995, Majak y col 1995). Ambos factores provocan una mayor turgencia de las hojas, lo cual determina una mayor fragilidad ante la masticación y la digestión por los microorganismos ruminales. Esto implica una mayor velocidad inicial de digestión y un ambiente más propenso para el desarrollo del ME.

Tiempo de permanencia en la parcela. El pastoreo continuo de alfalfa (24 h/día) redujo el riesgo de ME con respecto al pastoreo de 6 horas diarias (Majak y col 1995). Los sistemas de pastoreo que promueven un vaciamiento ruminal rápido y continuo (más “bypass”, menos producción de gas) reducirían el riesgo de ME (Majak y col 1995).

Grado de ayuno previo al pastoreo. La producción de gas por sí misma es irrelevante en la generación de ME si los agentes estabilizadores de la espuma no están presentes (Moate y col 1997). Waghorn (1991b) determinó que el ayuno previo al pastoreo genera un pH ruminal elevado que contribuye a una mayor producción de CO2 durante las primeras horas de pastoreo debido a la acidificación del bicarbonato ruminal. Por lo tanto, bajo esta situación, la presencia de los agentes estabilizadores de la espuma contribuye a un mayor riesgo de ME. Por otro lado, Fay y col (1986) sugieren que el ayuno prolongado (24 h) reduce la actividad proteolítica ruminal, favoreciendo el atrapamiento del gas en el rumen debido a una mayor persistencia de las proteínas solubles.

Después de un período de ayuno, la mayoría de los animales presentan un mayor consumo en comparación con los animales alimentados ad libitum (Baile y McLaughlin 1987). Dougherty y col (1989) determinaron que los perío-dos de ayuno en animales que pastorean alfalfa generan un aumento en la tasa de consumo durante la siguiente sesión de pastoreo. Además, concluyeron que el comportamiento ingestivo en respuesta al ayuno del ganado en pastoreo estaría determinado por el tiempo de retención del forraje en el tracto digestivo. Sin embargo, no se ha demostrado que tanto la tasa de consumo (Clarke y Reid 1974, Majak y col 1995) como el grado de ayuno al momento del pastoreo sean de importancia en el desarrollo del ME (Walgenbach y Marten 1980). En este sentido, Howarth (1975) indica que la tasa de consumo determina la velocidad con que un animal se meteoriza aunque no determina la frecuencia del trastorno digestivo.

Suplementación con heno. Cole y col (1945) determina-ron que es necesario 4,5 y 7,7 kg de heno de pasto sudan (Sorghum × drummondii)/animal/día previo al pastoreo para una protección parcial y completa contra el ME, respectivamente. Por lo tanto, las elevadas cantidades a suministrar determinan que ésta sea una medida de preven-ción poco práctica que, además, reduce el aprovechamiento de la pastura. Kitroser y Correa Luna (1993) indicaron la presentación de casos de ME en experiencias donde se suministraron altos consumos de heno (1,7% del PV) previo al pastoreo de leguminosas. Sin embargo, un trabajo reciente (Majak y col 2008) mostró que la suplementa-ción con heno de pasto Ovillo (Dactylis glomerata L.) en cantidad de 2,5 kg MS/animal/día, previo al suministro de alfalfa fresca, redujo la ocurrencia de ME (> 90%) en novillos con fístula ruminal alimentados a corral. Es de

142

G BRETSCHNEIDER

destacar que en este mismo ensayo el heno de alfalfa no fue efectivo para controlar el ME.

Suplementación con concentrados energéticos y proteicos. Phillips y col (1996) sostienen que ante el riesgo de ME es conveniente utilizar aquellos suplementos que se fermentan lentamente en el rumen y que se consumen en suficiente cantidad como para reducir los períodos de rápido consumo del forraje. Por otro lado, los suplementos que contienen un alto nivel de energía rápidamente fermentecible y un elevado contenido proteico incrementarían la incidencia de ME como consecuencia del sinergismo entre el aporte de energía y nitrógeno, lo cual estimularía la fermentación ruminal.

La utilización de suplementos que reducen el pH ru-minal genera condiciones que favorecen el desarrollo del ME, por esta razón no sería aconsejable la utilización de granos como suplemento para pasturas potencialmente meteorizantes (McArthur y Miltimore 1969). Howarth y Horn (1984) sostienen que existe una correlación positiva entre el contenido de almidón del forraje y la presentación de ME. En este sentido, Peralta y col (2002) mostraron que la suplementación con grano de maíz entero (1% PV de MS) previo al pastoreo de alfalfa no reduce la ocurrencia de ME.

También se han utilizado raciones que contienen un elevado porcentaje de grasas o taninos para controlar el ME, sin embargo los resultados no han sido concluyentes (Colucci y Sienra 1982).

Suplementación con ensilaje de maíz. Pritchard y col (1989) lograron controlar el ME en vacas lecheras mediante el uso de ensilaje de maíz en una proporción no inferior al 40% (5 kg MS/animal/día) de la dieta total. Asimismo, en los sistemas intensificados de producción de carne del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Balcarce, Argentina, se empleó la suplementación con ensilaje de maíz de novillos que pastorean alfalfa, sin que se hayan registrado casos de ME clínico (Bretschneider 2000).

De Boever y col (1990) sostienen que la masticación de ingestión y rumiación dependen de la naturaleza de la dieta, y que el principal responsable de esta respuesta es el nivel de fibra dietario. El proceso masticatorio estimula la secreción salival, la cual se requiere para humedecer el alimento como requisito previo a la colonización microbiana y para aportar sustancias buffer tendientes a prevenir cambios bruscos del pH ruminal (McAllister y col 1994). Elizalde y col (1993) indican que el alto contenido de fibra del ensilaje de maíz aumentaría la salivación y, por lo tanto, provocaría un aumento del pH ruminal en animales alimentados con pasturas de calidad. Es importante tener en cuenta que la longitud de la fibra dietaria juega un rol muy importante en la respuesta masticatoria y, en consecuencia, en el patrón de fermen-tación ruminal (Lu 1987, De Boever y col 1993). Por otro lado, Howarth y Horn (1984) indican que el contenido

de fibra del forraje está negativamente relacionado con la ocurrencia de ME.

Mediante la información obtenida a partir de ocho ensayos (Stockdale 1994b, 1996,1997a, 1997b) de suple-mentación con ensilaje de maíz en vacas lecheras realizados en otoño y primavera sobre pasturas de trébol blanco (Trifolium repens) y trébol persa (Trifolium resupinatum), se obtuvo el valor medio y error estándar de los niveles de sustitución observados (kg MS de forraje no consumido/kg MS de suplemento consumido), y de los niveles de suplementación (expresados como % PV) utilizados. Los resultados de estos ensayos indican que para un nivel de suplementación de 0,98 ± 0,09% PV en MS de ensilaje de maíz la respuesta sustitutiva fue de 0,20 ± 0,05 kg/kg. El mayor consumo de MS en los grupos suplementados demuestra un efecto asociativo del ensilaje de maíz con las leguminosas. El elevado contenido de proteínas y mi-nerales de las leguminosas, asociado al aporte de energía rápidamente fermentecible (almidón del grano) y el alto aporte de fibra del ensilaje de maíz, lo cual mantiene el funcionamiento ruminal, determinan la complementarie-dad de ambas fuentes alimenticias (Pritchard y col 1989, Stockdale 1994b).

Según Stockdale (1994a), el objetivo de la suplementación de los rumiantes en condiciones de pastoreo es aportar los nutrientes que en la dieta base son deficitarios. Según este concepto, el ensilaje de maíz complementaría el desbalance nutritivo ocasionado por el consumo de leguminosas, dado que no sólo permite obtener una mayor respuesta productiva debido al consumo elevado de MS (baja tasa de sustitu-ción), sino que también permite utilizar las pasturas en un estado de mayor calidad al generarse un menor riesgo de ME. En este sentido, Bretschneider y col (2001 y 2007) indicaron que la suplementación con ensilaje de maíz (0,5% PV de MS) previo al pastoreo de alfalfa redujo no solo la ocurrencia (56 ± 30%), sino también la severidad (38 ± 6,3%) del ME. Stockdale (1994c) y Bretschneider y col (2007) sugirieron que una menor tasa de consumo inicial sería una de las posibles causas por la cual el uso del ensilaje de maíz, previo al pastoreo de leguminosas meteorizantes, reduciría el riesgo de ME.

Cheng y col (1998) concluyeron que debido a las pre-siones de los consumidores para reducir el uso de productos químicos (antibióticos, detergentes, etc.) en las dietas, y dado que la aprobación del uso de aditivos por parte de los organismos reguladores de alimentos es económicamente prohibitiva, las medidas de manejo tendientes a controlar el ME van a cobrar mayor importancia en el futuro.

PERSPECTIVAS PARA EL CONTROL DEL METEORISMO ESPUMOSO BOVINO

Nuevas variedades de alfalfa con menor velocidad de digestión inicial fueron evaluadas por Kudo y col (1985), quienes demostraron que, durante las primeras horas de consumo de un cultivar de alfalfa con una tasa de digestión

143


inicial in situ (TDIS) 6% inferior a la TDIS del cultivar testigo, se generaba una menor concentración de proteínas y carbohidratos solubles, clorofila, AGV e iones hidrógenos a nivel ruminal. Así, la obtención de nuevas variedades de alfalfa con una menor TDIS podría resultar en una reducción de su potencial meteorizante.

Hall y col (1994) alimentaron a novillos en pastoreo y a corral con un cultivar de alfalfa que presentaba una TDIS 4 a 11% menor que la del cultivar testigo, pero no observaron una reducción significativa (P > 0,05) en la ocurrencia de ME. Los autores sostienen que la falta de éxito se debió a que el cultivar de alfalfa con baja TDIS estaba muy por debajo de lo recomendado (reducciones en la TDIS del 20 al 30%) para prevenir el ME.

En Argentina, Basigalup y col (1999) están trabajando desde el año 1991 en un programa de mejoramiento con el objetivo de seleccionar cultivares de alfalfa con bajo potencial meteorizante. Los resultados obtenidos hasta el presente indican una reducción promedio de 22,7% en la TDIS (4 horas de incubación) del tercio superior de la planta de alfalfa (ProINTA Carmina) que la población original. Sin embargo, para el mismo cultivar de alfalfa la TDIS de las hojas del tercio superior del forraje resultó sólo un 4,5% menor que la TDIS de las hojas del cultivar usado como testigo (Bárbara SP INTA) (Bernáldez y col 2007).

Tanner y col (1995) demostraron mediante pruebas in vitro que los taninos condensados reducen, a dosis depen-diente, la fuerza compresiva de la espuma generada por las proteínas de las leguminosas. La mayoría de las legumino-sas meteorizantes carecen de taninos foliares (Fay y Dale 1993). En un futuro, la manipulación genética permitirá la incorporación de taninos a las leguminosas meteorizantes mediante la transferencia de genes de especies portadoras (Familton 1990, Fay y Dale 1993), aunque será necesario determinar su concentración óptima en el forraje, de modo que se obtenga un equilibrio que no afecte la digestibilidad ni la cantidad de proteína protegida en las leguminosas transferidas (Frame y col 1998).

Finalmente, la reducción en la actividad proteolítica ruminal en las primeras horas postpastoreo descrita por Bretschneider y col (2001, 2007) destaca el rol potencial de la proteólisis en la persistencia de las proteínas solubles en el fluido ruminal, como fue sugerido por Fay y col (1986), y reafirma la hipótesis de Hazlewood y col (1983), que al conocimiento del autor no ha sido aún evaluada, sobre la implicancia de los inhibidores de las proteasas de la alfalfa (Ramírez y Mitchell 1960, Chien y Mitchell 1970, Walker-Simmons y Ryan 1977, Chang y col 1978) en el desarrollo del ME bovino.

RESUMEN

El meteorismo espumoso bovino es un trastorno digestivo que limita la producción en los bovinos para carne y leche. Muchos factores han sido involucrados como causales del mismo, sin conocerse a ciencia cierta su influencia en el desarrollo de este trastorno. Actualmente no está claro

el origen etiológico del meteorismo espumoso y, como consecuencia, no contamos con una medida ciento por ciento segura para su control, resultando la misma únicamente paliativa del problema. Este trabajo resume los aspectos más estudiados y relevantes sobre la etiología del meteorismo espumoso bovino, así como también las medidas de control disponibles hasta la fecha.

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), institución de la cual el autor fue becario durante el período en el que se realizaron los estudios experimentales que se resumen en esta revisión. Un especial agradecimiento al Dr. José Patricio Fay (INTA, EEA-Balcarce) quien fue mi mentor durante mis estudios de postgrado en la Unidad Integrada INTA Balcarce/Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata. Se agradece también a la Dra. Sandra. E. Pérez (Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires -UNCPBA-Tandil) por la lectura crítica del manuscrito.

REFERENCIAS

Allen MS. 1996. Physical constraints on voluntary intake of forages by ruminants. J Anim Sci 74, 3063-3075.

Allison MJ. 1969. Nitrogen metabolism of ruminal micro-organisms. In: Phillipson AT (ed). Proceedings of the Third International Symposium on the Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant, Cambridge, England, Pp 456-473.

Baile CA, CL McLaughlin. 1987. Mechanisms controlling feed intake in ruminants: a review. J Anim Sci 64, 915-922.

Baintner K. 1981. Determination of proteolytic activity of rumen liquor with azocasein. Zbl Vet Med A 28, 796-802.

Basigalup DH, CV Castell, V Arolfo, ML Benítez. 1999. Selección de un cultivar de alfalfa con bajo potencial empastador. III Jornadas Chileno-Argentinas de Genética, Rosario, Argentina.

Bernáldez ML, J Martínez Ferrer, D Basigalup, D Alomar, ME Terreno, MS Bucéeme. 2007. Ambiente y digestión ruminal de una alfalfa seleccionada por menor desaparición ruminal para reducir su potencial meteorizante. XX Reunión de la Asociación Latinoamericana de Producción Animal (ALPA) - XXX Reunión Anual de la Asociación Peruana de Producción Animal (APPA), Cusco, Perú.

Branine ME, ML Galyean. 1990. Influence of grain and monensin supplementation on ruminal fermentation, intake, digesta kinetics and incidence and severity of frothy bloat in steers grazing winter wheat pasture. J Anim Sci 68, 1139-1150.

Bretschneider G. 2000. Efectos de la suplementación con distintos niveles de silaje de maíz previo al pastoreo de alfalfa sobre la presentación de meteorismo espumoso bovino. Tesis de Magister Scientiae, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, INTA - Estación Experimental Agropecuaria de Balcarce, Buenos Aires, Argentina.

Bretschneider G, FJ Santini, JP Fay, C Faverin. 2001. Effects of maize silage supplementation before lucerne grazing on the occurrence of bloat in cattle. N Z J Agric Res 44, 241-251.

Bretschneider G, M Peralta, FJ Santini, JP Fay, C Faverin. 2007. Influence of corn silaje supplementation before alfalfa grazing on ruminal environment in relation to the occurrence of frothy bloat in cattle. Anim Feed Sci Technol 136, 23-37.

Bretschneider G, JC Elizalde, FA Pérez. 2008. The effect of feeding anti-biotic growth promoters on the performance of beef cattle consuming forage-based diets: A review. Livest Sci 114, 135-149.

Brock F, C Forsberg, J Buchanan-Smith. 1982. Proteolytic activity of rumen microorganisms and effects of proteinase inhibitors. Appl Environ Microbiol 44, 561-569.

Broderick GA, RJ Wallace, ER Orskov. 1991. Control of Rate and Extent of Protein Degradation. In: Tsuda T, Sasaki Y, Kawashima R (eds).

144

G BRETSCHNEIDER

Physiological Aspects of Digestion and Metabolism in Ruminants. Proceedings of the Seventh International Symposium of Ruminant Physiology. Academic Press, Tokyo, Japan, Pp 542-579.

Buckingham JH. 1970. Effect of pH, concentration, and temperature on the strength of cytoplasmic protein foams. J Sci Food Agric 21, 441-445.

Cangiano C, P Fay. 1994. Empaste o meteorismo espumoso. En: Area de Producción Animal - EEA Balcarce-INTA (ed). Curso de Nutrición Animal en Rumiantes. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Balcarce, Argentina, Pp 67-77.

Carruthers VR, MB O’ Connor, C Feyter, MP Upsdell, SF Ledgard. 1987. Results from the Ruakura Bloat Survey. Proceedings of the Ruakura Farmers’ Conference, Ruakura, New Zealand, Pp 44-46.

Chang H, GR Reeck, HL Mitchell. 1978. Alfalfa trypsin inhibitor. J Agric Food Chem 26, 1463-1464.

Cheng KJ, JP Fay, RE Howarth, JW Costerton. 1980. Sequence of events in the digestion of fresh legume leaves by rumen bacteria. Appl Environ Microbiol 40, 613-625.

Cheng KJ, TA McAllister, JD Popp, AN Hristov, Z Mir, HT Shin. 1998. A review of bloat in feedlot cattle. J Anim Sci 76, 299-308.

Chien TF, HL Mitchell. 1970. Purification of a trypsin inhibitor of alfalfa. Phytochemistry 9, 717-720.

Clarke RTJ, CSW Reid. 1974. Foamy bloat of cattle. A review. J Dairy Sci 57, 753-785.

Cole HH, CF Huffman, M Kleiber, TM Olson, AF Schalk. 1945. A review of bloat in ruminants. J Anim Sci 4, 183-236.

Colucci P, R Sienra. 1982. Meteorismo Espumoso. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina.

Colvin HW, GW Horn. 1984. The significance of ruminal motility in the etiology of bloat. Proceedings of the National Wheat Pasture Symposium, October. Oklahoma State University, Oklahoma, USA, Pp 165-176.

Colvin HW, RC Backus.1988. Bloat in sheep (ovis aries). Comp Biochem Physiol 91A, 635-644.

Correa Luna M, D Damen. 1997. Meteorismo espumoso bovino. Sexto Congreso Nacional de Lechería, 29 de agosto. Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina, Pp 55-66.

Cotta M, R Hespell. 1984. Protein and amino acid metabolism of rumen bacteria. Ch.7. In: Milligan LP, Grovum WL, Dobson A (eds). Control of Digestion and Metabolism in Ruminants. Proceedings of the Sixth International Symposium on Ruminant Physiology, September 10-14, Banff, Canada, Pp 122-136.

Craig WM, GA Broderick, DB Ricker. 1987. Quantitation of microor-ganisms associated with the particulate phase of ruminal ingesta. J Nutr 117, 56-62.

Davies P, JP Fay, CJ Escuder. 1993. Efecto del marchitamiento sobre variables asociadas al potencial meteorizante de la alfalfa. Rev Arg Prod Anim, 13, suppl 1, Pp 43-44.

Davies P, JP Fay, CJ Escuder. 1994. Parámetros de potencial meteorizante en alfalfa fresca y marchitada con paraquat. Rev Arg Prod Anim, 14, suppl 1, Pp 17.

De Boever JL, JI Andries, DL De Brabander, BG Cottyn, FX Buysse. 1990. Chewing activity of ruminants as a measure of physical structure - A review of factors affecting it. Anim Feed Sci Technol 27, 281-291.

De Boever JL, DL De Brabander, AM De Smet, JM Vanacker, CV Boucque. 1993. Evaluation of physical structure. 2. Maize silage. J Dairy Sci 76, 1624-1634.

Dougherty CT, NW Bradley, PL Cornelius, LM Lauriault. 1989. Short-term fasts and the ingestive behaviour of grazing cattle. Grass Forage Sci 44, 295-302.

Dougherty CT, M Collins, NW Bradley, LM Lauriault PL Cornelius. 1992. The effects of poloxalene on ingestion by cattle grazing lucerne. Grass Forage Sci 47, 180-188.

Elizalde JC, DH Rearte, FJ Santini. 1993. Utilización de silaje de maíz en vacas lecheras en pastoreo. Boletín Técnico del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Balcarce, Argentina, Nº 117.

Erfle J, R Boila, R Teather, S Mahadevan, F Sauer. 1982. Effect of pH on fermentation characteristics and protein degradation by rumen microorganisms in vitro. J Dairy Sci 65, 1457-1464.

Familton AS. 1990. Animal Disorders Arising from Consumption of Pasture. Ch. 9. In: Langer RHM (ed). Pastures their Ecology and Management. Oxford University Press, New York, USA.

Fay JP, KL Cheng, MR Hanna, RE Howarth, JW Costerton. 1981. A scanning electron microscopy study of the invasion of leaflets of a bloat-safe and a bloat-causing legume by rumen microorganisms. Can J Microbiol 27, 390-399.

Fay JP, GL Micheo, G Santucho, A García Astrada. 1986. Effect of fasting on digestion of white clover leaflets by rumen microorganisms and possible implications in cattle bloat. J Vet Med A 23, 781-787.

Fay JP, CJ Escuder, C Cangiano, P Davies. 1992. Empaste (meteorismo espumoso) en bovinos. Boletín Técnico del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Balcarce, Argentina, Nº 111.

Fay MF, PJ Dale. 1993. Condensed tannins in Trifolium species and their significance for taxonomy and plant breeding. Genetic Resources and Crop Evolution, GRES-MS 999, 1-7.

Ferrari O. 1994. Meteorismo: Incidencia económica de la enfermedad. Gac Agr 14, 237-251.

Frame J, JFL Charlton, AS Laidlaw. 1998. Lucerne (syn.alfalfa) In: CAB International (ed). Temperate Forage Legumes. Ch.3. Wallingford, UK.

Frost DF, GW Horn, LI Croy, GL Burnett. 1978. Stocker bloat on wheat pasture. Animal Science Research Report of Oklahoma Agricultural Experimental Station, Oklahoma, USA, Pp 54-59.

Guaita S, M Gallardo. 1997. Utilización de la alfalfa en las unidades intensivas de producción de leche de la E.E.A. Rafaela. Producir XXI, Mayo, Pp 31-33.

Hall JW, W Majak, AL van Ryswyk, RE Howarth, CM Kalnin. 1988. The relationship of rumen cations and soluble protein with predisposition of cattle to alfalfa bloat. Can J Anim Sci 68, 431-437. (Original no consultado, citado por: Majak W, JW Hall, PW McCaughey. 1995. Pasture management strategies for reducing the risk of legume bloat in cattle. J Anim Sci 73, 1493-1498).

Hall JW, W Majak. 1989. Plant and animal factors in legume bloat. In: Cheeke PR (ed). Toxicants of Plant origin (Volume III). CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA, Pp 94-106.

Hall JW, W Majak, DG Stout, KJ Cheng, BP Goplen, RE Howarth. 1994. Bloat in cattle fed alfalfa selected for a low initial rate of digestion. Can J Anim Sci 74, 451-456.

Hall JW, W Majak. 1995. Effect of time of grazing or cutting and fee-ding on the incidence of alfalfa bloat in cattle. Can J Anim Sci 75, 271-273.

Hazlewood GP, JM Horsnell, JL Mangan. 1983. Trypsin isoinhibitors of lucerne: Association with leaf fraction I protein. Phytochemistry 22, 1107-1111.

Howarth RE. 1975. A review of bloat in cattle. Can Vet J 16, 281-294.Howarth RE, W Majak, DE Waldern, SA Brandt, AC Fesser, BP Goplen,

DT Spurr. 1977. Relationships between ruminant bloat and the chemical composition of alfalfa herbage. I. Nitrogen and protein fractions. Can J Anim Sci 57, 345-357.

Howarth RE, BP Goplen, AC Fesser, SA Brandt. 1978. A possible role for leaf cell rupture in legume pasture bloat. Crop Sci 18, 129-133.

Howarth RE, GW Horn. 1984. Wheat pasture bloat of stocker cattle: A comparison with legume pasture bloat. Proceedings of the National Wheat Pasture Symposium, October 24-25. Oklahoma State University, Oklahoma, USA, Pp 145-164.

Howarth RE, RK Chaplin, KJ Cheng, BP Goplen, JW Hall, R Hironaka, W Majak, OM Radostits. 1991. Bloat in cattle. Agriculture Canada Publication 1858/E, Ottawa, Canada.

Jones WT, JW Lyttleton. 1969. Bloat in cattle. XXIX. The foaming properties of clover proteins. N Z J Agric Res 12, 31-46.

Jones WT, JW Lyttleton. 1972. Bloat in cattle XXXVI. Further studies on the foaming properties of soluble leaf proteins. N Z J Agric Res 15, 267-277.

145


Kitroser C, M Correa Luna. 1993. Actualización en empaste. Evaluaciones de los controles y sus costos. Primer Congreso Internacional de Ganadería Intensiva. Bureau de Producción Animal, Buenos Aires, Argentina, Pp 51-61.

Kopecny J, J Wallace. 1982. Cellular location and some properties of proteolytic enzymes of rumen bacteria. Appl Environ Microbiol 43, 1026-1033.

Kudo H, KJ Cheng, MR Hanna, RE Howarth, BP Goplen, JW Costerton. 1985. Ruminal digestion of alfalfa strains selected for slow and fast initial rates of digestion. Can J Anim Sci 65, 157-161.

Laby RH. 1991. Bloat: Its etiology and significance to the Australian dairy industry. In: Dairy Research and Development Corporation (DRDC) (ed). Bloat / DRDC Bloat Workshop. Ellinbank, Australia.

Latimori NJ, AM Kloster, MA Amigone, L Cuerpo, A Pizza. 1992. Marchitamiento con paraquat en el control del meteorismo: efecto sobre la ganancia de peso y residuos en el tejido animal. Rev Arg Prod Anim 12, 217-222.

Latimori NJ, AM Kloster, CO Descarga, MA Amigone. 1997. Meteorismo espumoso o empaste. En: Latimori NJ, Kloster AM (eds). Invernada Bovina en Zonas Mixtas. Agro 2 de Córdoba, Marcos Juárez, Argentina, Pp 118-140.

Leedle JAZ, MP Bryant, RB Hespell. 1982. Diurnal variations in bacterial numbers and fluid parameters in ruminal contents of animals fed low - or high-forage diets. Appl Environ Microbiol 44, 402-412.

Lees GL, RE Howarth, BP Goplen, AC Fesser. 1981. Mechanical disrup-tion of leaf tissues and cells in some bloat-causing and bloat-safe forage legumes. Crop Sci 21, 444-448.

Lehninger AL. 1991. Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular. 2da ed. Omega S.A. Barcelona, España.

Lowe LB. 1991. Monensin controlled-release anti-bloat capsule. In: Dairy Research and Development Corporation (DRDC) (ed.) Bloat / DRDC Bloat Workshop, Ellinbank, Australia.

Lu CD. 1987. Implication of forage particle length on chewing activities and milk production in dairy goats. J Dairy Sci 70, 1411-1416.

Majak W, RE Howarth, KJ Cheng, JW Hall. 1982. Rumen conditions that predispose cattle to pasture bloat. J Dairy Sci 66, 1683-1688.

Majak W, JW Hall. 1990. Sodium and potassium concentrations in ruminal contents after feeding bloat-inducing alfalfa to cattle. Can J Anim Sci 70, 235-241.

Majak W, JW Hall, PW Mccaughey. 1995. Pasture management stra-tegies for reducing the risk of legume bloat in cattle. J Anim Sci 73, 1493-1498.

Majak W, GJ Garland, TJ Lysyk. 2008. The effect of feeding hay before fresh alfalfa on the occurrence of frothy bloat in cattle. Can J Anim Sci 88, 29-31.

McAllister TA, HD Bae, GA Jones, KJ Cheng. 1994. Microbial attachment and feed digestion in the rumen. J Anim Sci 72, 3004-3018.

McArthur JM, JE Miltimore. 1969. Bloat investigations. The pH of rumen contents and its role in legume bloat. Can J Anim Sci 49, 56-67.

Mendel VE, JM Boda. 1961. Physiological studies of the rumen with emphasis on the animal factors associated with bloat. J Dairy Sci 44, 1881-1898.

Moate PJ, T Clarke, LH Davis, RH Laby. 1997. Rumen gases and bloat in grazing dairy cows. J Agric Sci 129, 459-469.

Nolan JV. 1993. Nitrogen kinetics. In: Forbes JM, France J (eds). Quantitative Aspects of Ruminant Digestion and Metabolism. CAB International, Wallingford, UK.

Nugent JHA, JL Mangan.1981. Characteristics of the rumen proteolysis of fraction I (18S) leaf protein from lucerne (Medicago sativa L). Br J Nutr 46, 39-58.

Oliver WM. 1975. Effect of monensin on gains of steers grazed on Coastal bermudagrass. J Anim Sci 41, 999-1001.

Peralta EM, FJ Santini, JP Fay, G Bretschneider, J Soler. 2002. Prevención del meteorismo espumoso bovino con grano de maíz entero. 25º Congreso de la Asociación Argentina de Producción Animal. Buenos Aires, Argentina, Vol 22: Supl 1, p 52 (Abstract: NA38).

Phillips CJC, NL James, JP Murray-Evans. 1996. Effect of forage supplements on the incidence of bloat in dairy cows grazing high clover pastures. Vet Rec 139, 162-165.

Potter EL, RL Vanduyn, CO Cooley. 1984. Monensin toxicity in cattle. J Anim Sci 58, 1499-1511.

Pritchard KE, WK Mason, CR Stockdale, JB Moran. 1989. Integrating forage maize with pasture legumes for efficient dairy production in South Eastern Australia. Proceedings of the XVI International Grassland Congress, Nice, France, Pp 1143-1144.

Ramírez JS, HL Mitchell. 1960. The trypsin inhibitor of alfalfa. J Agric Food Chem 8, 393-395.

Reid C, RTJ Clarke, FRM Cockrem, WT Jones, JT Mcintosh, DE Wright. 1975. Physiological and genetical aspects of pasture (legume) bloat. In: Digestion and Metabolism in the Ruminant. Proceedings of the IV International Symposium on Ruminant Physiology, Sidney, Australia, Pp 525-536.

Reid C, P Vlieg, G Derrick, A Campbell. 1984. Bloat in cattle: anti-foaming agents for control. P.D. Hasselberg Government Printer. Wellington, New Zealand.

Roige MB, MO Tapia, R Rubio. 1998. Effects of paraquat on rumen microbial function in vitro. Anim Feed Sci Technol 72, Issue 3-4, (Abstract).

Segarra C, C Casalongué, RD Conde, 1997. Presencia de un inhibidor de proteasas en el fluido intercelular de hojas de trigo en el sistema planta patógeno Triticum aestivum - Septoria tritici. XXXIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica. Villa Giardino, Córdoba, Argentina, M13 (Resumen).

Stockdale R. 1976. Summary of Bloat Research, Kyabram. Internal Report. (Original no consultado, citado por: Fay JP, CJ Escuder, C Cangiano, P Davies. 1992. Empaste (meteorismo espumoso) en bovinos. Boletín técnico del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Balcarce, Argentina, Nº 111.

Stockdale CR. 1991. Efficacy of conventional bloat control methods in dairy cows. In: Dairy Research and Development Corporation (DRDC) (ed). Bloat / DRDC Bloat Workshop. Ellinbank, Australia.

Stockdale CR. 1994a. Persian clover and maize silage. II. Effects of variations in clover and silage consumption on the productivity of dairy cows at various stages of lactation. Aust J Agric Res 45, 1767-1782.

Stockdale CR. 1994b. Persian clover and maize silage. I. Silage as a supplement for lactating dairy cows offered herbage of different quality. Aust J Agric Res 45, 1751-1765.

Stockdale CR. 1994c. Incidence of bloat in lactating dairy cows fed clover-dominant herbage and maize silage. Proc Aust Soc Anim Prod 20, 214-216.

Stockdale CR. 1996. Influence of energy and protein supplements on the productivity of dairy cows grazing white clover swards in spring. Aust J Exp Agric 36, 771-776.

Stockdale CR. 1997a. Influence of energy and protein supplements on the productivity of dairy cows grazing white clover swards in spring. Aust J Exp Agric 37, 151-157.

Stockdale CR. 1997b. Supplements improve the production of dairy cows grazing either white clover or paspalum-dominant pastures in late lactation. Aust J Exp Agric 37, 295-302.

Tanner GJ, PJ Moate, LH Davis, RH Laby, L Yuguang, PJ Larkin. 1995. Proanthocyanidins (Condensed tannins) destabilise plant protein foams in a dose dependent manner. Aust J Agric Res 46, 1103-1109.

Vogel G. 1995. The effect of ionophores on feed intake by feedlot cattle. In: Owens FN (ed). Symposium on Intake by Feedlot Cattle. Oklahoma State University, Oklahoma, USA, Pp 281-288.

Waghorn GC. 1991a. Relationships between intra-ruminal pressure, distension, and the volume of gas used to simulate bloat in cows. N Z J Agric Res 34, 213-220.

Waghorn GC. 1991b. Intra-ruminal gas and bloat in cows. In: Dairy Research and Development Corporation (DRDC) (ed). Bloat / DRDC Bloat Workshop, Ellinbank, Australia.

Waghorn GC, ID Shelton. 1994. Effect of copper in a bloat drench on rumen by-pass in cattle. N Z J Agric Res 37, 87-92.

146

G BRETSCHNEIDER

Walgenbach RP, GC Marten. 1980. The latest theories concerning the cause of legume bloat in ruminants and effects of environment on alfalfa bloat potential. Forage and Grassland Conference. Ramada Inn-Bluegrass Convention Center Louisville, Kentucky, USA.

Walker-Simmons M, CA Ryan. 1977. Wound-induced accumulation of trypsin inhibitor activities in plant leaves. Plant Physiol 59, 437-439.

Wallace RJ, MA Cotta. 1988. Metabolism of nitrogen - containing com-pounds; Ch. 7. In: Hobson PN (ed). The Rumen Microbial Ecosystem. Elsevier Science Publishing Co. Inc., New York, USA.

Wilkins RJ, CA Morris. 1992. Predicting bloat susceptibility in the test tube. Proceedings of the 44th Ruakura Farmers’ Conference, Ruakura, New Zealand, Pp 111-115.

147

Arch Med Vet 42, 147-154 (2010)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 16.06.2010.

* Instituto de Ciencias Agrícolas, UABC, carretera Delta S/N, Ejido Nuevo León, CP. 21705, México; [email protected]

Crecimiento y características de canal en corderos Pelibuey puros y cruzados F1 con razas Dorper y Katahdin en confinamiento

Growth and carcass traits in pure Pelibuey lambs and crosses F1 with Dorper and Katahdin breeds in confinement

U Macías-Cruza, FD Álvarez-Valenzuelaa, J Rodríguez-Garcíaa, A Correa-Calderóna, NG Torrentera-Oliveraa, L Molina-Ramírezb, L Avendaño-Reyesa*

aInstituto de Ciencias Agrícolas, Universidad Autónoma de Baja California, Baja California, México.bBachillerato Tecnológico Agropecuario No. 41, Baja California, México.

SUMMARY

The aim of this study was to evaluate feedlot performance and carcass characteristics of 36 male and female lambs from the genotypes pure Pelibuey, Dorper x Pelibuey, and Katahdin x Pelibuey under desert conditions in northwestern Mexico. Lambs were slaughtered for carcass evaluation after 85 d of a productive performance test. Dorper x Pelibuey lambs had higher (P < 0.05) daily weight gain and feed intake than the other genotypes. However, there were no differences (P > 0.05) among the three genotypes in carcass yield, Longissimus dorsi muscle area and back-fat thickness. Males presented higher (P < 0.01) daily weight gain and lower (P < 0.01) feed conversion than females. Hot and cold carcasses were heavier (P < 0.05) in males than in females, but carcass yield and back-fat thickness were similar (P > 0.05) between sexes. Yield and total weight of primary cuts were also similar (P > 0.05) among genotypes and sexes. These findings suggest that the Dorper breed can be used in crossbreeding schemes to improve mutton production in arid zones, like in northwestern Mexico.

Palabras clave: ovinos de pelo, cruzamientos, crecimiento, canales, estrés calórico.

Key words: sheep, crossbreeding, growth, carcasses, heat stress.

INTRODUCCIóN

Las condiciones climáticas extremas predominantes en las zonas desérticas de todo el mundo han sido factores que afectan el desarrollo de la actividad agropecuaria en estas regiones debido al estrés que se presenta en el animal. Pocas razas de las diferentes especies de ani-males domesticados son capaces de sobrevivir y, más aún, de producir eficientemente bajo estas condiciones. Normalmente, este clima exige a las diferentes especies un máximo de disponibilidad de energía para mantener la homeostasis en su cuerpo, lo cual limita la producción (Marai y col 2007). Algunas razas de ovinos y cabras se encuentran ampliamente distribuidas bajo diferentes climas y han demostrado sobrevivir y producir en condiciones ambientales donde para el ganado sería imposible (El Khidir y col 1998).

En el noroeste de México, donde las condiciones climáticas son típicamente desérticas, los ovinos de pelo de raza Pelibuey han sido adoptados por los productores para la producción de corderos en sus explotaciones. Bajo

estas condiciones, esta raza ha demostrado una gran capa-cidad reproductiva, rusticidad y adaptación, colaborando en mejorar la eficiencia productiva de los rebaños debido a su reducido manejo y menores costos de producción (Avendaño y col 2004). Sin embargo, los corderos Pelibuey al nacimiento presentan pesos bajos; a su vez, su crecimiento y calidad de la canal son inferiores a las razas de lana o cárnicas al ser clasificada como una raza ligera (Gutiérrez y col 2005). Esta situación ha provocado recientemente que ovinocultores de la región incorporen a sus rebaños sementales de razas especializadas en producción de carne para realizar esquemas de cruzamientos, tales como Dorper y Katahdin. Los ovinos Dorper bajo las condiciones del desierto de Sudáfrica han demostrado excelente adaptación basada en su nula estacionalidad a través del año y gran velocidad de crecimiento (Cloete y col 2000). Por su parte, la raza Katahdin desarrollada en el sur de Estados Unidos se ha caracterizado como de buen desarrollo productivo y reproductivo en condiciones tropicales y áridas (Burke y Apple 2007). Se ha observado que los cruzamientos entre hembras Pelibuey y sementales Dorper o Katahdin producen corderos para el abasto que presentan tasas de crecimiento superiores a los Pelibuey puros, así como buena adaptación en climas áridos (Avendaño y col 2004). En otros estudios realizados en climas templados (Gutiérrez y col 2005) o tropicales (Bores y col 2002, Canton y

148

U MACÍAS-CRUZ Y COL

col 2009a) también se ha observado una superioridad en crecimiento de corderos Pelibuey cruzados con alguna raza cárnica, de lana o de pelo comparados a los puros, lo cual es atribuido al efecto de heterosis y al más rápido grado de madurez que alcanzan los corderos cruzados. Sin embargo, hace falta generar más información del creci-miento y características de la canal de corderos de pelo cruzados con razas cárnicas, bajo condiciones desérticas del noroeste de México, ya que el ambiente puede ser un factor determinante en la utilización de la energía dispo-nible en la ración y consecuentemente en el desarrollo del animal. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el comportamiento productivo en corral y las características de canal en corderos Pelibuey puros y sus cruzas F1 con Dorper y Katahdin bajo un clima desértico.

MATERIAL Y MÉTODOS

El estudio se realizó en la Unidad Experimental Ovina del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California (UABC), que se encuentra ubicada en el Valle de Mexicali, Estado de Baja California, en el noroeste de México. Las condiciones climáticas predominantes en esta región son clasificadas como Desierto de Sonora, que se caracteriza por ser un clima extremadamente seco y caliente, con temperaturas máximas en verano (50 ºC) y mínimas durante invierno (0 ºC). La precipitación media anual es de 80 mm, siendo entre los meses de noviembre y diciembre donde mayormente se concentra el período de lluvias (García 1987).

ANIMALES Y MANEJO

Todos los procedimientos desarrollados sobre los ani-males experimentales se realizaron en base a las normas oficiales mexicanas1. Un total de 50 corderos nacidos en noviembre del 2006 producto de un esquema de cruza-mientos entre 60 hembras de raza Pelibuey y tres machos Dorper, Katahdin y Pelibuey (uno de cada raza) fueron destetados cuando alcanzaron una edad de 90 d. Al des-tete, a estos animales se les aplicaron vía intramuscular vitaminas (A, D y E) y antiparasitario. Posteriormente se seleccionaron 36 corderos, 12 de cada cruzamiento (seis machos y seis hembras): Pelibuey puro (Pb), Dorper x Pelibuey (DrX) y Katahdin x Pelibuey (KaX), para reali-zar el experimento. Como los corderos presentaban una edad variable entre los 129 y 136 d al momento de iniciar la prueba, el peso vivo (PV) inicial se ajustó a 133 d de edad (Notter y col 1975). Las medias de los PV iniciales

1 Secretaría de Economía de México. 1997. Dirección General de Normas: Catálogo de normas oficiales mexicanas. NOM-051-ZOO-1995 (trato humanitario en la movilización de animales) y NOM-033-ZOO-1995 (sacrificio humanitario de los animales domésticos y salvajes en México), http://www.economia-noms.gob.mx/noms/inicio.do

fueron 18,1 ± 0,73, 22,6 ± 0,73 y 19,2 ± 0,73 kg para Pb, DrX y KaX, respectivamente. El PV inicial para todos los machos y hembras fue 21,1 ± 0,59 y 18,3 ± 0,59 kg, respectivamente. Los corderos se alojaron en parejas de similar genotipo y sexo en corrales provistos de bebede-ros, comederos y sombra. La prueba de comportamiento productivo tuvo una duración de 100 d, 15 d de adaptación y 85 d de período experimental. La alimentación durante este período consistió de dos dietas (cuadro 1): a) dieta de iniciación, ofrecida los primeros 32 d (19,6% PC y 2,65 Mcal/kg de EM) y b) dieta de finalización, ofrecida por el resto del experimento (16,4% PC y 2,73 Mcal/kg de EM). Todos los días se retiró el alimento rechazado de un día anterior para poder ofrecer alimento fresco a razón de dos veces por día (8:00 y 16:00 h). Además, los corderos fueron pesados cada 18 d hasta finalizar el experimento para ajustar el alimento ofrecido por día a 4,5% de su PV. Diariamente, el alimento rechazado y ofrecido se pesó para estimar el consumo diario de alimento.

Una vez que se finalizó la prueba de comportamiento productivo, los corderos de los tres genotipos fueron condu-cidos a la planta faenadora universitaria y sacrificados por el método de degüello sin previa insensibilización. Previo al sacrificio (24 h), se les retiró el agua y el alimento. La piel, cabeza y órganos viscerales fueron retirados de cada

Cuadro 1. Ingredientes y composición química de las dietas utilizadas para la alimentación de los corderos durante el período de engorda. Ingredients and chemical composition of diets used to feed the lambs during the fattening period.

Ingredientes (g/kg de alimento)Dietas

Iniciación Finalización

Grano de trigo 417,7 533,7

Heno de alfalfa 313,3 266,9

Harina de soya 156,6 106,7

Paja de trigo 52,2 53,4

Melaza 52,2 31,9

Sal común en grano 4,7 4,8

Piedra caliza 3,3 2,5

Composición química (% en base fresca)

Materia seca 93,8 93,6

Materia orgánica 85,3 85,4

Proteína cruda 19,6 16,4

Extracto etéreo 1,4 1,1

Fibra cruda 14,8 13,2

Fibra detergente neutral 17,5 15,1

Cenizas 8,5 8,2

Energía metabolizable (Mcal/kg) 2,6 2,7

149

OVINOS DE PELO, CRUZAMIENTOS, CRECIMIENTO, CANALES, ESTRÉS CALóRICO

canal y su peso fue registrado de forma separada. A su vez, fue medido el peso de la canal caliente. Posteriormente, las canales se refrigeraron durante 24 h a 4 ºC para determinar el peso de la canal fría y la longitud de la canal, la cual se estimó midiendo la distancia desde la última vértebra cervical hasta la última vértebra sacra. Las canales fueron cortadas a lo largo de la línea media dorsal con una sierra eléctrica. El lado derecho de cada canal fue trozado entre la 12 y 13va costilla para medir espesor de grasa dorsal y área del músculo Longissimus dorsi usando una cuadrícula de puntos (64 mm). Finalmente, se realizó un despiece de cada canal para obtener el peso del cuello y cortes primarios (lomo, costillares, paletas y piernas). La suma de los pesos de los cortes primarios fue considerada como peso total de cortes primarios (PTCP), el cual a su vez fue expresado como porcentaje del peso de la canal fría para determinar el rendimiento en cortes primarios (RCP). El peso de piernas, paletas, lomo y costillas fue expresado como porcentaje del peso de la canal fría, mientras que el peso de la canal caliente fue expresado como porcentaje del peso al sacrificio.

CONDICIONES CLIMÁTICAS

De la Estación Climatológica Experimental de la UABC se colectó la información referente a las condi-ciones climáticas (temperatura ambiental, T; y humedad relativa, HR) registradas diariamente durante el desarrollo del experimento. A partir de esta información, se calculó el índice de temperatura-humedad (ITH) con la ecuación propuesta para ovinos (Kelly y Bond 1971):

ITH = T - {[0,55*(1-HR)] * (T-14,4)}

El ITH sirve para determinar el grado de estrés calórico al cual está sometido un animal bajo condiciones ambientales.

VARIABLES DE ESTUDIO

Las variables de estudio evaluadas fueron peso final (peso registrado al finalizar la prueba de comportamiento productivo), consumo diario de alimento, ganancia diaria

de peso, conversión alimenticia, longitud de la canal, espesor de grasa dorsal y área del músculo Longissimus dorsi. Además se analizó peso de canal caliente, de canal fría, de cabeza, de piel, de órganos viscerales y del total de cortes primarios y se calculó el porcentaje de cada corte primario (en base al peso de canal fría), de rendimiento en canal y del total de cortes primarios.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Las variables fueron sometidas a un análisis de varianza utilizando un diseño completamente al azar con un arreglo factorial 2 x 3, donde el modelo incluyó el efecto fijo de genotipo (Pb, DrX y KaX) y sexo (macho y hembra), así como su posible interacción. El peso ajustado a 133 d se incluyó como covariable en el modelo, mientras que el peso final fue considerado como una covariable para peso de canal caliente y canal fría. Las comparaciones de medias fueron hechas con la prueba “t” a una α = 0,05. El análisis estadístico fue desarrollado con el paquete es-tadístico SAS versión 9,12 para Windows (SAS Institute, Cary, NC, USA), utilizando el procedimiento PROC GLM (SAS 2004). Los resultados para cada variable de estudio se presentan como medias ± error estándar.

RESULTADOS

La temperatura ambiental e ITH variaron entre los meses de estudio (cuadro 2), tendiendo a incrementarse a medida que avanzó el desarrollo del experimento. En promedio (máximos y mínimos), la temperatura, la humedad relativa y el ITH en el período experimental fueron de 25,4 ºC (16,7 en abril a 36,0 ºC en junio), 30,7% (9,5 en mayo a 50,7% en abril) y 22,7 unidades (15,7 en abril a 28,5 unidades en junio), respectivamente. En general, durante los tres meses de estudio se regis-traron días con ITH superior a las 23 unidades, siendo en mayo y junio donde se observó mayor cantidad de días con estos índices de estrés calórico. Tanto en mayo como en junio la temperatura e ITH presentaron valores promedios de 28,5 y 33,0 ºC y de 23,0 y 25,8 unidades, respectivamente.

Cuadro 2. Condiciones climáticas e índice de temperatura-humedad predominantes durante el desarrollo del experimento*. Climatic conditions and temperature-humidity index during the experiment.

Mínimas Máximas Promedios

T H ITH T H ITH T H ITH

Abril 16,7 17,2 15,7 30,0 50,7 23,1 23,7 33,0 19,8Mayo 22,4 9,5 18,9 33,1 49,9 24,1 28,5 28,1 22,5Junio 25,4 17,2 20,4 36,0 39,9 28,5 33,0 31,1 25,8

* T = Temperatura ambiental, HR = Humedad relativa, ITH = Índice de temperatura-humedad.

150


La interacción genotipo x sexo fue estadísticamente significativa (P < 0,05) sólo para peso final. El peso final entre hembras KaX (34,9 ± 1,1 kg) y Pb (32,3 ± 1,1 kg) fue estadísticamente similar (P > 0,05), pero menor (P < 0,05) al observado en los machos de los tres genotipos (38,8 ± 1,1, 39,3 ± 1,1 y 37,2 ± 1,1 kg para DrX, KaX y Pb, respectivamente) y las hembras DrX (38,9 ± 1,1 kg). Además, entre los machos y las hembras DrX también se observaron pesos finales similares (P > 0,05).

Los animales estudiados presentaron en promedio 206 ± 10 g de ganancia diaria de peso, 1,3 ± 0,1 kg de alimento consumido por día y una conversión alimenticia de 6,6 ± 0,3 kg (cuadro 3). Los corderos DrX ganaron 16 y 25% más peso por día (P < 0,05) que los KaX y Pb, respectivamente; asimismo, consumieron 16 y 18% más alimento por día (P < 0,05), respectivamente. Los corderos de los tres genotipos consumieron cantidades similares (P > 0,05) de alimento para incrementar un kilogramo de su PV. Por otra parte, se observó que la ganancia diaria de peso y el consumo diario de alimento fue mayor (P < 0,01) en 32 y 14%, respectivamente, en machos que en hembras. Adicionalmente, la conversión alimenticia en machos (5,9 ± 0,2) fue menor (P < 0,05) que en hembras (7,3 ± 0,2).

El genotipo no afectó significativamente (P > 0,05) las medias de rendimiento en canal, peso de la cabeza, peso de los órganos viscerales, área del músculo Longissimus dorsi y espesor de grasa dorsal (cuadro 4). Sin embargo, el peso de la canal caliente (20,1 ± 0,6 vs 18,3 ± 0,6 kg) y canal fría (18,9 ± 0,6 vs 16,6 ± 0,6 kg) fue mayor (P < 0,01) en corderos DrX que en Pb. Las canales de corderos KaX presentaron pesos semejantes (P > 0,05) a los otros dos genotipos estudiados. En relación a la longitud de la canal, las canales fueron más cortas en el genotipo KaX por 5 cm (P < 0,01) que las del genotipo DrX (63,0 ± 1,3 vs 58,0 ± 1,3), pero de tamaño similar (P > 0,05) a las del genotipo Pb. Las pieles de los corderos cruzados pesaron en promedio 350 g más (P < 0,01) que las de corderos puros Pb. No obstante, el sexo resultó significa-tivo (P < 0,05) sobre las características de canal medidas,

con excepción de las variables (P > 0,05) rendimiento en canal, área del músculo Longissimus dorsi y espesor de grasa dorsal. En los machos se observaron canales más largas (P < 0,01; 62,3 ± 1,0 vs 58,7 ± 1,0 cm) y pesadas (P < 0,05; 20,0 ± 0,5 vs 18,2 ± 0,5 kg para canal caliente y 18,81 ± 0,5 vs 16,54 ± 0,5 kg para canal fría), así como valores superiores (P < 0,05) en el peso de cabeza, piel y órganos viscerales en relación a las hembras.

En cuanto a los resultados de cortes primarios (cuadro 5) se observó que el genotipo sólo influyó (P < 0,01) en el porcentaje del corte pierna y sexo sobre el porcentaje de costilla y de paletas. El porcentaje de pierna fue mayor (P < 0,05) en los genotipos DrX (25,4 ± 3,2%) y KaX (24,4 ± 3,2%) comparado con el Pb (20,6 ± 3,2%). Mientras que el porcentaje del corte paleta fue más alto (P < 0,05) en machos (23,9 ± 0,8 vs 19,3 ± 0,8%) y el de costillas en hembras (20,5 ± 0,8 vs 16,4 ± 0,8%), respectivamente.

DISCUSIóN

Cuando las combinaciones entre temperatura y hume-dad relativa producen un ITH ≥ 23 unidades se consideran condiciones ambientales suficientes para producir un estrés calórico sobre los ovinos (Kelly y Bond 1971). Por los ITH registrados durante el desarrollo del experimento se consideró que los animales estuvieron bajo un estrés calórico de mo-derado a severo, principalmente en mayo (entre 18,9 y 24,1 unidades) y junio (entre 20,4 y 28,5 unidades). En ovinos y otras especies domésticas, las condiciones de estrés calórico se relacionan con una disminución en el consumo de alimento como consecuencia de una reducción en el funcionamiento de la glándula tiroides (Marai y col 2007). En consecuencia, esta reducción en el consumo se refleja negativamente sobre la tasa de crecimiento, peso al sacrificio y sobre la calidad de la carne (Srikandakumar y col 2003). En este estudio, el consumo diario de alimento, la ganancia diaria de peso y el rendimiento en canal presentaron valores promedios de 1,3 kg, 206 g y 53%, respectivamente. Estos resultados son semejantes y en ocasiones superiores a otros reportados en corderos Pelibuey puros y cruzados bajo condiciones

Cuadro 3. Medias ± errores estándar (E.E.) del comportamiento productivo en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro y cruzados. Means ± standard error of the productive performance in male and female lambs of the genotype Pure Pelibuey and their crosses.

VariablesGenotipo** Sexo

DrX KaX Pb E.E. Macho Hembra E.E.

Ganancia diaria de peso (g/d) 240,0a 200,0b 180,0b 0,1 250,0a 170,0b 0,1

Consumo de alimento (kg/d) 1,5a 1,3b 1,2b 0,0 1,4a 1,2b 0,0

Conversión alimenticia* 6,3a 6,3a 6,9a 0,3 5,9a 7,3b 0,2

Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superíndice (a, b, c) significa diferencia a P < 0,05.* Conversión alimenticia: Consumo de alimento/Ganancia diaria de peso (kg/kg).** DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.

151


de estabulación y sin presencia de estrés calórico (Bores y col 2002, Canton y col 2007, Canton y col 2009a, Partida de la Peña y col 2009). Por ejemplo, en condiciones tropicales (Canton y col 2007) reportaron valores promedios para con-sumo de alimento, ganancia de peso y rendimiento en canal de 1,2 kg/d, 232 g/d y 55%, respectivamente, en corderos de genotipos similares a los usados en esta investigación. Mientras que bajo un clima templado Partida de la Peña y col 2009 observaron que corderos Pb y cruzas de Pelibuey con Suffolk y Dorset consumieron 1,1 kg/d de alimento,

incrementaron su peso 175 g/d y el promedio de rendimiento en canal fue de 52%. El ITH ≥ 23 que señala como punto de inicio de estrés calórico en ovinos fue estimado en base a razas de lana (Kelly y Bond 1971), lo cual explica por qué las condiciones ambientales en que se realizó este estudio no afectaron negativamente el crecimiento de los corderos estudiados. Hubiese sido apropiado haber usado un punto de ITH referencial de estrés calórico para ovinos de pelo, sin embargo, no se encontró ningún estudio donde éste se haya estimado.

Cuadro 4. Medias ± errores estándar (E.E.) de características de canal en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro y cruzados. Means ± standard error of carcass characteristics in male and female lambs of the genotype Pure Pelibuey and their crosses.

VariablesGenotipos* Sexo


Peso al sacrificio (kg) 39,9a 36,6b 34,2c 0,8 39,4a 34,4b 0,6

Peso de canal caliente (kg) 20,1a 18,9ab 18,3b 0,6 20,0a 18,2b 0,5

Peso de canal fría (kg) 18,9a 17,5ab 16,6b 0,6 18,8a 16,5b 0,5

Rendimiento en canal (%) 52,6a 52,4a 54,5a 1,1 53,1a 54,1a 0,9

Cabeza (kg) 1,4a 1,4a 1,3a 0,1 1,6a 1,2b 0,1

Piel (kg) 2,7a 2,6a 2,3b 0,1 2,7a 2,3b 0,1

órganos viscerales (kg) 1,5a 1,6a 1,3a 0,1 1,7a 1,2b 0,6

Longitud de la canal (cm) 63,0a 58,0b 60,2ab 1,3 62,3a 58,7b 1,0

Área del M.L.D. (cm2)** 16,2a 16,8a 16,3a 0,9 17,0a 15,9a 0,7

Grasa dorsal (cm) 0,3a 0,3a 0,4a 0,1 0,3a 0,4a 0,1

Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superíndice (a, b) significa diferencia a P < 0,05.* DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.** M.L.D. = Muscle Longissimus dorsi;

Cuadro 5. Medias ± errores estándar (E.E.) de los cortes primarios en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro y cruzados. Means ± standard error of wholesale cuts in male and female lambs of genotypes pure Pelibuey and their crosses.

VariablesGenotipos* Sexo


Piernas (%) 25,4a 24,4a 20,6b 3,2 24,2a 22,8a 1,0

Lomo (%) 21,9a 19,3a 18,1a 4,7 18,7a 20,9a 1,7

Costillas (%) 16,5a 19,3a 19,6a 3,4 16,4a 20,5b 0,8

Paletas (%) 21,9a 21,3a 21,5a 3,2 23,9a 19,3b 0,8

Cuello (%) 5,1a 6,1a 5,5a 1,3 5,4a 5,7a 0,5

PTCP (kg)** 16,4a 16,0a 15,3a 1,7 15,9a 15,9a 0,4

RCP (%)3 85,7a 84,3a 79,9a 5,2 83,2a 83,5a 1,7

Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superíndice (a, b) significa diferencia a P < 0,05.* DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.** PTCP: Peso total de los cortes primarios, 3 RCP: Rendimiento en cortes primarios.

152


Los ovinos de pelo son razas que se desarrollaron en climas tropicales donde las temperaturas y humedades son altas; mientras que las razas de lana siempre se han mantenido en climas fríos. Debido a esto, los ovinos de pelo muestran ser razas más tolerantes al calor y adap-tables a diferentes condiciones ambientales (Fitzhugh y Bradford 1983). Esta situación permite hipotetizar res-pecto al potencial que tendrían los ovinos de pelo (como Pelibuey, Dorper y Katahdin), para sobrevivir y producir en cualquier región de México, particularmente conside-rando que el lugar donde se desarrolló este estudio es una de las regiones del país con el registro de temperaturas más elevadas durante el verano.

Los resultados de efecto de genotipo y sexo sobre el peso final coinciden con los encontrados en otro estudio (Partida de la Peña y col 2009), en el cual reportaron pesos finales similares entre machos de los genotipos Pb, Suffolk x Pelibuey y Dorset x Pelibuey, asimismo, menor peso en las corderas Pb que en las cruzadas. También en otro experimento Canton y col 2009b observaron que corderos machos de genotipo Pb (30,3 kg), DrX (33,8 kg) y KaX (34,8 kg) presentaron pesos similares después de man-tenerlos en corral por 75 d. Estos resultados sugieren un crecimiento similar entre los machos de los tres genotipos, lo cual posiblemente se deba al nivel de proteína (19,6 y 16,4%) y energía (2,6 y 2,7 Mcal/kg) que contenían la dietas ofrecidas. En un estudio realizado en el centro de México, Ruiz y col (2009) observaron que cuando ofrecieron a corderos Dorper y Pb una dieta con 18% de proteína, después de 70 d de consumo el peso vivo fue similar (37,4 vs 36,8 kg); mientras que cuando ofrecieron la dieta con 14% de proteína, los corderos Dorper (37,2 kg) pesaron 7% más que los Pb (34,6 kg). Comparando tres niveles de energía metabólica (2,2, 2,5 y 2,8 Mcal/kg de MS) sobre el comportamiento productivo de corderos Pb, DrX y KaX, se observó un mayor crecimiento cuando se alimentaron con la dieta que contenía 2,8 Mcal/kg de MS, en comparación de cuando se alimentaron con la dieta que contenía 2,2 Mcal/kg de MS (Canton y col 2009a). Por lo tanto, los machos de los tres genotipos de este estudio pesaron estadísticamente igual porque los contenidos de proteína y energía metabolizable estuvieron muy cercanos a los óptimos recomendados en la literatura, ya que según Solís y col (1991) para corderos de crecimiento moderado éstos corresponden a 2,6 Mcal/ kg de MS de EM y 14,7% de PC. Adicionalmente, las corderas Pb y KaX presentaron pesos finales inferiores a los corderos de los tres genotipos y corderas DrX, lo cual está relacionado parcialmente con la menor velocidad de crecimiento que presentan las hembras debido a su sistema hormonal (Bores y col 2002). Asimismo, dentro del grupo de hembras, el mayor incremento de peso final en las DrX puede atribuirse parcialmente a que las hembras de raza cárnicas tienden fijar hasta 40% mayor grasa corporal que las razas prolíficas (Canton y col 2009b). También este resultado se puede deber a la habilidad que tienen los ovinos de genotipo Dorper para

madurar a edad más temprana y fijar entre la carne gran cantidad de grasa, lo cual no ha sido observado en ninguna otra raza de pelo, incluyendo Katahdin y Pelibuey (Cloete y col 2007). Lo anterior explica la razón por la que tanto machos como hembras de genotipo DrX presentaron ma-yores pesos finales en comparación a Pb y KaX.

En la literatura existe marcada discrepancia concer-niente al comportamiento productivo que presentan los corderos producto de esquemas de cruzamiento entre razas de pelo prolíficas y razas especializadas para producción de carne. Algunos estudios (Pineda y col 1998, Bunch y col 2004, Partida de la Peña y col 2009) señalan que los corderos híbridos presentan un mayor incremento en su peso que los puros, mientras en otros no reportan dife-rencias significativas, sólo tendencias numéricas (Canton y col 2007, Canton y col 2009a). Los resultados de este estudio coinciden en parte con aquellas investigaciones donde han encontrado diferencias en la tasa de crecimien-to entre genotipos a favor de las cruzas. Los corderos DrX ganaron 25% más de peso por día que los Pb, sin embargo, los corderos KaX presentaron similar tasa de crecimiento que los Pb. Posiblemente estos resultados estén relacionados con el efecto de heterosis (Bunch y col 2004), el cual se expresa en las crías al aparearse pro-genitores de dos razas puras, aunque en esta investigación la falta de información sobre la ganancia diaria de peso que alcanzan los corderos puros Dorper y Katahdin no permite observar el nivel de heterosis adquirido por la acción del cruzamiento practicado. Otra causa de estos resultados es la diferencia en el peso adulto entre las razas utilizadas (Notter y col 2004). El ovino Pelibuey se caracteriza por ser una raza ligera en relación a la raza Dorper y Katahdin, asimismo, en general a las razas de lana (Bradford 2002).

En el consumo diario de alimento, los corderos DrX consumieron 16 y 18% más que los KaX y Pb, respec-tivamente. En un estudio realizado en Estados Unidos también encontraron que los corderos St. Croix puros consumieron 8 y 16% menos alimento que las cruzas de cordero Callipyge wool x St. Croix y Dorper x St. Croix, respectivamente (Bunch y col 2004). Igualmente en México han reportado diferencias en el consumo entre corderos Pb, DrX y KaX de 8% –en promedio– a favor de las cruzas (Canton y col 2009a). En este estudio, los corderos DrX consumieron mayor cantidad de alimento, por lo cual ganaron también mayor PV por día. Se encuentra documentado que los animales cambian su consumo para ajustar sus requerimientos nutricionales (Forbes 1986). Así, el consumo de alimento se relaciona con los cambios en el peso vivo. Cabe mencionar que esta relación positiva entre consumo y ganancia conllevó a que no se observaran diferencias en la conversión alimenticia (6,3 para corderos híbridos y 6,9 para Pb). El comportamiento observado entre los genotipos estudiados sobre conversión alimen-ticia está acorde a lo reportado previamente al comparar corderos de raza de pelo puros y sus cruzas (Canton y

153


col 2009a, y Bunch y col 2004). Se puede inferir que los genotipos utilizados presentan similar eficiencia en el uso del alimento consumido al nivel de proteína y energía que contenían las dietas.

Los resultados concernientes al efecto del sexo son consistentes con los reportados en otros estudios (Pineda y col 1998, Bores y col 2002, Partida de la Peña y col 2009) donde mencionan que los machos tienden a presentar tasas de crecimiento más altas y a utilizar más eficientemente el alimento consumido que las hembras. Esto es atribuido al efecto anabólico de los andrógenos presentes en los machos (Bradford 2002). Por otra parte, el mayor consumo de alimento que registraron los machos se relaciona también con el mayor incremento de peso (Bores y col 2002).

En corderos Pb, Suffolk x Pelibuey y Rambouillet x Pelibuey sacrificados a los 35 kg de PV, no se encontraron diferencias entre las medias del peso de la canal caliente y fría por efecto de genotipo (Gutiérrez y col 2005). Canton y col (2009b) tampoco encontraron diferencias para estas variables al comparar canales del genotipo Pb, DrX y KaX. Ambos resultados son contrarios a los observados en este estudio. Esto posiblemente se deba a que en este trabajo hubo diferencias entre los PV al sacrificio de los corderos (de 10 a 14% más pesados al sacrificio los DrX y KaX) debido a que fueron sacrificados a la misma edad, mientras que en los resultados reportados en la literatura, los genotipos usados se sacrificaron a pesos similares. Además, canales de DrX fueron más pesadas y largas comparadas a las de Pb debido a diferencias en el tamaño corporal en relación al peso maduro (Bradford 2002). Sin embargo, estas diferencias entre genotipos no fueron detectadas en la evaluación de rendimiento de canal, lo que es coincidente con lo reportado por otros autores (Bores y col 2002, Gutiérrez y col 2005, Partida de la Peña y col 2009). La ausencia de diferencias en rendimiento de canal entre los genotipos estudiados se atribuye a que no se observaron variaciones significa-tivas sobre el espesor de grasa dorsal (Bradford 2002). Aunque existen otros factores que también pueden ayudar a explicar este resultado, tal como el bajo contenido gastrointestinal al sacrificio, grado de finalización y los pesos similares registrados para los componentes corpo-rales no considerados en el peso de la canal (Gutiérrez y col 2005). Por otra parte, el peso de la piel varió entre los genotipos siendo más pesadas las de corderos DrX (2,7 kg) y KaX (2,6 kg). Esto se debe al mayor tamaño corporal que presentaban dichos genotipos. Características como peso de la cabeza, peso de los órganos viscerales, área del músculo Longissimus dorsi y el espesor de grasa dorsal no mostraron variaciones en sus medias por efecto de genotipo. Igualmente, otros autores tampoco reportaron diferencias para estas características de canal entre corderos Pb y sus cruzas con razas cárnicas (Bores y col 2002, Bunch y col 2004).

En la literatura se menciona que entre corderos de genotipos de razas puras o sus cruzas no hay diferencias

en cortes primarios cuando son expresados como por-centaje del peso de la canal (Snowder y Dunckett 2003, Gutiérrez y col 2005, Espinoza y col 2009). Esto debido a que a medida que se expresa el peso como porcentaje, la variabilidad entre pesos de la canal y de cada corte tiende a disminuir. Los resultados para cortes primarios por efecto de genotipo del presente estudio son consis-tentes con la literatura a excepción de porcentaje del corte pierna, el cual fue 4,2% mayor en las cruzas. El incremento del peso de las piernas como porcentaje de canal fría posiblemente esté relacionado con una madu-rez más tardía en la raza Pelibuey en comparación con los otros genotipos (Espinoza y col 2009), y además, con una mayor cantidad de grasa intramuscular en las piernas de los corderos híbridos, ya que en otro estudio se encontró que la grasa se distribuye más rápidamente en los cuartos anteriores comparado con las otras partes de la canal (Gallo 2002).

Los resultados de efecto de sexo sobre características de la canal se debieron en gran medida a diferencias entre los pesos al sacrificio. Los machos presentaron en promedio, un peso al sacrificio de 39,4 kg, mientras que las hembras de 34,4 kg. Así, variables relacionadas con la longitud y el peso de los componentes de la canal (canal caliente, canal fría, cabeza, piel y órganos viscerales) presentaron valores más altos en machos que en hembras. En un estudio (Gutiérrez y col 2005) donde sacrificaron corderos y cor-deras a los 35 kg de los genotipos Pb, Suffolk x Pelibuey y Rambouillet x Pelibuey, no se observaron diferencias en peso (15,9 kg para machos y 16,5 kg para hembras) ni en longitud (60,3 cm para machos y 60,4 cm para hembras) de la canal. También se considera que estos resultados estuvieron influenciados por el efecto hormonal, el cual en los machos favorece que haya un mayor desarrollo muscular y en las hembras una mayor fijación de grasa (Bradford 2002). Anteriormente, en animales Pelibuey y sus cruzas con Suffolk y Dorset se detectó una mejor relación músculo/grasa en machos (5,8) que en hembras (3,5) (Partida de la Peña y col 2009). Por otra parte, otros estudios (Notter y col 2004, Gutiérrez y col 2005) tam-bién han reportado que no existen diferencias importantes entre sexos para rendimiento en canal, área del músculo Longissimus dorsi y espesor de grasa dorsal.

Actualmente no existe una tendencia bien definida del efecto de sexo sobre el porcentaje de cortes primarios. Factores como peso al sacrificio, edad, concentraciones hormonales, ambiente y alimentación se han relacionado con las variaciones en los resultados. En este estudio se observó que el sexo solamente influyó sobre el porcentaje de los cortes paleta y de costillares. No obstante, otro es-tudio (Gutiérrez y col 2005) encontró que el sexo afectó solamente porcentaje de cuello y lomo.

En las condiciones en que se realizó el presente estu-dio, los corderos de genotipo DrX presentaron tasas de crecimiento y consumos de alimento más altos que los genotipos Pb y KaX. Además, a pesar de que los corderos

154


Pb no son de raza cárnica, mostraron rendimientos en canal tan satisfactorios como las cruzas con razas especializadas en producción de carne (Dorper y Katahdin). Por otra parte, los resultados sugieren que sería recomendable engordar machos en lugar de hembras debido a su mayor tasa de crecimiento, eficiencia para aprovechar los nutrientes del alimento para incrementar su peso y por la producción de canales más pesadas. Los registros de ganancia diaria de peso y peso al sacrificio de los corderos, sugieren buena capacidad de adaptación de las razas de pelo utili-zadas al clima árido y seco, al menos en condiciones de confinamiento.

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue evaluar el comportamiento productivo en corral y las características de canal de 36 corderos (machos y hembras) de los genotipos Pelibuey puro, Dorper x Pelibuey y Katahdin x Pelibuey bajo condiciones desérticas del noroeste de México. Después de 85 d de prueba de comportamiento en corral, se sacrificaron todos los corderos para la evaluación de sus canales. Los corderos Dorper x Pelibuey presentaron mayor (P < 0,05) ganancia diaria de peso y consumo diario de alimento que los otros dos genotipos. Sin embargo, entre los tres genotipos no se observaron diferencias (P > 0,05) para rendimiento en canal, área del músculo Longissimus dorsi y espesor de grasa dorsal. Los machos presentaron mayor ganancia diaria de peso (P < 0,01) y menor conversión alimenticia que las hembras. Los pesos de la canal caliente y fría fueron mayores (P < 0,05) en machos que en hembras, pero el rendimiento en canal y el espesor de grasa dorsal fueron similares (P > 0,05) entre ambos sexos. El peso total y el rendimiento de cortes primarios fueron similares (P > 0,05) entre los genotipos y los sexos. Estos resultados sugieren que la raza Dorper puede ser usada en esquemas de cruzamiento para mejorar la producción de carne ovina en zonas áridas como las del noroeste de México.

AGRADECIMIENTOS

A la Coordinación de Posgrado e Investigación de la Universidad Autónoma de Baja California, en Mexicali, México, por el financiamiento de este proyecto de investigación.

REFERENCIAS

Avendaño RL, FD Álvarez, L Molina, JS Saucedo, A Correa. 2004. Engorda de corderos Pelibuey y sus cruzas con Dorper y Katahdin bajo condiciones de estrés calórico. Memorias del XXVIII Congreso Nacional de Buiatría, Michoacán, México, Pp 10-13.

Bores QRF, PA Velázquez, M Heredia. 2002. Evaluación de razas terminales en esquemas de cruza comercial con ovejas de pelo F1. Téc Pec Méx 40, 71-79.

Bradford GE. 2002. Relationships among traits: growth rate, mature size, carcass composition and reproduction. Sheep & Goat Res J 17, 38-41.

Bunch TD, RC Evans, S Wang, CP Brennand, DR Whittier, BJ Taylor. 2004. Feed efficiency, growth rates, carcass evaluation, cholesterol level and wool sheep and their crosses. Small Ruminant Res 52, 239-245.

Burke JM, JK Apple. 2007. Growth performance and carcass traits of forage-fed hair sheep wethers. Small Ruminant Res 67, 264-270.

Canton GJ, JA Quintal. 2007. Evaluation of growth and carcass char-acteristics of pure Pelibuey sheep and their cross with Dorper and Katahdin breeds. J Anim Sci 85, 571.

Canton GJ, QR Bores, RJ Baeza, FJ Quintal, RR Santos, CC Sandoval. 2009a. Growth and efficiency of pure and F1 Pelibuey lambs

crossbred with specialized breeds for production of meat. J Anim Vet Adv 8, 26-32.

Canton GJ, QR Bores, RJ Baeza, FJ Quintal, RR Santos, CC Sandoval. 2009b. Energy retention of F1 Pelibuey lambs crossbred with breeds for meat production. J Anim Vet Adv 8, 2655-2661.

Cloete SWP, MA Snyman, MJ Herselman. 2000. Productive performance of Dorper sheep. Small Ruminant Res 36, 119-135.

Cloete JJE, SWP Cloete, JJ Olivier, LC Hoffman. 2007. Terminal crossbreeding of Dorper ewe to Ile France Merino Landsheep and SA mutton Merino sires: Ewe production and lamb performance. Small Ruminant Res 69, 28-35.

El Khidir IA, SA Babiker, SA Shafie. 1998. Comparative feedlot per-formance and carcass characteristics of Sudanese desert sheep and goats. Small Ruminant Res 30, 47-151.

Espinoza LMT, A Estrada, JJ Portillo, G Ríos, JC Robles. 2009. Efecto del grupo racial de corderos de pelo en el peso y ren-dimiento de cortes primarios. Memoria de la XXXVII Reunión de la Asociación Mexicana de Producción Animal, Chihuahua, México, Pp 312-315.

Fitzhugh HA, GE Bradford. 1983. Hair Sheep of Western Africa and the Americas: A Genetic Resource for the Tropics. Westview, Boulder, CO, USA.

Forbes JM. 1986. The voluntary food intake of farm animals. Butterworths, London, UK, Pp 205-208.

Gallo C. 2002. Crecimiento y composición de canales. En: Tadich N (ed). Salud y producción ovina. Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile, Pp 165-188.

García E. 1987. Modificaciones al sistema de clasificación climática de Koeppen. Editorial Universidad Nacional Autónoma de México, México, Pp 12-13.

Gutiérrez J, MS Rubio, RD Méndez. 2005. Effects of crossbreeding Mexican Pelibuey sheep with Rambouillet and Suffolk on carcass traits. Meat Sci 70, 1-5.

Kelly CF, TE Bond. 1971. Bioclimatic factors and their measurement: A guide to environmental research on animals. National Academy of Sciences, Washington, DC, USA.

Marai IFM, AA El-Darawany, A Fadiel, MAM Abdel-Hafez. 2007. Physiological traits as affected by heat stress in sheep- A review. Small Ruminant Res 71, 1-12.

Notter DR, AL Swiger, RW Harvey. 1975. Adjustment factors for 90-day lamb weight. J Anim Sci 40, 383-391.

Notter DR, SP Greiner, ML Wahlberg. 2004. Growth and carcass characteristics of lambs sired by Dorper and Dorset rams. J Anim Sci 82, 1323-1328.

Partida de la Peña JA, D Braña, L Martínez. 2009. Desempeño produc-tivo y propiedades de la canal en ovinos Pelibuey y sus cruzas con Suffolk y Dorset. Téc Pec Méx 47, 313-322.

Pineda J, JM Palma, FW Haenlein, MA Galina. 1998. Fattening of Pelibuey hair sheep and crossbreds (Rambouillet-Dorset X Pelibuey) in the Mexican tropics. Small Ruminant Res 27, 263-266.

Ruiz NA, JJ Uribe, JR Orozco, VO Fuentes. 2009. The effect of different protein concentrations in the diet of fattening Dorper and Pelibuey lambs. J Anim Vet Adv 8, 1049-1051.

SAS INSTITUTE. 2004. SAS/STAT: User’s guide statistics released 9.12th ed. SAS Institute, Inc. Cary, NC, USA.

Snowder GD, SK Duckett. 2003. Evaluations of South Africa Dorper as a terminal sire breed for growth, carcass, and palatability char-acteristics. J Anim Sci 81, 368-375.

Solís RG, RA Castellanos, AM Velázquez, FG Rodríguez. 1991. Determination of nutritional requirements of growing hair sheep. Small Ruminant Res 4,115-125.

Srikandakumar A, EH Johson, O Mahgoub. 2003. Effect of heat stress on respiratory rate, rectal temperature and blood chemistry in Omani and Australian Merino sheep. Small Ruminant Res 49, 193-198.

155

Arch Med Vet 42, 155-163 (2010)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 24.03.2010.

# Fuente financiamiento: INTA-Instituto Nacional de Tecnología Agro-pecuaria, Argentina, CSIRO - Sustainable Ecosystem, Townsville, Australia.

* Pinto 399 (7000) Tandil, Argentina; [email protected].

Efecto antihelmíntico in vitro de extractos de plantas sobre larvas infectantes de nematodos gastrointestinales de rumiantes#

In vitro anthelmintic effect of plant extracts against infective larvae of ruminants gastrointestinal nematode parasites

FC Morenoa,b,d*, IJ Gordona, AD Wrightc, MA Benvenuttia,d, CA Saumellb

aCSIRO Davies Laboratory, University Drive, Townsville, Queensland, Australia.bFacultad de Ciencias Veterinarias, U.N.C.P.B.A. Campus Pje., Arroyo Seco s/n, Tandil, Argentina.

cAIMS Australian Institute of Marine Science, Townsville, Queensland, Australia.dINTA EEA Cerro Azul, Cerro Azul, Misiones, Argentina.

SUMMARY

With the purpose of studying the anthelmintic efficacy of some plant species presents in Queensland State, Australia, we tested in vitro the effect of plant extracts on infective larvae (L3) migration of Haemonchus placei, Cooperia sp., Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis. In general, plant extracts reduced the larval migration of Haemonchus placei and Cooperia sp. The most effective plants against Haemonchus placei and Cooperia sp. (P < 0.0001) were Allocasuarina torulosa, Neolitsea dealbata, Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris endlicheri and Casuarina cunninghamiana. Plants extracts were less effective on L3 migration of Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis. Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana, Acacia farnesiana, Acacia holosericea and Acacia nilotica were the plant extracts that shown an important larval migration inhibition against H. contortus and Trichostrongylus colubriformis (P < 0.0001). Callitris endlicheri was the plant that consistently inhibited the larval migration of every nematode species under study. These in vitro results suggest anthelmintic properties associate with some of the plant species we studied.

Palabras clave: evaluación in vitro, nematodos gastrointestinales, plantas, propiedades antihelmínticas.

Key words: in vitro test, gastrointestinal nematodes, plants species, anthelmintic properties.

INTRODUCCIóN

Los parásitos nematodos gastrointestinales de rumiantes representan un serio problema a nivel mundial ya que afectan la productividad del hospedador causando reducciones en las tasas de crecimiento, fecundidad e incremento en la mortalidad. La parasitosis gastrointestinal es una de las enfermedades que mayor impacto económico ocasiona en los sistemas de producción de carne (Mcleod 1995, Fiel y Steffan 1994).

Hasta el presente, el principal modo de control de los parásitos del tracto digestivo ha estado basado en el trata-miento químico con antiparasitarios. Debido al creciente desarrollo de resistencia a los antiparasitarios por parte de los nematodos gastrointestinales (Jackson y Coop 2000) es necesario investigar estrategias alternativas al control farmacológico de las helmintiasis. A esto se suma la

creciente demanda de limitar el uso de sustancias quími-cas en la producción animal para reducir los residuos de drogas en los productos animales (McKellar 1997, Waller y Thamsborg 2004).

La necesidad de encontrar alternativas para el control de los nematodos que puedan reducir el uso de antihelmínticos es reconocida internacionalmente. Varias opciones están siendo investigadas, dentro de las cuales se pueden citar el control biológico, usando hongos nematófagos (Larsen 1999, Larsen 2000), la producción de vacunas contra helmintos (Smith 1999, Vercruysse y col 2007), inmunonutrición (Houdijk y Athanasiadou 2003) y estudios genéticos ten-dientes a producir animales resistentes a helmintos (Gray 1997, Gasbarre y Miller 2000). También se han iniciado experimentos sobre la influencia de la suplementación proteica en la dieta, que podría mejorar la respuesta a la vacunación y en el desarrollo de animales inmunorresis-tentes (Coop y Holmes 1996). Otra estrategia alternativa para el control de parásitos gastrointestinales la constituye el uso de metabolitos secundarios de las plantas (MSP) (Athanasiadou y Kyriazakis 2004), con el objetivo no solo de encontrar nuevos compuestos químicos eficaces contra helmintos, sino que también por su aplicabilidad desde el punto de vista orgánico, ya que ellos podrían reemplazar el

156

F MORENO Y COL

uso de químicos sintéticos corrientemente usados, lo cual puede proveer métodos ecológicos para el tratamiento de parásitos usando plantas con propiedades antihelmínticas.

Los test in vitro son un medio apropiado para evaluar especies de plantas debido a que son rápidos de realizar y económicos, comparados a los test in vivo. Aunque se ha encontrado que existe una correlación significativa entre los test in vitro e in vivo en estudios de eficacia de los antihelmínticos y resistencia de los parásitos a las drogas sintéticas (Geary y col 1999, Athanasiadou y Kyriazakis 2004), no es claro aún si una relación similar existe para los MSP (Athanasiadou y Kyriazakis 2004). Por ello, es importante que los resultados de los test in vitro sean siempre validados in vivo antes de hacer generalizaciones respecto a las propiedades antiparasitarias de los MSP (Athanasiadou y Kyriazakis 2004).

Debido a que el parásito adulto es el blanco prin-cipal de los MSP, sería deseable poder utilizarlos para determinar el potencial antiparasitario de los MSP. Sin embargo, los parásitos adultos no pueden ser mantenidos vivos fuera del hospedador por más de 24 horas, lo cual es inadecuado para los test in vitro. Por ello, los test in vitro se realizan usualmente con los estadios infectantes (L3) en lugar de adultos (Geary y col 1999, Athanasiadou y Kyriazakis 2004).

El test in vitro de inhibición de la migración larval con L3 ha sido ampliamente usado para estudiar la eficacia antiparasitaria de los MSP en Nueva Zelanda (Molan y col 2004, Molan y col 2000c) y Francia (Hounzangbe-Adote y col 2005, Paolini y col 2004). El test de inhibición de la movilidad larval fue desarrollado por Wagland y col (1992) y modificado por Rabel y col (1994) y Paolini y col (2004). El uso de L3 para el test de migración parece ser apropiado para el estudio de la eficacia antiparasitaria de los MSP debido a que el primer contacto de los MSP con los parásitos se da cuando las L3 son consumidas junto con el forraje. A su vez, el test de inhibición de la migración de L3 tiene la ventaja sobre los test basados en la eclosión de huevos o en el desarrollo larval en que las L3 son fácilmente disponibles y almacenables y son relativamente simples de usar (Rabel y col 1994).

El objetivo del presente trabajo fue utilizar el test in vitro de inhibición de la migración larval para estudiar el efecto antihelmíntico de 24 extractos de plantas autóctonas de Australia con potenciales propiedades antiparasitarias, a tres concentraciones diferentes (5, 15 y 30 mg/ml), en la migración de L3 de nematodos que afectan al ganado bovino (Haemonchus placei y Cooperia sp.) y caprino (Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis).

MATERIALES Y MÉTODOS

DISEñO EXPERIMENTAL

El trabajo experimental se llevó a cabo en el CSIRO Davies Laboratory, Townsville, Australia. Se realizó un

experimento in vitro para evaluar el efecto de extractos de plantas australianas en la migración de L3 de nema-todos que afectan al ganado bovino (Haemonchus placei y Cooperia sp.) y caprino (Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis).

PLANTAS

Para decidir las especies de plantas a evaluar, libros de etnobotánica en medicina tradicional humana o vete-rinaria y otras fuentes de información fueron consultados (Lassak y McCarthy 1983, Seigler 2002, Anderson 1993, WHO 19991, Chittendon 19562, Cribb y Cribb 19813, Bennet-Jenkins y Bryant 1996, Moore 2005 comunicación personal, Grieve 19842, Satrija y col 19944, Athanasiadou y col 2000a, b, Athanasiadou y col 2001).

Como resultado, 24 especies de plantas con potencial antihelmíntico fueron identificadas: Acacia farnesiana, Acacia melanoxylon, Acacia salicina, Acacia holosericea, Acacia flavescens, Acacia leptostachya, Acacia nilotica, Eucalyptus tessellaris, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus platyphylla, Eucalyptus corymbia, Eucalyptus drepano-phylla, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus moluccana, Eucalyptus crebra, Casuarina cunninghamiana, Callitris endlicheri, Melaleuca leucodendra, Alphitonia excelsa, Erythrina variegata, Neolitsea dealbata, Allocasuarina torulosa, Euphorbia hirta y Panicum minutiflora. De las 24 especies seleccionadas, 19 fueron evaluadas en bovinos y 14 en caprinos. La selección de las plantas se basó en tres criterios: a) plantas conocidas previamente como activas en el control de parásitos internos en animales o humanos, b) plantas con alto contenido de MSP, no mencionadas como antiparasitarias pero con potencial antihelmíntico, c) especies que sean abundantes ya que las especies raras podrían ser irrelevantes para los animales en pastoreo.

PREPARACIóN DE LOS EXTRACTOS DE PLANTAS

Hojas frescas de las especies de plantas a evaluar fueron colectadas en el estado de Queensland, Australia, durante los meses de septiembre y octubre y mantenidas en freezer (-20 ºC) hasta su procesamiento. Aproximadamente 50 g de material correspondiente a cada una de las especies fue secado en liofilizador (freeze drier) y posteriormente molido a un milímetro de tamaño de partícula. Setenta y cinco mililitros de metanol fueron adicionados a tres gramos del material ya molido y dejado en agitación durante toda una noche para favorecer la extracción de los compuestos. Las muestras extraídas fueron filtradas en filtro de papel

1 http://www.genhealth.com/garlic.htm. fecha consulta: 08/08/20052 http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_ht ml?Melaleuca+hyperici-

folia&CAN=LATIND. fecha consulta: 08/08/2005.3 http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_ht ml?Callitris+endlicheri

&CAN=COMIND. fecha consulta: 08/08/2005.4 http://www.ansci.cornell.edu/plants/medicinal/papaya.html. fecha

consulta: 08/08/2005.

157

EVALUACIóN IN VITRo, NEMATODOS GASTROINTESTINALES, PLANTAS, PROPIEDADES ANTIHELMÍNTICAS

Whatmann Nº 40. El filtrado fue luego liofilizado para obtener los polvos de extracto.

El polvo de los extractos de las plantas fue disuelto en buffer fosfato (0,1 M fosfato, 0,05 M NaCl; pH 7,2) y diluido en serie previo a la incubación. Las diluciones evaluadas fueron 5, 15 y 30 mg/ml . Dichas diluciones fueron elegidas debido a que son comparables con las concentraciones usadas in vivo. Asumiendo que el contenido gastrointestinal de bovinos de destete de aproximadamente 200 kg de peso vivo es de aproxi-madamente 30 litros y sabiendo que el consumo de alimento es de aproximadamente 4 kg de materia seca por día, y que el máximo rendimiento de extracto es de aproximadamente 15% (Van Soest 1982), la máxima concentración de extracto de planta en el tracto gastrointestinal sería de aproximadamente 20 mg/ml (4 kg/día x 0,15/30 lts) cuando el animal consume solamente plantas ricas en MSP.

PARÁSITOS

Las L3 provenientes de cultivos puros de H. placei fueron suministradas por el Dr. Malcolm Knox, del CSIRO Livestock Industries FD McMaster Laboratory, Armidale, Australia; y las L3 provenientes de Cooperia sp. fueron suministradas por Novartis Animal Health, New South Wales, Australia, para realizar la primoinfección de los bovinos donadores de L3.

Dos terneros de destete libres de parásitos fueron infectados con una dosis única de 10.000 L3 H. placei y otros dos animales con una dosis única de 15.000 L3 Cooperia sp. Los cuatro animales se mantuvieron en corrales individuales en las instalaciones del CSIRO’s Lansdown Research Station, Townsville, Australia. L3 de H. placei y Cooperia sp. se obtuvieron de cultivos fecales después de 28 días postinfección siguiendo el procedimiento de Lyndall-Murphy (1993). Aproximadamente 30 g de heces y un volumen similar de vermiculita fueron puestos en botellas de cultivo. Las heces fueron cultivadas para pro-ducir L3 solamente si el recuento de huevos de parásitos excedió los 200 huevos por gramo.

L3 provenientes de cultivos puros de H. contortus y T. co-lubriformis fueron suministradas en su totalidad para realizar el test in vitro por el Dr. Malcolm Knox, del CSIRO Livestock Industries FD McMaster Laboratory, Armidale, Australia, por lo que no se necesitó contar con animales dadores.

TEST DE INHIBICIóN DE LA MIGRACIóN LARVAL

Para determinar la eficacia antihelmíntica de los extractos de plantas se utilizó el test in vitro de inhibi-ción de la migración larval desarrollado por Wagland y col (1992) y modificado por Rabel y col (1994). Se construyeron filtros con tubos de acrílico transparente de 20 mm de largo y 7 mm de diámetro interno a los que se les adhirió una malla de nylon de 20 µm en uno de sus extremos. Se utilizaron tubos plásticos de 2 ml a los cuales se le agregó 0,4 ml de extracto diluido (dilución

final 5, 15 y 30 mg/ml) y 150 a 200 L3 suspendidas en 0,1 ml de solución acuosa. Se realizaron tres repeticio-nes para cada una de las distintas concentraciones de los extractos de plantas y un control negativo (L3 en buffer fosfato) se corrió en paralelo. Los tubos fueron incubados a 37 ºC por 16 horas. El contenido total de los tubos (0,5 ml) fue luego transferido a los filtros localizados dentro de cámaras de acrílico de 1,9 cm de diámetro interno. Dichas cámaras con los filtros fueron incubadas a temperatura ambiente por 18 horas para permitir a las larvas migrar a través de los filtros dentro de la cámara. Luego, los filtros fueron removidos de las cámaras y el número total de larvas en las cámaras y en los filtros fueron contados.


La inhibición de la migración larval (IML) se determinó usando la siguiente fórmula:

IML = A - B x100

A

Donde A = proporción de larvas migradas en el control y B = proporción de larvas migradas en los tratamientos

Para la variable porcentaje de migración larval fue realizado un análisis de variancia con un arreglo factorial de planta por concentración utilizando el procedimiento PROC GLM de SAS V.9.1.3 (SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA). Para obtener el cumplimiento de los supuestos, la variable fue transformada con la función arcoseno. Como la interacción resultó significativa fue estudiado el com-portamiento de las plantas dentro de cada concentración. Con el objeto de detectar las mejores combinaciones de planta y concentración fueron realizadas comparaciones múltiples con la media más pequeña (CMM) (Kuehl 2001). Esta metodología estadística permitió detectar subconjun-tos conformados por extractos de plantas con porcentajes de inhibición larvaria similares dentro de cada una de las concentraciones evaluadas. Cuando se compararon todas las combinaciones de extractos de plantas y concentraciones, la CMM detectó un subgrupo combinación extracto-concentración con los mejores porcentajes de inhibición larvaria para cada especie parasitaria.

RESULTADOS

La interacción entre extractos de plantas y concen-traciones fue significativa en cada uno de los géneros parasitarios evaluados (P < 0,0001).

El porcentaje de migración de larvas de Haemonchus placei en el tratamiento control con solo buffer fue de 89,66%. A la concentración de 5 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas (P < 0,0001). En el cuadro 1 puede observarse que la CMM detectó un

158

F MORENO Y COL

subconjunto de extractos que afectaron la migración larval, conformado por las plantas Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus tessellaris, Eucalyptus crebra, Eucalyptus moluccana, Eucalyptus platyphylla, Acacia flavescens, Acacia holosericea, Acacia leptostachya, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, con porcentajes de migración menores al 81,6%. A la concentración de 15 mg/ml el efecto de los extractos también fue estadísticamente significativo (P < 0,0001) y la CMM detectó un subconjunto confor-mado solamente por la planta Allocasuarina torulosa con un porcentaje de migración de 4,19%. A la concentración de 30 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas (P < 0,0001) y la CMM detectó un subconjunto de extractos conformado por las plantas Acacia holose-ricea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, con porcentajes de migración menores al 20,5%. Cuando se compararon todas las combinaciones de plantas y concentraciones, la CMM detectó un grupo conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri,

Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, a la concentración de 30 mg/ml, y la planta Allocasuarina torulosa a la concentración de 15 mg/ml con porcentajes de migración menores al 21%.

Para Cooperia sp., el porcentaje de migración larval en el tratamiento control con solo buffer fue de 93,78%. En el cuadro 2 se observa que a la concentración de 5 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,0002) y la CMM detectó un subconjunto de extractos confor-mado por las plantas Acacia farnesiana, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, con porcentajes de migración menores al 73%. A la concentración de 15 mg/ml el efecto de las plantas fue estadísticamente significativo (P < 0,0001) y la CMM detectó un subconjunto de extractos que afectaron la migración larval, conformado por las plantas Acacia salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea dealbata, con porcentajes de migración menores al 16%. A la concentración de 30 mg/ml también fue detectado efecto significativo entre plantas (P < 0,0001) y la CMM detectó un subconjunto de extractos, conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia melanoxylon, Acacia salicina,

Cuadro 1. Porcentaje de migración de larvas infectivas de Haemonchus placei después de la incubación con extractos de plantas a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3). Percentage migration of infective larvae of Haemonchus placei after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).

ConcentraciónExtractode plantas

[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]

Media EE Media EE Media EE

Eucalyptus citriodora 81,92 1,49 79,95 1,99 79,88 0,93

Eucalyptus tereticornis 77,04* 2,48 72,12 3,95 58,72 4,03

Eucalyptus tessellaris 81,64* 3,13 79,11 2,17 68,95 5,06

Eucalyptus crebra 72,43* 4,61 68,37 1,68 66,55 5,56

Eucalyptus moluccana 81,09* 1,51 84,47 1,79 74,01 5,33

Eucalyptus platyphylla 73,45* 2,28 63,89 4,42 65,16 4,43

Acacia farnesiana 91,49 1,18 82,85 0,44 80,48 7,52

Acacia flavescens 77,09* 4,33 71,21 6,31 68,03 6,45

Acacia holosericea 62,87* 4,29 54,77 3,36 11,80*# 8,98

Acacia leptostachya 80,18* 1,48 45,96 7,48 34,83 5,78

Acacia melanoxylon 83,89 2,14 64,79 5,83 51,30 7,56

Acacia salicina 74,24* 2,60 42,79 8,81 17,32*# 4,69

Allocasuarina torulosa 61,28* 10,28 4,19*# 2,09 1,07*# 0,45

Alphitonia excelsa 90,17 1,90 74,18 3,47 67,61 9,35

Callitris endlicheri 83,64 1,45 47,90 1,26 9,62*# 4,82

Casuarina cunninghamiana 78,08* 10,69 59,39 7,14 7,36*# 5,24

Erythrina variegata 92,24 3,27 49,97 8,32 49,43 6,36

Melaleuca leucodendra 86,95 2,79 78,00 2,66 80,54 1,48

Neolitsea dealbata 68,09* 4,81 34,93 6,60 20,41*# 4,67

* Subconjuntos de extractos con menor porcentaje de migración, detectados por la CMM en cada una de las concentraciones.# Subconjunto de combinación extractos/concentración con menor porcentaje de migración, detectados por la CMM.

159


Cuadro 2. Porcentaje de migración de larvas infectivas de Cooperia sp. después de la incubación con extractos de plantas a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3). Percentage migration of infective larvae of Cooperia sp. after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).


[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]


Eucalyptus citriodora 82,92 1,46 74,11 2,29 85,75 1,87

Eucalyptus tereticornis 90,20 1,83 73,47 9,39 69,19 4,09

Eucalyptus tessellaris 91,78 2,17 86,06 2,30 56,16 1,90

Eucalyptus crebra 89,59 1,63 84,92 3,24 79,32 5,10

Eucalyptus moluccana 92,06 1,73 87,34 1,06 50,71 2,59

Eucalyptus platyphylla 77,44 1,60 53,59 8,02 47,55 8,66

Acacia farnesiana 72,71* 8,70 83,17 6,28 90,32 0,48

Acacia flavescens 81,01 6,54 72,52 5,43 66,54 9,51

Acacia holosericea 86,60 2,42 40,46 6,37 15,46*# 8,88

Acacia leptostachya 88,06 4,26 84,71 8,09 58,60 12,97

Acacia melanoxylon 84,71 3,51 75,94 12,27 29,74*# 11,51

Acacia salicina 68,27* 7,96 13,52*# 1,35 0,41*# 0,21

Allocasuarina torulosa 38,93* 16,31 5,55*# 1,52 2,30*# 1,16

Alphitonia excelsa 84,75 1,26 81,69 4,82 72,85 9,90


Casuarina cunninghamiana 72,14* 9,54 55,74 5,64 20,49# 11,83

Erythrina variegata 85,88 4,52 86,16 2,22 70,98 3,21

Melaleuca leucodendra 92,77 0,51 87,84 3,59 88,32 1,03

Neolitsea dealbata 66,64* 13,71 15,69*# 2,00 2,07*# 0,82


Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri y Neolitsea dealbata, con porcentajes de migración menores al 30%. Cuando se compararon todas las combinaciones de plantas y concentraciones, la CMM detectó un grupo conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia melanoxylon, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endli-cheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, a la concentración de 30 mg/ml, y las plantas Acacia salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea dealbata a la concentración de 15 mg/ml con porcentajes de migración menores al 30%.

El porcentaje de migración de larvas de Haemonchus contortus en el tratamiento control con solo buffer fue de 99,3%. A las concentraciones de 5 mg/ml y 15 mg/ml no fue detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,3777) y (P = 0,0529) respectivamente. Sin embargo, a la concentración de 30 mg/ml (cuadro 3) fue detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,0053) y la CMM detectó un subconjunto

de extractos que afectaron la migración larval, conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia farnesiana, Callitris endlicheri y Casuarina cunninghamiana, con porcentajes de migración menores al 88%. Cuando se compararon todas las combinaciones de plantas y concentra-ciones, la CMM detectó un grupo conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia farnesiana, Callitris endlicheri y Casuarina cunninghamiana a la concentración de 30 mg/ml y la planta Casuarina cunninghamiana a la concentración de 15 mg/ml con porcentajes de migración entre 64,14 y 89,83%.

Para Trichostrongylus colubriformis el porcentaje de migración larval en el tratamiento control con solo buffer fue de 99,5%. A la concentración de 5 mg/ml no fue detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,4129). En el cuadro 4 puede observarse que a la concentración de 15 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,0006) y la CMM detectó un subconjunto

160

F MORENO Y COL

Cuadro 3. Porcentaje de migración de larvas infectivas de Haemonchus contortus después de la incubación con extractos de plantas a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3). Percentage migration of infective larvae of Haemonchus contortus after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).


[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]


Acacia holosericea 97,41 2,59 98,28 0,84 83,49*# 1,47


Acacia nilotica 100 0 96,60 0,05 77,12*# 5,41

Acacia salicina 98,90 0,65 99,78 0,23 97,29 0,98

Acacia farnesiana 98,78 0,67 98,42 0,58 87,79*# 0,45


Casuarina cunninghamiana 96,98 0,01 89,83# 8,13 77,89*# 16,70

Eucalyptus drepanophylla 98,01 1,11 97,75 0,72 96,63 0,97



Eucalyptus tessellaris 99,57 0 99,27 0,25 99,34 0,17

Eucalyptus corymbia 97,09 1,23 99,78 0,23 99,77 0,23

Euphorbia hirta 98,90 0,62 99,44 0,04 98,54 0,15

Panicum minutiflora 95,91 1,36 96,41 2,11 98,44 0,57


Cuadro 4. Porcentaje de migración de larvas infectivas de Trichostrongylus colubriformis después de la incubación con extractos de plantas a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3). Percentage migration of infective larvae of Trichostrongylus colubriformis after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).


[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]


Acacia holosericea 99,14 0,05 99,40 0,16 98,51 1,49


Acacia nilotica 99,09 0,91 97,22* 0,89 87,12 0,65

Acacia salicina 100 0 100 0 97,65 1,51

Acacia farnesiana 99,79 0,21 99,39 0,62 100 0

Callitris endlicheri 99,17 0,04 92,96* 2,72 21,55*# 14,96

Casuarina cunninghamiana 97,55 1,06 100 0 86,86 8,58

Eucalyptus drepanophylla 98,81 0,24 98,34 1,23 97,71 0,97



Eucalyptus tessellaris 99,14 0,01 99,45 0,15 99,37 0,28

Eucalyptus corymbia 99,57 0 100 0 100 0

Euphorbia hirta 98,15 1,85 98,54 0,61 97,85 1,70

Panicum minutiflora 99,50 0,08 98,13 0,61 97,03 1,68


161


de extractos conformado por las plantas Acacia nilotica y Callitris endlicheri, con porcentajes de migración de 97,22% y 92,96%, respectivamente. A la concentración de 30 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas (P < 0,0001) y la CMM detectó un subconjunto confor-mado solamente por la planta Callitris endlicheri con un porcentaje de migración de 21,55%. Cuando se compararon todas las combinaciones de plantas y concentraciones, la CMM detectó solo la planta Callitris endlicheri a la concentración de 30 mg/ml como diferente del resto de los extractos.

DISCUSIóN

Las especies de plantas estudiadas en el presente trabajo se eligieron debido a que fueron previamente nombradas en fuentes de etnobotánica como activas en el control de parásitos en animales o humanos e identificadas previamente por su alto contenido en MSP con potencial antiparasitario.

Para H. placei la CMM nos permitió detectar subconjun-tos de extractos de plantas que causaron bajos porcentajes de migración dentro de cada una de las concentraciones evaluadas. La mayoría de las extractos analizados afectaron significativamente (P < 0,0001) la migración de larvas a la concentración de 5 mg/ml, pero los niveles de inhibición de la migración larval (IML) de entre 8 y 28% no fueron relevantes, mientras que a la concentración de 15 mg/ml el extracto de Allocasuarina torulosa logró una reducción importante de la migración con niveles de IML mayores a 85%. Los extractos de Acacia holosericea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, a la concentración de 30 mg/ml causaron una reducción de la migración con niveles de IML de 69%.

Para Cooperia sp. la CMM detectó subconjuntos de extractos de plantas que causaron porcentajes de migración variables. A la concentración de 5 mg/ml los extractos lograron IML en un 22%, mientras que a la concentración de 15 mg/ml y 30 mg/ml los niveles de IML llegaron a 78 y 64% respectivamente. Las especies de plantas que resultaron más efectivas en reducir significativamente la migración de larvas de H. placei y Cooperia sp. con por-centajes menores a 21% y 30% respectivamente fueron: Acacia holosericea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata (cuadro 1). Allocasuarina torulosa fue una de las especies que redujo la migración de larvas en ambas especies de parásitos a las diferentes concentraciones eva-luadas. Acacia salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea dealbata fueron las especies de plantas detectadas por el método CMM que demostraron una significativa capacidad de inhibición de la migración en L3 de Cooperia sp. a las tres concentraciones estudiadas.

Para el caso de las L3 de H. contortus y T. colubri-formis, pudo observarse un menor efecto de los extractos

vegetales evaluados, lo que se vio reflejado en los altos porcentajes de migración larval. Para H. contortus, solo a la concentración de 30 mg/ml pudieron detec-tarse extractos de plantas que redujeron la migración larval con bajos índices de IML (11%), mientras que a la concentración de 15 mg/ml un solo extracto redujo escasamente la migración larval con un IML de 3%. Estos valores demuestran una baja efectividad de los extractos, lo que se traduce en una reducida capacidad de inhibición de la migración de L3 de H. contortus a las tres concentraciones estudiadas

En el caso de T. colubriformis, si bien a la concentra-ción de 15 mg/ml los niveles de IML (2,5%) no fueron relevantes, a la concentración de 30 mg/ml el extracto de Callitris endlicheri logró una reducción importante de la migración con niveles de IML mayores a 78%. Callitris endlicheri fue la única especie de planta detectada por el método CMM que mostró una significativa capacidad de inhibición de la migración larval.

Callitris endlicheri es una de las especies de plantas que redujo la migración de larvas en todas las especies de nematodos evaluadas en el presente estudio. Estos resul-tados concuerdan con los antecedentes que muestran que esta especie de planta fue previamente identificada por su alto contenido en taninos y por su efecto antihelmíntico en equinos (Lassak y McCarthy 1983, Chittendon 19565, Cribb y Cribb 19813).

Por su parte, Eucalyptus grandis es conocido por su efecto antihelmíntico en caprinos (Bennet-Jenkins y Bryant 1996). Sin embargo, en el presente estudio las especies de Eucalyptus evaluadas tuvieron un efecto leve en larvas de H. placei y Cooperia sp. y no afectaron la migración de larvas de H. contortus y T. colubriformis.

En general, las especies de Acacia (Seigler 2002, Anderson 1993) y Eucalyptus6 son conocidas por su alto contenido en MSP siendo particularmente ricas en taninos. En el presente estudio las especies de Acacia presentaron una mayor actividad antihelmíntica que las especies de Eucalyptus. Por ejemplo, Acacia holosericea y Acacia salicina estuvieron dentro de las especies que mostraron tener actividad para H. placei y Cooperia sp., mientras que ningún Eucalyptus se encontró dentro de este grupo. Algo similar ocurrió en H. contortus y T. colubriformis donde Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia farnesiana fueron las especies más activas, pero ningún Eucalyptus se encontró dentro de este grupo.

Existe muy poca información acerca de la actividad antiparasitaria de las especies de plantas evaluadas en el presente estudio. A su vez, la poca información disponible en general no es clara. Es necesario que estos resultados generados in vitro sean validados con estudios in vivo. De

5 http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_ht ml?Callitris+endlicheri&CAN=LATIND. fecha consulta: 08/08/2005.

6 Moore B. 2005. Senior Research Associate. School of Tropical Biology. James Cook University (comunicación personal).

162

F MORENO Y COL

hecho, algunos estudios encontraron una buena relación entre los resultados in vitro e in vivo, por ejemplo Molan y col (2000a, b) encontraron que los taninos condensados purificados de varias especies vegetales redujeron la mo-vilidad y migración de L3 de nematodos y estos resultados estuvieron de acuerdo con los obtenidos en estudios in vivo en rumiantes (Athanasiadou y col 2000ª, b, Paolini y col 2003ª, b). Sin embargo, se requiere prudencia en la extrapolación de los resultados in vitro a condiciones in vivo debido a que los componentes químicos de las plan-tas pueden ser modificados luego de pasar por el tracto digestivo. Esto es particularmente cierto en el ambiente ruminal que afecta a los taninos por degradación bacteriana (Makkar 2003). Sumado a ello deben tenerse presente los mecanismos adaptativos especiales desarrollados por los animales. La presencia de Streptococcus caprinus en el rumen de caprinos y la secreción de saliva rica en prolina son las principales adaptaciones experimentadas por los caprinos, en los cuales plantas ricas en taninos son parte de su dieta (Landau 2000). Por otra parte, la toxicidad de los taninos para los animales no puede ser evaluada in vitro. Es ampliamente conocido que bajas a moderadas concen-traciones de taninos (3-6% MS) mayoritariamente tuvieron efectos positivos en la fisiología del hospedador, crecimiento y producción de lana y leche (Min y col 2003), mientras que altas concentraciones (7-8% MS) reducen la ganancia de peso y productividad de los animales e incluso pueden causarle la muerte (Waghorn y McNabb 2003). Por ello, una vez identificadas las especies de plantas con mayor potencial antihelmíntico a través de estudios in vitro, es necesario validar dichos resultados con estudios in vivo.

Se concluye que, en general, los extractos de plantas evaluados redujeron la migración de larvas de H. placei y Cooperia sp. Las plantas que mostraron una mayor inhibición de la migración larval contra estas especies de nematodos fueron Allocasuarina torulosa, Neolitsea dealbata, Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris endlicheri y Casuarina cunninghamiana.

Los extractos fueron menos efectivos en inhibir la migración de larvas de H. contortus y T. colubriformis. Las plantas que mostraron una mayor inhibición de la migración larval contra esta especies de nematodos fueron Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana, Acacia farnesiana, Acacia holosericea y Acacia nilotica.

Callitris endlicheri fue la especie que inhibió la migra-ción de todas las especies de nematodos estudiadas.

Estos resultados in vitro sugieren la existencia de propiedades antihelmínticas asociadas con algunas de las especies de plantas evaluadas. Para confirmar estos resultados in vitro es necesario conducir estudios in vivo con dichas plantas.

RESUMEN

Con el objeto de estudiar la capacidad antihelmíntica de algunas especies de plantas presentes en el Estado de Queensland, Australia, se evaluó el efecto in vitro de extractos de hojas de plantas en la migración de

larvas infectantes (L3) de Haemonchus placei, Cooperia sp., Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis. En general, los extractos de plantas redujeron la migración de larvas de H. placei y Cooperia sp. Las plantas con mayor actividad antihelmíntica contra estas especies de nematodos fueron Allocasuarina torulosa, Neolitsea dealbata, Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris endlicheri y Casuarina cunninghamiana (P < 0,0001). Los extractos fueron menos efectivos en inhibir la migración de larvas de H. contortus y T. colubriformis. Las plantas que mostraron una mayor inhibición de la migración larval contra estas especies de nematodos fueron Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana, Acacia farnesiana, Acacia holosericea y Acacia nilotica (P < 0,0001). Callitris endlicheri fue la especie que más consistentemente inhibió la migración de todas las especies de nematodos estudiadas. Estos resultados in vitro sugieren la existencia de propiedades antihelmínticas asociadas con algunas de las especies de plantas evaluadas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo técnico y económico del CSIRO Sustainable Ecosystem, Townsville, Australia, y del INTA, Argentina, para la realización de este trabajo. Un especial agradecimiento a Edgardo Rodríguez y Juan Passucci de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA, por su ayuda en el análisis estadístico de los datos.

REFERENCIAS

Anderson ER. 1993. Plants of central Queensland: their identification and uses. Eric Anderson Dept. of Primary Industries, Brisbane, Qld., Australia.

Athanasiadou S, I Kyriazakis, F Jackson, RL Coop. 2000a. Consequences of long-term feeding with condensed tannins on sheep parasited with Trichostrongylus colubriformis. Int J Parasitol 30, 1025-1033.

Athanasiadou S, I Kyriazakis, F Jackson, RL Coop. 2000b. Effects of short-term exposure to condensed tannins on adult Trichostrongylus colubriformis. Vet Rec 146, 728-732.

Athanasiadou S, I Kyriazakis, F Jackson, RL Coop. 2001. Direct anthelmintic effects of condensed tannins towards different gastrointestinal nematodes of sheep: in vitro and in vivo studies. Vet Parasitol 99, 205-219.

Athanasiadou S, I Kyriazakis. 2004. Plant secondary metabolites: antiparasitic effects and their role in ruminant production systems. P Nutr Soc 63, 631-639.

Bennet-Jenkins E, C Bryant. 1996. Novel sources of anthelmintics. Int J Parasitol 26, 937-947.

Coop RL, PH Holmes. 1996. Nutrition and Parasite Interaction. Int J Parasitol 26, 951-962.

Fiel C, P Steffan. 1994. Epidemiología de los nematodos gastrointesti-nales en la pampa húmeda. En: Nari A, Fiel C (eds). Enfermedades parasitarias de importancia económica en bovinos. Bases epide-miológicas para su prevención y control. Editorial Hemisferio Sur, Montevideo, Uruguay.

Gasbarre LC, JE Miller 2000. Genetics of helminth resistance. In: Axford RFE, Bishop SC, Nicholas FW, Owen JB (eds). Breeding for di-sease resistance in farm animals. CAB International,Wallingford, UK, Pp 129-152.

Geary TG, NC Sangster, DP Thompson. 1999. Frontiers in anthelmintic pharmacology. Vet Parasitol 84, 275-295.

Gray GD. 1997. The use of genetically resistant sheep to control nematode parasitism. Vet Parasitol 72, 345-366.

Houdijk JGM, S Athanasiadou. 2003. Direct and indirect effects of host nutrition on ruminant gastrointestinal nematodes. In: Mannetje Lt’, Ramirez-Aviles L, CA Sandoval-Castro, JC Ku-Vera (eds). Matching Herbivore Nutrition to Ecosystems Biodiversity. Universidad Autónoma de Yucatán, Yucatán, México, Pp 213-236.

Hounzangbe-Adote MS, V Paolini, I Fouraste, K Moutairou, H Hoste. 2005. In vitro effects of four tropical plants on three life-cycle stages of the parasitic nematode, Haemonchus contortus. Res Vet Sci 78, 155-160.

163


Jackson F, RL Coop. 2000. The development of anthelmintic resistance in sheep nematodes. Parasitology 120, 95-107.

Kuehl R. 2001. Diseño de experimentos. Principios estadísticos de diseño y análisis de investigación. 2da ed. Thomson Learning, México D.F., México.

Landau S, N Silanikove, Z Nitsan, D Barkai, H Baram, FD Provenza, A Perevolotsky. 2000. Short-term changes in eating patterns explain the effects of condensed tannins on feed intake in heifers. Appl Anim Behav Sci 69, 199-213.

Larsen M. 1999. Biological control of helminths. Int J Parasitol 29, 139-146.Larsen M. 2000. Prospects for controlling animal parasitic nematodes

by predacious micro fungi. Parasitology 120, S120-S131.Lassak EV, T McCarthy. 1983. Australian Medicinal Plants. Methuen

Australia, North Ryde, NSW, Australia.Lyndall-Murphy M. 1993. Anthelmintic resistance in sheep. In: Corner

LA, Bagust TJ (eds). Australian Standard Diagnostic Techniques. Standing Committee on Agriculture and Resource Management, CSIRO, Melbourne, Australia.

Makkar HPS. 2003. Effects and fate of tannins in ruminant animals, adaptation to tannins and strategies to overcome detrimental effects of feeding tannin-rich feeds. Small Ruminants Res 49, 241-256.

McKellar QA. 1997. Ecotoxicology and residues of anthelmintic compounds. Vet Parasitol 72, 413-435.

McLeod RS. 1995. Cost of major parasites to the Australian livestock industries. Int J Parasitol 25, 1363-1367.

Min BR, TN Barry, GT Attwood, WC McNabb. 2003. The effect of condensed tannins on the nutrition and health of ruminants fed fresh temperate forages: a review. Anim Feed Sci Tech 106, 3-19.

Molan AL, RA Alexander, IM Brookes, WC McNabb. 2000a. Effect of an extract from Sulla (Hedysarum coronarium) containing condensed tannins on the migration of three sheep gastrointestinal nematodes in vitro. Proc New Zeal Soc An 60, 21-25.

Molan AL, GC Waghorn, BR Min, WC McNabb. 2000b. The effect of condensed tannins from seven herbages on Trichostrongylus colubriformis larval migration in vitro. Folia Parasitol 47, 39-44.

Molan AL, SO Hoskin, TN Barry, WC McNabb. 2000c. Effect of condensed tannins extracted from four forages on the viability of the larvae of deer lungworms and gastrointestinal nematodes. Vet Rec 147, 44-48.

Molan AL, S Sivakumaran, PA Spencer, LP Meagher. 2004. Green tea flavan-3-ols and oligomeric proanthocyanidins inhibit the motility of

infective larvae of Teladorsagia circumcincta and Trichostrongylus colubriformis in vitro. Res Vet Sci 77, 239-243.

Paolini V, JP Bergeaud, C Griez, F Prevot, P Dorchies, H Hoste. 2003a. Effects of condensed tannins on goats experimentally infected with Haemonchus contortus. Vet Parasitol 113, 253-261.

Paolini V, A Frayssines, F De la Farge, P Dorchies, H Hoste. 2003b. Effects of condensed tannins on established populations and on incoming larvae of Trichostrongylus colubriformis and Teladorsagia circumcincta in goats. Vet Res 34, 331-339.

Paolini V, I Fouraste, H Hoste. 2004. In vitro effects of three woody plant and sainfoin extracts on 3rd-stage larvae and adult worms of three gastrointestinal nematodes. Parasitology 129, 69-77.

Rabel B, R McGregor, PGC Douch. 1994. Improved bioassay for estimation of inhibitory effects of ovine gastrointestinal mucus and anthelmintics on nematode larval migration. Int J Parasitol 5, 671-676.

SAS Institute. 2004. Statistical Analysis Systems. Version 9.1.3. SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA.

Seigler DS. 2002. Economic potencial from Western Australian Acacia species: secondary plant products. Conserv Sci W Aust 4, 109-116.

Smith WD. 1999. Prospects for vaccines of helminth parasites of grazing ruminants. Int J Parasitol 29, 17-24.

Van Soest PJ. 1982. Nutritional ecology of the ruminant. O & B Books Inc., Corvallis, Oregon, USA.

Vercruysse J, TPM Schetters, DP Knox, P Willadsen, E Claerebout. 2007. Control of parasitic disease using vaccines: an answer to drug resistance? Rev Sci Tech off Int Epiz 26, 105-115.

Waghorn GC, WC McNabb. 2003. Consequences of plant phenolic compounds for productivity and health for ruminants. P Nutr Soc 62, 383-394.

Wagland BM, WO Jones, L Hribar, T Bendixen, DLA Emery. 1992. A new simplified assay for larval migration inhibition. Int J Parasitol 22, 1183-1185.

Waller PJ, SM Thamsborg. 2004. Nematode control in ‘green’ ruminant production systems. Trends in Parasitol, 20, 493-497.

Wood IB, NK Amaral, K Bairden, JL Duncan, T Kassai, JB Malone, JA Pankavich, RK Reinecke, O Slocombe, SM Taylor, J Vercruysse. 1995. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP) second edition of guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in ruminants (bovine, ovine, caprine). Vet Parasitol 58, 181-213.

165

Arch Med Vet 42, 165-171 (2010)

ORIGINAL ARTICLE

Accepted: 09.06.2010.

# This work was supported by CONACYT-SAGARPA (project No. 12441).

* Apdo. Postal. 4-116, Itzimná, 97000, Mérida, Yucatán, México; [email protected]

Adaptation of Haemonchus contortus to condensed tannins: can it be possible?#

Adaptación de Haemonchus contortus a los taninos condensados: ¿puede ser posible?

JA Calderón-Quintala, JFJ Torres-Acostaa, CA Sandoval-Castroa*, MA Alonsob, H Hostec, A Aguilar-Caballeroa

aFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán, Yucatán, México. bCentro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical,

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México.cUMR1225 INRA/DGER IHAP, ENVT, Toulouse, France.

RESUMEN

El efecto antihelmíntico (AH) in vitro de los extractos ricos en taninos de Acacia pennatula, Lysiloma latisiliquum, Piscidia piscipula y Leucaena leucocephala sobre larvas L3 de tres cepas mexicanas de Haemonchus contortus fue evaluado. Extractos acetona/agua fueron obtenidos del follaje de A. pennatula, L. latisiliquum, P. piscipula y L. leucocephala proveniente de la vegetación de Yucatán, México. Concentraciones crecientes de extractos liofilizados (300, 600, 1.200, 1.800 and 2.400 mg/ml PBS) fueron empleados para evaluar el efecto AH utilizando la prueba de inhibición de la migración larvaria (LMI). Se utilizaron tres cepas mexicanas no relacionadas de H. contortus (CENID-INIFAP, UADY y UNAM). El papel de los taninos sobre el efecto AH fue confirmado mediante el uso de polivinil polipirrolidona (PVPP), un inhibidor de taninos. Las cepas de H. contortus mostraron diferente respuesta a los extractos. Unicamente un extracto de planta (L. latisiliquum) mostró efecto sobre la migración larvaria en la cepa de Yucatán (UADY). Dos extractos de plantas (A. pennatula y L. latisiliquum) inhibieron la migración larvaria en la cepa CENID-INIFAP. Mientras que tres extractos tuvieron efecto sobre la cepa UNAM (A. pennatula, L. latisiliquum y P. piscipula). Adicionalmente, la cepa UNAM fue afectada con dosis menores de los extractos en comparación con las cepas CENID-INIFAP y UADY. Los resultados indican que las larvas obtenidas de Yucatán, México, son menos sensibles a los extractos de PRT obtenidos de la misma región sugiriendo una posible adaptación a los taninos.

Key words: larval migration inhibition test, tropical tannin rich fodder, Haemonchus contortus.

Palabras clave: inhibición de la migración larvaria, forraje tropical rico en taninos, Haemonchus contortus.

INTRODUCTION

The direct anthelmintic (AH) activity, attributed to phenolic compounds and specifically to condensed tan-nins, is present in certain forages (Niezen et al 1995, Hoste et al 2006). The nematocidal activity of tannin extracts against L3 larvae of gastrointestinal nematode (GIN), such as Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubri-formis, has been tested in vitro using legume forages or woody plants grown under temperate (Molan et al 2003, Paolini et al 2004) and tropical conditions (Alonso-Díaz et al 2008a, 2008b). The AH effects have also been tested in vivo (Brunet et al 2008, Martinez-Ortiz-de-Montellano et al 2009, 2010).

The tropical and subtropical regions have a large vari-ety of tropical tannin rich plants (TRP) within the native vegetation of Yucatan (Flores-Guido 2001). These are an important component of the diet of goats and sheep (Rios

and Riley 1985). In a previous study, we reported that Acacia pennatula, Piscidia piscipula and Lysiloma latisiliquum are consumed by goats (Alonso-Díaz et al 2008c) and sheep (Alonso-Díaz et al 2009). Therefore, ruminants have evolved and developed adaptation mechanisms that allow them to consume tannins contained in TRP while satisfying their nutrient requirements from this type of vegetation. Furthermore, animals infected with H. contortus ate more TRP fodder than non infected animals when offered the same diet (Martinez-Ortiz de Montellano et al 2010).

Tannins from the fodder of TRP have a direct AH effect upon the exsheatment of infective parasitic larvae (Brunet et al 2008). The AH effect on adult stages is recently being explored and preliminary results indicated lesions on the cu-ticle, buccal cavity and vulva (Martinez-Ortiz-de-Montellano et al 2009). However, sheep and goats consuming TRP, can have GIN burden in their gastrointestinal tract which can severely affect their health status. Therefore, it is possible to hypothesize that GIN’s from animals with a history of TRP intake might have also developed adaptation mechanisms to survive tannins. This hypothesis is not unexpected since both host and parasites co-evolve to adapt to prevailing environmental conditions (Cordero-del-Campillo and Rojo-Vázquez 1999). Parasites evolving to develop some kind of adaptation mechanisms would be a logical result of the

166

JA CALDERóN-QUINTAL ET AL

direct response against the ruminant’s TRP intake. Whether the animal’s intake of TRP is linked to controlling their GIN burden or just a nutrient search, parasites would need to adapt to such hostile environment. This phenomenon has not being studied yet in ruminants. However, recent evidence from plant studies has suggested that phenolic compounds appear to be the reciprocal cause and effect of plant defense mechanisms and larval adaptation to such mechanisms (Ibanez et al 2009). Hence, the objective of the present study was to determine the sensitivity to TRP in three H. contortus strains obtained from three zones in Mexico, based on the assumption that the contact with TRP was divergent depending on the area.

MATERIAL AND METHODS

SAMPLING AREA

The plant material was collected in the deciduous tropi-cal forest of the north of Yucatan, Mexico (20°48' N and 89°42' W), in an area nearby the Faculty of Veterinary Medicine of the Universidad Autonoma de Yucatan (UADY), between June and November 2006 (wet season). The climate of the area is hot sub-humid with summer rainfalls. The average temperature ranged from 26 to 27.8 °C. Annual rainfall ranges from 940 to 1100 mm (García 1988). Prior to the beginning of the trial, samples of the different plants were collected and identified at the FMVZ-UADY herbarium.

PREPARATION OF PLANT EXTRACTS

The extracts used in this trial were the same used by Alonso-Díaz et al (2008a, 2008b). These were obtained from fresh leaves of L. latisiliquum, A. pennatula, P. pi-scipula and Leucaena leucocephala harvested from the low deciduous forest nearby the premises of UADY, in Merida, Yucatan, Mexico (20°52’ N, 89°37’ W). These plant species were chosen because of their high content of CT (Bobadilla-Hernández et al 2007, Monforte-Briceño et al 2005, Alonso-Díaz et al 2008c). Fresh leaves of each plant species (500 g) were chopped to obtain the extracts. The chopped material was then placed in a mixer containing one liter (l) of acetone: water (70:30) containing ascorbic acid (1 g 1-1) to avoid oxidation. The mixture was then sonicated for 20 min in a water bath (Branson 5510®). The extract was obtained from the filtered material using a filter paper. Acetone was evaporated from the extract at 58 °C using a roto-vapor (Buchii R-114®). The aqueous solution was washed four times with 500 ml methylene chloride to remove chlorophyll and lipids. A separation funnel was used for discarding the methylene chloride fraction. The remaining fractions were lyophilized and kept refrigerated at 4 °C in air-tight containers until their use for biochemical and biological assays.

POLY-PHENOLIC COMPOUND COMPOSITION OF THE PLANT

EXTRACTS

The extracts were analyzed to quantify the content of polyphenolic compounds by Alonso-Díaz et al (2008a). This included total phenols (TP with Folin–Ciocalteu), total tannins (TT with Folin–Ciocalteu + PVPP), condensed tan-nins (CT with the Vanillin method) and biological activity (BA units measured as relative precipitation per gram of extract using resorcinol as standard). The highest level of CT and BA was found in A. pennatula extract (95.98 g/100 and 11.54 units respectively). Lysiloma latisiliquum and L. leucocephala extracts followed with 46.91 g/100 and 7.00 units and 45.71 g/100 and 5.80 units respectively. Finally, the lowest values were found in P. piscipula extract (26.07 g/100 and 5.00 units).

PREPARATION OF GASTROINTESTINAL NEMATODE LARVAE

Larvae were harvested from faecal cultures of sheep faeces with mono-specific H. contortus infection. Three sheep were used as egg donors for the faecal cultures. Each donor sheep was infected with one of the three different H. contortus strains used. The strains originated from three different parasitology laboratories: UADY (Merida, Mexico), UNAM (Cuatitlan, Mexico) and CENID-INIFAP (Cuernavaca, Mexico). The first strain (UADY) was ob-tained from a donor sheep which was artificially infected with a local H. contortus strain isolated from a browsing animal with daily access to the area where the plants were collected. The UNAM strain was obtained from grazing sheep from the highlands of the centre of Mexico (grass fed). The third strain (CENID-INIFAP) was obtained from sheep herded in a subhumid tropical area in Hueytamalco, Puebla in the centre of Mexico.

Faeces were collected from the respective donor sheep every morning using plastic containers. Faeces were ho-mogenized and moistened to achieve a crumbly (doughy) consistency in a plastic container with an aluminum lid. The faeces were incubated at room temperature (27-30 °C) for 7 to 8 days. This allowed the eggs of H. contortus to hatch and develop to the infective L3 larvae. At the end of the incubation period, the mixture was placed in respective Baerman’s apparatus overnight to harvest the L3 larvae. The larvae were sieved (250 mm) to remove faecal debris. Then, larvae were stored at 4 °C for later use. The larvae from the three strains were used between two and six weeks of age.

LARVAL MIGRATION INHIBITION BIOASSAY (LMI)

The inhibitory activity of the native tanniniferous plants extracts was evaluated with an in vitro larval migration inhibition (LMI) assay (Rabel et al 1994). This assay measures the percentage of L3 larvae of H. contortus that fails to pass through a sieve relative to the larvae in the

167

LARVAL MIGRATION INHIBITION TEST, TROPICAL TANNIN RICH FODDER, HAEMoNCHUS CoNToRTUS

control wells containing phosphate-buffer solution (PBS). A range of plant extract concentrations (600, 1,200, 1,800 and 2,400 µg/ml diluted on PBS) were used as described by Alonso-Díaz et al (2008a, 2008b). Briefly, four ml of larval solution concentrated at ~1000 L3/ml were added to tubes containing four ml of either PBS, an anthelmintic control (levamisole 0.4%) or a range of plant extract concentrations for each plant species. All incubations were carried out for three hours at 24 °C. Thereafter, the L3 were added with 4 ml of PBS and centrifuged (3,500 rpm during 5 min). The supernatant was removed (4 ml). This procedure was repeated three times. Then, 800 μl of this solution were added to inserts equipped with a 20 μm mesh, positioned in a conical tube with the mesh just above PBS. Four repli-cates were run for each plant concentration as well as for its PBS and anthelmintic controls. As in other studies, the 20 μm mesh was selected in order to ensure that migration of larvae through the sieves was an active phenomenon. After three hours at room temperature, the inserts were retrieved and L3 which had actively migrated through the mesh into the PBS below, were counted under a stereomicroscope at magnification 20x, based on a 10% aliquot.

In order to confirm the role of tannins in the AH effect, another series of incubations were made using polyvinyl polypirrolidone (PVPP) as a tanning blocking agent (Makkar et al 1995). The procedure was similar to that described above including three treatments: i) the negative control (PBS), ii) the solution to be tested with PVPP (50 mg PVPP/ml) and iii) the same test solution without PVPP. Four replicates were run for each treatment.

DATA CALCULATION AND STATISTICAL ANALYSES

The larval migration (%) was determined according to the following equation:

%LM = B/A * 100

Where: A is the number of larvae deposited in the sieves in the wells, and B is the number of larvae migrating through sieves in wells.

The significance of differences (P < 0.05) of larval migration among different treatments (extract doses) and their respective PBS control in the different assays was performed by means of Mann-Whitney tests using Minitab 15 (Minitab 2007). No statistical comparison was performed between strains. Also, PBS values were not compared statistically as they were used as reference control values.

Larval migration inhibition was determined according to the equation reported by Rabel et al (1994):% LMI = ((A-B)/A) * 100

Where: A is the number of larvae migrating through the sieves in negative control wells (PBS), and B is the number of larvae migrating through sieves in the respec-tive treatment wells (containing extracts). No statistical analysis was performed for these values.

RESULTS

LARVAL MIGRATION INHIBITION BIOASSAYS

UNAM strain. The migration obtained with the PBS control ranged from 50.71 to 66.70% and the levamisol migration ranged from 0 to 1.31%. Significant differences (P < 0.05) to control values were found at low doses (600 µg/ml) for the larvae after contact with A. pennatula and even lower for L. latisiliquum (300 µg/ml) (table 1). Meanwhile, a high concentration (1,200 µg of extract/ml) of P. piscipula extract was needed to cause inhibition of larval migration for this strain of H. contortus (–57% relative to the PBS control). The L. leucocephala extract did not cause a reduction in the larval migration at any concentrations used in this trial (P > 0.05).

CENID-INIFAP strain. The migration obtained with the PBS control ranged from 83.04 to 100.00% and the levamisol migration ranged from 0 to 1.95%. A consistent AH effect was found with the A. pennatula extract from 600 µg/ml causing a significant reduction (–49.18%) on the larval migration compared to the PBS control (P < 0.05). The L. latisiliquum extract showed an effect only at the highest concentration with 2,400 µg/ml (–35.06%; P < 0.008). The L. leucocephala and P. piscipula extracts did not cause a reduction in the larval migration of H. contortus at any concentrations used (P > 0.05).

UADY strain. The migration obtained with the PBS control ranged from 50.63 to 68.90% and the levamisol migration ranged from 0 to 2.15%. Significant differences to control values were found for the larvae after contact with 300, 600, 1,200, 1,800, 2,400 µg/ml of the L. latisiliquum extract (P < 0.05) and the larval migration inhibition showed to be –27.8%, –22%, –28%, –35% and –51.7% respectively. The A. pennatula, L. leucocephala and P. piscipula extracts did not cause reduction in the larval migration of H. contortus at any concentrations used (P > 0.05).

A second series of LMI assays, with and without PVPP, showed significant differences (P < 0.05) compared to control values for the three larvae strains. The level used for the UNAM strain was 1,200 µg/ml meanwhile the UADY and the CENID-PAVET strains were tested at 2,400 µg/ml because some extracts were not showing AH effect at 1,200 µg/ml. Migration was restored to control values in A. pennatula, L. latisiliquum, and P. piscipula when PVPP was added.

DISCUSSION

Although the AH effect of tannins on GIN has been demonstrated consistently, the efficacy has been variable. Alonso-Diaz et al (2008a, 2008b) reported that tannin-containing extracts obtained from different TRP have a

168


Table 1. Percentage of migration of Haemonchus contortus infective larvae (UNAM strain) exposed to different concentrations of tannin rich plant extracts (Mean+/–SE). Migración (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa UNAM) expuestas a diferentes concentracions de extractos vegetales ricos en taninos (Media +/–SE)†.

Treatments 2,400 µg/ml 1,800 µg/ml 1,200 µg/ml 600 µg/ml 300 µg/ml

Acacia pennatula – – 48.03 ± 1.23* 47.83 ± 3.73* 45.05 ± 7.31

Leucaena leucocephala 43.45 ± 3.65 49.06 ± 4.10 46.78 ± 3.44 56.59 ± 4.21 43.84 ± 3.46

Piscidia piscipula – – 28.53 ± 4.49* 62.81 ± 4.01 ††

Lysiloma latisiliquum – – 42.05 ± 8.52* 35.49 ± 5.51* 40.10 ± 4.73*

* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values. † using the larval migration inhibition (LMI) assay.†† No reduction in larval migration compared to PBS control.

Table 2. Percentage of migration of Haemonchus contortus infective larvae (CENID-INIFAP strain) exposed to different concentrations of tannin rich plant extracts†(Mean+/–SE). Migración (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa CENID-INIFAP) expuestas a diferentes concentracions de extractos vegetales ricos en taninos (Media +/–SE)†.


Acacia pennatula 34.5 ± 6.89* 40.33 ± 6.01* 55.09 ± 12.41* 58.52 ± 9.93* ††

Leucaena leucocephala 73.44 ± 6.0 †† †† † † ††

Piscidia piscipula 98.41 ± 4.71 †† 97.26 ± 7.69 92.13 ± 2.73 ††

Lysiloma latisiliquum 31.60 ± 1.07*** 72.04 ± 6.55 77.36 ± 5.74 75.77 ± 3.09 ††

* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values. † using the larval migration inhibition (LMI) assay.†† No reduction in larval migration compared to PBS control.

Table 3. Migration (%) of Haemonchus contortus infective larvae (UADY strain) exposed to different concentrations of tannin rich plant extracts (Mean+/-SE). Migración (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa UADY) expuestas a diferentes concentracions de extractos vegetales ricos en taninos (Media +/–SE)†.


Acacia pennatula – 48.37 ± 2.91 48.58 ± 6.94 40.01 ± 4.82 40.38 ± 5.31

Leucaena leucocephala 58.16 ± 4.31 †† 66.93 ± 4.16 47.35 ± 3.07 ††

Piscidia piscipula – 48.22 ± 4.01 50.28 ± 3.78 – –

Lysiloma latisiliquum 29.60 ± 3.16* 39.84 ± 3.63* 44.04 ± 1.22* 42.27 ± 2.62* 39.14 ± 2.24

* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values. † using the larval migration inhibition (LMI) assay.† †No reduction in larval migration compared to PBS control.

variable AH effect measured with in vitro tools such as the LMI or larval exsheathment assays. Moreover, some extracts did not show AH effect when using the LMI test but when using the exsheathment assay they did. The results of the present trial illustrate such phenomenon and explain part of the reason for such variability: our hypothesis was that worm strains originating from geographic areas where they are exposed to TRP would be less sensitive

to the extracts obtained from the same TRP than those worm strains from other geographic areas. For example, the UADY strain was obtained in an area where TRP are an important part of the host diet. Those same TRP’s were used to obtain the tannin rich extracts used in the pres-ent trial. As a result, only one of the four TRP extracts (L. latisiliquum) showed a clear AH effect with this strain. It is possible that the extract of this plant was the only one

169


showing in vitro AH effect because the fodder of this tree is less accessible to browsing animals due to its higher branches (compared to other TRP evaluated in the trial). Meanwhile, the UNAM strain was originated from grazing sheep of the highlands of central Mexico with no recent history of browsing. This strain was sensitive to three differ-ent extracts (A. pennatula, L. latisilquum and P. piscipula) and at lower doses than UADY or CENID-INIFAP strains. Finally, the CENID-INIFAP strain was sensitive to two plant extracts A. pennatula and L. latisiliquum. The latter strain originated from a tropical region in the highlands of Mexico. Due to the higher altitude of the region of origin (compared to central Yucatan) the plant species in contact with the strain may have differed from those where the extracts were obtained.

It is noticeable that the L. latisiliquum extract was effective against the three H. contortus strains tested. The AH effect found for this extract is consistent with earlier results with H. contortus and T. colubriformis strains obtained in France (Alonso-Díaz et al 2008a, 2008b). Moreover, in both French strains the AH effect of the extracts was dose dependent and the AH effect was found at lower doses than those found in some Mexican strains used in the present trial (UADY and CENID-INIFAP). This plant has already demonstrated its AH effect under in vivo conditions using sheep fed with cut and carry fresh fodder and infected with the H. contortus strain from CENID-PAVET (Brunet et al 2008, Martinez-Ortiz-de-Montellano et al 2010).

It is possible that the lack of AH effect of the A. pen-natula extract in the UADY strain could be explained by the frequent exposure of UADY strain to the tannins contained in this plant. The A. pennatula fodder is commonly browsed in the Yucatan tropical forest due to the low height of the plant fodder. The lack of AH effect was observed in spite of the high CT content and high BA of the extract used. Such features might explain why this extract was effective against the UNAM and CENID-INIFAP strains.

The AH effect of L. leucocephala was not evident in any of the strains of the present trial. For the UADY and CENID-INIFAP strains this result could be expected as the fodder of this type of plant is commonly used for browsing and/or cut and carry feeding systems. However, it is not possible to explain the lack of effect on the UNAM strain as this plant is not common in the grazing systems of the highlands of Mexico. Furthermore, this same extract has shown to be efficacious against an H. contortus strain from France.

An inhibitor of tannins (PVPP) confirmed the role of tannins on the in vitro AH effect of the different ex-tracts, as it has been performed elsewhere (Alonso-Díaz et al 2008a, 2008b).

The development of adaptive mechanisms to avoid negative effects of different plant secondary compounds (PSC) is not new and has been reported for different or-ganisms exposed to the PSC. The plant produces tannins as a defense mechanism against herbivores (Levin 1976,

Robbins et al 1987a, 1987b). As a result, the organisms attacked by tannins adapt to these substances in order to be able to continue using such resource in their diet or survive in an environment rich in this type of compounds. The nematode can develop morphological adaptations like changes in esophageal glands, the mount and gut, and the cuticula surface (Jasmer et al 2003). In animals, an example of adaptation is the proline rich saliva of ruminants that has been reported in deer and rhinoceros (Clauss et al 2005). This type of adaptation was recently found in sheep and goats from Yucatan1. Thus, it is not unthinkable that parasitic nematodes present in the GIT of ruminants might also develop adaptive mechanisms to cope with the tannin rich environment.

Using TRP fodder as a nutraceutical option to control GIN is feasible for some farmers in tropical areas. Sheep and goats may consume large enough quantities of fodder from TRP to cause AH effect without any evidence of toxicity (Alonso-Díaz et al 2008c, 2009, Martinez-Ortiz-de-Montellano et al 2010, Aregheore and Perera 2004, Hernández-Orduño et al 2008, Mendez-Ortiz et al 2009). Also, the in vitro and in vivo AH effects have been con-firmed (Niezen et al 1995, 1998, Molan et al 2000, Paolini et al 2003a, 2003b, Hoste et al 2008, Hoste et al 2006, Brunet et al 2008, Martinez-Ortiz de Montellano et al 2010). However, sheep and goats browsing TRP keep worm parasite populations in their gastrointestinal tract. Therefore, it is difficult to conceal a clear AH effect with the TRP intake from browsing. Recent browsing and pen studies with sheep and goats suggested that animals might use TRP intake to affect the worm biology (reducing worm fecundity, worm size and/or quantity of eggs in faeces) rather than eliminating their actual worm burden (Martinez-Ortiz de Montellano et al 2010). Similar results were suggested by Ibanez et al (2009) where adonivernith (a phenolic compound contained in a flower) acted as a growth inhibitor or a feed deterrent rather than a lethal compound for Chiastocheta spp. larvae feeding on globeflower seeds.

Hence, it is possible that parasitized small ruminants will eat more TRP fodder which will increase the quantity of tannins in the diet affecting the worm biology (less larval establishment, reduced worm female fecundity and worm size) leading to reduced parasite challenge. As a result, the parasites will need to develop adaptation mechanisms for survival. Controlling worms rather than eliminating them is a better strategy for the host as the surviving worms can help the host to maintain premunity against parasites. In this case animals are using the direct AH mechanism and the animal immune system to tackle worm infection. This warrants further research.

Although results obtained from LMI are not directly ap-plicable in vivo, they provide supporting evidence to previous in vivo trials by Brunet et al 2008 and Martinez-Ortiz de

1 Alonso-Díaz et al unpublished data.

170


Montellano et al (2009, 2010) and suggest that Mexican H. contortus strains could be controlled by tannins from TRP normally present in the host diets. However, the current results also suggest that the diet of the host (browsing or grazing) and the nature of the polyphenolic compounds contained in the diet should be considered in order to understand/avoid low sensitivity of the parasites leading to failure of tannins in modifying the biology of those same parasites. This leads to the opportunity to investigate other sources of tannins which would not be normally present in the host’s diet such as agroindustrial by products or plants not used for feeding ruminants. Promising results have been recently obtained in our lab using cocoa beans, extracted coffee and mangrove leaves (Nieves-Guerrero et al 2009).

In conclusion, this experiment suggested that different H. contortus strains showed different sensitivities to tannin rich extracts. The strains that have been in contact with TRP normally present in the host diet were less sensitive to the extracts and those strains from grazing animals were more sensitive. Further studies are needed to confirm this result in vivo.

SUMMARY

The in vitro anthelmintic (AH) effect of Acacia pennatula, Lysiloma latisiliquum, Piscidia piscipula and Leucaena leucocephala tannin rich extracts on three Mexican strains of Haemonchus contortus L3 larvae was eval-uated. Water/acetone extracts were obtained from the fodder of A. pennatula, L. latisiliquum, P. piscipula and L. leucocephala collected in the vegetation of Yucatan, Mexico. Increasing concentrations of lyophilized extracts (300, 600, 1,200, 1,800 and 2,400 µg/ml PBS) were screened for their in vitro AH effect using the larval migration inhibition (LMI) assay. Three unrelated H. contortus Mexican strains were used (CENID-INIFAP, UADY and UNAM). The role of tannins on the AH effect was confirmed by means of polyvinyl polypyrrolidone (PVPP), an inhibitor of tannins. The differ-ent H. contortus strains showed different responses to the extracts. Only one plant extract (L. latisiliquum) affected the larval migration of the H. contortus strain obtained from Yucatan (UADY). Two plants extracts (A. pennatula and L. latisiliquum) inhibited the larval migration of the CENID-INIFAP strain. Meanwhile, three plant extracts affected larval migration of UNAM strain (A. pennatula, L. latisiliquum, P. piscipula). Furthermore, UNAM strain was affected by extracts at lower doses than CENID-INIFAP and UADY strains. These results indicated that the larvae obtained from Yucatan, Mexico, were less sensitive to extracts of TRP from the same region suggesting a possible adaptation to tannins.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was performed by J.A. Calderón-Quintal to obtain a MSc degree at the Universidad Autónoma de Yucatán, Mexico. This work was financially supported by CONACYT-SAGARPA (project No. 12441). Infective larvae were kindly provided by M.C. Alfredo Cuellar-Ordáz (UNAM strain) and Enrique Liebano Hernandez and Pedro Mendoza de Gives (CENID-INIFAP strain).

REFERENCES

Alonso-Díaz MA, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, H Hoste, AJ Aguilar-Caballero. 2008a. In vitro larval migration and kinetics of exsheathment of Haemonchus contortus larvae exposed to four tropical tanniniferous plant extracts. Vet Parasitol 153, 313-319.

Alonso-Díaz MA, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, CM Capetillo-Leal, S Brunet, H Hoste. 2008b. Effects of four tropical tanniniferous plant extracts on the inhibition of larval migration and the exsheathment process of Trichostrongylus colubriformis infective stage. Vet Parasitol 153, 187-192.

Alonso-Díaz MA, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, H Hoste, AJ Aguilar-Caballero, CM Capetillo-Leal. 2008c. Is goats preference of forage trees affected by their tannins of fiber content when offered in cafeteria experiments? Anim Feed Sci Technol 141, 36-48.

Alonso-Díaz MA, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, H Hoste, AJ Aguilar-Caballero, CM Capetillo-Leal. 2009. Sheep preference for different tanniniferous tree fodders and its relationship with in vitro gas production and digestibility. Anim Feed Sci Technol 151, 75-85.

Aregheore EM, D Perera. 2004. Effect of supplementation of a basal diet of maize stover with Erythrina variegata, Gliricidia sepium or Leucaena leucocephala on feed intake and digestibility by goats. Trop Anim Health Prod 36, 175-189.

Bobadilla-Hernández AR, L Ramírez-Avilés, CA Sandoval-Castro. 2007. Effect of supplementing tree foliage to grazing dual-purpose cows on milk composition and yield. J Anim Vet Adv 6, 1042-1046.

Brunet S, C Martínez-Ortiz-de-Montellano, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, AJ Aguilar-Caballero, CM Capetillo-Leal, H Hoste. 2008. Effect of the consumption of Lysiloma latisiliquum on the larval establishment of parasitic gastrointestinal nematodes in goats. Vet Parasitol 157, 81-88.

Clauss M, J Gehrke, JM Hatt, ES Dierenfeld, EJ Flach, R Hermes, J Castell, WJ Streich, J Fickel. 2005. Tannin-binding salivary protein in three captive rhinoceros species. Comp Biochem Physiol Part A Mol Int Physiol 140, 67-72.

Cordero-del-Campillo M, FA Rojo-Vázquez. 1999. Parasitología Veterinaria. McGraw-Hill Interamericana, Madrid, España.

Flores-Guido S. 2001. Leguminosae. Florística, etnobotánica y ecología. Etnoflora yucatanense, Fascículo 18. Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, Yucatán, México.

García E. 1988. Modificaciones del sistema de clasificación climática de Köppen (para adaptarlo a las condiciones de la República Mexicana). 2da ed. Instituto de Geografía, UNAM, México.

Hernández-Orduño G, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, AJ Aguilar-Caballero. 2008. Polyethylenglicol (PEG) did not modify preference for tanniniferous plants in cafeteria trials of sheep and goats with browsing experience. Proceedings 9th International Conference on Goats, Querétaro, México.

Hoste H, F Jackson, S Athanasiadou, SM Thamsborg, SO Hoskin. 2006. The effects of tannin-rich plants on parasitic nematodes in ruminants. Trends Parasitol 22, 253-261.

Hoste H, JF Torres-Acosta, MA Alonso-Díaz, S Brunet, C Sandoval-Castro, S Adote. 2008. Identification and validation of bioactive plants for the control of gastro intestinal nematodes in small ruminants. Trop Biomed 25, 56-71.

Ibanez S, C Gallet, F Dommanget, L Despres. 2009. Plant chemical defence: a partner control mechanism stabilising plant-seed-eating pollinator mutualisms. BMC Evol Biol 9, 261.

Jasmer, PD, A Goverse, G Smant. 2003. Parasitic nematode interactions with Mammals and plants. Annu Rev Phytopathol 41, 245-270.

Levine DA. 1976. The chemical defenses of plants to pathogens and herbivores. Ann Rev Ecol Syst 7, 121-159.

Makkar HPS, M Blümmel, K Becker. 1995. Formation of complexes between polyvinyl pyrrolidones or polyethylene glycols and tannins, and their implication in gas production and true digestibility in in vitro techniques. Brit J Nut 73, 897-913.

Martinez-Ortiz-de-Montellano C, I Fourquaux, S Brunet, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, H Hoste. 2009. Scanning electron microscopy of Haemonchus contortus adults after contact with extracts of two tannin rich plants: Lysiloma latisiliquum and onobrychis viciifolia. Proceedings WAAVP Conference. Calgary, Canada.

Martinez-Ortiz-de-Montellano, C, JJ Vargas-Magaña, HL Canul-Ku, R Miranda-Soberanis, C Capetillo-Leal, CA Sandoval-Castro, H

171


Hoste, JFJ Torres-Acosta. 2010. Effect of a tropical tannin-rich plant Lysiloma latisiliquum on adult populations of Haemonchus contortus in sheep. Vet Parasitol 10.1016/j.vetpar.2010.04.040.

Minitab. 2007. Minitab Release 15. Minitab Reference Manual. Minitab, State college. Philadelphia, USA.

Molan AL, RA Alexander, IM Brookes, WC McNabb. 2000. Effects of an extract from sulla (Hedysarum coronarium) containing condensed tannins on the migration of three sheep gastrointestinal nematodes in vitro. Proc New Z Soc Anim Prod 60, 21-25.

Molan AL, AJ Duncan, TN Barry, WC McNabb. 2003. Effects of condensed tannins and crude sesquiterpene lactones extracted from chicory on the motility of larvae of deer lungworm and gastrointestinal nematodes. Parasitol Int 52, 209-218.

Monforte-Briceño GE, CA Sandoval-Castro, L Ramírez-Avilés, CM Capetillo-Leal. 2005. Defaunating capacity of tropical forage trees. Effect of PEG and its relationship with in vitro gas production. Anim Feed Sci Technol 123-124, 313-327.

Niezen JH, TS Waghorn, WAG Charleston, GC Waghorn. 1995. Growth and gastrointestinal nematode parasitism in lambs grazing either Lucerne (Medicago sativa) or Sulla (Hedysarum coronarium) which contains condensed tannins. J Agric Sci 25, 281-289.

Niezen JH, HA Robertson, GC Waghorn, WAG Charleston. 1998. Production, faecal egg counts and worm burdens of ewe lambs which grazed six contrasting forages. Vet Parasitol 80, 15-27.

Nieves-Guerrero A, JFJ Torres-Acosta, H Hoste, C Sandoval-Castro, R Cámara-Sarmiento, MA Alonso-Díaz. 2009. Evaluación de fuentes de taninos provenientes de sustratos agroindustriales (cacao y café)

en el control de Haemonchus contortus en ovinos. Memoria VIII Congreso Nacional de Parasitología Veterinaria. Mérida, Yucatán, México.

Paolini V, A Frayssines, F De La Farge, F Dorchies, H Hoste. 2003a. Effects of condensed tannins on established populations and on incoming larvae of Trichostrongylus colubriformis and Teladorsagia circumcincta in goats. Vet Res 34, 1-9.

Paolini V, JP Bergeaud, C Grisez, F Prevot, Ph Dorchies, H Hoste. 2003b. Effects of condensed tannins on goats experimentally infected with Haemonchus contortus. Vet Parasitol 113, 253-261.

Paolini V, I Fouraste, H Hoste. 2004. In vitro effects of three woody plant and sainfoin extracts on two parasitic stages of three parasitic nematode species. Parasitol 129, 69-77.

Rabel B, R McGregor, PGC Douch. 1994. Improved bioassay for estimation of inhibitory effects of ovine gastrointestinal mucus and anthelmintics on nematode larval migration. Int J Parasitol 24, 671-676.

Ríos GT, JA Riley. 1985. Estudios preliminares sobre la producción caprina con dietas a base de ramoneo en monte bajo en la zona henequenera de Yucatán. I. Selección y valor nutritivo de las plantas nativas. Trop Anim Prod 10, 1-11.

Robbins CT, TA Hanley, AE Hagerman, O Hjeljord, DL Baker, CC Schwartz, WW Mautz. 1987a. Role of tannins in defending plants against ruminants: reduction in protein availability. Ecology 68, 98-107.

Robbins CT, S Mole, AE Hagerman, TA Hanley. 1987b. Role of tannins in defending plants against ruminants: reduction in dry matter digestion? Ecology 68, 1606-1615.

173

Arch Med Vet 42, 173-178 (2010)

ORIGINAL ARTICLE

Accepted: 14.07.2010.

* Avda. Universidad s/n 10071, Cáceres, Spain; [email protected]

Electrophoretic pattern of serum proteins in horses with babesiosis

Patrón electroforético de proteínas séricas en caballos con babesiosis

R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza*

Department of Medicine and Health Animal, Faculty of Veterinary Sciences, University of Extremadura, Spain.

RESUMEN

La electroforesis sérica en hojas de acetato de celulosa es una técnica que se usa frecuentemente para separar las distintas fracciones proteicas. Esta técnica permite detectar cambios cualitativos y cuantitativos en las proteínas séricas relacionados con distintas enfermedades. El propósito de este estudio fue caracterizar los cambios que se producen en las distintas fracciones proteicas en caballos con babesiosis con el fin de evaluar su aplicación en el diagnóstico de la enfermedad. En este trabajo se han calculado las concentraciones de proteínas totales de 53 caballos y se ha realizado electroforesis sérica de estos animales. Los caballos fueron divididos en dos grupos: Grupo I (19 caballos sanos) y Grupo II (34 caballos con babesiosis clínica). La enfermedad fue diagnosticada por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados obtenidos en el grupo de caballos enfermos se compararon con los mostrados por los caballos sanos. Las medianas estadísticas para la concentración de proteínas totales y la fracción de γ-globulinas fueron estadísticamente más altas (P < 0,01) que las observadas en el grupo control. Además, la subfracción de α2-globulina en los caballos enfermos mostró también un aumento estadísticamente significativo (P < 0,05) con respecto a los caballos sanos. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la alteración más significativa observada en el patrón sérico de proteínas en caballos con babesiosis es el aumento de las α2-y las γ-globulinas.

Key words: electrophoresis, serum, babesiosis, horse.

Palabras clave: electroforesis, suero, babesiosis, caballo.

INTRODUCTION

Serum electrophoresis is a common technique of laboratory diagnosis in human medicine, as well as in small animal medicine. There are different techniques of electrophoresis but the most common method in clinical medicine is zone electrophoresis (Batamuzi et al 1996, Thomas 2000). It is characterized because the serum is placed on a supporting medium such as cellulose acetate. Serum proteins have a negative charge, so they migrate in an electric field and can be separated from each other in different bands (zones). Each band is made up of a group of individual proteins which can be identified by this technique (Barta and Pourciau 1984). Although this technique provides very useful information about the quantitative alterations of the serum protein fractions related to the disease, it is not commonly used in equine medicine.

Serum electrophoresis from healthy horses is characterized by the absence of prealbumin region and by six different bands: albumin, α1-globulins, α2-globulins, β1-globulins, β2-globulins and γ-globulins (Kohn 1997). However, in the disease such as in equine babesiosis, the serum concentration of the proteins can change significantly (Kumar et al 2002).

Equine babesiosis is a tick-borne protozoal disease caused by Babesia caballi and Babesia equi. Although it has been

reported that horses are most susceptible to infection, the disease can affect horses, donkeys, their hybrids and wild equidae (Okamura et al 2005, 2007). The disease may take on an acute or chronic form (Radostits et al 1999). Clinical signs of the acute form include weakness, anorexia, fever of up to 42 °C, which usually becomes irregular after the second day (Malikides et al 2000). Animals that have the chronic form of the illness usually survive for months without any apparent signs of the disease. Symptoms may include steady weight loss and slight anaemia usually following exercise or stress situations (Hailat et al 1997).

Babesiosis is an important disease from both economic and animal health point of view, because it involves substantial losses by death and by decrease in animal production. In addition, the equestrian legislation of some countries do not allow seropositive symptomatic and non-symptomatic animals (Asenzo et al 2008).

Horses with babesiosis often display an increase in the concentration of total proteins usually caused by dehydration and by the increase in the γ-globulin concentration (Kumar et al 2002). However, until now zone-electrophoresis to evaluate changes in protein fractions has not been applied to the serum in equine babesiosis, although it is very useful from a clinical point of view because it is less time consuming.

The aim of the present work was characterize the serum electrophoretic pattern in horses suffering from babesiosis and to evaluate its application in the diagnosis by the study of the quantitative alterations in the serum proteins associated to this disease.

174

R BARRERA ET AL

MATERIALS AND METHODS

ANIMALS

Fifty three adult horses of different breed, sex, and age were studied and classified in two groups. Group I included 19 healthy horses all seronegative to babesiosis. Animals from Group II were presented to the Veterinary Teaching Hospital at Extremadura University (Spain) showing clinical symptoms consistent with the disease (table 1). This group included 34 horses suffering from naturally acquired babesiosis: 7 horses (20.59%) showed positive antibody titre against Babesia caballi, 9 horses (26.47%) against Babesia equi and 18 horses (52.94%) showed positive titre against both Babesia species (Table2). Disease was always diagnosed or ruled out by indirect immunofluorescence antibody assay.

SEROLOGICAL TESTS

Serological tests were performed according with Callow et al (1979), Donnelly et al (1980a, b), Soule et al (1984), and Habela et al (1989). Antigen of Babesia equi was prepared after esplenectomized carrier horse (titre 1/320) from Andalucía (local strain), and the antigen of Babesia caballi after infection with USDA strain of seronegative horse, which was kindly provided for Professor G. Uilenberg (Veterinary Faculty, Utrecht, Netherlands). Commercial fluorescein conjugated rabbit anti-horse immunoglobulin (Nordic, Tilburg, Netherlands) was used at a dilution of 1:60 in phosphate-buffered saline. A titre of 1:80 was considered positive. Positive and negative control sera were kindly supplied by Professor G. Uilenberg (Veterinary Faculty, Utrecht, Netherlands).

SERUM TOTAL PROTEIN

Blood samples were obtained under non-stress conditions by jugular venipuncture using vacutainer tubes. Serum was obtained by centrifugation for 10 minutes at 600 g using serum-separator tubes. Serum was used instead of plasma in order to avoid interference from fibrinogen. Serum protein concentration was calculated by Biuret’s method (Gornall et al 1949). Freeze-dried bovine serum albumin (Química Clínica Aplicada, Spain) was used as a control.

SERUM ELECTROPHORESIS

To characterize the serum electrophoretic pattern in the animals studied, serum electrophoresis was performed. Zone electrophoresis (Kohn 1957) on a supporting medium of cellulose acetate strips (2.5 × 17 cm) (Cellogel®, Atom Biosystems, Spain) was performed. Serum proteins migrated in an electric field of 200 volts for 65 minutes. The buffering solution used was sodium veronal 0.04 M and sodium-dietilbarbiturate 0.82 g/dl. Amido-Black

Table 1. More significant clinical manifestations noted in the Group II (horses with babesiosis). Manifestaciones clínicas más significativas observadas en el Grupo II (caballos con babesiosis).

HorseNº

Weakness Anorexia Fever*Steady weight

loss

Pale mucous mem-branes

Jaundice Oedemas

1 – – – + – – –2 – + + – – + +3 + + + – – + +4 – + + – + + –5 – – – + – – –6 – – – + – – –7 + + – + + + –8 + + + – + + –9 – – – + – – –10 – – + – + – –11 + + – + + – –12 – – – – – – –13 – – – + + – –14 – + – – – – –15 + + + + + + +16 + + + – + + –17 – + – – – – –18 + + + – + + –19 + + – + – – –20 – – – – + – –21 + + – + – – –22 – – – + – – –23 + + – + + + –24 – – – – – – –25 + + + – – + –26 + + + – – + –27 + + – + – – –28 – – – + + – –29 + + – + + + –30 + + + + + + –31 + + + – – + –32 + + – + + + –33 – + + – + + –34 + + + – + + –

* Body temperature up to 39 °C.

(Atom Biosystems, Spain) staining was used, and a solution of methanol, acetic acid, and water (40:10:50) was applied as a destaining solution. Finally, the strips were analyzed in a scanner densitometer using the Ultroscan GSX software (Pharmacia LKB Biotechnology, San Francisco, CA, USA).

STATISTICAL ANALYSIS

Statistical analysis of the results was performed using the non-parametric of Mann-Whitney U test. The used software was SPSS 14 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

175

ELECTROPHORESIS, SERUM, BABESIOSIS, HORSE

Table 2. Antibody titers for Babesia equi and Babesia caballi obtained by indirect immunofluorescence test (IFI) in the Group II (horses with babesiosis). Títulos de anticuerpos frente a Babesia equi y Babesia caballi obtenidos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en el Grupo II (caballos con babesiosis).

Horse Nº B. equi B. caballi Horse Nº B. equi B. caballi

1 1/160 1/160 18 1/1280 Negative2 1/640 1/320 19 1/160 1/1603 1/160 1/320 20 1/320 Negative4 1/80 1/320 21 1/320 Negative5 1/160 1/160 22 Negative 1/6406 Negative 1/640 23 1/160 Negative7 1/320 1/1280 24 1/80 Negative8 Negative 1/640 25 1/160 1/3209 Negative 1/160 26 1/160 Negative10 1/640 1/160 27 1/80 1/64011 Negative 1/320 28 1/640 Negative12 1/80 1/80 29 1/1280 1/64013 1/640 Negative 30 1/80 1/64014 Negative 1/320 31 1/160 1/32015 1/320 1/320 32 1/1280 1/16016 Negative 1/1280 33 1/160 1/8017 1/160 Negative 34 1/320 1/160

RESULTS

GROUP I

Serum electrophoresis from Group I showed a normal electrophoretic pattern, characterized by six different bands: albumin, α1-globulin, α2-globulin, β1-globulin, β2-globulin and γ-globulin fractions (figure 1). Statistical analysis results of serum protein fractions from Group I are shown in table 3.

GROUP II

In our study, the median obtained for the serum total proteins in the Group II was 7.18 g/L (interquartile range (IQR) 5.80-9.03 g/L), showing a statistically significant difference (P < 0,001) with the Group I (table 3). Although, the range of values obtained was very wide (minimum value = 36g/L; maximum value = 142.7 g/L), hyperproteinemia was observed in 14 horses. Conversely, six animals showed hypoproteinemia with a serum total protein concentration lower than 55 g/L.

Although the median albumin concentration was 3.96 g/L, 13 horses with babesiosis displayed high values of the albumin concentration. Statistical data obtained for the concentration albumin in Group II are shown in table 3.

In this group, the α-globulin fraction was also resolved into two subfractions: α1-globulin and α2-globulin, respectively. The α1-globulin values from sick horses were similar to the results obtained in healthy horses for the same subfraction. Conversely, a statistically significant increase (P < 0,005) in the median α2-globulin sub-fraction was observed in Group II (table 3). Fourteen of the 34 horses

studied, showed high values of α2-globulin sub-fraction, mainly 5 of them (figure 2).

The β-globulin fraction in horses with babesiosis was also resolved into two subfractions: β1-globulin and β2-globulin, respectively. Statistical results are shown in table 3. The β1 and β2-globulin median from sick horses was similar to the results obtained in healthy horses for the same subfraction. Although 3 horses in particular, had an increase in the β2-globulin and a decrease in β1-globulin, 2 animals presented an increase in both sub-fractions and 9 horses showed a decrease in both sub-fractions.

The median value of the γ-globulins fraction obtained in the sick horses (1.36 g/L) was significantly higher (P < 0.01) than that obtained in Group I (table 3).

Finally, 12 of the sick animals displayed a ratio lower than 1 and a low albumin concentration was observed in the majority of them. The statistical results obtained for the albumin/globulin ratio in Group II are shown in table 3.

DISCUSSION

Hyperproteinemia in babesiosis is usually caused by dehydration, whose main cause is the letargy associated to the disease (Divers 1998). In addition, the increase in the γ-globulin concentration also contributes to the increase in the total proteins concentration (Radostits et al 1999). In our study, the median value obtained for the serum total proteins in the Group II was significantly higher (P < 0.01) than that obtained in the Group I (table 3). Hypoproteinemia observed in six animals may be related to the severe anorexia that characterizes the disease in its acute form, as well as the feverish symptoms displayed (table 1). In some cases, hypoproteinemia can be so severe

176

R BARRERA ET AL

proteins are usually evaluated together and reference is made to the α-globulin fraction without indicating the sub-fraction (Sevelius and Andersson 1995, Kaneko 1997). The α1-globulin median from the sick horses was similar to the results obtained in the healthy horses for the same subfraction (table 3). Changes of the α1-globulin concentration do not appear to be important from a diagnostic point of view. However, the median value for the α2-globulin subfraction in Group II was significantly higher (P < 0.05) when compared with that obtained in Group I (table 3). The increase of the α-globulin fraction occurs frequently in equidae suffering from different pathologies (Carapeto et al 2006). Although its increase has not been described in equine babesiosis, a clear increase in the α2-globulin sub-fraction was observed in five of the horses studied (figure 2). Although this increase is due to tissue damage and inflammatory processes, elevation of the α-globulin fraction may be observed in diseases that are not linked to inflammation, such as occurs in cases of hepatic or renal damage (Kaneko 1997). This fact may explain the results observed in some of the horses studied because when a hepatopathy is developed, an increase in the α1-glycoprotein-acid, α1-antitrypsin, haptoglobin and α2-macroglobulin can be observed (Sevelius and Andersson 1995). In addition, animals with babesiosis frequently develop renal disease resulting from dehydration and haemoglobinuria by intra-vascular haemolysis produced by the parasite (Navarrete y Serrano 1999). Finally, the increase of α-globulin fraction may be cut off by the decrease in the concentration of the haptoglobin, usually observed in animals with haemolytic anaemia, which characterizes the disease (Jain 1993).

1

23

45 7

Figure 1. Densitometer scan of the serum electrophoresis of a healthy horse. 1: albumin; 2: α1-globulin; 3: α2-globulin; 4: β1-globulin; 5: β2-globulin; 6: γ-globulins. Lectura densitométrica de la electroforesis sérica de un ca-ballo sano. 1: albúmina; 2: α1-globulina; 3: α2-globulina; 4: β1-globulina; 5: β2-globulina; 6: γ-globulinas.

1

2

3

4 56

Figure 2. Densitometer scan of the serum electrophoresis of a horse with babesiosis showing an increase of the α2-globulin subfraction. 1: albumin; 2: α1-globulin; 3: α2-globulin; 4: β1-globulin; 5: β2-globulin; 6: γ-globulins. Lectura densitométrica de la electroforesis sérica de un caballo con babesiosis mostrando un aumento en la fracción de α2-globulinas. 1: albúmina; 2: α1-globulina; 3: α2-globulina; 4: β1-globulina; 5: β2-globulina; 6: γ-globulinas.

that oedema in the limbs of 3 horses was observed in our study (table 1).

The median concentration of albumin in Group II was higher than that obtained in Group I, although non-statistically significant difference was observed (table 3). The increase in the albumin concentration may be explained as a consequence of dehydration because no pathological processes with increase in the production of albumin have been described (Kaneko 1997). In order to produce clinical signs, it is considered that the serum albumin level must decrease until some values below 15.0 g/L. The presence of oedema was verified in the 3 horses that presented such values. The decrease of the albumin concentration in horses with babesiosis is related to the hepatopathy that may develop during the disease (Colville 2002) and to the symptomatic anorexic state (Stockham and Scott 2002) observed in 23 horses (table 1). Hypoalbuminemia is usually related to chronic cases and a prolonged course. Furthermore, the albumin concentration variation is usually associated to that of serum total proteins since it is the most abundant protein in the blood, as usually observed in the animals studied. However, in 5 of the 14 horses that showed an increase in serum total proteins, hyperalbuminemia was not the main cause of the increase, it was a severe hypergammaglobulinemia that had contributed noticeably to that increase.

The α-globulin fraction are known as acute stage proteins because their concentration increases immediately after an inflammation or a wound (Stockham and Scott 2002). In horses, the concentration of α1-globulin is lower than α2-globulin (Kohn 1997), although functional differences between them have not been reported. These

177

ELECTROPHORESIS, SERUM, BABESIOSIS, HORSE

When the results of β-globulin sub-fractions in horses with babesiosis were compared with those obtained in the control group, no significant differences were observed (table 3). Changes in this fraction depend on different factors, such as the progress of the disease (acute or chronic) and the course or severity of the haemolytic anaemia caused. In addition, an increase in its concentration related to acute hepatic damage has been described (Kaneko 1997) as a consequence of the increase in the transferrin concentration. This protein also contributes to the β-globulin decrease if the hepatic disease is chronic (Barta and Pourciau 1984). Conversely, horses suffering from babesiosis are characterized by haemolytic anaemia. Although this has not been confirmed in natural clinical processes, the β-globulin increase is a consequence of in vitro haemolysis caused by the presence of free haemoglobin. In addition, a decrease in the β-globulin concentration as a result of a decrease in the pepsin concentration in cases of clinical haemolysis has been described (Barta and Pourciau 1984). Horses with babesisosis occasionally show disseminated intra-vascular coagulation (Radostits et al 1999) that causes an increase in the plasminogen concentration, which is included in the β-globulin fraction. Finally, β-globulin fraction concentration may be related to the albumin fraction in cases of extra-vascular liquid exudation. This fact was observed in two of the horses that presented lower β-globulin values and hypoalbuminemia.

In babesiosis, the immunity mechanisms are mainly of humoral nature (Morris et al 2002), although the protozoa can activate a cellular-type immune response (Tizard 1996). In this study, the median value obtained for the γ-globulin fraction in sick horses was significantly higher (P < 0.01) than the one obtained in healthy horses (table 3). This increase observed in the serum γ-globulin concentration (figure 3) is related to the humoral immunity activated by the parasitation of the animals

studied. This occurs mainly in horses with a more severe hypergammaglobulinemia and hepatic damage, although the immune response in some animals may produce an increase of immunoglobulin too small to be detected through routine electrophoresis techniques (Jain 1993, Stockham and Scott 2002).

Finally, although one third of the sick animals displayed a albumin/globulin ratio lower than 1, the absence of statistically significant difference against healthy horses (table 3) may be due to the increase in the albumin concentration observed in a high number of animals (14 horses), as well as to the increase in the

Table 3. Median and interquartile range of the total protein concentration (g/L), serum protein fractions (g/L) and albumin/globulin ratio (A/G) from Group I (healthy horses) and Group II (horses suffering from babesiosis). Statistical differences between both groups are shown. Mediana y rango intercuartílico de la concentración de proteínas totales (g/L), fracciones de proteínas (g/L) y cociente albúmina/globulina (A/G) del Grupo I (caballos sanos) y del Grupo II (caballos con babesiosis). Se muestran las diferencias estadísticas obtenidas entre ambos grupos.

Total protein Albumin α1-

globulinα2-

globulinβ1-

globulinβ2-

globulinγ-

globulin A/G

GROUP I(N = 19)

Median 6.00 3.21 0.12 0.53 0.65 0.41 0.94 1.05

IQR 0.60 0.44 0.05 0.23 0.25 0.42 0.29 0.35

GROUP II(N = 34)

Median 7.18 3.63 0.12 0.68 0.69 0.36 1.36 1.22

IQR 3.23 1.65 0.08 0.33 0.35 0.42 1.22 0.76

Significance level P < 0.01 NS NS P < 0.05 NS NS P < 0.01 NS

IQR = interquartile range.NS = non-statistically significant.NS = no estadísticamente significativo.

1

2

34

5

6

Figure 3. Densitometer scan of the serum electrophoresis of a horse with babesiosis showing an increase of the γ-globulin fraction. 1: albumin; 2: α1-globulin; 3: α2-globulin; 4: β1-globulin; 5: β2-globulin; 6: γ-globulins. Lectura densitométrica de la electroforesis sérica de un caballo con babesiosis mostrando un aumento en la fracción de γ-globulinas. 1: albúmina; 2: α1-globulina; 3: α2-globulina; 4: β1-globulina; 5: β2-globulina; 6: γ-globulinas.

178

R BARRERA ET AL

concentrations of α2-globulin and γ-globulin fractions discussed previously.

Results obtained in this study allow to conclude that the increase of the γ-globulin fraction, associated in some cases to the increase of the α2-globulin fraction, is a common finding in the serum electrophoresis of the horses suffering from babesiosis and it can be very useful for the diagnosis of the disease.

SUMMARY

Serum electrophoresis in cellulose acetate strips is a technique commonly used to separate the protein fractions. This technique allows detecting quantitative and qualitative changes in the serum proteins associated with different diseases. The aim of this study was to characterize the changes of the serum protein fractions produced in horses suffering from babesiosis and to evaluate its application in its diagnosis. Serum total proteins were calculated and the serum electrophoresis from 53 horses was performed. Animals were classified in two groups: Group I (19 healthy horses) and Group II (34 horses suffering from babesiosis). Babesiosis was diagnosed by indirect immunofluorescence antibody assay. Data obtained in the group of sick horses were compared with those from the healthy horses. Median values from total proteins and γ-globulins fraction were significantly higher (P < 0.01) than that observed for the control group. In addition, a statistically significant increase was observed (P < 0.05) in the values of α2-globulin subfraction in the sick horses. Results obtained in this study allow concluding that the most significant alteration observed in the serum electrophoretic pattern of horses suffering from babesiosis is the increase of α2-globulin and γ-globulin fractions.

REFERENCES

Asenzo G, S Wilkowsky, M Barrandeguy, M Mesplet, D Benitez, M Florin-Christensen. 2008. Development of an indirect ELISA for the diagnosis of equine piroplasmosis. Ann N Y Acad Sci 1149, 235-238.

Barta O, SS Pourciau. 1984. Electrophoresis. In: Barta O (ed). Laboratory techniques of veterinary clinical immunology. Charles C Thomas, Illinois, USA, Pp 116-122.

Batamuzi EK, E Kristensen, AL Jansen. 1996. Serum protein electrophoresis: potential test for use in geriatric companion animal health programmes. Zbl Vet Med 43, 501-508.

Callow LL, W McGregor, BJ Rodwell, RJ Rogers, GG Fraser, DF Mahoney, GM Robertson. 1979. Evaluation of an indirect fluorescent antibody tests to diagnose Babesia equi infection in horses. Aust Vet J 55, 555-559.

Carapeto MV, R Barrera, MC Mañe, C Zaragoza. 2006. Serum α-globulin fraction in horses is related to changes in the acute phase proteins. J Equine Vet Sci 26, 120-127.

Colville J. 2002. Blood chemistry. In: Hendrix CM (ed). Laboratory procedures for veterinary technicians. 4th ed. Mosby, St. Louis, USA, Pp 75-104.

Divers TJ. l998. Liver failure: hemolitic anemia. In: Orsini JA, Divers TJ (eds). Manual of equine emergencies. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 273-296.

Donnelly J, LP Joyner, C Frank. 1980a. Quantitative epidemiological studies on the prevalence of babesiosis in horses in Kuwait. Trop Anim Health Prod 12, 253-258.

Donnelly J, LP Joyner, O Graham-Jones, CP Ellis. 1980b. A comparison of complement fixation and immunofluorescent antibody tests in a survey of the prevalence of Babesia equi and Babesia caballi in horses in the Sultanate of Oman. Trop Anim Health Prod 12, 50-60.

Gornall AG, CJ Bardawill, MM David. 1949. Determination of serum proteins by means of the Biuret reaction. J Biol Chem 177, 751-766.

Habela M, D Reina, C Nieto, SG Verdugo, I Navarrete. 1989. Epidemiología de la babesiosis equina en Extremadura: estudio preliminar. Med Vet 6, 1-7.

Hailat NQ, SQ Lafi, AM Al-Darraji, FK Al-Ani. 1997. Equine babesiosis associated with strenous exercise: clinical and pathological studies in Jordan. Vet Parasitol 69, 1-8.

Jain NC. 1993. The plasma proteins, dysproteinemias, and immune deficiency disorders. In: Essentials of veterinary hematology. Lea and Febiger, Philadelphia, USA, Pp 349-380.

Kaneko JJ, JW Harvey, ML Bruss. 1997. Clinical biochemistry of domestic animals. 5th ed. Academic Press, New York, USA.

Kohn J. 1957. A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis. Clin Chim Acta 2, 297-303.

Kumar S, DV Malhotra, AK Nichani. 2002. Identification of immunoreactive polypeptides of Babesia equi parasite during immunization. Vet Parasitol 107, 295-301.

Malikides N, JL Hodgson, AE Kessell. 2000. Practical Clinical Pathology. In: Rose RJ, DR Hodgson (eds). Manual of equine practice. 2th ed. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 593-620.

Morris DD, JK Johnston. 2002. Alterations in blood proteins. In: Smith BP (ed). Large animal internal medicine. 3rd ed. Mosby, St. Louis, USA, Pp 427-433.

Navarrete I, FJ Serrano. 1999. Babesiosis. In: Cordero del Campillo M, Vázquez FA, Martínez AR, Sánchez MC, Hernández S, Navarrete I, Diez P (eds). Parasitología Veterinaria. McGraw-Hill Interamericana, Madrid, España, Pp 587-592.

Okamura M, N Yokohama, NP Wickramathilaka, N Takabatake, Y Ikehara, I Igarashi. 2005. Babesia caballi and Babesia equi: implications of host sialic acids in erythrocyte infection. Exp Parasitol 110, 406-411.

Okamura M, N Yokohama, N Takabatake, K Okubo, Y Ikehara, I Igarashi. 2007. Modification of host erythrocyte membranes by trypsin and chymotrypsin treatments and effects on the in vitro growth of bovine and equine Babesia parasites. J Parasitol 93, 208-211.

Radostits OM, CC Gay, DC Blood, KW Hinchcliff. 1999. Diseases caused by protozoa. In: Radostits QM, Gay CC, Blood DC, Hinchcliff KW (eds). Veterinary medicine. 9th ed. WB Saunders, London, United Kingdom, Pp 289-1329.

Sevelius E, M Andersson. 1995. Serum protein electrophoresis as a prognostic marker of chronic liver disease in dogs. Vet Rec 137, 663-667.

Soule C, C Perret, P Dorchies. 1984. Babesiose equine a Babesia equi: comparison des techniques de fixation du complement d’immunofluorescence indirecte et ELISA. Rev Med Vet 135, 419-423.

Stockham SL, MA Scott. 2002. Proteins. In: Stockham SL, Scott MA (eds). Fundamentals of veterinary clinical pathology. Iowa State Press, Iowa, USA, Pp 251-276.

Thomas JS. 2000. Protein electrophoresis. In: Feldman BF, Zinnkl JG, Jain NC (eds). Schalm's veterinary hematology. 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA, Pp 899-903.

Tizard IR. 1996. Veterinary immunology an introduction. 5th ed. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 316-321.

179

Arch Med Vet 42, 179-186 (2010)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 03.03.2010.

# Proyecto FONDEF DO6I1020. Casilla 15-D Temuco, Chile; [email protected]

Almacenamiento en frío de espermatozoides de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss): Efectos en la motilidad, superóxido intracelular, integridad

de la membrana plasmática y potencial de membrana mitocondrial#

Cold storage of sperm of rainbow trout (oncorhynchus mykiss): Effect on motility, intracellular superoxide, plasma membrane integrity and mitochondrial membrane potential

O Berríos*, I Valdebenito, F Treulén, A Ubilla

Escuela de Acuicultura, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.

SUMMARY

In teleostei, as opposed to what happens in mammals, most of the studies that evaluate the quality storages of semen are oriented toward the exposure of spermatozoa to some reactive oxygen species (ROS), the utilization of antioxidants in the diet, or the incorporation of these in seminal plasma. There is no available the literature covering the presence of superoxide ions (O2

._), or the function of these on the interior of the spermatozoa that have been stored. In this study, we evaluated the effect of storage on intracellular O2

._, motility, plasmatic membrane integrity, and mitochondrial membrane potential (ΔΨMit) of spermatozoa of rainbow trout (oncorhynchus mykiss). Semen was extracted and put into storage for 12 days at 4 ºC. Spermatozoa motility, (ΔΨMit), plasmatic membrane integrity were evaluated every 4 days, and intracellular O2

._ was detected. It was found that 82.59% of the cells were positive for the staining of O2

._ on the day of sample extraction, while sperm motility, ΔΨMit and plasmatic membrane integrity only showed deterioration after the eighth day of storage. Only ΔΨMit is correlated negatively with O2

._ starting from the eighth day of storage (r = –0.56 P < 0.05). Regarding motility and plasmatic membrane integrity, these were not affected by intracellular O2

._, although the deterioration observed in these last two indicators, could have been caused by the prolonged contact of the spermatozoa with contaminating agents that were not evaluated in this study.

Palabras clave: almacenamiento, superóxido intracelular, trucha arcoiris, espermatozoides.

Key words: storage, intracellular superoxide, rainbow trout, spermatozoa.

INTRODUCCIóN

Es habitual en especies de cultivo utilizar el almace-namiento de semen fuera del ambiente testicular, en caso de diagnóstico ictiosanitario o por ubicación de los repro-ductores a grandes distancias del sitio en que se realiza la incubación. Generalmente, este procedimiento es fácil de ejecutar y no requiere de implementación costosa ni de conocimientos avanzados, por lo que frecuentemente se practica en centros de cultivo.

Una forma de evitar el deterioro de los espermatozoi-des almacenados es diluir el semen en soluciones salinas isotónicas o diluyentes que imitan el medio en que se encuentran dentro del testículo. Los beneficios de estas soluciones están centrados principalmente en mantener las condiciones de humedad y control bacteriano del semen, permitiendo conservar las potencialidades fecundantes de los espermatozoides por largos periodos de tiempo (Babiak y col 2006).

En atención a lo anterior, se han identificado algunos agentes que perjudican la viabilidad y motilidad de los espermatozoides almacenados in vitro, entre estos se cuentan las condiciones propias de los reproductores como la edad de maduración, o factores relacionados con el medio de almacenamiento como temperatura, exposición a CO2, pH, concentración de oxígeno o contaminación con orina (Billard y col 1993, Billard y col 1997, Ohta y Izawa 1996, Bencic y col 2001, Ingermann y col 2002, Liley y col 2002, Valdebenito y col 2009).

Los estudios relacionados con calidad del semen de teleósteos almacenado in vitro en su mayoría están orientados a evaluar algunas características como color, consistencia (Estay y Téllez 1994), densidad espermática, motilidad (Billard 1988, Aas y col 1991, Estay y Téllez 1994) o composición del plasma seminal (Lahnsteiner y col 1998) y, a diferencia de lo que ocurre con mamíferos, poco se ha estudiado el deterioro estructural o producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en espermatozoides mantenidos fuera del testículo.

En relación a lo anterior, en mamíferos se ha observado un evidente incremento en la concentración de especies reactivas del oxígeno (ROS), como resultado de patolo-gías o por criopreservación de las células espermáticas (Chatterjee y col 2001, Agarwal 2004).

180

O BERRÍOS Y COL

Las ROS son una serie de radicales con carga negativa, y por ser altamente inestables tienden a reaccionar con otras moléculas dentro de la célula, las más frecuentes son el anión superóxido (O2

.–), radical peroxilo (ROO–) y anión hidroxilo (OH–). Además, existen otras ROS que no son radicales, como por ejemplo el peróxido de hidrógeno (H2O2). En mamíferos, estos elementos se producen naturalmente en bajas concentraciones dentro de la célula, interviniendo en procesos como capacitación, hiperactivación espermática, reacción acrosómica y en la unión del espermatozoide a la zona pelúcida (Sharma y Agarwal 1996, de Lamirande y col 1997, Cuquerella y col 2003).

La producción en exceso de ROS por la célula recibe el nombre de estrés oxidativo, fenómeno que origina daño a la membrana plasmática causando peroxidación lipídica, alteraciones de fluidez, fragmentación en el ADN, apoptosis vinculada a la activación de algunas caspasas y también se asocia a disminución de la motilidad por descenso en la fosforilación de proteínas del axonema (Connell y col 2002, Paasch y col 2004, Martin y col 2004) y aun cuando el plasma seminal cuenta con sistemas enzimáticos y no enzimáticos para reducir el efecto, en caso de estrés estos mecanismos no son suficientes (de Lamirande 1997, Peeker y col 1997).

Al respecto, se ha encontrado que concentraciones de ROS sobre las normales coinciden con deterioro de la membrana plasmática, disminución del potencial de mem-brana mitocondrial y motilidad de los espermatozoides. Para disminuir experimentalmente los niveles de ROS con frecuencia se han utilizado antioxidantes similares a aquellos presentes en el semen natural. Esta técnica ha mostrado mejorar los parámetros de calidad espermática, logrando a veces buenos resultados (Baumber y col 2000, Michael y col 2007).

En peces se desconoce si existe presencia de O2._ intra-

celular cuando el semen se encuentra almacenado in vitro, o como consecuencia de contaminación con desechos al momento de su extracción; además tampoco se encuentra literatura sobre el efecto del almacenamiento del semen en la integridad de la membrana plasmática y potencial de membrana mitocondrial, no obstante, los escasos trabajos publicados sobre el tema en su mayoría están orientados principalmente a la evaluación indirecta de ROS o a la inclusión de antioxidantes en la dieta (Mansour y col 2006, Mirzoyan y col 2006, Zhou y col 2006).

El propósito de este estudio fue evaluar el efecto del almacenamiento refrigerado en la permanencia de motilidad, O2

._ intracelular, integridad de la membrana plasmática y ΔΨMit de espermatozoides de trucha arcoiris (oncorhynchus mykiss).

MATERIAL Y MÉTODO

OBTENCIóN DE SEMEN

Se extrajo semen de veinte machos maduros de trucha arcoiris (oncorhynchus mykiss) de dos años de edad

provenientes de la Piscicultura Los Laureles perteneciente a la Universidad Católica de Temuco. Antes de la extrac-ción, los peces fueron anestesiados con BZ-20 al 0,015%, procediendo posteriormente a vaciar la vejiga urinaria. Luego, mediante masaje abdominal o stripping se extrajo la muestra de semen, la cual fue oxigenada y depositada en contenedores plásticos herméticamente cerrados.

En el laboratorio, el semen fue diluido en una pro-porción 1:2 (semen: diluyente espermático), este último compuesto de NaCl 18,8 g/L, CaCl2 * 3H2O 2 g/L, KCl 72 gr/L, NaH2PO4 * H2O 4,1 g/L, NaHCO3 1 g/L, MgSO4 * 7 H2O 2,3 g/L y glucosa 1g/L.

Todos los procedimientos fueron realizados a 4 °C. Diariamente los tiestos con las muestras se agitaron y se airearon inyectándoles oxígeno comprimido.

ANÁLISIS CITOMÉTRICO

Las lecturas de fluorescencia fueron realizadas en un citómetro de flujo FACscalibur (Becton-Dickinson) controlado por el software Cell-Quest pro. Las células pasaron a través del instrumento a aproximadamente 600-1.000 cel/s y se registraron datos de 10.000 células. La excitación de las células fue a 488 nm usando un láser de argón. La coloración fluorescente del SYBR-14 fue detectada utilizando un filtro con banda de 520 nm (FL1); la fluorescencia del ioduro de propidio (IP) y dihydroethi-dium (DHE) fue detectada con filtro de 610 nm de banda (FL3); todos sobre escalas logarítmicas.

EVALUACIóN DE MOTILIDAD

En un portaobjeto dispuesto sobre hielo se depositaron 10 µl de semen de trucha arcoiris; el portaobjeto con la muestra rápidamente fue montado sobre un microscopio de contraste de fase Olimpus BX 41. Una vez enfocada la muestra, se aplicaron sobre ésta 20 µl de agua de pozo, la cual activa el movimiento de los espermatozoides. Luego se procedió a evaluar el tiempo desde que comenzó el movimiento espermático, hasta que la totalidad de las células del campo visual dejaron de moverse.

DETERMINACIóN DE SUPERóXIDO INTRACELULAR

Para medir el anión superóxido se utilizó la técnica propuesta por De Iuliis y col (2006) modificada, la cual utiliza el colorante fluorescente dihydroethidium (DHE) (Molecular Probe). Este compuesto tiene la particularidad de aceptar radicales superóxido (O2

._) transformándose en 2-hydroxyethidium. La técnica consistió en centrifugar a 470 g por 5 min una suspensión espermática conteniendo 3 x 106 espermatozoides en diluyente espermático. Se retiró el sobrenadante y el pellet fue disuelto en 400 µl de dilu-yente conteniendo una concentración final de DHE 2 µM. Las células fueron incubadas en oscuridad durante 15 min a 4 ºC, y nuevamente centrifugadas a 470 g por 5 min; se

181

ALMACENAMIENTO, SUPERóXIDO INTRACELULAR, TRUCHA ARCOIRIS, ESPERMATOZOIDES

retiró el sobrenadante y el pellet fue diluido en 400 µl de diluyente espermático, para evaluación citométrica.

DETERMINACIóN DE POTENCIAL DE MEMBRANA

MITOCONDRIAL

Para la detección de la disminución del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨMit) de los espermatozoides se utilizó el kit comercial (Biomol® Research Laboratories, AK-116), cuyo colorante activo es 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-benzamidazolocarbocyanin iodide (JC-1). Éste posee una estructura de carga positiva y lipofílica que le permite ingresar fácilmente a las células y mitocondrias. La carga negativa de la membrana mitocondrial interna pro-duce agregación del colorante JC-1, el cual forma dímeros que emiten fluorescencia de color rojo cuando existe un alto potencial mitocondrial. Cuando en la célula el ΔΨMit disminuye, el reactivo ingresado asume una forma monomé-rica que emite fluorescencia verde (Marchetti y col 2004).Ambos colores son detectados por citometría.

Para la experimentación se adicionaron 3 x 106 esperma-tozoides a 1 ml de diluyente, la suspensión se centrifugó a 470 g por 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Luego, el pellet fue disuelto en una concentración final de 10 µg JC-1/ml diluyente. Para que actuara el colorante la suspensión se incubó 15 minutos a 4 ºC protegido de la luz, y se centrifugó nuevamente a 470 g por 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y los espermatozoides contenidos en el pellet fueron disueltos en 400 µl de diluyente para ser evaluados al citómetro.

EVALUACIóN DE INTEGRIDAD DE MEMBRANA PLASMÁTICA

La integridad de la membrana plasmática se evaluó con el kit Live/Dead® Sperm Viability Kit (L-7011) (Molecular Probes), el cual está compuesto por dos colo-rantes fluorescentes, uno para la tinción de ácidos nucleicos (SYBR 14 dye) y otro para viabilidad celular (ioduro de propidio (IP)). Esta tinción permite la identificación de células con la membrana íntegra (color verde) y aquellas muertas (color rojo).

Para la experimentación se adicionaron 3 x 106 esper-matozoides a 1 ml de diluyente espermático, se centrifugó a 470 g por 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. El pellet fue diluido en 1 ml de solución compuesta por SYBR14-IP a una concentración final de 1 µM y 5 µM respectivamente, e incubado por 15 minutos a 4 ºC protegido de la luz. Posteriormente, la suspensión compuesta por espermatozoides, diluyente y colorante fue centrifugada a 470 g por 5 minutos, eliminando luego el sobrenadante. Por último, el pellet resultante fue diluido en 400 µl de diluyente para ser evaluado al citómetro.


La normalidad de los datos se verificó con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la homocedasticidad con la

prueba de Levene. Se aplicó análisis de varianza ANDEVA con respecto a los días de almacenamiento. Cuando éste resultó significativo se utilizó la prueba de Tukey para la separación de medias con P < 0,05. Para ver si los días de almacenamiento con los parámetros evaluados se correlacionaban, se utilizó la correlación de Pearson con P < 0,05. También se utilizó esta prueba para ver la exis-tencia de correlación entre la producción de superóxido con potencial de membrana mitocondrial e integridad de membrana plasmática. Todos los datos fueron analizados con el programa estadístico XLSTAT versión 7.5.2.

RESULTADOS

MOTILIDAD

El tiempo que permanecieron en movimiento los espermatozoides el primer día de almacenamiento fue de 1,7 ± 0,2 min. Sin embargo, a partir del octavo día la mo-tilidad disminuye a menos de un minuto (0,53 ± 0,3 min), encontrando que el movimiento espermático es de solo 0,47 ± 0,5 min el último día de encontrarse los esperma-tozoides almacenados (figura 1).

SUPERóXIDO INTRACELULAR

La tinción con DHE para detectar O2._ intracelular

reveló un alto porcentaje de espermatozoides que son teñidos con DHE, desde el primer día de almacenamiento 82,59 ± 26,57% del semen, aumentando hacia el último día de evaluación, donde se detecta O2

._ a un 96,7 ± 3,4%

0

1

2

1.8

1.6

0.8

0.6

0.8

0.2

1.4

1.2

Man

tenc

ión

de la

mot

ilida

d (m

in)

1 4 8 2(Días)

Figura 1. Mantención de la motilidad de espermatozoides de trucha arcoiris (o. mykiss) almacenados in vitro. Valores pro-medio ± DE. Maintenance of motility of spermatozoa of rainbow trout (o. mykiss) stored in vitro. Mean values ± SD.

182

O BERRÍOS Y COL

de los espermatozoides (figura 2). El análisis de varianza ANDEVA mostró diferencias significativas en el porcentaje de espermatozoides que presentaron O2

._ solo el último día de evaluación (P < 0,05), no obstante, se encontró alta correlación entre los días de almacenamiento del semen y el porcentaje de espermatozoides que presentaba O2

._ (r = 0,8 P < 0,05).

Los gráficos de dispersión de la figura 3 muestran en la región superior izquierda la población de aquellos espermatozoides que se tiñeron positivamente con DHE. Se observa que este grupo de células se mantuvo más o menos constante a partir del primer día de evaluación.

INTEGRIDAD DE MEMBRANA CITOPLASMÁTICA

La integridad de la membrana plasmática también se vio afectada con el almacenamiento del semen; al respecto, se encontró que el 88,6 ± 9,3% de los espermatozoides regis-trados en el citómetro presenta la membrana íntegra el día de extracción (figura 2). Este porcentaje se ve disminuido a la mitad, 50,3 ± 14,9%, el octavo día de almacenamiento; y después de doce días de encontrarse los espermatozoi-des fuera del testículo se observa el 47,0 ± 13,7% de los espermatozoides con la membrana intacta, caracterizada por la fluorescencia de color verde. Al igual que el ΔΨMit,

el análisis de varianza ANDEVA muestra diferencias significativas de la integridad, a partir del octavo día de almacenamiento (P < 0,05). Correlacionando los días de almacenamiento con la integridad de la membrana, se encontró que la permanencia de los espermatozoides fuera del testículo la afecta negativamente (r = –0,8 P < 0,05). Al correlacionar el O2

._ con la integridad, para observar algún grado de relación, no se encuentra correlación entre ambos (P > 0,05).

El gráfico de dispersión muestra el desplazamiento de la población celular desde el cuadrante inferior derecho de células con la membrana íntegra hacia el cuadrante superior derecho, donde se detectan las células con la membrana deteriorada o muertas, teñidas con IP (figura 4).

POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL

Se observó gran porcentaje de espermatozoides con alto ΔΨMit el primer día de evaluación (80,8 ± 11,6%), dis-minuyendo a la mitad los espermatozoides con alto ΔΨMit el octavo día (53,8 ± 20,3%). Finalmente la evaluación correspondiente al duodécimo día reveló un 44,9 ± 26,1% de espermatozoides con alto ΔΨMit (figura 2). Por otro lado, el test de comparaciones múltiples (T-Tukey) muestra diferencias significativas del ΔΨMit entre los días 1 y 4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Esp

erm

atoz

oide

s (%

)

ΔΨMit Integr. membrana plasmática O2.–

r = –0.6 r = –0.8r = –0.8

aa

aa

a

a a

b

b

bb

b

Día 1 Día 4 Día 8 Día 12

Figura 2. Porcentaje de espermatozoides de trucha arcoiris (o. mykiss) con ΔΨMit alto, membrana citoplasmática íntegra y con superóxido intracelular. En la parte superior se exhibe el coeficiente de correlación con respecto a los días de almacenamiento y la significancia, aquí letras diferentes muestran diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05). Los resultados se dan en promedio ± DE. El recuadro muestra los días de las evaluaciones. Percentage of spermatozoa of rainbow trout (o. mykiss) with high ΔΨMit, cytoplasmic integral membrane and with intracellular superoxide. At the top is displayed the correlation coefficient with respect to days of storage, and the significance, here different letters show statistically significant differences (p < 0.05). The results are average ± SD. The box shows the days of the evaluations.

183


humanos y equino sometidos a criopreservación (De Iuliis y col 2006, Burnaugh y col 2007).

En espermatozoides de mamíferos, el O2._ intracelular

es consecuencia de los procesos metabólicos que habi-tualmente ocurren en la mitocondria (de Lamirande 1997, Sanocka y Kurpisz 2004); aquí este radical es generado y liberado al citoplasma donde es transformado a H2O2, el cual finalmente difunde hacia el espacio extracelular (de Lamirande 1997, Koppers y col 2008).

En humanos, habitualmente es baja la concentración de O2

._ disponible al interior de la célula, el cual formaría parte de una cascada de eventos que finalizaría con la capacitación espermática (de Lamirande 1998).

No se encuentran trabajos disponibles que traten la producción de superóxido intracelular y la función que éste cumple al interior del espermatozoide de peces. Los escritos publicados están orientados a la utilización de antioxidantes en la dieta, su aplicación en el plasma seminal o la exposición de los espermatozoides a otros tipos de ROS, donde se pone énfasis en la evaluación de la motilidad, capacidad fecundante, lipoperoxidación y daño del ADN de los espermatozoides por efecto de antioxidantes (Ciereszko y Dabrowski 1995, Kiron y col 2004, Mansour y col 2006, Zhou y col 2006, Canyurt y Akhan 2008).

DDH

E

A B

C

Figura 3. Comportamiento de los espermatozoides de trucha arcoiris (o. mykiss) respecto de la tinción de DHE para supe-róxido. Se observa a la mayoría de los espermatozoides ubicados en el cuadro superior izquierdo, que corresponde a las células con O2

._ intracelular, durante todos los días que permanecieron almacenadas. A = día 1, B = día 4, C = día 8 y D = día 12. Behavior of spermatozoa of rainbow trout (o. mykiss) after DHE staining for superoxide. Note the majority of sperm located in the upper left box, which corresponds to the cells with intracellular O2

._, every day they remained in storage. A = 1st, B = 4 days, C8 days and D = 12 days.

IP

SYBR-14

A B

C D

Figura 4. Tinción de SYB14 - IP para integridad de membrana plasmática de trucha arcoiris. Se observa el desplazamiento de los espermatozoides desde el cuadro inferior derecho, que corresponde a la membrana íntegra, hacia el cuadro superior derecho correspondiente a la tinción de ioduro de Propidio, este último tiñó las células muertas. A = día 1, B = día 4, C = día 8 y D = día 12. Staining SYB14 - IP for plasma membrane integrity of rainbow trout. It shows the movement of sperm from the lower right square that corresponds to the integral membrane, towards right upper square for the propidium iodide staining, the latter stained dead cells. A = 1st, B = 4 days, C8 days and D = 12 days.

con los días 8 y 9 (P < 0,05). Al correlacionar los días de almacenamiento versus el porcentaje de espermatozoides con alto ΔΨMit se encuentra correlación negativa entre ambos (r = –0,6 P < 0,05), al igual que al correlacionar el porcentaje de células con tinción positiva para O2

._ y ΔΨMit, donde también se obtiene un índice de correlación negativo r = –0,56 P < 0,05.

El test de comparaciones múltiples entre el porcentaje de espermatozoides con tinción positiva para O2

._ y el porcentaje de espermatozoides con alto ΔΨMit nuevamente muestra diferencias significativas entre los días 1 y 4 con los días 8 y 12.

En el gráfico de dispersión de la figura 5 se aprecia un desplazamiento evidente de las células desde el cuadrante inferior derecho, donde se encuentran los espermatozoides con alto ΔΨMit, hacia el cuadrante superior derecho donde se encuentran las células con bajo ΔΨMit, este último grupo aumenta notoriamente los días 8 y 12.

DISCUSIóN

El tiempo que permanece almacenado el semen fuera del ambiente testicular produce efectos perjudiciales en los espermatozoides. La presencia del anión superóxido (O2

._) intracelular, una especie reactiva de oxígeno (ROS), anteriormente había sido detectado en espermatozoides

184

O BERRÍOS Y COL

peces (Alavi y col 2004, Alavi y Cosson 2005, Alavi y col 2007). Una particularidad que tienen los espermato-zoides de salmónidos, entre los que se encuentra la trucha arcoiris, es la carencia de movimiento cuando se hallan dentro del testículo o en el líquido seminal, característica que permite mantenerlos inactivos in vitro, recurriendo a soluciones isoosmóticas con una concentración de potasio similar a la del semen, puesto que este ion es el principal responsable de inhibir el movimiento dentro del testículo (Morisawa y Morisawa 1986). Inversamente, cuando se requiere evaluar motilidad, los espermatozoides deben ser activados depositándolos en agua o medios salinos isoosmóticos, con una concentración de potasio inferior al líquido seminal, donde, al igual que en la naturaleza, el movimiento finalizará 15 a 30 s después que la célula haya sido activada (Christen y col 1987).

En este estudio, el movimiento espermático presentó un evidente descenso a partir del octavo día, observándose solo la mitad de los espermatozoides con movimiento en esta evaluación. Considerando el largo periodo de tiempo transcurrido antes de que la motilidad fuera afectada, al parecer ésta no estuvo influenciada negativamente por los radicales O2

._ intracelulares, y el perjuicio podría deberse a otros factores externos que no fueron evaluados en este trabajo, como puede ser la contaminación con orina o mi-croorganismos (Dreanno y col 1998, Ochsendorf 1999).

Los espermatozoides obtienen la energía para el movimiento del flagelo a partir del adenosin-trifosfato (ATP) (Christen y col 1987). La forma como adquieren esta molécula puede variar entre las diferentes especies, así en Cyprinus carpio o carpa común, por ejemplo, los espermatozoides obtienen parte de la energía para el movimiento por vía glicolítica, en trucha arcoiris, en cambio, obtiene prácticamente la totalidad de la energía a partir de respiración aeróbica, con participación de las mitocondrias, las cuales generan más O2

._ a medida que aumenta el movimiento flagelar (Zie̜tara y col 2009). En este aspecto, llama la atención el alto porcentaje de células que presentaron tinción positiva para O2

._, aun cuando durante los ensayos los espermatozoides perma-necieron en soluciones que no activaron su motilidad, lo cual debería disminuir considerablemente la generación de este radical en las mitocondrias. Lo anterior hace presumir que los O2

._ observados en gran porcentaje de espermatozoides podrían provenir de otro compartimento distinto a las mitocondrias (De Iuliis y col 2006) o tener un origen extracelular como se ha observado en algunos mamíferos (Marklund 1984).

La importancia de la membrana plasmática radica principalmente en funciones de transporte, reconocimiento de señales, balance hídrico y capacidad fecundante de la célula espermática (Boitano y Omoto 1991, Cabrita y col 2001). En este estudio, se entregan los primeros antecedentes sobre integridad de membrana en esperma-tozoides de trucha arcoiris almacenados. No obstante, en espermatozoides de mamíferos sometidos a criopreservación ha sido ampliamente estudiada (De Baulny y col 1997, Rasul y Anzar 2001).

Inte

nsid

ad

Intensidad

Alto ΔΨMIT

(�uorescencia roja)

Bajo ΔΨMIT

(�uorescencia roja)

A B

C D

Figura 5. Comportamiento del ΔΨMit durante el almacenamien-to. Se observa la mayoría de los espermatozoides en el cuadro inferior derecho, indicando un alto ΔΨMit los primeros días de evaluación, mientras que en las dos últimas evaluaciones se produjo desplazamiento de la mancha hacia la parte superior derecha donde se encuentran los espermatozoides con bajo ΔΨMit, caracterizados por una mezcla de ambos colores. Las flechas de los ejes indican intensidad de la fluorescencia. A = día 1, B = día 4, C = día 8 y D = día 12. ΔΨMit behavior during storage, observed the majority of sperm in the lower right square indicating a high ΔΨMit first days of evaluation, while in the last two assessments were moving toward the part upper right in which are spermatozoa with low ΔΨMit, characterized by a mixture of both colors. The arrows indicate the axes of the fluorescence intensity. A = day 1, B = day 4, C = day 8 and D = day 12.

A diferencia de lo observado en espermatozoides de humanos y jabalí (Guthrie y Welch 2006), en el presente estudio se detectó O2

._ intracelular en gran porcentaje de los espermatozoides desde el día de extracción del semen. Sin embargo, no se advirtió que este radical afectara la motilidad, integridad de la membrana plasmática o el ΔΨMit los primeros siete días de almacenamiento. Lo anterior podría indicar la inocuidad de los radicales superóxido cuando se encuentran al interior celular, al igual que lo observado en espermatozoides incubados en medios con xantina-xantina oxidasa (XA-XO), donde el daño a la motilidad y estructuras celulares es producido principal-mente por el exceso de H2O2 liberado del metabolismo de los O2

._ y no directamente por la presencia de este radical (Aitken y col 1993, Baumber y col 2000, Guthrie y Welch 2006, Martínez-Pastor y col 2009).

La motilidad espermática es un indicador que habi-tualmente se evalúa en los experimentos con semen de

185


Una característica de la membrana plasmática de trucha arcoiris es su alto contenido en colesterol (Pustowka 2000), lo cual permite a la célula regular funciones como la fluidez y permeabilidad (Sanocka y Kurpisz 2004). En este trabajo no se observó relación entre la integridad de la membrana y O2

._ presente en el interior celular, ya que al correlacionar ambos no hubo asociación. Sin embargo, cuando se correlacionó integridad con días de almacena-miento sí se encontró elevada correlación negativa, r = –0,8, lo que podría indicar perjuicio del almacenamiento, tal vez debido a otros radicales generadores de oxígeno, como por ejemplo, peróxido de hidrógeno generado a partir de O2

._ al transcurrir los días de almacenamiento o por otros agentes contaminantes, ya por un tema de protección al medio ambiente; la solución salina isoosmótica que se utilizó para la conservación de los espermatozoides carecía de cualquier tipo de antibiótico, razón por la cual es muy probable que la muestra de semen haya contado con una gran carga de microorganismos, algunos de los cuales podrían haber producido peróxido de hidrógeno (Ochsendorf 1999), dañando la membrana y alterando la motilidad espermática durante el almacenamiento.

Otro agente que frecuentemente se puede encontrar en la extracción del semen es la orina, y aunque se tomaron algunas precauciones para evitar su extracción junto con la muestra de semen, probablemente éstas no fueron suficientes. La orina en el semen altera la molaridad y concentración de potasio, además influye en la concentración de ATP y motilidad espermática (Dreanno y col 1998).

El ΔΨMit es el único indicador que fue afectado por O2

._ intracelular, lo cual se demuestra en la correlación negativa obtenida (r = –0,56) al asociar ambos indicadores. De acuerdo a los resultados, los espermatozoides también fueron afectados por los días de almacenamiento, presentan-do una disminución en el potencial a partir del octavo día. Esto último probablemente debido a la interacción directa y prolongada entre O2

._ y algunas moléculas que son pro-ductos de la cadena respiratoria en la mitocondria (Koppers y col 2008), ya que, a diferencia del ROS intracelular, el extracelular (principalmente peróxido de hidrógeno) no produce daño peroxidativo a corto plazo en la membrana, ni afecta el ΔΨMit (Baumber y col 2000), inversamente a lo encontrado en espermatozoides de jabalí, donde el exceso de O2

._ sí provoca disminución del potencial mitocondrial y motilidad, a pesar de encontrarse este radical en un escaso número de espermatozoides (Guthrie y Welch 2006).

En conclusión, en nuestro estudio se observó un alto por-centaje de espermatozoides que presentaron O2

._ intracelular. De acuerdo a los análisis estadísticos, este anión no afectó la motilidad ni la integridad de la membrana plasmática. Sin embargo, el potencial de membrana mitocondrial sí es afectado, lo cual podría deberse a la exposición directa y prolongada de O2

._ con moléculas generadas como producto de la respiración dentro de la mitocondria.

Por otro lado, teniendo en cuenta los días de almacena-miento, se observó deterioro en todos los indicadores aquí evaluados, no obstante, dos de ellos (motilidad e integridad de la membrana citoplasmática) no son efecto directo de los O2

._, sino que al parecer de otros factores no evaluados en

esta investigación, como puede ser el peróxido de hidróge-no generado a partir de la contaminación bacteriana o por efecto de la contaminación involuntaria con orina.

Finalmente, considerando la importancia que tiene la reproducción de peces en cautiverio y silvestres, resulta conveniente profundizar la investigación en aspectos celulares y así proporcionar información útil para la ela-boración de medios de cultivos y otros insumos utilizados en el manejo de gametos.

RESUMEN

A diferencia de lo que ocurre en mamíferos, en teleósteos la mayoría de los estudios que evalúan la calidad del semen almacenado están orientados a la exposición de los espermatozoides a algunas especies reactivas de oxígeno (ROS), a la incorporación de antioxidantes en la dieta o a la aplicación de éstos en el plasma seminal. No se encuentran trabajos disponibles que traten la presencia del radical superóxido (O2

._), ni la función que éste cumple al interior del espermatozoide cuando se encuentran almacenados. En la presente investigación se evaluó el efecto del almacenamiento en el O2

._, motilidad, integridad de la membrana plasmática y potencial de membrana mitocondrial (ΔΨMit) en espermatozoides de trucha arcoiris (oncorhynchus mykiss). Para ello se extrajo el semen, el cual fue almacenado durante 12 días a 4 ºC. Cada 4 días se evaluó motilidad, ΔΨMit, integridad de la membrana plasmática y se detectó O2

._ intracelular en los espermatozoides. Se encontró un 82,59% de células con tinción positiva para O2

._ el día de extracción de la muestra, mientras que la motilidad, ΔΨMit y la integridad de la membrana plasmática, solo mostraron deterioro después del octavo día de almacenamiento. Únicamente el ΔΨMit se correlaciona negativamente con O2

._ a partir del octavo día de almacenamiento (r = –0,56 P < 0,05). Respecto a la motilidad e integridad de la membrana plasmática no fueron afectadas por el O2

._ intracelular, no obstante el deterioro observado en estos dos últimos indicadores podría deberse al contacto prolongado de los espermatozoides con agentes contaminantes no evaluados en el presente trabajo.

AGRADECIMIENTOS

A la Dirección General de Investigación de la Universidad Católica de Temuco, por su colaboración.

REFERENCIAS

Aas GH, T Refsti, B Gjerde. 1991. Evaluation of milt quality of Atlantic salmon. Aquaculture 95, 125-132.

Agarwal A. 2004. Role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Rep BioMed on line 8, 616-627.

Aitken RJ, D Harkiss, D Buckingham. 1993. Relationship between iron-catalysed lipid peroxidation potential and human sperm function. J Rep Fert 98, 257-265.

Alavi SMH, J Cosson, M Karami, BM Amiri, M Al Akhoundzadeh. 2004. Spermatozoa motility in the Persian sturgeon, Acipenser persicus: effects of pH, dilution rate, ions and osmolality. Reproduction 128, 819-828.

Alavi H, J Cosson. 2005. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biol Internal 29, 101-110.

Alavi MH, M Rodina, T Policar, P Kozak, M Psenicka, O Linhart. 2007. Semen of Perca fluviatilis L.: Sperm volume and density, seminal plasma indices and effects of dilution ratio, ions and osmolality on sperm motility. Theriogenology 68, 276-283.

Babiak I, O Ottesen, G Rudolfsen, S Johnsen. 2006. Chilled storage of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.: I: Optimizing the protocol. Theriogenology 66, 2025-2035.

Baumber J, B Ball, C Gravance, V Medina, M Davies-Morel. 2000. The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility,

186

O BERRÍOS Y COL

viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and membrane lipid peroxidation J Andro 21, 895-902.

Bencic DC, RL Ingermann, JG Cloud. 2001. Does CO2 enhance short-term storage success of Chinook salmon (oncorhynchus tshawytscha) milt? Theriogenology 56, 157-166.

Billard R. 1988. Artificial insemination and gamete management in fish. Marin Behav Phisiol 14, 3-21.

Billard R, J Cosson, LW Crim. 1993. Motility of fresh and aged halibut sperm. Aquat Liv Resour 6, 67-75.

Billard R, O Linhart, L Fierville, J Cosson. 1997. Motility of European catfish Silurus glanis spermatozoa in testes and in milt. Pols Arch Hydrobiol 44, 112-122.

Boitano S, CK Omoto. 1991. Membrane hyperpolarization activates trout sperm without an increase in intracellular pH. J Cell Sci. 98, 343-349.

Burnaugh L, K Sabeur, B Ball. 2007. Generation of superoxide anion by equine spermatozoa as detected by dihydroethidium. Theriogenology 67, 580-589.

Cabrita E, L Anel, MP Herráez. 2001. Effect of external cryopro-tectants as membrane stabilizers on cryopreserved rainbow trout sperm Theriogenology 56, 623-635.

Canyurt M, S Akhan. 2008. Effect of ascorbic acid supplementation on sperm quality of rainbow trout (oncorhynchus mykiss). Turk J Fisher Aquat Sc 8, 171-175.

Chatterjee S, C Gagnon. 2001. Production of reactive oxygen species by spermatozoa undergoing cooling, freezing, and thawing. Mol Rep Dev 59, 451-458.

Christen R, J Gatti, R Billard. 1987. Trout sperm motility: the transient movement of trout sperm is related to changes in the concentration of ATP following the activation of the flagellar movement. Eur J Biochem 166, 667-671.

Ciereszko A, K Dabrowski. 1995. Sperm quality and ascorbic concentra-tion in rainbow trout semen are affected by dietary vitamin C: And across-season study. Biol Rep 52, 982-988.

Connell N, C McClure, M Lewis. 2002. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mithocondrial function. Hum Reprod 17, 704-709.

Cuquerella M, I Peinado, I Ruiz, W Mohand, S Mayoral, A Romeo. 2003. Influencia de los factores ambientales en la generación de especies reactivas de oxígeno. Papel en la infertilidad humana. Rev Iberoam Fert 20, 369-376.

De Baulny BO, Y Le Vern, D Kerboeu, G Maisse. 1997. Flow Cytometric Evaluation of Mitochondrial Activity and Membrane Integrity in Fresh and Cryopreserved Rainbow Trout (oncorhynchus mykiss) Spermatozoa. Cryobiol 34, 141-149.

De Iuliis GN, K Wingate, J Koppers, A McLaughlin, R Aitken. 2006. Definitive Evidence for the Nonmitochondrial Production of Superoxide Anion by Human Spermatozoa. J Clin Endocrinol Metab 91 1968-1975.

de Lamirande E, P Leclerc, C Gagnon. 1997. Capacitation as a regula-tory event that primes spermatozoa for the acrosome reaction and fertilization. Mol Hum Rep 3, 175-194.

de Lamirande E, A Harakat, C Gagnon. 1998. Human sperm capacitation induced by biological fluids and progesterone, but not by NADH or NADPH, is associated with the production of superoxide anion J Androl 19, 215-225.

Dreanno C, M Suquet, E Desbruyères, J Cosson, H Le Delliou, R Billard. 1998. Effect of urine on semen quality in turbot (Psetta maxima). Aquaculture 169, 247-262.

Estay F, V Téllez. 1994. Biología del desarrollo y reproducción artifi-cial en la trucha arcoiris. Publicado gracias al aporte del proyecto “Manejos reproductivos aplicados a la producción de salmónidos”, CONICYT-FONDEF, realizado entre 1993-1996. Serie Publicaciones para la Acuicultura Nº 1.

Guthrie HD, GR Welch. 2006. Determination of intracellular reactive oxygen species and high mitochondrial membrane potential in Percoll-treated viable boar sperm using fluorescence-activated flow cytometry. J Anim Sci 84, 2089-2100.

Ingermann R, M Holcomb, L Robinson, JG Cloud. 2002. Carbon dioxide and pH affect sperm motility of white sturgeon (Acipenser transmontanus). J Exp Biol 2885-2890.

Kiron V, J Puangkaew, K Ishizaka, S Satoh, T Watanabe. 2004. Antioxidant status and nonspecific immune responses in rainbow trout (oncorhynchus mykiss) fed two levels of vitamin E along with three lipid sources. Aquaculture 234, 361-379.

Koppers AJ, GN De Iuliis, JM Finnie, EA McLaughlin, RJ Aitken. 2008. Significance of mitochondrial reactive oxygen species in the generation of oxidative stress in spermatozoa. J Clin Endoc Metab 93, 3199-3207.

Lahnsteiner F, B Berger, T Wisman, RA Patzner. 1998. Determination of semen quality of the rainbow trout, oncorhynchus mykiss, by sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture 163-181.

Liley P, P Tamkees, R Tsai, D Hoysak. 2002. Fertilization dynamics in rainbow trout (oncorhynchus mykiss): Effect of male age, social experience, and sperm concentration and motility on in vitro fertil-ization. Can J Fish Aquat Sci 59, 144-152.

Mansour N, A McNiven, G Ricardson. 2006. The effect of dietary supple-mentation with blueberry, α-tocopherol or astaxanthin on oxidative stability arctic char (Savelinus alpinus) semen. Theriogenology 66, 373-382.

Marchetti C, N Jouy, Beroy-Martin, A Defossez, P Formstecher, P Marchetti. 2004. Comparison of four fluorochromes for the detection of the inner mitochondrial membrane potential in human spermatozoa and their correlation with sperm motility. Hum Reprod 10, 2267-2276.

Marklund L. 1984. Extracellular superoxide dismutase and other su-peroxide dismutase isoenzymes in tissues from nine mammalian species. Biochem J 222, 649-655.

Martin G, O Sabido, P Durand, R Levy. 2004. Cryopreservation induces and apoptosis- like mechanism in bull sperm. Biol Reprod 71, 28-37.

Martínez-Pastor F, E Aisen, MR Fernández-Santos, MC Esteso, A Maroto-Morales, O García-Álvarez, JJ Garde. 2009. Reactive oxygen species generators affect quality parameters and apoptosis markers differently in red deer spermatozoa. Rep 137, 225-235.

Michael A, C Alexopoulos, E Pontiki, D Adjipavlou-Litina, P Saratsis, C Boscos. 2007. Effect of Antioxidant supplementation on semen quality and reactive oxygen species of frozen-thawed canine sper-matozoa. Theriogenology 68, 204-212.

Mirzoyan AV, NA Nebesikhina, NV Voynova, VA Chistyakov. 2006. Preliminary results on ascorbic acid and lysine suppression of clastogenic effect of deep-frozen sperm of the Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedti). Intern J Refrig 29, 374-378.

Morisawa S, M Morisawa. 1986. Acquisition of potential for sperm motility in rainbow trout and chum salmon. J Exp Biol 126, 89-96.

Ochsendorf FR. 1999. Infections in the male genital tract and reactive oxygen species. Hum Rep Upd 5, 399-420.

Ohta H, T Izawa. 1996. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture 142, 107-118.

Paasch U, R Sharma, A Gupta, S Grunewald, E Mascha, A Thomas, H Glander, A Agarwal. 2004. Cryopreservation and thawing is associated with varying extent of activation of apoptotic machinery in subsets of ejaculated human spermatozoa. Biol Reprod 71, 1828-1837.

Peeker R, R Abramsson, L. Marklund. 1997. Superoxide dismutase isoenzyme in human seminal plasma and spermatozoa. Molec Hum Reprod 3, 1061-1066.

Pustowka C, MA McNiven, GF Richardson, SP Lall. 2000. Source of dietary lipid affects sperm plasma membrane integrity and fertility in rainbow troutn oncorhynchus mykiss (Walbaum) after cryopreserva-tion. Aquaculture Res 31, 297-305.

Rasul Z, N Ahmad, M Anzar. 2001. Changes in motion characteristics, plasma membrane integrity, and acrosome morphology during cryo-preservation of buffalo spermatozoa. J Androl 22, 278-283.

Sanocka D, M Kurpisz. 2004. Reactive oxygen species and sperm cells. Rep Biol Endoc 2, 1-7.

Sharma RK, A Agarwal. 1996. Role of reactive oxygen species in male infertility. Urolog 48, 835-850.

Valdebenito I, C Fletcher, V Vera, J Fernández. 2009. Factores fisico-químicos que regulan la motilidad espermática en peces: aspectos básicos y aplicados. Una revisión. Arch Med Vet 41, 97-106.

Zhou B, W Liu, W Siu, D O’Toole, P Lam, R Wu. 2006. Exposure of spermatozoa to duroquinonae may impair reproduction of the common carp (Cyprinus carpio) through oxidative stress. Aquat Toxicol 77, 136-142.

Zie̜tara MS, A Biegniewska, E Rurangwa, J Swierczynski, F Ollevier, E Skorkowski. 2009. Bioenergetics of fish spermatozoa during semen storage. Fish Physiol Biochem 35, 607-614.

187

Arch Med Vet 42, 187-193 (2010)

ORIGINAL ARTICLE

Accepted: 06.08.2010.

* [email protected]

Effects of crowding on blood constituents and flesh quality variables in Atlantic salmon (Salmo salar L.)

Efecto del confinamiento sobre las variables sanguíneas y calidad de carne de Salmón Atlántico (Salmo salar L.)

MC Gaticaa*, GE Montib, TG Knowlesc, CB Galloa

aInstituto de Ciencia Animal y Tecnología de Carnes, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile.

bInstituto de Medicina Preventiva Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile.

cSchool of Clinical Veterinary Science, University of Bristol, Langford, Bristol, UK.

RESUMEN

Se compararon en los días 0, 1, 4, 7 y 10 post mortem, en términos de variables de la calidad de la carne y constituyentes sanguíneos, los efectos de la anestesia (como tratamiento del control) y el confinamiento controlado con disminución del nivel de oxígeno en salmones tamaño cosecha (Salmo salar). Los peces fueron mantenidos en triplicado en estanques y muestreados después de anestesiar con AQUI-S® y después de confinar por un período de una hora. Dieciocho peces de cada tratamiento fueron insensibilizados mediante un golpe en la cabeza, se les extrajo sangre mediante la punción de la vena caudal para luego ser sangrados mediante el corte de branquias y posteriormente procesados para obtener los filetes. Todas las variables sanguíneas a excepción del cortisol fueron significativamente más altas (P < 0,05) en los peces confinados comparados con los peces anestesiados. El pH muscular inicial fue más bajo en los pescados confinados únicamente en los días 0, 1 y 4 post mortem. El color muscular obtuvo una puntuación significativamente más baja (P < 0,05) en los peces confinados que en aquellos anestesiados en los días 0 y 1 post mortem. La pérdida del peso fue mayor (P < 0,05) en los peces confinados, aumentando en ambos tratamientos en los siguientes días post mortem. La concentración de astaxantina muscular no mostró ninguna diferencia estadística entre los tratamientos ni en los días post mortem. Se puede concluir que el confinamiento y el bajo nivel de oxígeno tienen un efecto negativo en las variables sanguíneas y en parámetros de calidad de carne, disminuyendo la puntuación de color, bajando el pH muscular inicial y aumentando la pérdida del peso de los filetes.

Key words: stress, quality, blood, pH, cortisol.

Palabras clave: stress, calidad, sangre, pH, cortisol.

INTRODUCTION

Animal welfare has become a subject of great importance in farm animals and is also an important topic to consider in farmed fish (Kestin et al 1995, Håstein 2004). Intensively produced fish are exposed to management practices such as handling, transportation or confinement which elicit stress responses. There is an extensive literature that has examined the response of fish to typical stressors in aquaculture practices (Barton 2002, Acerete et al 2004). ‘Stressors’ can be multiple and of diverse origin: deficient feeding, high stocking densities, low water oxygen, inappropriate water conditions (physical-chemical), pH, inappropriate temperature, high carbon dioxide levels, ammonium, nitrites, sulphydric acid, organic matter in the water, salinity, photo and/or thermo period, vibrations and noises, injuries from handling (harvests, transport) (Rottmann et al 1992, Ruiz

et al 2003), high metal concentrations in water, as well as pollution (Iwama et al 2004). Kestin (1994), identified handling and confinement as the major “stressing” agents in commercial salmon aquaculture.

Increasing stocking density is one method of increasing productivity at the growing farm, however, high densities have been shown to produce aggressive behaviour, reduce feed conversion and growth rate, decrease water quality and increase the presence of physical injuries (Wall 2001).

High stocking densities were identified as one of the main causes of problems related to flesh quality as well as animal welfare (Wall 2001). High stocking densities are often associated with lowered water quality (excess ammonium and low oxygen tension). The increased proximity between fish contributes to the dissemination of disease, an increase in stress and a consequent reduction in the immune response (Kestin 1994). Bell et al (2002) did not find a correlation between high stocking densities and various measures of animal welfare until a break point of 20 to 24 kg/m3, however, densities above this point were thought to jeopardize the welfare of the fish.

188

MC GATICA ET AL

Harvesting is an inevitable part of farmed fish production and places fish in an acute stress situation by reducing surrounding water volume and causing increased activity as fish attempt to escape (Thomas et al 1999). Further live transport in wellboats and high stocking densities in the resting cages before slaughtering are all stressful procedures (Skjervold et al 2001, Foucat et al 2004). The harvesting is under-represented in investigations into fish welfare, probably due to the endpoint (for the biologist) being the death of the fish (Erikson et al 1997b, Thomas et al 1999, Skjervold et al 2001).

In Chile, live transportation of harvest size salmon to slaughter is common and carried out mainly in wellboats. The fish are loaded by means of pumps into the wellboat’s chambers, where they are kept during the whole journey at high stocking densities (approximately 120 kg/m3). Once the wellboat arrives at the processing plant’s pier, unloading is either into the resting cages, where fish are kept at stocking densities between 25 and 30 kg/m3, usually for a period of up to 24 hours, or directly to the processing plant to slaughter.

Disturbance during harvest and antemortem handling can be detected through physiological changes that can be used as indicators of the degree of stress experienced by the fish (Barton 2000). Fish respond in different ways to maintain homeostasis during stress and many physiological changes are involved in the stress response, including changes in osmolality, hormone release, and energetic metabolism (Barton and Iwama 1991, Wendelaar Bonga 1997).

Of great commercial importance is the influence that these changes have on various characteristics of flesh quality: firmness (Skjervold et al 2001), onset and duration of rigor mortis, muscle pH, water holding capacity, texture, gaping and shelf life (Huss 1995, Thomas et al 1999, Skjervold et al 2001, Roth et al 2002, Foucat et al 2004, Jittinandana et al 2005). From a commercial, as well as from an animal welfare point of view, it is important to understand the nature of the physiological and metabolic changes in order to implement appropriate measures to reduce any deleterious effects (Kestin 1994, Pottinger 2001).

The aim of the present study was to evaluate the effect of crowding and low oxygen on blood levels of glucose, lactate, cortisol, sodium, chlorides and osmolality, and on flesh quality parameters of weight loss, asthaxantin content, colour and muscle pH in harvest size salmon (Salmo salar).


EXPERIMENTAL DESIGN

Thirty six fish from a total of 75.4, to 5 kg harvest size Atlantic salmon, that had been brought from cages to tanks and allowed to acclimatise for a period of 86 days before the trial, were used for the experiment. The

fish were held in three 3000 L. tanks, each holding 25 fish (aprox. 33 kg/m3) at the biggining of the study. The tanks had an open flux of water with a total rechange of the water in 1 hour. The three tanks were considered as replicates. On the first day of the experiment, 30 mg/L of AQUI-S® were used as an anaesthetic in all three tanks, dissolved directly into the water and left to act for a period of 30 minutes at the time that the flux of water was closed; then 6 fish at random were sampled individually from each tank by means of a ketch (Anaesthetized fish, n = 18). Each fish was stunned by a blow to the head, and a blood sample was obtained with a syringe from the posterior aorta. The blood was divided in two tubes, one with NaF, to obtain plasma by means of centrifugation for glucose and lactate concentrate determination, and another without anticoagulant, to obtain serum for cortisol, osmolality, Na and Cl concentrate determination. Both plasma and serum were frozen (-20 ºC) for later analysis. After blood sampling, the fish were killed by gill cut, hung by the peduncle and left to bleed out of the water for a period of one hour. After bleeding each fish was filleted and the Norwegian Quality Cut (NQC) from the left and right fillets were used to determine quality characteristics. Once the 18 anaesthetized fish were blood sampled from the three tanks, the flux of water was restored in each of them and the anaesthetic was eliminated.

The next day, the remaining fish were crowded, by means of a mesh inside the tanks and the escape of water, to a maximum density of 200 kg/m3 over the period of one hour. Fifty per cent of the water was released from the tanks, and oxygen saturation level reduced from an average of 90% to 23%. Fish from the 3 tanks (replicates) were crowded at 1 hour intervals to allow enough time to sample each tank before starting the next one. After one hour of crowding, six fish from each tank were taken individually out of the water in the same way the anaesthetized fish were sampled on day one (Crowded fish, n = 18). Then the holding mesh was removed and the water level in the tank returned to its original level.

BLOOD VARIABLE ANALYSIS

Glucose concentration was determined spectro-photometrically using the GOD-PAP method without deproteinization. The lactate concentration was also determined spectrophotometrically by means of an enzymatic-colorimetric method. Serum sodium concentration was determined with a Perkin-Elmer 238 atomic absorption spectrophotometer. Both urea and chlorides were determined colorimetrically using the GLDH enzymatic method and the tripyriditiazine (TPTZ) method respectively. Glucose, lactate, urea and chlorides were determined in an autoanalyzer (Cobas Mira Plus spectrophotometer (Roche®)) by means of the colorimetric technique. Urea Nitrogen was determined in order to calculate osmolality using the formula:

189

STRESS, QUALITY, BLOOD, PH, CORTISOL

(1) UreaNitrogenurea=2 14.

.

Serum osmolality was then obtained using the formula:

(2) mosmol kg NaGlu e UreaN

/ .cos= +

+1 8618 2..8

(Holmes 1962)

Cortisol concentration was determined by a RIA technique (Radio Immune Assay). The samples were measured on a radioimmunoassay using marked cortisol with iodine 125 and this marked hormone is made to compete with cold hormone, which is in the samples. As the antibody is attached to the tube, this test is called “coat-to-count”. The antibody is highly specific for cortisol and has very low reaction crossed with other steroids such as cortisone and corticosterone. At FISENLAB laboratory all RIAs have been validated for use in animals.

MUSCLE PH, COLOUR, ASTHAXANTIN CONTENT

AND PERCENTAGE WEIGHT LOSS

Muscle pH and colour scores were determined at 0 (1 hour post-mortem), 1, 4, 7 and 10 days post-mortem. Muscle pH was measured by directly inserting a pH probe (Checker 200) in the left NQC fillet of each fish; probe insertion was always performed at the same position and by the same person. At the same time, visual colour scores were obtained using the DSM SalmoFan (DSM Nutritional Products, Chile), which uses a scale ranging from 21 (light red) to 34 (dark red), under standardised illumination in a Salmon Colour Box and by the same person every time. Asthaxantin content was determined by HPLC on days 1, 4, 7 and 10 postmortem, also in the left NQC fillet. Between measurements the fillets were kept refrigerated (0-4 ºC) in individually labelled plastic bags. The right NQC fillets were weighed and also kept individually labelled in refrigeration (0-4 ºC); any liquid exudate present in the bag was wiped off before each weighing. Weight loss was determined as the difference between day 1 and days 4, 7, 10, and then calculated as a percentage of the initial weight on day 1. All flesh quality analysis were performed at TraceLab Analytical Services, Puerto Montt, Chile.


The normality of the distribution of the blood variables was determined by visual inspection of a histogram and by means of the Shapiro-Wilks Normality Test. A two sample t-test was used to test variables with a normal distribution and the Wilcoxon Rank Sum Test for those not normally distributed. Flesh quality data were repeated measures

and were analysed with a model that allowed a varying intercept (Singer and Willett 2003), expressed as:

Yij = b0ij + β1 Days post mortem0j + … β3 Days post

mortem10j + β4Treatmentjb0ij = π0i + μ0j + ε0ij

Where i = days postmortem and j = individual

This model assumes that μ0j takes a particular variance structure (simple, compound symmetry first-order autoregressive and unstructured (more details in the next paragraph) for the repeated measures within-individuals and the error term ε0ij is a Gaussian random variable that are uncorrelated and have expectations 0 and and variances Ωε (N (0, Ωε) (Singer 1998).

With typical repeated measures, as here, two measure-ments that are taken at adjacent time are more correlated than those measurements taken several time points apart (Little et al 1996). Therefore, it is important to account for these correlations in estimating the effects of time and of treatment.

Several error structures were evaluated including simple (no correlation), compound symmetry, first-order autoregressive and unstructured (estimating a correlation for each separate correlation). The different correlation structures were evaluated using Akaike’s Information Criterion (AIC). AIC can be used to compare models with the same fixed effects but that differ in the variance structure (Little et al 1996). We found the first-order autoregressive (AR(1)) correlation structure to provide the best fit to these data. For the first-order autoregressive model, the correlations decrease exponentially with the distance between measurements. Therefore, we illustrate below a correlation sub-matrix for the ith individual:

1

1 2

2 1

3 2 1

ρ ρ ρρ ρ ρ

ρ ρ ρρ ρ ρ

2 3

Analysis were performed in SAS V.9.1 and statistical significance was defined at P < 0.05.

RESULTS

The results from the analysis of blood constituents for each group are shown in table 1. All of the blood variables analyzed, (glucose, lactate, Na, Cl and osmolarity) with the exception of cortisol, increased (P < 0.05) in the salmon which were crowded.

The results from the flesh quality measurements are shown in table 2. Flesh colour was significantly lower (P < 0.05) in crowded salmon, both at death and on day 1, post mortem.

190

MC GATICA ET AL

Table 1. Anaesthetized and crowded salmon’s blood variables. Mean and SD. Variables sanguíneas para salmón anestesiado y en confinamiento. Promedio y DS.

Treatment Glucosemmol/L (SD)

Lactatemmol/L

(SD)

Cortisolng/ml (SD)

Nammol/L (SD)

Clmmol/L

(SD)

Osmolalitymosm/kg

(SD)

Anesthetised 4.26* (1.1) 3.40* (3.2) 242.79 (78.9) 149.82* (22.7) 126.37* (31.8) 263.77* (77.4)

Crowded 7.52 (1.9) 14.0 (4.3) 284.53 (60.6) 161.33 (10.8) 139.35 (3.0) 300.87 (20.1)

* For a variable, it indicates statistical differences between treatment groups (P < 0.05).

Table 2. Mean and SD of anaesthetized (Anaest) and crowded salmon’s muscle colour, muscle pH, asthaxantine content and weight loss percentage on days 0, 1, 4, 7 and 10 post-mortem. Promedio y DS para salmón anestesiado (Anaest) y en confinamiento para color muscular, pH muscular, contenido de astaxantina y porcentaje de pérdida de peso en los días 0, 1, 4, 7 y 10 post-mortem.

ColourSalmofan (SD) Muscle pH

pH (SD) Asthaxantineppm (SD) Weight loss

% (SD)

TreatmentDay P-M Anaest. Crowded* Anaest. Crowded* Anaest. Crowded Anaest. Crowded*

0 28.00 (0.63)

♣ 27.00 (6.39)

7.31 (0.11) ♣ 6.39 (0.23)

Nd Nd Nd Nd

1 26.00 (0.42)

♣ 25.00 (0.76)

6.34 (0.28) ♣ 5.98 (0.07)

6.97 (1.44) 6.98 (2.08) Nd Nd

4 25.00 (0.57)

25.00 (0.50)

5.96 (0.07) 5.87 (0.08)

6.83 (1.20) 6.66 (1.88) 1.73 (0.82) ♣ 2.72 (0.95)

7 25.00 (0.42)

25.00 (0.46)

5.94 (0.07) 5.99 (0.10)

6.18 (1.24) 6.57 (1.88) 3.07 (1.12) ♣ 4.35 (1.07)

10 (Ref.) 25.00 (0.48)

25.00 (0.46)

5.92 (0.08) 5.72 (0.86)

6.07 (1.34) 6.65 (1.76) 5.10 (1.10) 5.59 (1.37)

* different superscripts in the same line within a variable indicate statistical differences between treatment group P < 0.05).

♣ different superscripts in middle columns of the same variable indicate statistical differences between days post-mortem (P < 0.05) in reference to 10 days post-mortem.

Nd = not determined.

Muscle pH was also significantly lower (P < 0.05) in crowded fish until day 1 postmortem. There was no statistical difference (P > 0.05) in asthaxantin content, neither between treatments, nor over time, postmortem. Weight loss was statistically greater (P < 0.05) in crowded fish at days 4 and 7 postmortem. Within groups, the weight loss increased significantly (P < 0.05) between days 4, 7 and 10.

DISCUSSION

This study was carried out to compare the effects of crowding and low oxygen on blood constituents and flesh quality parameters under controlled experimental conditions, but simulating those conditions used during harvest.

A primary response to stress is an increase in plasma cortisol levels (Barton and Iwama 1991, Barton 2002,

Acerete et al 2004), and it is widely used to index a stressful stimulus (Skjervold et al 1999). The 242.79 ng/ml of cortisol obtained in the anaesthetized fish (table 1) was higher than the 100.4 ng/ml observed in previous work in low density and uncrowded Atlantic salmon (Skjervold et al 1999, Skjervold et al 2001). Other studies have found even lower values in the order of 20.9 ng/ml for unstressed salmon (Erikson et al 1999). In our study there was no significant difference in cortisol concentration between anaesthetized and crowded fish. This could have been due to the fact that the cortisol level was already high, at over twofold the value found by others (Skjervold et al 2001). To accommodate the sampling protocol during this study, the daily schedule of handling and feeding of the fish was modified, which could have contributed to the elevated cortisol levels

191


observed in the anaesthetized fish. These fish were sampled 30 minutes after the anaesthetic was poured in the water and not one hour after handling, as in the case of the crowded fish.

Osmotic changes during stress are affected directly by changes in branchial permeability to water and electrolytes (Redding and Schreck 1983). Changes seen in the levels of blood Na+, Cl- and osmolality in the crowded fish were consistent with this mechanism and the high levels of cortisol found in this study.

In the present work, after crowding, the blood monovalent ion Cl- increased over 10% (table 1). In previous studies (Iversen et al 1998) it has also been observed to increase in seawater adapted fish in response to handling or confinement. Additionally, a difference increase of 7% was observed in Na+ concentration after crowding. This can be explained by the net transepithelial fluxes of Na+ and C1- in these euryhaline fish during stress (Redding and Schreck 1983). A major driver of these ionic imbalances is increased gill permeability, which in turn promotes the exchange rate of Na+ and Cl- and water along concentration gradients (Urbinati et al 2004).

A short-term intensive stress generally leads to a large increase in cortisol concentration followed, after a set delay, by a concomitant change in glucose (Svobodová et al 1999). The mobilization of glucose in response to stress is generally accepted as being a means of providing extra energy resources, enabling the animal to overcome the disturbance (Acerete et al 2004), making increase of the glucose plasmatic concentration one of the most common indicators of the metabolic changes following stress (Iwama 1998, Reddy and Leatherland 1998). In this study, plasma glucose levels (table 1) in the anesthetized fish were within the range observed previously for harvest size Salmo salar (Erikson et al 1999, Skjervold et al 2001). Glucose concentration was increased by 76% in the crowded group. This is similar to values found in a previous study (Skjervold et al 2001) where an increase of 70% was seen in crowded fish.

With increased physical activity, pre-mortem, the greater is the depletion of glycogen and the formation of lactic acid (Roth et al 2002). Lactate concentration has been shown to increase significantly in several species following severe exercise or as a result of hypoxia (Acerete et al 2004). In our study, blood lactate in the crowded fish increased by over 300%, significantly higher than in anesthetized fish (table 1), and indicative of a high level of anaerobic muscle activity (Thomas et al 1999). Skjervold et al (2001) showed similar results when comparing lactate levels in crowded and uncrowded Atlantic salmon. Fish white muscle mainly generates energy by means of anaerobic metabolism which results in an accumulation of lactic acid that must be transported to the liver for metabolization (Huss 1995). Our results for lactate agree with those of Thomas et al (1999), who found a significant increase in plasma lactate in two species of salmonids following

lowering the water level, to simulate handling during harvest and forced exercise.

High stocking densities can be very stressful for fish (Erikson et al 1997a, Thomas et al 1999, Skjervold et al 2001, Bahuaud et al 2010). At slaughter, the cessation of blood circulation results in a decrease in oxygen concentration in the cell and a progressive reduction of the redox potential, leading to anaerobiosis (Toldrá 2003) and a reduction in muscle pH, due to lactic acid accumulation (Einen and Thomassen 1998, Skjervold et al 2001). The more the fish struggle before and during harvesting and slaughtering procedures, the greater is the stress and the faster will be the post-mortem drop in muscle pH (Thomas et al 1999). The fall in post mortem muscle pH has an effect on the physical properties of the fillet, lowering the net charge of muscle proteins and causing a partial denaturation, which results in a diminished water holding capacity (Kristoffersen et al 2006). In our study, initial pH was significantly lower (P < 0.05) in crowded than in anaesthetized fish (table 2). This is in accordance with a previous study where muscle pH was lower at slaughter in fish exposed to exercise, activity or stress before death (Gatica et al 2008, Bahuaud et al 2010). A lower initial pH, post mortem, is associated with more rapid and detrimental quality changes in muscle properties (Huss 1995, Einen and Thomassen 1998, Skjervold et al 2001, Toldrá 2003). In the anaesthetized fish, initial pH was significantly higher (table 2) than in the crowded fish, probably indicative of a better quality, a longer pre rigor period, and therefore, also allowing a longer time to process the fish before rigor sets in. This is of great importance to the industry as a fish in rigor cannot be easily manually or mechanically processed: a rapid onset of rigor leaves a limited time in which to gut and process the fillets. There was no difference in pH between both treatments from the fourth day postmortem, as seen in table 2. In the case of the anaesthetized fish, the decrease in pH was faster than in the crowded fish. This is in agreement with (Robb 2001), who stated that there is no difference in final pH between stressed and unstressed fish of the same species in spite of presenting differences in initial post-mortem pH (Skjervold et al 2001, Bahuaud et al 2010).

As a consequence of pH drop, water binding decreases rapidly as the charge on proteins moves towards neutrality, causing a loss of water from the flesh (Toldrá 2003). In our study, one hour after death, both muscle pH and colour were significantly lower (P < 0.05) in those fish subjected to crowding (table 1). This is in accordance with our previous work (Gatica et al 2008) in which fish subjected to the stress of transport had lower initial muscle pH. These findings are supported by other authors (Robb et al 2000; Robb 2001), who stated that with a more rapid decrease in pH, generally observed in fish which show higher muscle activity prior to slaughter, there are also significant changes in the colour of the salmon fillets. These same authors affirmed to that these changes in colour are a result of changes in the reflection of light from the surface of the fillet, due to the

192

MC GATICA ET AL

water loss from the flesh. As in this study it was possible to observe differences in colour between anaesthetized and crowded fish but there was no significant difference in the content of asthaxantin between both groups. This result suggests that the difference in colour is likely to be due to water loss due to protein denaturation, and this water loss also the cause of the significantly higher weight loss on days 4 and 7, post-mortem, in the fillets from the crowded fish (table 2). This change in colour, without a loss in pigment (asthaxantin) content, is very similar to an effect that occurs in pigs that are acutely stressed at slaughter, which results in paler flesh known as pale, soft and exudative (PSE) (Robb 2001).

It can be concluded that crowding increases blood concentrations of glucose, lactate, Na, Cl and osmolarity. Effects were also seen within the muscle, where pH was lowered compared with anaesthetized fish until day four, postmortem. Low muscle pH lowers the water holding capacity of the proteins. This resulted in a greater weight loss in fillets from the crowded fish. The difference in colour observed between the crowded and anaesthetized fillets during the first two days, could not be attributed to a decrease in the content of the pigment asthaxantin under the conditions of this study but rather to a change in the relectance of the surface of the fillet of the crowded fish, due to greater loss of water content.

SUMMARY

The effects of anaesthesia (as a control treatment) and controlled crowding, with its concomitant low oxygen level, on harvest size salmon (Salmo salar) were compared in terms of blood constituents and flesh quality variables, at 0, 1, 4, 7 and 10 days post-mortem. Fish were held in tanks in triplicate and were sampled after anaesthetizing with AQUI-S® and after crowding for one hour. Eighteen fish from each treatment were stunned, blood sampled from the posterior aorta and the fish bled by gill cut and filleted. All blood variables with the exception of cortisol were higher (P < 0.05) in crowded fish compared with anaesthetized fish. Initial muscle pH was lower in the crowded fish and only between days 0; 1 and 4. Colour was significantly lighter in crowded than in anaesthetized fish on days 0 and 1. Weight loss was higher (P < 0.05) in the crowded fish and also increased in both treatments with time post mortem. Muscle asthaxantin concentration showed no statistical difference between treatments nor post mortem. It can be concluded that crowding and reduced oxygen level had a negative effect on blood variables and on flesh quality, lowering colour score, lowering initial muscle pH, and increasing the weight loss of fillets.

ACKNOWLEDGMENTS

We are most grateful to DSM Nutritional Products Chile S.A., EWOS Innovation Chile S.A. and Universidad Austral de Chile, through its Project MECESUP AUS 0005, who financially supported this work. Also, we would like to thank Fundación Chile at Quillaipe Experimental Centre who provided facilities for the experiment.

REFERENCES

Acerete L, JC Balasch, E Espinosa, A Josa, L Tort. 2004. Physiological responses in Eurasian perch (Perca fluviatilis, L.) subjected to stress by transport and handling. Aquaculture 237, 167-178.

Barton BA, GK Iwama. 1991. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. An Rev Fish Dis 1, 3-26.

Barton BA. 2000. Salmonid fishes differ in their cortisol and glucose responses to handling and transport stress. N Am J Aquic 62, 12-18.

Barton BA. 2002. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integ and Comp Biol 42, 517-525.

Bahuaud D, T Mørkøre, TK Østbye, E Veiseth-Kent, MS Thomassen, R Ofstad. 2010. Muscle structure responses and lysosomal cathepsins B and L in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.) pre- and post-rigor fillets exposed to short and long-term crowding stress. Food Chemistry 118, 602-615.

Bell A, J Bron, JF Turnbull, CE Adams, FA Huntingford. 2002. Factors influencing the welfare of farmed Atlantic salmon (Salmo salar) in commercial marine cages. Res Vet Sci 72 (Suplement A), 7-8.

Einen O, MS Thomassen. 1998. Starvation prior to slaughter in Atlantic salmon (Salmo salar) II. White muscle composition and evaluation of freshness, texture and colour characteristics in raw and cooked fillets. Aquaculture 169, 37-53.

Erikson U, AR Beyer, T Sigholt. 1997a. Muscle high-energy phosphates and stress affect K-values during ice storage of Atlantic salmon (Salmo salar). J Food Sci 62, 43-47.

Erikson U, T Sigholt, A Seland. 1997b. Handling stress and water quality during live transportation and slaughter of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture 149, 243-252.

Erikson U, T Sigholt, T Rustad, IE Einarsdottir, L Jørgensen. 1999. Contribution of bleeding to total handling stress during slaughter of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquic Inter 7, 101-115.

Foucat L, R. Taylor, GR Labas, JP Renou. 2004. Soft Flesh Problem in Freshwater Rainbow Trout Investigated by Magnetic Resonance Imaging and Histology. J Food Sci 69, 320-327.

Gatica MC, G Monti, C Gallo, TG Knowles, PD Warriss. 2008. Effects of Well-Boat Transportation, on Muscle pH and Onset of Rigor Mortis of Atlantic Salmon. Vet Rec 163, 111-116.

Håstein T. 2004. Animal welfare issues relating to aquaculture, OIE Global Conference on Animal Welfare, Paris, France, Pp 219-227.

Huss HH. 1995. Quality and quality changes in fresh fish. Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAO Technical Paper, Rome, Italy, Pp 348.

Iversen M, B Finstad, KJ Nilssen. 1998. Recovery from loading and transport stress in Atlantic salmon (Salmo salar L.) smolts. Aquaculture 168, 387-394.

Iwama GK. 1998. Stress in Fish. Ann N Y Acad Sci 851, 304-310.Iwama GK, LOB Afonso. A Todgham. P Ackerman. K Nakanao. 2004.

Are hsps suitable for indicating stressed states in fish?, Commentary. J Exp Biol 207, 15-19.

Jittinandana S, PB Kenney, PM Mazik, M Danley, CD Nelson, RA Kiser, JA Hankins. 2005. Transport and stunning affect quality of artic char fillets. J Muscle Foods 16, 274-288.

Kestin S. 1994. Pain and stress in fish. In: RSPCA (Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals). Pp 36.

Kestin S, S Wotton, S Adams. 1995. The effect of CO2, concussion of electrical stunning of rainbow trout (oncorhynchus mykiss) on fish welfare. In: European Aquaculture Society (eds) Quality in Aquaculture. Special Publication 23. Gent, Belgium, Pp 380-381

Kristoffersen S, T Tobiassen, V Steinsund, RL Olsen. 2006. Slaughter stress, postmortem muscle pH and rigor development in farmed Atlantic cod (Gadus morhua L.). Int J Food Sci Technol 41, 861-864.

Little RC, GA Milliken, WW Stroup, RD Wolfinger. 1996. SAS System for Mixed Models. Statistical Analysis System Institute, Cary, NC, USA.

Pottinger TG. 2001. Effects of husbandry stress on flesh quality indicators in fish. In: Kestin S, Warriss PD (eds). Farmed fish quality. Blackwell Science, Bristol, England, Pp 145-160.

Redding JM, CB Schreck. 1983. Influence of ambient salinity on osmoregulation and cortisol concentration in yearling coho salmon during stress. Trans Am Fish Soc 112, 800-807.

193


Reddy PK, JF Leatherland. 1998. Stress Physiology. In: Leatherland JF, Woo PTK (eds). Fish diseases and disorders. Vol. 2. CABI Publishing, Oxford, UK, Pp 279-301.

Robb DHF. 2001. The Relationship between killing methods and quality. In: Kestin S, Warriss PD (eds). Farmed Fish Quality. Blackwell Science, Bristol, England, Pp 220-233.

Robb DHF, SC Kestin, PD Warriss. 2000. Muscle activity at slaughter: I. Changes in flesh colour and gaping in rainbow trout. Aquaculture 182, 261-269.

Robb DHF. 2003. How Harvest can Affect Quality, Canadian Edition, Surrey, EWOS Pp 9-12.

Roth B, D Moeller, JO Veland, A Imsland, E Slinde. 2002. The Effect of Stunning Methods on Rigor Mortis and Texture Properties of Atlantic salmon (Salmo salar). J Food Sci 67, 1462-1466.

Rottmann RW, R Francis-Floyd, R Durborow. 1992. The Role of Stress in Fish Disease in Southern Regional Aquaculture Center (SRAC), Publication Nº 474.

Ruiz I, AB Fernández, I De Blas. 2003. El sistema inmune de los teleósteos (IV): Principales factores que afectan a la respuesta inmune. AquaTIC 19, 1-7.

Singer, J. 1998. Using SAS PROC MIXED to fit multilevel models, hierarchical models and individual growth models. J Educ behav stat 24, 323-355.

Singer JD, JB Willett. 2003. Applied longitudinal data analysis: modeling change and event occurrence. Oxford University Press, New York, USA.

Skjervold PO, SO Fjæra, PB Østby. 1999. Rigor in Atlantic salmon as affected by crowding stress prior to chilling before slaughter. Aquaculture 175, 93-101.

Skjervold PO, SO Fjæra, PB Østby, O Einen. 2001. Live-chilling and crowding stress before slaughter of Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture 192, 265-280.

Svobodová Z, P Kaláb, L Dušek, B Vykusová, J Kolárová, D Janoušková 1999. The Effect of Handling and Transport on the Concentration of Glucose and Cortisol in Blood Plasma of Common Carp. Acta Veterinaria Brunensis 68, 265-274.

Thomas PM, NW Pankhurst, HA Bremner. 1999. The effect of stress and exercise on post-mortem biochemistry of Atlantic salmon and rainbow trout. J Fish Biol 54, 1177-1196.

Toldrá F. 2003. Muscle Foods: Water, Structure and Functionality. Food Sci Technol Inter 9, 173-177.

Urbinati EC, JS De Abreu, AC Da Silva Camargo, MA Landinez Parra. 2004. Loading and transport stress of juvenile matrinxa (Brycon cephalus, Characidae) at various densities. Aquaculture 229, 389-400.

Wall AJ 2001. Ethical considerations in the handling and slaughter of farmed fish. In: Kestin S, Warriss PD (eds). Farmed fish quality. Blackwell Science. Bristol, England, Pp 108-119.

Wendelaar Bonga SE. 1997. The stress response in fish. Physiol Rev 77, 1-39.

195

Arch Med Vet 42, 195-201 (2010)

COMMUNICATION

Accepted: 17.03.2010.

* Casilla 567, Valdivia, Chile; [email protected]

Preliminary behavioural study of Caballo Fino Chilote stallions with restricted access to space and water during summer

Estudio preliminar del comportamiento de potros raza Caballo Fino Chilote con acceso restringido a espacio y agua durante el verano

TA Tadicha b*, RG Pulidob

aBecario CONICYT, Programa Doctorado en Ciencias Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

bInstituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

RESUMEN

El Caballo Fino Chilote (CFCh) es la única raza de pony chileno y un recurso genético único. Un grupo de 7 potros CFCh fue observado por 60 horas, durante el verano, en la estación experimental del INIA-Butalcura, Isla de Chiloé, bajo condiciones de restricción de espacio y agua. El método de muestreo por escaneo se utilizó cada 5 minutos para evaluar estados conductuales y focal continuo para los eventos. Se registraron 5 estados y 19 eventos conductuales. Las interacciones entre potros tuvieron una frecuencia de presentación baja, siendo la más común “evasión” con un promedio de 1,2 eventos por potro por día. Los equinos utilizaron un 55,89% (± 4,3%) del tiempo en forrajear, 2,5% (± 0,82%) en locomoción, 7,26% (± 0,82%) de pie alerta, 32,24% (± 2,7%) descansando y 1,86% (± 0,64) en otras actividades. Forrajeo fue la principal actividad, siendo significativamente más baja (P < 0,05) durante el mediodía, periodo donde el descanso fue significativamente mayor (P < 0,05) comparado con los periodos de mañana y tarde. Se encontró una correlación positiva significativa entre temperatura y descanso y una correlación negativa significativa entre temperatura y forrajeo. Este estudio es la primera descripción conductual de potros de raza CFCh; la distribución de sus actividades es comparable a la de otras razas mantenidas en sistemas de pastoreo. Se enfatiza que la restricción de acceso a agua a la cual estaban sujetos estos animales es preocupante desde el punto de vista ético poniendo en riesgo su bienestar. Se requieren más estudios conductuales de esta raza para clasificarla de acuerdo a su temperamento y posibles usos.

Key words: Caballo Fino Chilote, horse, stallion, behaviour, Chile.

Palabras clave: Caballo Fino Chilote, potros, conducta, Chile.

INTRODUCTION

In Chile the most popular horse breed is the “Caballo Criollo Chileno” for which pedigree information can be traced back to 1893 (Pinochet 1980). There is a second Chilean horse breed; the “Caballo Fino Chilote” (CFCh). This breed is related to the Archipiélago of Chiloé located between 41º and 43º of south latitude. The island has an oceanic temperate rainy climate, with medium annual temperatures of 11 ºC (Sánchez and Morales 2000).

The CFCh is a unique equine resource; morphological characteristics (Voeltz 1996, Escobar and Tadich 2006) and a genetic analysis (Barrera 1998) confirm that its origins comes from those equines from the Península Ibérica brought by the Spaniard conquerors between the XVI and XVII centuries (Escobar et al 1998, Mujica et al 2005) with a close relationship with the “Garrano” horse from Portugal (Mujica et al 2005). The main importance of the CFCh is that it is considered the only pony with Spanish origins

subsisting in South America (Cothran et al 1993). Records for the CFCh can be found since 1999 when the stud book was opened as a result of a conservation program (FIA 2000). It has an average height to the withers of 120 cm (Voeltz 1996) and an average weight of 218 kg for stallions and 247 kg for mares (Mujica et al 2005).

The breed is known for being alert with excellent temperament (Escobar et al 1998). It has also been described as a rustic, strong and tame horse (Mujica et al 2005), and with biokinematic characteristics, such as stride and step length, and conformational parameters, suitable for its use in hipotherapy (Escobar and Tadich 2006), although there are no studies about the breed’s behaviour.

Animals in natural conditions are regarded as showing the normal behaviour of that species (Christensen et al 2002). Time budgets assess objectively important aspects of behaviour (Fraser 1992) such as amount of time involved in them and their distribution according to time of day or season. Diurnal studies of the time budgets of domestic horses on pasture, and of free-ranging feral horses, have been conducted by Schoen et al (1976), Salter and Hudson (1979), Crowel-Davis (1983), Kaseda (1983) and Sweeting et al (1985). Behavioural information about Chilean breeds

196

TA TADICH, RG PULIDO

is scarce, for this reason the objective of this study was to perform a preliminary study of some behavioural aspects of CFCh stallions kept on pasture in their natural habitat (Chiloé Island) during summer, under typical management conditions used for this breed.


A group of seven CFCh stallions, kept at the National Institute of Agricultural Research (INIA) located in Butalcura, Chiloé Island was studied. Stallions at INIA are kept together on pasture, in a reduced area of 1 hectare. No handling is done with them since they are kept only as a genetic resource.

The group was observed between 08:00 h and 20:00 h between the 27th of February and 2nd of March of 2008 (summer season). During this period, except for the presence of the observer, no human contact occurred. Stallions were kept with no ad libitum access to water (not recommended) and with no mares in the vicinity of the enclosure. They were taken to a water source once daily after observation hours, being this the normal management routine used at the station. They had been kept in this area prior to the beginning of the study.

Stallions were identified by natural marks. Observations were conducted by one observer from a distance between 15-20 m to avoid influencing the horses’ behaviour. Average temperatures and relative humidity were registered through the meteorological unit located at the research station.

Five mutually exclusive behavioural states were recorded by scan sampling every five minutes. These behavioural states were foraging, resting, standing alert, locomotion, and other behaviours and are defined in table 1 (1-5). Foraging was categorized into grazing and browsing while resting was categorized into rest standing and rest recumbent.

To assess male related and inter-male interactions, 19 behavioural events were registered (table 1, 6-24) using continuous focal sampling.

The twelve hour observation period was subdivided into three periods: 08:00-12:00; 12:00-16:00 and 16:00-20:00 h. These intervals divided the day into a morning, midday and afternoon periods.

The body condition score (BCS) of each horse was recorded once at the beginning of the study using the body condition scoring index for horses from 0 (very poor) to 5 (very fat), based on the Carroll and Huntington (1988) method. The age of stallions was provided by INIA.

Data analysis: Differences in percentage of time dedicated to each behavioural state, between and within stallions and between different periods of the day, among the 5 days of observation, were analyzed by One-Way Analysis of Variance. In cases where data was not normally distributed, according to the Shapiro Wilk test, a Kruskal Wallis test was applied. For assessing correlations between temperature and each of the five behavioural states studied, a Pearson’s correlation was coefficient obtained. Behavioural

events are presented in terms of total occurrence, average frequency per day and standard deviation. All calculations were made in the computer software STATISTIX® 8. A significance level of P < 0.05 was applied.

RESULTS AND DISCUSSION

The geographical location where the study took place (Butalcura, Chiloé Island) corresponds to the original conditions in which this breed has developed, since it was first introduced by the Spanish conquerors (Cabrera 1945, Escobar et al 1998, Mujica et al 2005). The average temperatures of 18.7 ºC (4.5 ºC min and 29.4 ºC max) and average relative humidity (57.9%) registered during the period of observation were normal for the period (Sánchez and Morales 2000).

Social status and nutritional condition have been described as linked to the biological rhythm of an individual (Souris et al 2007). The 7 stallions observed ranged between 4 and 14 years of age (average 9 years), 6 of them had a BCS of 3 (good) and only one had a score 2 (moderate).

For horses living in natural social units, interactions among stallions comprise a prominent feature of social behaviour, ranging from peaceful and cooperative to sparring (McDonnell 2003). Some male related and inter-male interactions observed in the CFCh stallions are summarised in table 2. Avoidance behaviour was more frequent (1.20 events per day per stallion) than aggressive interactions such as biting, boxing or lunging (0.03, 0.37 and 0.03 events per stallion per day respectively) (figure 1). Positive interactions such as allogroom and play were also observed (table 2). Christensen et al (2002) registered a higher number of social interactions in naturally reared and mixed age group of Przewalski stallions than in a domestically reared and of similar age group of stallions. Although the restricted space (1ha) a low number of interactions was found in the present study (table 2). This could be a result of the small size of the group of stallions, of similar ages and the fact that it has been conformed over a long period of time, since according to Boyd and Houpt (1994) the dominance relationship in a group depend on these characteristics; or the fact that they had enough resources to supply their biological needs and that there were no mares present, since aggression may be induced by competition for limited resources (Christensen et al 2002). Another reason for the low frequencies of interactions found could be some intrinsic characteristics of the breed, which has been described as having good temperament (Escobar et al 1998), but this would need further studies to assure.

Over the period monitored, the group of stallions studied spent 55.89% (± 4.3) of the time foraging, 32.4% (± 2.7) resting, 7.26% (± 2.04) standing alert, 2.54% (± 0.82) in locomotion and for 1.86% (± 0.64) of their time they were involved in other activities (table 3). This

197

CABALLO FINO CHILOTE, HORSE, STALLION, BEHAVIOUR, CHILE

Table 1. Ethogram of the behaviours recorded based on Christensen et al (2002), McDonnell (2003) and Souris et al (2007). Etograma de las conductas observadas, basado en Christensen et al (2002), McDonnell (2003) y Souris et al (2007).

Behaviour Description

1. Foraging Grazing: Ingest grassy vegetation. With the lips and tongue, vegetation is gathered into the mouth, broken off usually in clumps by jerking the jaw while chewing, and swallowed.

Browsing: Ingest woody plants.

2. Resting Rest Standing: Standing inactive in a relaxed posture, usually with head slightly lowered, eyes partly or nearly closed, and often bearing weight on three legs (one hind leg slightly flexed). With deeper drowsiness (transition between wakefulness and sleep), the lips relax and the ears rotate laterally.

Rest recumbent: Rest or sleep while lying down with head up or legs and head outstretched.

3. Standing alert Rigid stance with the neck elevated and the head oriented toward the object or animal of focus. The ears are held stiffly upright and forward, and the nostrils may be slightly dilated.

4. Locomotion Walk trot or gallop with a minimum duration of 10s. The horse is not involved in grazing.

5. Other behaviours All other behaviours, e.g. social behaviours, urination, defecation, inter-male interactions, etc.

6. Roll Dropping from standing to sternal recumbency, then rotating one or more times from sternal to dorsal recumbency, tucking the legs against the body. Typically occurs on dusty or sandy areas.

7. Autogroom Nibbling, biting, licking, or rubbing a part of the body.

8. Allogroom Reciprocal coat care in which the partners stand beside one another, usually head to shoulder or head to tail, grooming each other’s neck, mane, rump or tail by gently nipping, nuzzling, or rubbing.

9. Stomp Raising and lowering of a foreleg to strike the ground sharply, usually repeatedly.

10. Avoidance Movement that maintains or increases an individual’s distance from an approaching stallion. The head is usually held low and ears turned back. The retreat can be at any gait but usually occurs at trot.

11. Posturing Pre-fight head-bowing, prancing, stomping, olfactory investigation, as well as stiffening of the entire body, including forelegs. The arched neck threat is also a major component, being held through out most of the interaction.

12. Lunge Swift forward thrust of the body from the rear position or charge from close range toward another stallion (usually toward his fore body), most often displayed concurrently with a bite threat, with ears pinned.

13. Push Pressing of the head, neck, shoulder, chest, or body against another horse, causing it to move one or more legs to regain balance.

14. Bite threat Bite intention movement with ears back and neck extended, with no actual contact.

15. Bite Opening and rapid closing of the jaws with actual contact to another horse’s body.

16. Strike threat A strike motion that appears abbreviated or gestured so as to miss contacting the opponent, often a part of ritualized interactions between stallions.

17. Boxing Two stallions in close proximity simultaneously rearing and striking out toward one another with alternate forelegs.

18. Chase Pursuit of another stallion, usually at a gallop in an apparent attempt to overtake, direct the movement of, or catch up with the pursued stallion. The pursuing stallion usually pins the ears, exposes the teeth, and bites at the pursued stallions rump and tail.

19. Herding Combination of head threat and ears laid back with forward locomotion, apparently directing the movement of another stallion(s).

20. Defecate over Defecation on faecal piles in a characteristic sequence: sniff faeces, step forward. Defecate, pivot or back up, and sniff faeces again.

21. Flehmen Head elevated and neck extended, with the eyes rolled back, the ears rotated to the side, and the upper lip everted exposing the upper incisors and adjacent gums while drawing air and fluids through the teeth.

22. Play Play directed at another individual, which may or may not reciprocate; includes low intensity play movements such as nipping, nuzzling, or rubbing.

23. Body sniff Olfactory investigation. A horse sniffs the neck, withers, flank, or tail of another horse, which may or not reciprocate.

24. Displacement Approach of one horse with ears back causes another to move away so that distance is maintained or increased, without overt aggression.

198


Table 2. Total occurrence by stallion, average and standard deviation by stallion and daily frequency by stallion for the behavioural events observed. Presentación total por potro, promedio por potro y desviación estándar y frecuencia de ocurrencia diaria por potro de eventos conductuales.

Behavioural event

total occurrence by stallionaverage by

stallionfrequency

by day1 2 3 4 5 6 7 total

roll 4 3 7 1 2 0 3 20 2.86 ± 2.27 0.57

autogroom 9 2 8 8 9 5 2 43 6.14 ± 3.13 1.23

allogroom 5 1 5 3 3 0 0 17 2.43 ± 2.15 0.49

stomp 0 0 0 0 0 4 3 7 1.00 ± 1.73 0.20

avoidance 0 4 1 15 5 7 10 42 6.00 ± 5.23 1.20

posturing 0 0 0 0 0 1 1 2 0.29 ± 0.48 0.06

lunge 0 0 0 0 0 0 1 1 0.14 ± 0.38 0.03

push 1 0 2 0 0 0 0 3 0.43 ± 0.79 0.09

bite threat 2 1 7 0 1 0 0 11 1.57 ± 2.51 0.31

bite 0 0 1 0 0 0 0 1 0.14 ± 0.38 0.03

strike threat 0 0 2 0 0 1 3 6 0.86 ± 1.21 0.17

boxing 0 0 4 0 1 3 5 13 1.86 ± 2.12 0.37

chase 0 0 9 0 0 0 0 9 1.29 ± 3.4 0.26

herding 0 0 0 0 12 0 0 12 1.71 ± 4.54 0.34

defecate over 2 2 4 0 1 5 5 19 2.71 ± 1.98 0.54

flehmen 5 1 2 2 2 0 0 12 1.71 ± 1.7 0.34

play 2 2 1 0 0 0 0 5 0.71 ± 0.95 0.14

body sniff 2 2 2 0 0 2 1 9 1.29 ± 0.95 0.26

displacement 1 0 13 0 2 0 0 16 2.29 ± 4.79 0.46

Figure 1. Caballo Fino Chilote stallion lunging against another stallion. Potro Caballo Fino Chilote embistiendo a otro potro.

preliminary overall time budget for the CFCh stallions studied (table 3) can be compared with those described for other breeds as Camargue horses (Kiley-Worthington 1989), draft and light mares (Flannigan and Stookey 2002) and Przewalski horses (Souris et al 2007). There were no significant differences among the days included in the study in relation to the distribution of the behaviours within stallions, and no significant differences (P > 0.05) between the stallions observed.

From the time spent foraging, 54.4% (± 4.97) was done by grazing and 1.6% (± 1.15) by browsing. Foraging is known to be the main activity of horses, occupying most of their time budgets, and its is characterized by being controlled by a highly regulated motivational system (Fraser 1992). The CFCh stallions spent most of their time in this activity (56%), percentage similar to that reported by Duncan (1980, 1985) for Camargue horses and higher than the 25.83% ± 26.8% found for densely housed Arab breeding mares by Benhajali et al (2008). The CFCh, being a rustic breed, is capable of adapting to adverse foraging conditions (Escobar et al 1998, Mujica et al 2005), this

199


is why time spent browsing was also calculated (1.6%). The main species available for grazing were Blechnum pennamarina, a common fern in this island, and for browsing Drimys winteri (tree) and Berberis microphylla (bush). Because of the characteristics of these species, it becomes highly important the adjustability of the ingestive behaviour of the CFCh horse, important feature of equines that has been described by many authors (Hintz 1977, Frape 1980).

Resting time was also divided into rest standing (29% ± 3.92) and rest recumbent (3% ± 2.35). This behaviour was the second main activity (32%, table 3) in which stallions were involved after foraging, although it tended to follow an opposite trend (figure 2). Percentages reported by Boyd et al (1988) were slightly higher for rest recumbent (5.3%) and lower for rest standing (16%). This could be due to the fact that their study was done over a 24 hour period. Deep sleep occurs in a recumbent position only (McDonnell 2003) which is lower during day time (Boyd et al 1988). According to Boyd et al (1988) a certain amount of recumbency is critical for well being; horses depend on vigilance and speed, and are especially vulnerable while in recumbent rest. Most predators of horses are crepuscular or diurnal, so minimizing recumbency during day time avoids leaving them in a vulnerable position (Boyd 1998).

The mutually exclusive behaviours studied were not equally distributes during the study period. Foraging and resting showed the largest variation during the day. Foraging was significantly lower (P < 0.001) during midday, time at which resting was significantly higher (P < 0.001) compared to the morning and afternoon period. There was a significant higher amount of time spent resting at midday compared to the other periods, the exact opposite occurred for foraging (P < 0.001).

The percentage of time spent in each behaviour, during the 12 hours studied was associated to average temperature (figure 2). Average temperature showed a statistically significant positive correlation with the amount of time spent resting (r = 0.65, P = 0.025) and a statistically significant negative correlation with the amount of time spent foraging (r = –0.67, P = 0.016). There were no statistically significant correlations (P > 0.05) between average temperature and the remaining behaviours. Similar correlations were described by Boyd (1998). Horses conserve energy by resting during the hottest hours of the day until it becomes cool enough for them to become active and graze without incurring in thermal stress (Berger 1986) probably this is the reason why stallions used the midday period, when temperatures were higher, for resting. This midday decrease in foraging activity has been observed to disappear during winter (Rubenstein 1981), when energy requirements of horses are probably higher, because of a higher metabolic rate needed to maintain core body temperature, requiring more time engaged in this behaviour (Boyd et al 1988). Even though resting was the main activity during midday, short bouts of foraging also occurred within this period

(figure 2). Equines salivate as a response to chewing, while production of gastric acids are continues (Harris and Arkell 2005), there fore avoiding long periods of time without feeding enables horses to maintain an adequate gastrointestinal environment and avoid discomfort as a result of excessive acidity.

Locomotion was also found to be constant over the whole observation period, a pattern that was also described by Souris et al (2007). Locomotion is considered an integral part of foraging, since horses are able to keep their heads down ingesting food while taking a step or two (Fraser 1992, McGreevy 2004). In the present study, locomotion was only considered when performed separately from foraging behaviour, otherwise the 2.54% reported for this activity would be higher.

Even though stallions were enclosed in a reduced area (1ha) the percentage of time involved in standing alert (7.23%) was consistent with percentages reported by Griffitts (1985) and the Boyd et al (1988) and close to the 11% reported by Souris et al (2007). A low percentage of the stallion’s time was occupied in standing alert and other activities (table 3) compared to other studies (Boyd et al 1988, Boyd 1998, Flannigan and Stookey 2002, Benhajali et al 2008). This could be due to differences in the conditions in which horses were kept and the overall observation hours included in the studies. Because of the range of ages between the stallions in this study (4-13) we expected them to be, more alert and vigilant because of possible agonistic interactions in such a reduced space.

010

2030

40

50

60

70

80

90100

8:00

9:00

10:0

0

11:0

0

12:0

0

13:0

0

14:0

0

15:0

0

16:0

0

17:0

0

18:0

0

19:0

0

20:0

0

Day hours

0

5

10

15

20

25

% T

ime

Foraging

Average T ºCOther behaviours

Standing alertLocomotion

Resting

Figure 2. Day time distribution of the five behaviours observed and temperature, averaged by hour and day and subsequently over all five days. Distribución diaria de los 5 estados conductuales observados y temperatura, datos promediados por hora por el total de días registrados.

200


Drinking was not included in the behaviours observed in this study because stallions had no ad libitum access to water. Horse’s daily water requirements range between 20-70 litres, depending on body weight, air temperature and humidity, level of activity and health (NEWC 2005); Porte (1992) indicates that water requirements can vary between 2.5 and 5 litres for every kilogram of feedstuff or 5-6% of live body weight. The presence of dew on the grass during early morning and water included in the species foraged were probably an important extra source of water for these stallions. Heat stress is probably not a problem because of the temperate climate of Chiloé Island, compared to the situation of horses kept in arid or tropical areas where average temperatures are higher during summer, as in the case of working horses in Afghanistan, Egypt, India, Jordan and Pakistan (Pritchard et al 2005). According to the NEWC (2005) every horse must have free access to a supply of fresh, clean drinking water to meet its individual maintenance and activity requirements and wellbeing.

Even though the present study has limitations in relation to management conditions and period of observation it gives a first description of some behavioural characteristics of CFCh stallions kept under restricted space and access to water. The distribution of their activities during day time is comparable to those of other free ranging horses, spending the highest amount of time foraging at mornings and afternoons when temperatures are lower. Although agonistic interactions occurred with low frequencies, further studies regarding specific behaviours are needed to be able to classify this breed according to temperament and possible uses, especially in relation to therapeutic work with children.

SUMMARY

The Caballo Fino Chilote (CFCh) is the only Chilean pony breed and a unique genetic resource. A group of seven CFCh stallions were observed for 60 hours, during summer, at INIA- Butalcura research station, Chiloé Island, under restricted space and access to water conditions. Scan sampling every five minutes was used to register 5 behavioural states and continuous focal sampling for 19 behavioural events. Inter-male interactions had a low frequency of presentation being avoidance (1.2 average events per stallion per day) the most common. Overall stallions spent 55.89% (± 4.3%) of their time foraging, 2.5% (± 0.82%) in locomotion, 7.26% (± 0.82%) standing alert, 32.24% (± 2.7%) resting and 1.86% (± 0.64) in other behaviours. Foraging was

the main activity, its occurrence was significantly lower (P < 0.05) during midday, time when resting was significantly higher (P < 0.05) compared to the morning and afternoon periods. Locomotion, standing alert and other behaviours had a constant distribution during the day. A significant positive correlation between temperature and resting was found while there was a significant negative correlation between temperature and foraging. The present study is a first attempt in describing behavioural characteristics of CFCh stallions. Distribution of their activities during day time is comparable to those of other free ranging horses. Emphasis is made on the fact that the restricted access to water, that these horses were subjected to, is of ethical concern and a risk for their wellbeing. More studies in relation to behaviour are needed in order to classify this breed according to temperament and possible uses.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to acknowledge INIA-Butalcura for allowing us to undertake this study at their facilities, and CONICYT for the funding of the Doctor in Veterinary Science degree.

REFERENCES

Barrera M. 1998. Parámetros morfológicos y tipificación de polimorfismos antigénicos eritrocitarios y bioquímicos como base del stud book de la raza Caballo Chilote. Tesis de Licenciatura, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Benhajali H, MA Richard-Yris, M Leroux, M Ezzaouia, F Charfi, M Hausberger. 2008. A note on the time budget and social behaviour of densely housed horses. A case study in Arab breeding mares. Appl Anim Behav Sci 112, 196-200.

Berger J. 1986. Wild horses of the Great Basin, social competition and population size. The University of Chicago Press, Chicago, USA.

Boyd LE, DA Carbonaro, KA Houpt. 1988. The 24-hour time budget of Przewalski horses. Appl Anim Behav Sci 21, 5-17.

Boyd LE, KA Houpt. 1994. Activity patterns. In: Boyd L, KA Houpt (eds). Przewalski’s Horse: the history and biology of an endan-gered species. State University of New York Press, Albany, USA, Pp 195-254.

Boyd LE. 1998. The 24-h time budget of a takh harem stallion (Equus ferus przewalskii) pre and post reintroduction. Appl Anim Behav Sci 60, 291-299.

Cabrera A. 1945. Caballos de América. Editorial Sudamericana. Buenos Aires, Argentina.

Carroll CL, PJ Huntington. 1988. Body Condition Scoring and Weight Estimation of Horses. Equine Vet J 20, 41-45.

Christensen JW, T Zharkikh, J Ladewig, N Yasinetskaya. 2002. Social behaviour in stallion groups (Equus przewalskii and Equus cabal-lus) kept under natural and domestic conditions. Appl Anim Behav Sci 76, 11-20.

Cothran G, R Mansilla, J Oltra, M Ortiz. 1993. Análisis genético del caballo Chilote de Isla de Chiloé-Chile. Arch Med Vet 25, 137-146.

Crowel-Davis SL. 1983. The behaviour of Welsh pony foals and mares. PhD thesis, Cornell University, Ithaca, New York, USA.

Table 3. Overall day-time time budget for the seven Caballo Fino Chilote stallions observed over 12 hours for 5 days. Presupuesto de actividad diurno total para los 7 potros Caballo Fino Chilote observados 12 horas diarias por 5 días.

Foraging Locomotion Standing alert Resting Other behaviours

Percentage of time 55.89 2.54 7.26 32.40 1.86

S.D. ± 4.30 ± 0.82 ± 2.04 ± 2.70 ± 0.64

Time in minutes 402.19 18.29 52.27 233.28 13.39

201


Duncan P. 1980. Time-budgets of Camargue horses. II. Time-budgets of adult horses and weaned sub-adults. Behaviour 72, 26-49.

Duncan P. 1985. Time-budgets of the Camargue horses. III. Environmental influences. Behaviour 72, 26-49.

Escobar A, J Oltra, M Ortiz, J Voeltz. 1998. Caballo Chilote. FAo Animal Genetic Resources Information 23, 41-47.

Escobar A, T Tadich. 2006. Caracterización biocinemática, al paso guiado a la mano, del Caballo Fino Chilote. Arch Med Vet 38, 53-61.

FIA, Fundación para la Innovación Agraria. 2000. Proyecto: Recuperación y multiplicación del caballo chilote.

Flannigan G, JM Stookey. 2002. Day-time time budget of pregnant mares housed in tie stalls: a comparison of draught versus light mares. Appl Anim Behav Sci 78, 125-143.

Frape DL. 1980. Facts about feeding horses. Practice 21, 14-21.Fraser AF. 1992. Maintenance behaviour. In: The behaviour of the horse.

Charper 3. CABI Publishing, Wallingford, UK, Pp 78-83.Griffits C. 1985. The behaviour of Przewalski horses at the Denver Zoo.

Thesis, Department of Animal Science, Cornell University, Ithaca, New York, USA.

Harris PA, K Arkell. 2005. How understanding the digestive process can help minimize digestive disturbances due to diet and feeding practices. In: Harris PA, Mair TS, Slater JD, Green RE (eds). Equine nutrition for all. Proceedings the ist BEVA and Waltham nutrition symposia, Harogate, UK.

Hintz HF. 1977. Nutrition of the Horse. In: Evans JW, Borton A, Hintz HF, Van Vleck LD (eds). The Horse. Freeman, San Francisco, USA, Pp 239-347.

Kaseda Y. 1983. Seasonal changes in time spent grazing and resting of Misaki horses. Jpn J Zootech Sci 54, 464-469.

Kiley-Worthington M. 1989. Feeding behaviour and digestion. In: The behaviour of horses in relation to management and training. Chapter 7. JA Allen, London, UK, Pp 151-159.

McDonnell S. 2003. The equid ethogram, a practical field guide to horse behaviour. The Blood Horse Inc., Hong Kong, China, Pp 23-89.

McGreevy P. 2004. Ingestive behavior. In: Equine behavior, a guide for veterinarians and equine scientists. Chapter 8. Saunders, Philadelphia, USA, Pp 189-216.

Mujica F, V Obreque, P Hinrichsen, G Cothran. 2005. Recuperación, conservación y caracterización del Caballo Chilote. Agro Sur 33, 58-67.

NEWC, National Equine Welfare Council. 2005. Equine industry wel-fare guidelines compendium for horses, ponies and donkeys. 2nd ed. Oxfordshire, UK.

Pereira JR, SSS Vianna. 2006. Gastrointestinal parasitic worms in equines in the Paraíbo Valley State of Sao Paulo, Brazil. Vet Parasitol 140, 289-295.

Pinochet JL. 1980. Estudio hipométrico y morfológico del caballo de raza criolla chilena y su posible cambio tipológico. Tesis de Licenciatura, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Porte E. 1992. Equino de tiro. Editorial Universitaria S.A., Santiago, Chile.

Pritchard JC, AC Lindberg, DCJ Main, HR Whay. 2005. Assessment of the welfare of working horses, mules and donkeys, using health and behaviour parameters. Prev Vet Med 69, 265-283.

Rubenstein DI. 1981. Behavioural ecology of island feral horses. Equine Vet J 13, 27-34.

Salter RE, RJ Hudson. 1979. Feeding ecology of feral horses in Western Alberta. J Range Manage 32, 221-225.

Sánchez A, R Morales. 2000. Décima Región de los Lagos. En: Las regiones de Chile. Espacio físico y humano económico. Editorial Universitaria, Santiago, Chile.

Schoen AMS, EM Banks, SE Curtis. 1976. Behaviour of young Shetland ponies (Equus caballus). Biol Behav 1, 199-216.

Souris AC, P Kaczensky, R Julliard, C Walzer. 2007. Time budget, behavioral synchrony and body score development of a newly released Przewalski’s horse group Equus ferus przewalskii, in the Great Gobi B strictly protected area in SW Mongolia. Appl Anim Behav Sci 107, 307-321.

Sweeting MP, CE Houpt, KA Houpt. 1985. Social facilitation of feeding and time budgets in stabled ponies. J Anim Sci 60, 369-374.

Voeltz J. 1996. Descripción morfológica del Caballo Chilote y su distribución en la Isla de Chiloé. Tesis de Licenciatura, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

203

Arch Med Vet 42, 203-207 (2010)

COMUNICACIóN

Aceptado: 10.08.2010.

* Programa Bienestar Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias, UACh, Casilla 567, Valdivia, Chile; [email protected]

Características de manejo y conducta en caballos estabulados en el sur de Chile: Estudio preliminar

Husbandry and behaviour characteristics in stabled horses in the south of Chile: A preliminary study

C Márqueza, A Escobarab, TA Tadichab*

aInstituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.bPrograma Bienestar Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

The use of stables for horses has become a routine practice, especially for those used in equestrian sports, affecting some behaviours due to the changes in their natural environment which can have a detrimental effect on their welfare. In Chile the conditions under which horses are kept in stables in relation to welfare have not been described. This is why the main objective of this study was to describe the housing systems for horses used in the south of Chile and determine if they have the conditions required to maintain an adequate welfare status. Fourteen stud farms, including 283 horses of different breeds located in Valdivia, Ranco, Osorno and Chiloé provinces were visited. Direct and indirect methods were used for the evaluation; these included aspects of health, behaviour, handling of the horses and training of the personnel. According to our results most horses had a good body condition score (88%), 2.5% presented lesions and only 0.7% were lame. All stud farms had deworming schedules and the majority a vaccination programme. The main problems were related with the presence of behavioural disorders (18.4%), low number of food rations per day, size of the stables and lack of training of the personnel, especially in relation to animal welfare concepts. All stud farms had a high level of concern about the care of their horses. However, the lack of knowledge in some aspects related to horse management need to be addressed through training in order to improve horses welfare.

Palabras clave: equinos, bienestar, manejo, estabulación.

Key words: equines, welfare, management practices, stables.

INTRODUCCIóN

La estabulación del equino es una práctica que se ha ido masificando en los criaderos a través del tiempo; entre las razones de esto están la necesidad de ahorrar pasturas, eliminar la competencia durante la alimentación y facilitar a los dueños un mayor control sobre el valor nutritivo del alimento entregado y sobre la ingesta de agua (McGreevy 2004). Sin embargo, la estabulación puede tener un efecto negativo sobre el bienestar equino, principalmente debido a las modificaciones conductuales que sufren al reempla-zar su ambiente natural por establos (McGreevy 2004). La conducta de forrajeo se ve altamente alterada en un sistema de estabulación. Los equinos en su ambiente natural pueden ocupar hasta 16 horas diarias forrajeando, mientras que en estabulación esta conducta se ve reducida a aproximadamente tres horas del día (Kiley-Worthington 1987), produciendo frustración alimenticia durante el encierro; la estabulación es también un factor de riesgo para la presentación de conductas anormales o no deseadas (Christie y col 2006, Tadich y Araya 2010).

La evaluación del bienestar animal se basa princi-palmente en la recolección de dos tipos de información: los métodos indirectos, que evalúan lo adecuado de los insumos y las prácticas de manejo que el animal recibe e indican el riesgo de un problema de bienestar (Wood y col 1998), y los métodos directos, que usan parámetros basados en el animal proporcionando una medida del estado de bienestar de éste (Pritchard y col 2005). Dentro de los aspectos a evaluar se deben incluir aquellos relacionados con el comportamiento, mantención, alimentación y cui-dado veterinario, elementos básicos para la mantención de equinos en condiciones adecuadas (Endenburg 1999).

Las condiciones en que se mantienen los equinos es-tabulados en relación a su bienestar no han sido descritas en Chile, por ello se planteó como objetivo describir los sistemas de estabulación en relación a la presencia de con-diciones apropiadas para mantener un estado de bienestar adecuado de los equinos.

MATERIAL Y MÉTODOS

ANIMALES

Se utilizaron 283 equinos, en su mayoría destinados a deporte, de diversas razas, pertenecientes a 14 criaderos de la zona sur del país, ubicados en las Provincias de

204

C MÁRQUEZ Y COL

Valdivia y Ranco, Región de Los Ríos, y en las Provincias de Osorno y Chiloé, Región de Los Lagos.

EVALUACIóN DE BIENESTAR ANIMAL

Se aplicó el protocolo de evaluación de bienestar animal aplicado por Márquez (2009), el cual contempla indicadores directos e indirectos.

Indicadores directos: fueron utilizados el estado de salud de los animales, incluyendo la condición corporal, según la tabla de condición corporal desarrollada por Henneke (1985) y modificada por Naour (2003), clasificando la condición corporal en buena, regular o mala; presencia de heridas y cicatrices, presencia de claudicaciones y lesiones de cascos observables a la inspección del animal, tales como: fisuras, desprendimiento de muralla e infecciones. Además, se observó la presencia de conductas anormales como lignofagia, aerofagia con o sin fijación, mal del oso, sacudir la cabeza, patear la pesebrera y caminar estereo-tipado, según las descripciones entregadas por Tadich y Araya (2010). Estos indicadores se evaluaron por inspec-ción directa de los equinos dentro de sus pesebreras. En el caso de los indicadores conductuales, estos se registraron mediante el método de escaneo focal, por el tiempo que duró la visita al criadero, en promedio 4 horas, y se con-trastó con lo indicado por los respectivos cuidadores por medio de encuesta.

Indicadores indirectos: fueron utilizados los programas de manejo sanitario (vacunas y desparasitaciones), infraestruc-tura de los establos (tamaño, iluminación y ventilación), manejo nutricional y alimenticio, tiempo de estabulación (horas por día), presencia y tipo de herraje, método de amansa utilizado (tradicional o racional) y capacitación del personal en manejo equino. Estos indicadores fueron evaluados mediante observación del establo y la aplicación de una encuesta en relación a manejo, confeccionada para los trabajadores de los criaderos que estaban en contacto permanente con los equinos estabulados.


Se utilizó estadística descriptiva. Los resultados para las distintas observaciones se expresaron en base a números totales y porcentajes.

RESULTADOS Y DISCUSIóN

De la evaluación de los 283 equinos incluidos en este estudio se evidenció que un 88% de ellos obtuvo una calificación de condición corporal buena; un 12% una condición corporal regular y no se observó ningún animal con una calificación de condición corporal mala. Esto contrasta con lo reportado por Naour (2003) y Tadich y col (2008) quienes utilizaron la misma escala de evaluación de condición corporal en equinos de tiro liviano (carretoneros) encontrando 36% y 59% de los

equinos en condición corporal buena y un 9% y 8% en condición corporal mala respectivamente. Las diferencias con los estudios mencionados podrían deberse a que los dueños de caballos carretoneros son en general personas de clase socioeconómica baja (Mac-Leod 1999), lo que dificulta la mantención de una buena condición corporal de los animales producto de la falta de recursos para comprar alimentos de buena calidad para satisfacer sus requerimientos nutricionales, los cuales probablemente se pueden solventar en los equinos de deporte involucrados en este estudio.

En cuanto a la presencia de heridas y cicatrices, se observó un bajo porcentaje de lesiones, siendo éstas de un 2,5% y un 8,8% respectivamente. Estos porcentajes son inferiores al 27% de heridas y 50% de cicatrices encontra-dos en equinos carretoneros por Tadich y col (2008). En dicho estudio la mayoría de las lesiones fueron provocadas por los aperos, los cuales, tal como señala Hovell (1998), causan lesiones producto de una pobre mantención o uso inapropiado; en cambio, los aperos utilizados en equinos de deporte presentan mejores características de calidad y ajuste de acuerdo a la función y necesidades particulares del equino (Del Campo 2004).

La prevalencia de problemas de comportamiento en este estudio fue de un 18,4%, teniendo en cuenta que al-gunos equinos presentaban más de un problema conductual (cuadro 1). Este porcentaje es mayor al 10% reportado en Chile para caballos chilenos por Muñoz y col (2009) y a resultados en otros países, donde se han encontrado prevalencias que van desde un 2,5% en Italia (Vecchiotti y Galanti 1986) hasta un 15% en Canadá (Luescher y col 1991). La alta prevalencia de problemas de compor-tamiento en el presente estudio se puede deber a que se consideró un mayor número de desórdenes conductuales

Cuadro 1. Distribución de los problemas de comportamien-to observados en los equinos estabulados de los criaderos evaluados. Distribution of the behavioural disorders observed in stabled horses.

Problema conductual Número de equinos

Porcentaje (%)

Masticar madera (lignofagia) 16 5,7

Patear la pesebrera 10 3,5

Aerofagia con o sin fijación 8 2,8

Sacudir la cabeza 6 2,1

Mal del oso 9 3,2

Caminar estereotipado 1 0,4

Otro* 2 0,7

Ninguno 233 82,3

* Otro corresponde a morderse el labio continuamente y levantar la cola continuamente.

205

EQUINOS, BIENESTAR, MANEJO, ESTABULACIóN

que en los estudios mencionados, donde sólo tomaron en cuenta problemas como el mal del oso, aerofagia con fijación, caminar estereotipado y otros desórdenes como lignofagia. La mayor presencia de problemas de com-portamiento podría atribuirse a la cantidad de horas de estabulación continua a la que eran sometidos los equinos en el presente estudio (cuadro 2), siendo éste un factor de riesgo para la presentación de conductas anormales (Christie y col 2006).

El mal del oso, la aerofagia con fijación y el ca-minar estereotipado se presentaron en un porcentaje levemente menor a los encontrados en otros estudios (cuadro 1). Waters y col (2002) reportaron un 4,6% de equinos con el mal del oso, un 2,3% con caminar estereotipado y 10,5% aerofagia con fijación. En tanto, Christie y col (2004) registraron prevalencia para estos comportamientos de un 4,8, 3,8 y 3,8% respectivamente. Esto podría deberse a que, a pesar de su estabulación continua, todos los equinos tenían contacto entre ellos, siendo principalmente este contacto de tipo visual y en menor medida visual y táctil (cuadro 2), lo cual podría disminuir la presentación de problemas como el mal del oso (McGreevy y col 1995).

En cuanto al manejo sanitario, los equinos de los 14 criaderos evaluados (100%) contaban con asistencia veterinaria periódica, siendo esto superior a lo señalado por Iturriaga (1998) en el país, quien encontró que sólo un 64,5% de los centros equinos en Chile contaba con asis-tencia veterinaria periódica. La totalidad de los criaderos realizaba tratamientos antiparasitarios a sus equinos en forma periódica, con fechas predeterminadas sin basarse

en exámenes coprológicos, en donde la mayor parte de éstos la realizaban cada tres meses (78,6%). Esta forma de manejo puede afectar el bienestar animal de los equinos debido a que produce resistencia de los parásitos hacia los fármacos antihelmínticos, como se ha reportado en el caso de los ciatostomas a los bencimidazoles (Herd y Coles 1995), lo cual se ha reportado en equinos del sur de Chile (von Witzendorff y col 2003).

La mayoría de los criaderos utilizaban vacunas para prevenir algunas enfermedades infecciosas (influenza equina, rinoneumonitis y gurma); sólo se encontró un 14,3% de criaderos que no aplicaban este método pre-ventivo. Esto se debe a que los dueños de los criaderos en cuestión no han tenido problemas de esta naturaleza, por lo cual no consideran necesario este manejo; aun así, este porcentaje es menor al 22,6% reportado hace ya una década por Iturriaga (1998).

En cuanto a la infraestructura, el 100% de los establos contaba con ventilación, dada principalmente por aperturas en el techo y por ventanas, tal como recomienda Ensminger (1973). Todos los criaderos tenían en sus establos luz natural y luz artificial lo que, según Retamales (1989), es importante para evitar la sensación de encierro en los animales. Las características que presentaban las pesebreras diferían entre los criaderos principalmente en tamaño y en algunos casos en el uso que se les daba, en relación al almacenamiento de alimento (cuadro 2).

Más del 50% de los criaderos evaluados presentaba pesebreras con dimensiones iguales o menores a 3 x 3 metros, siendo que esas son las dimensiones mínimas recomendadas para equinos de alzadas menores a 1,42 m (Webster y col 1987). A pesar de no haberse realizado una clasificación de los equinos según su alzada, se estima que la mayoría de los animales involucrados en el estudio era de una alzada mayor. La utilización de pesebreras de tamaños menores a los recomendados limita el movimiento y actividad de los equinos al interior de éstas, provocan-do así distrés en el animal, impidiendo que exhiban un repertorio conductual adecuado y repercutiendo en la posible aparición de conductas estereotipadas (Broom y Kennedy 1993).

La utilización de las pesebreras como lugar de almace-namiento de alimento (cuadro 2) no es aconsejable, ya que éste puede atraer roedores que transmiten enfermedades, además el heno en mal estado favorece la presentación de problemas respiratorios como la obstrucción recurrente de las vías aéreas (Clarke 1987, Morán y col 2006).

En cuanto a la alimentación y estabulación, en el cuadro 2 se observan algunos aspectos importantes que se pueden relacionar con el bienestar de estos equinos. En la mayoría (57,1%) de los criaderos evaluados la frecuencia de alimentación más usada era de dos veces/día. Esta frecuencia resulta insuficiente y provoca una reducción importante de la conducta de forrajeo (Kiley-Worthington 1987). Un bajo número de raciones repercute negativamente en el sistema digestivo ya que facilita la

Cuadro 2. Características de la infraestructura y del manejo equino durante la estabulación. Characteristics of the stables and husbandry practices used.

Características de la estabulación

Número Porcentaje (%)

Tamaño de pesebreras (m)

2x5v3 2 14,2

3x3 6 42,9

≥ 3,5x3,5 6 42,9

Lugar de almacenamiento del alimento

Pesebreras 1 7,1

Bodega y pesebrera 3 21,4

Galpón o bodega 10 71,4

Frecuencia de alimentación

2 veces/día 8 57,1

3 veces/día 5 35,6

4 veces/día 1 7,1

Tiempo de estabu-lación continua en el día

< 2 horas 1 7,1

2 - 4 horas 5 35,7

4 - 8 horas 6 42,9

> 8 horas 2 14,3

Contacto entre equinos estabulados

Visual 11 78,6

Visual y táctil 3 21,4

206

C MÁRQUEZ Y COL

presentación de úlceras gástricas; éstas como consecuencia de una disminución del pH gástrico, provocada por la secreción continua de ácido clorhídrico que realizan los equinos (Andrews y col 2005) y que, en estos casos, no es amortiguado correctamente por la secreción salival, debido a los largos periodos de ayuno a los que son so-metidos. Además un reducido tiempo dedicado al forrajeo podría causar frustración alimenticia causando cambios conductuales. Una frecuencia de alimentación recomen-dable es de cuatro veces al día, ya que un aumento en la frecuencia previene la aparición de conductas anormales (Ninomiya y col 2004) y al mismo tiempo disminuyen la probabilidad de aparición de úlceras gástricas, ya que la entrega, cada seis horas, de forrajes ricos en fibras ayuda a regular el pH estomacal (Andrews y col 2005) a través de una adecuada producción de saliva.

En cuanto al tiempo de estabulación, sobre el 50% de los criaderos mantenía a sus animales estabulados por más de cuatro horas continuas (cuadro 2), factor de riesgo importante en la presentación de problemas de comporta-miento (Mills y col 2005).

La capacitación del personal en diferentes ámbitos relacionados a los equinos se muestra en el cuadro 3. En el caso de los herrajes la mayoría de los criaderos contaba con una persona capacitada para realizar este manejo. La práctica del herraje es una actividad fundamental que requiere conocimientos adecuados para realizarlo sin provocar daños en el pie del equino y es indispensable que el herrador esté formado académicamente (Funtanillas 2004).

El 0,7% de los equinos presentaba algún tipo de claudi-cación y un 9,9% problemas a nivel de cascos, porcentajes inferiores a lo reportado por Mac-Leod (1999) y Naour (2003) en equinos carretoneros, quienes encontraron 13,5% y 10% de prevalencia de claudicaciones y 90,4% y 93% de problemas en los cascos, respectivamente. Los bajos porcentajes encontrados podrían ser producto de que la mayoría de los criaderos (85,7%) contaba con gente capacitada en herraje y el 100% de los criaderos evaluados efectuaban despalme y cambio de herraje con intervalos de cuatro a seis semanas, coincidiendo con lo recomendado por la World Society for the Protection of Animals (WSPA 2003).

La amansa de los caballos la efectuaba mayoritaria-mente personal sin capacitación en el tema (60%), lo que podría afectar el bienestar de los equinos, ya que en general éstos utilizan la amansa tradicional (80%), la cual se basa principalmente en el uso de castigos (Porte 1979), mientras que sólo un 20% practicaba amansa racional (cuadro 3), basada en el comportamiento y refuerzo positivo del ca-ballo (Muñoz 2004).

La capacitación del personal en el manejo equino y bienestar animal demostró ser un aspecto que todavía no es considerado como elemento importante. Mejorar los porcentajes de capacitación, especialmente en el tema de bienestar animal, podría mejorar las condiciones de los equinos. Altamirano (2004) demostró cómo la capacitación de trabajadores con respecto a temas de manejo animal resultó en mejoras en los indicadores de bienestar animal en plantas faenadoras.

En general, la buena condición corporal en que se encontraban los equinos denota que existe preocupación por el cuidado de ellos. Sin embargo, la presencia de problemas de comportamiento es un aspecto preocu-pante. Una manera de enfrentar este aspecto es dar a conocer los factores de riesgo y consecuencias de estos desórdenes conductuales sobre la salud de los equinos. Otros problemas que se encontraron se relacionan con desconocimiento de las necesidades referentes a espacio, conducta normal y frecuencia de alimentación requerida por los equinos, aspectos que pueden ser solucionados a través de capacitación del personal que maneja de forma directa a los equinos en los criaderos.

RESUMEN

La estabulación de los equinos es una forma de manejo cotidiana, principalmente en aquellos destinados a deporte, provocando modificaciones conductuales debido al cambio desde un ambiente natural a uno artificial, pudiendo afectar su bienestar. En Chile, las condiciones en que se mantienen los equinos estabulados en relación a su bienestar no han sido descritas. El objetivo de este estudio fue describir algunas de las condiciones de estabulación de equinos y determinar si éstas son las requeridas para mantener un estado de bienestar adecuado. Se evaluaron 283 equinos, de distintas razas, pertenecientes a 14 criaderos del sur de Chile (Provincias de Valdivia, Ranco, Osorno y Chiloé). Se utilizaron métodos directos e indirectos; éstos consideraron aspectos de

Cuadro 3. Capacitación del personal en distintos aspectos asociados al manejo equino. Training of handlers in different aspects associated with equine management.

CapacitaciónHerraje Amansa* Manejo general Bienestar animal

Nº % Nº % Nº % Nº %

Sí 12 85,7 4 40 7 50 1 7,1

No 2 14,2 6 60 7 50 13 92,9

* Sólo 10 de los criaderos evaluados realizaban la amansa.

207

EQUINOS, BIENESTAR, MANEJO, ESTABULACIóN

salud, comportamiento, prácticas de manejo y capacitación del personal. El 88% de los equinos presentó buena condición corporal, mientras que pocos presentaron heridas (2,5%) y claudicaciones (0,7%). Todos los criaderos se preocupaban de realizar manejo antiparasitario y la mayoría de vacunar contra enfermedades infecciosas. Las principales falencias fueron la presencia de problemas conductuales (18,4%); la baja frecuencia de la alimentación de los equinos, tamaño de las pesebreras y la capacitación del personal en el manejo equino, particularmente la capacitación en relación al bienestar animal. En todos los criaderos existe preocupación por el cuidado de sus animales, sin embargo, la falta de conocimiento en relación a los problemas presentados es una situación que debería ser solucionada. La capacitación del personal encargado del manejo equino, en cuanto a comportamiento normal, sería un aporte para mejorar el bienestar de estos animales.

REFERENCIAS

Altamirano A. 2004. Evaluación del bienestar animal mediante la observación de tres indicadores en una planta faenadora de carnes de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Andrews FM, BR Buchanan, SB Elliot, NA Clariday, LH Edwards. 2005. Gastric ulcers in horses. J Anim Sci 83, Suppl E18-E21.

Broom DM, MJ Kennedy. 1993. Stereotypies in horses: their relevance to welfare and causation. Equine Vet Educ 5, 151-153.

Christie JL, CJ Hewson, CB Riley, MA McNiven, IR Dohoo, LA Bate. 2004. Demographics, management and welfare of nonracing horses in Prince Edward Island. Can Vet J 45, 1004-1011.

Christie JL, CJ Hewson, CB Riley, MA McNiven, IR Dohoo, LA Bate. 2006. Management factors affecting stereotypies and body condition score in nonracing horses in Prince Edward Island. Can Vet J 47, 136-143.

Clarke AF. 1987. Air hygiene and equine respiratory disease. In Pract 9, 196-204.

Del Campo CH. 2004. A la huella: caballos, aperos y cabalgatas. Imprenta América Ltda., Valdivia, Chile.

Endenburg N. 1999. Perceptions and attitudes towards horses in European societies. Equine Vet J, Suppl 28, 38-41.

Ensminger M. 1973. Producción equina. 6a ed. El Ateneo, Buenos Aires, Argentina.

Funtanillas H. 2004. Elementos de podología equina y herrado correctivo. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina.

Henneke DR. 1985. A condition score system for horses. Equine Pract 7, 13-15.

Herd RP, G Coles. 1995. Slowing the spread of anthelmintic-resistant ne-matodes of horses in the United Kingdom. Vet Rec 136, 481-485.

Hovell G. 1998. Welfare considerations when attaching animals to vehicles. Appl Anim Behav Sci 59, 11-17.

Iturriaga L. 1998. Estudio descriptivo de 31 centros reproductivos equinos en la Décima Región de Los Lagos. Tesis de Licenciatura, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Kiley-Worthington M. 1987. The behaviour of horses; in relation to management and training. JA Allen, London, UK.

Luescher UA, DB McKeown, J Halip. 1991. Reviewing the causes of obsessive-compulsive disorders in horses. Vet Med 86, 527-530.

Mac-Leod C. 1999. Estudio de los equinos carretoneros atendidos en un policlínico en Valdivia, caracterizando aspectos de hipometría, patologías, alimentación, cascos y herrajes. Tesis de Licenciatura, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Márquez C. 2009. Elaboración y aplicación de una pauta de bienestar animal en equinos estabulados. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

McGreevy PD, PJ Cripps, NP French, LE Green, CJ Nicol. 1995. Management factors associated with stereotypic and redirected behaviour in the Thoroughbred horse. Equine Vet J 27, 86-91.

McGreevy P. 2004. Equine behavior: A guide for veterinarians and equine scientists. Saunders, London, England.

Mills DS, KD Taylor, JJ Cooper. 2005. Weaving, headshaking, cribbing, and other stereotypies. American Association of Equine Practitioners. Lexington, KY, USA.

Morán G, O Araya, H Folch. 2006. Obstrucción recurrente de las vías aéreas en el caballo. Arch Med Vet 38, 201-217.

Muñoz R. 2004. Estudio descriptivo y comparativo de dos sistemas de amansa en caballos criollos chilenos. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Muñoz L, J Torres, O Sepúlveda, C Rehhof, R Ortiz. 2009. Frecuencia de comportamientos anormales estereotipados en caballos chilenos. Arch Med Vet 41, 73-76.

Naour E. 2003. Elaboración de una guía de consejos prácticos para el manejo de los caballos carretoneros de Valdivia. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Ninomiya S, R Kusunose, S Sato, M Terada, K Sugawara. 2004. Effects of feeding methods on eating frustration in horses. Anim Sci J 75, 465-469.

Pell SM, PD McGreevy. 1999. Prevalence of stereotypic and other problem behaviours in Thoroughbred horses. Aust Vet J 77, 678-679.

Porte E. 1979. Cría, doma y arreglo del caballo a la chilena. Editorial Universitaria SA, Santiago, Chile.

Pritchard JC, AC Lindberg, DC Main, HR Whay. 2005. Assessment of the welfare of working horses, mules and donkeys, using health and behaviour parameters. Prev Vet Med 69, 265-283.

Retamales NR. 1989. Reproducción, criaza y manejo de un haras F.S. de carrera. Ediciones Mar del Plata, Santiago, Chile.

Tadich T, A Escobar, RA Pearson. 2008. Husbandry and welfare aspects of urban draught horses in the south of Chile. Arch Med Vet 40, 267-273.

Tadich T, O Araya. 2010. Conductas no deseadas en equinos. Arch Med Vet 42, 29-41.

Vecchiotti G, R Galanti. 1986. Evidence of heredity of crib-biting, weaving and stall-walking in Thoroughbred horses. Livest Prod Sci 14, 91-95.

von Witzendorff C, I Quintana, G Sievers, T Schnieder, G Samson-Himmelstjerna. 2003. Estudio sobre resistencia frente a los bencimidazoles de pequeños estróngilos (Cyathostominae) del equino en el sur de Chile. Arch Med Vet 35, 187-194.

Waters AJ, CJ Nicol, NP French. 2002. Factors influencing the devel-opment of stereotypic and redirected behaviours in young horses: findings of a four year prospective epidemiological study. Equine Vet J 34, 572-579.

Webster A, A Clarke, T Madelin, C Wathes. 1987. Air hygiene in stables 1: effects of stable design, ventilation and management on the con-centration of respirable dust. Equine Vet J 19, 448-453.

Wood J, J Holder, D Main. 1998. Quality assurance schemes. Meat Sci 49, Suppl. 1: S191-1203.

WSPA, World Society for the Protection of Animal. 2003. Cuidados básicos para equinos. Kalion SA, Bogotá, Colombia.

209

Arch Med Vet 42, 209-214 (2010)

COMUNICACIóN

Aceptado: 12.05.2010.

* Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; [email protected]

Uso de concentrados autólogos de plaquetas como tratamiento de una fractura escapular y una lesión del plexo braquial producidas por un disparo en un caballo

Use of autologous platelet concentrates as treatment for a scapular fracture and brachial plexus nerve injury produced by a gunshot in a horse

C Lópeza, JU Carmonaa∗, I Samudiob

aGrupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Caldas, Colombia.bDepartamento de Nutrición y Bioquímica, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

SUMMARY

Gunshot injuries have been scarcely reported in horses. Close-range gunshots usually produce extensive soft tissue damage and comminute fractures. A case of a comminute fracture of the neck of the scapula with acute injury of the brachial plexus produced by a 9 mm gunshot in a six year-old stallion is described. The patient was successfully treated by combining surgical debridement of the affected region and local injection of several doses of autologous platelet concentrates (APCs) and physiotherapy. Although scapular fractures and peripheral nerve damage take at least 18-24 months for full recovery, this patient reached full recuperation of the affected limb in 9 months. These results suggest that injections of APCs in combination with physiotherapy could provide a therapeutic benefit in the treatment of soft tissue acute injuries and bone fractures in horses.

Key words: equine, autologous platelet concentrate, wound treatment.

Palabras clave: equinos, concentrado autólogo de plaquetas, tratamiento heridas.

INTRODUCCIóN

Las fracturas escapulares son poco frecuentes en caballos, ya que este hueso está bien protegido por mús-culos circundantes y situaciones traumáticas inusuales son necesarias para producir daño óseo (Dyson 1986). Las fracturas escapulares más frecuentes son las de la tuberosidad supraglenoidea (Pankowski y col 1986). Las fracturas del cuello de la escápula representan un desafío quirúrgico puesto que los extremos fracturados están des-plazados y su aposición completa es técnicamente difícil, por lo que en algunas circunstancias se han empleado placas de compresión dinámica para tratar esta clase de fracturas (Shamis y col 1989).

Usualmente, caballos con fracturas escapulares tratadas de manera conservadora (administración de antiinflamatorios no esteroidales combinada con 3-4 meses de descanso en cuadra, seguido por un periodo de 9-12 meses en pastura) o con cirugía requieren de un tiempo de recuperación entre 6-13 meses (Dyson 1986, Shamis y col 1989, Vallance y col 2007). Las fracturas escapulares, en especial del cuello, pueden estar acom-pañadas de lesión del nervio supraescapular (NSE) y subsecuentemente producir atrofia por denervación

de los músculos supra e infraespinoso (Dyson 1986, Dutton y col 1999). Este síndrome clínico es llamado en inglés sweeney (Schneider y col 1985). Normalmente, las lesiones del NSE requieren entre 16-18 meses para una completa recuperación. Reportes tempranos han indicado pronósticos favorables en caballos tratados de manera conservadora (Dutton y col 1999) o por cirugía (Schneider y col 1985).

Los concentrados autólogos de plaquetas (APCs) se obtienen por centrifugación de la sangre del mismo paciente. Se define como el contenido en plaquetas en forma de sobrenadante tras la centrifugación de sangre anticoagulada (Dugrillon y col 2002). Las plaquetas des-empeñan un papel muy importante dentro de los APCs, ya que constituyen la principal fuente de actividad mitógena en el plasma sanguíneo y funcionan como vehículo por-tador de factores de crecimiento (GFs), principalmente factor de crecimiento transformante β (TGF-β), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y de otras proteínas que modulan la inflamación y la cicatrización (Carmona y Prades 2009).

En este artículo se presenta un caso de fractura con-minuta del cuello de la escápula acompañada de lesión del NSE y compromiso moderado del plexo braquial producido por un balazo 9 mm (M882 NATO) a un caba-llo, el cual fue tratado exitosamente con APCs obtenidos mediante el método del tubo (Argüelles y col 2006) y fisioterapia.

210

C LóPEZ Y COL

MATERIAL Y MÉTODOS

DESCRIPCIóN DEL CASO CLÍNICO

Un caballo criollo colombiano, intacto, con seis años de edad y 330 kg fue referido para evaluación de una herida de bala producida accidentalmente por su propietario en el miembro anterior derecho (MAD), mientras era montado. El accidente había ocurrido tres horas antes con una pistola automática (Jericho 941, IMI, Israel) que disparaba cartuchos 9 mm NATO. Durante el ingreso el paciente presentaba tem-peratura, pulso y frecuencia respiratoria dentro de los límites normales. Sin embargo, el caballo presentaba cojera grado 5/5 del MAD mientras caminaba. Durante el examen físico se detectó tumefacción dolorosa sobre la región escapulo-humeral derecha con una pequeña herida (puntura) en la parte proximodorsal al nivel del borde dorsal de la escápula. En ese momento, la manipulación del miembro afectado no reveló la presencia de crepitación o inestabilidad.


EVALUACIóN ECOGRÁFICA

Se realizó evaluación ecográfica (Falcovet, Esoate, Genova, Italia) con un transductor convexo a una frecuencia

Figura 1. Ecografías de las porciones proximal (A) y central (B) del músculo infraespinoso derecho del paciente. A) La sonda ecográ-fica está ubicada sobre la entrada de la bala. Observe el edema subcutáneo y la trayectoria de la bala (flechas) con disrupción muscular mínima. B) La sonda ecográfica se encuentra 3 cm distal a la herida de entrada. Note la ecogenicidad anormal con maceración, disrup-ción y hematoma muscular. Ultrasonographies of the proximal (A) and central (B) portions of the infraspinatus muscle of the patient’s report. A) The ultrasound probe is just over the entry of the gunshot. Note the oedema of the subcutaneous tissue and the initial trajectory of the missile (arrows) with minimal disruption of the muscle. B) The ultrasound probe is just 3 cm distal to the entry wound. Note the abnormal echogenicity with fibre disruption and maceration and hematoma of the muscle.

de 3,5-5 mHz, para seguir la dirección de la bala y de-terminar la severidad y compromiso de las estructuras lesionadas por el disparo. Se notó edema subcutáneo y disrupción de las fibras del músculo infraespinoso derecho. La región central del músculo presentaba ecogenicidad anormal con daño de fibras, maceración y hematoma (figura 1A y B). La trayectoria del disparo seguía una dirección de lateral hacia medial. Inicialmente, no fue posible encontrar el proyectil debido a la gran tumefac-ción que limitaba la capacidad técnica de la sonda de ultrasonido.

EVALUACIóN RADIOGRÁFICA Y CIRUGÍA

El caballo fue sedado con xilacina (0,5 mg/kg, IV) y morfina (0,1 mg/kg, IV). La anestesia fue inducida con guayacolato de glicerilo al 5% (dosis efecto) y ketamina (2,2 mg/kg, IV) y mantenida con isofluorano al 2,5%, para estudio radiográfico y desbridamiento quirúrgico de los tejidos comprometidos. Se tomaron radiografías del hombro derecho para determinar la posición exacta del proyectil y la extensión del daño óseo. La inflamación del hombro y brazo era tan severa que afectó la obtención de radiografías de buena calidad y limitó la colocación adecuada de los casetes, para poder analizar la región inmediatamente superior a la articulación escapulohumeral

211

EQUINOS, CONCENTRADO AUTóLOGO DE PLAQUETAS, TRATAMIENTO HERIDAS

derecha. Sin embargo, las radiografías evidenciaron inte-gridad del húmero sin compromiso de la articulación del hombro, aunque no se pudo detectar la silueta radiopaca del proyectil en esa región.

Se realizó una incisión de 20 cm sobre la espina de la escápula que seguía la dirección del disparo. Se eliminaron las fibras musculares necróticas y el hematoma del mús-culo infraespinoso. Sin embargo, la trayectoria de la bala era difícil de seguir y se optó por realizar lavado copioso (a presión) del tracto restante de la herida y así evitar un posible daño iatrogénico. No se tomó muestra para cultivo y sensibilidad bacteriana. Se dejó un drenaje de Penrose durante 72 horas, el cual emergía de la región más distal de la incisión y estaba ubicado dentro de la zona de espacio muerto ocasionada por la cirugía en el músculo infraespi-noso. El caballo fue asistido por varios operarios durante la recuperación anestésica y recibió penicilina G cristalina (22.000 IU/kg/IV/q.u.i.d), sulfato de gentamicina (6,6 mg/kg/IV/s.id.) y fenilbutazona (2,2 mg/kg/IV/b.i.d) durante 10 días. Al tercer día postoperatorio, se apreció disminución de la tumefacción del hombro con atrofia progresiva de los músculos supra e infraespinoso, tríceps, deltoides, pectoral y extensor lateral, acompañada con desplazamiento lateral (abducción) del MAD. Sin embargo, el paciente podía apoyar levemente la extremidad contra el piso. En esa oca-sión, la manipulación del MAD evidenció crepitación en la región del hombro. La ecografía mostró que el proyectil

había producido intenso daño muscular de la porción distal del músculo infraespinoso y del deltoides. El cuello de la escápula mostró interrupción de la línea hiperecoica de su superficie y múltiples fragmentos óseos con hematoma pe-rilesional (figura 2A). Un artefacto hiperecoico con silueta de bala fue detectado cerca al foco de fractura (figura 2B). La bala no fue extraída para no producir más daño muscular. Con base en la historia, los hallazgos del examen clínico, cirugía y pruebas complementarias se diagnosticó fractura conminuta del cuello de la escápula con lesión del nervio SEC y afectación moderada del plexo braquial secundarios a impacto de bala.

TRATAMIENTO CON CONCENTRADOS

AUTóLOGOS DE PLAQUETAS

El foco de fractura (cuello de la escápula) y los tejidos blandos comprometidos por el balazo (músculos supra e infraespinoso, tríceps y deltoides) fueron tratados con inyecciones de APCs obtenidos mediante el método del tubo por doble centrifugación (Argüelles y col 2006, Carmona y col 2009, Carmona y Prades 2009). Se realizó una inyección ecoguiada con una aguja espinal Nº 18G y se depositaron 30 mL de APC activados con 3 mL de gluconato de calcio al 10%. Este protocolo se realizó tres veces, con un intervalo de dos semanas entre aplica-ción. Adicionalmente, se realizó estimulación eléctrica

Figura 2. Ecografías del hombro derecho del paciente tres días después de la herida de bala. A) Note que el cuello de la escápula pre-senta interrupción de la línea hiperecoica del hueso con esquirlas óseas y hematoma perilesional. B) Observe un artefacto hiperecoico con forma de bala cercano al foco de fractura (flechas). Shoulder ultrasonographies of the patient’s report at the third postoperative day. A). Note that the neck of the scapula presented interruption of the hyperechoic line of the bone with multiple bone fragments and perilesional hematoma. B) Note a hyperechoic like-bullet shaped artefact near to fracture foci (arrows).

212

C LóPEZ Y COL

transcutánea nerviosa (TENS) a cada músculo atrofiado a una frecuencia de 60 mHz y una duración de 300 µs/pulso durante 15-30 min. Esta terapia fue realizada cinco veces/semana, durante dos meses.


EVOLUCIóN CLÍNICA

Un mes después, el caballo presentó reducción de su grado de cojera (3/5) y desaparición de la crepitación. La ecografía reveló mejoría de la apariencia de la arquitectura de las estructuras óseas y musculares comprometidas. Sin embargo, el paciente presentaba un acortamiento aparente (~5 mm) del MAD respecto al miembro contralateral. El caballo fue dado de alta un mes y medio después del balazo y permaneció bajo confinamiento en cuadra durante un mes, seguido por descanso en un pequeño corral por dos meses. El siguiente mes comenzó a recibir paseos de la mano de 15 min, dos veces al día. En ese momento presentaba disminución de su grado de cojera a 2/5, pero aún presentaba atrofia de los músculos de la región del hombro del MAD, aunque el grado de abducción había disminuido notablemente. El caballo fue manejado con un programa gradual de ejercicio controlado y se recuperó completamente a los nueve meses postlesión (figura 3). Para ese tiempo, el paciente presentaba un grado de cojera de 0,5/5, quizás asociada a un componente mecánico como consecuencia del acortamiento del MAD. Para mejorar esa situación se realizó un herraje correctivo con una plantilla

de cuero de un espesor 5 mm entre la herradura y el casco comprometido. Actualmente, el caballo entrena dos horas, cuatro veces por semana y realiza paseos al trote de seis horas, dos veces por mes, y no ha manifestado complica-ciones adicionales.

Desafortunadamente, el uso indiscriminado de poderosas armas de fuego por parte de civiles ha producido muerte o lesiones severas a personas (Richmond y col 2005) y animales (Mellish y Andreani 2008), tal como es reportado en este caso. En caballos, se han documentado lesiones producidas por disparos, bien sean inducidas accidentalmente o producidas por violencia (Vatistas y col 1995, Mellish y Andreani 2008). Vatistas y col (1995) documentaron un disparo accidental que afectó la región del hombro en un caballo. El paciente de ese reporte había sido herido con un cartucho calibre 22 de baja velocidad (< 305 m/s (Farjo y Miclau 1997)) mientras era montado por su propietario. El caballo de este reporte sufrió el accidente de la misma manera, aunque fue producido por un proyectil 9 mm de velocidad intermedia (330-610 m/s (Farjo y Miclau 1997)) con alto poder destructivo.

Frecuentemente, los disparos efectuados a corta dis-tancia (a quemarropa) producen daño extenso de tejidos blandos y fracturas conminutas (Farjo y Miclau 1997, Okçu y Aktug±lu 2005). En personas, lesiones de las extremidades superiores producidas por disparos a corta distancia están asociadas con inestabilidad esquelética y daño de tejidos blandos y resultan en morbilidad significativa, prolongados periodos de incapacidad funcional y hospitalización (Okçu y Aktug±lu 2005). El caso presentado en este reporte fue

Figura 3. Evolución clínica comparativa del grado de atrofia muscular del miembro anterior derecho (afectado) al tercer (A), quinto (B) y noveno (C) meses postlesión. Note la completa resolución de la atrofia muscular en este caballo. Comparative clinical evolution of the degree of muscular atrophy of the right (affected) forelimb at the third (A), ninth (B) and eleventh (C) postinjury months. Note the complete resolution of the muscular atrophy in this horse.

213

EQUINOS, CONCENTRADO AUTóLOGO DE PLAQUETAS, TRATAMIENTO HERIDAS

producido por un disparo a quemarropa con un proyectil 9 mm. La complejidad de las lesiones producidas por este disparo hace de este caso único en la literatura, ya que normalmente caballos con fracturas de huesos largos oca-sionados por disparos tienen mal pronóstico y normalmente son sometidos a eutanasia (Vatistas y col 1995).

La extensión del daño producido por el proyectil en el caballo de este reporte fue más severa que el caso reportado por Mellish y Andreani (2008), quienes documentaron en una yegua una lesión de bala con daño de la muscula-tura del tríceps derecho, posiblemente producida por un proyectil de alta velocidad (> 610 m/s (Farjo y Miclau 1997)). En contraste, el caballo de este reporte sufrió daño muscular grave, daño nervioso parcial del plexo braquial con afectación de los nervios supraescapular, axilar, radial y torácicos (Levine y col 2007) y fractura conminuta del cuello de la escápula.

Las lesiones del plexo braquial son poco comunes en caballos, aunque se han descrito lesiones del NSE y del nervio radial (Reed 2008). No existen reportes previos sobre lesiones del plexo braquial producidas por heridas de bala en caballos. En personas se ha visto que las heridas de bala pueden ser la causa del 12-18% de lesiones del plexo braquial (Kim y col 2004). Normalmente, el 40% de esta clase de lesiones se recupera de manera espontánea sin necesidad de cirugía, sobre todo cuando son producidas por proyectiles de baja velocidad (Kim y col 2004). Sin embargo, cuando las lesiones nerviosas son producidas por proyectiles de alta velocidad o por disparos a corta distancia son más graves, ya que los nervios son dañados no sólo por el impacto directo, sino también por la onda del impacto y los efectos de cavitación (Farjo y Miclau 1997, Kim y col 2004). Los nervios lesionados por disparos de alta velocidad o a quemarropa tienen poca probabilidad de recuperar su función. Pacientes que no presentan signos de recuperación dentro de los primeros 2-4 meses siguientes a la lesión deberían ser tratados quirúrgicamente (Kim y col 2004). Es posible que el paciente de este reporte única-mente haya sufrido de neuropraxia de algunas estructuras del plexo braquial (Levine y col 2007), aunque no se sabe cómo pudo haber evolucionado sin el uso de los APCs.

La herida de bala de este reporte fue inicialmente ma-nejada con desbridaje muscular agresivo, lavado copioso y con terapia antiinflamatoria y antibiótica, tal como ha sido previamente recomendado para seres humanos (Rhee y Martin 1997, Okçu y Aktug±lu 2005) y caballos (Vatistas y col 1995, Mellish y Andreani 2008). Además, las inyec-ciones de APCs y la fisioterapia (TENS y el programa de ejercicio controlado) fueron empleadas con la meta de mejorar el pronóstico general de este paciente.

El tratamiento con los APCs fue realizado para acelerar la regeneración (Carmona y col 2009, Carmona y Prades 2009) de los tejidos afectados: músculo, hueso y nervio (Mariconda y col 2008, Simman y col 2008, Mishra y col 2009). Se ha demostrado que los APCs son útiles para el tratamiento de afecciones crónicas del aparato locomotor en

caballos (Carmona y col 2009, Carmona y Prades 2009) y existe información básica (Mariconda y col 2008, Simman y col 2008) y clínica (Mishra y col 2009) que valida el empleo de APCs en lesiones agudas de tejidos blandos y en fracturas óseas (Mariconda y col 2008, Simman y col 2008, Elgazzar y col 2008).

Otro importante efecto benéfico del APC es su poderoso efecto antibacteriano (Bielecki y col 2008). Normalmente, un proyectil no es esterilizado por el fuego del disparo y puede transportar bacterias viables dentro de la herida. La flora bacteriana de una herida de bala cambia con el tiempo, pero las especies que inicialmente causan infección son por lo regular biota de la piel (Bowyer y Rossiter 1997). Bielecki y col (2007) encontraron que el gel de plaquetas humano presentaba efecto antibacteriano in vitro contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. De esta manera los APCs podrían ser usados como una terapia adjunta para manejar heridas de bala infectas en combinación con antibióticos. Aunque la TENS y los programas de ejercicio controlado son ampliamente usados en clínica equina, no existen estudios clínicos controlados que soporten de manera contundente su uso en caballos (Buchner y Schildboeck 2006). En el paciente de este reporte se ob-servó que la utilización de APCs combinados con TENS disminuyeron el grado de dolor y permitieron una rápida introducción del paciente a programa de rehabilitación con ejercicio terapéutico. También los resultados de este reporte sugieren que el tratamiento con APCs puede facilitar el proceso regenerativo en hueso, músculo y nervio y que la TENS podría tener un efecto terapéutico sinérgico en combinación con los APCs.

Los resultados clínicos observados en este paciente fueron espectaculares y esperanzadores. Los registros clínicos asociados con cada uno de los problemas del paciente de este reporte, tales como fractura escapular, trauma muscular y daño del NSE, toman al menos 18-24 meses para alcanzar la recuperación completa en la mayoría de los casos en cada lesión (Schneider y col 1985, Dyson 1986, Pankowski y col 1986, Shamis y col 1989, Dutton y col 1999, Vallance y col 2007). El paciente de este reporte alcanzó recuperación completa de la extremidad afectada en tan sólo nueve meses. Estos resultados soportan el uso de inyecciones APCs y TENS (cuando es posible) para mejorar la cicatrización de lesiones agudas de tejidos blandos y fracturas óseas en caballos.

RESUMEN

Las heridas de bala han sido escasamente descritas en caballos. Los disparos a corta distancia suelen producir daños en tejidos blandos y fracturas conminutas. Un caso de una fractura conminuta del cuello de la escápula con lesión aguda del plexo braquial producida por una bala de 9 mm en un semental de seis años de edad es descrito. El paciente fue tratado con éxito mediante la combinación de desbridamiento quirúrgico de la región afectada e inyección local de varias dosis de concentrados autólogos de plaquetas (APC) y fisioterapia. A pesar de la fractura de la escápula y del daño en los nervios periféricos que toman al menos 18-24 meses para una recuperación completa, este paciente se recuperó

214

C LóPEZ Y COL

satisfactoriamente en nueve meses. Estos resultados sugieren que las inyecciones de APC en combinación con fisioterapia pueden proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de lesiones agudas de tejidos blandos y fracturas óseas en caballos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Dairo E. Gómez, MVZ, Alejandro López y a su caballo Consentido.

REFERENCIAS

Argüelles D, JU Carmona, J Pastor, A Iborra, L Vinals, P Martínez, E Bach, M Prades. 2006. Evaluation of single and double centrifugation tube methods for concentrating equine platelets. Res Vet Sci 81, 237-245.

Bielecki TM, TS Gazdzik, J Arendt, T Szczepanski, W Król, T Wielkoszynski. 2007. Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study. J Bone Joint Surg Br 89, 417-420.

Bowyer GW, ND Rossiter. 1997. Management of gunshot wounds of the limbs. J Bone Joint Surg Br 79, 1031-1036.

Buchner HH, U Schildboeck. 2006. Physiotherapy applied to the horse: a review. Equine Vet J 38, 574-580.

Carmona JU, C López, M Prades. 2009. Uso de concentrados autólogos de plaquetas obtenidos mediante el método del tubo como tratamiento de artropatías en caballos. Arch Med Vet 41, 175-179.

Carmona JU, M Prades. 2009. Platelet concentrates to treat musculo-skeletal disease in horses. VDM Verlag, Saarbrücken, Germany.

Davidson EJ, BB Martin. 2004. Stress fracture of the scapula in two horses. Vet Radiol Ultrasound 45, 407-410.

Dugrillon A, H Eichler, S Kern, H Klüter. 2002. Autologous concentrated platelet-rich plasma (cPRP) for local application in bone regeneration. Int J oral Maxillofac Surg 31, 615-619.

Dutton DM, CM Honnas, JP Watkins. 1999. Nonsurgical treatment of suprascapular nerve injury in horses: 8 cases (1988-1998). J Am Vet Med Assoc 214, 1657-1659.

Dyson S. 1986. Shoulder lameness in horses: an analysis of 58 suspected cases. Equine Vet J 18, 29-36.

Elgazzar RF, MA Mutabagani, SE Abdelaal, AA Sadakah. 2008. Platelet rich plasma may enhance peripheral nerve regeneration after cya-noacrylate reanastomosis: a controlled blind study on rats. Int J oral Maxillofac Surg 37, 748-755.

Farjo LA, T Miclau. 1997. Ballistics and mechanisms of tissue wounding. Injury 28 (Sup 3), SC12-SC17.

Kim DH, JA Murovic, RL Tiel, DG Kline. 2004. Penetrating injuries due to gunshot wounds involving the brachial plexus. Neurosurg Focus 16, E3.

Levine JM, GJ Levine, AG Hoffman, GR Bratton. 2007. Comparative anatomy of the horse, ox, and dog: the brain and associated vessels. Comp Equine 2, 279-292.

Mariconda M, F Cozzolino, A Cozzolino, E D’Agostino, A Bove, C Milano. 2008. Platelet gel supplementation in long bone nonunions treated by external fixation. J orthop Trauma 22, 342-345.

Mellish MA, CM Adreani. 2008. Management of a gunshot wound in a mare. Can Vet J 49, 180-182.

Mishra A, J Jr Woodall, A Vieira. 2009. Treatment of tendon and muscle using platelet-rich plasma. Clin Sports Med 28, 113-125.

Okçu G, K Aktug±lu. 2005. Management of shotgun induced open frac-tures of the humerus with Ilizarov external fixator. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 11, 23-28.

Pankowski RL, BD Grant, R Sande, FA Nickels. 1986. Fracture of the supraglenoid tubercle: treatment and results in five horses. Vet Surg 15, 33-39.

Reed SM. 2008. Neurological diseases affecting horses in the first year of life. Proc Am Assoc Equine Practrs Focus Meet 37-48.

Rhee MJ, R Martin. 1997. The management of retained bullets in the limbs. Injury 28 (Sup 3), SC-23-SC28.

Richmond TS, R Cheney, CW Schwab. 2005. The global burden of non-conflict related firearm mortality. Inj Prev 11, 348-352.

Schneider JE, OR Adams, KJ Easley, RK Schneider, Bramlage LR, J Peter, MJ Boero. 1985. Scapular notch resection for suprasca-pular nerve decompression in 12 horses. J Am Vet Med Assoc 187, 1019-1020.

Shamis LD, M Sanders-Shamis, LR Bramlage. 1989. Internal fixation of a transverse scapular neck fracture in a filly. J Am Vet Med Assoc 195, 1391-1392.

Simman R, A Hoffmann, RJ Bohinc, WC Petterson, AJ Russ. 2008. Role of platelet-rich plasma in acceleration of bone fracture healing. Ann Plast Surg 61, 337-344.

Vallance SA, JM Lumsden, CB O’Sullivan. 2007. Scapula stress frac-tures in eight thoroughbred racehorses. Proc Am Assoc Equine Practnrs 53, 56-57.

Vatistas NJ, DM Meagher, CL Gillis, JW Neves. 1995. Gunshot in-juries in horses: 22 cases (1971-1993). J Am Vet Med Assoc 207, 1198-1200.

215

Arch Med Vet 42, 215-219 (2010)

COMMUNICATION

Accepted: 16.06.2010.

* *Casilla 567, Valdivia, Chile; [email protected]

Canine perianal furunculosis and interdigital lesions: Probable systemic lupus erythematosus

Descripción clínico-patológica de fístulas perianales y dermatitis interdigital en un perro como posible diagnóstico de lupus eritematoso sistémico

J Ojedaa*, M Moronib, E Paredesb, MA Vidalc, CD Figueroac, M Conchac

aInstituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.bInstituto de Patología Animal, Universidad Austral de Chile, Chile.

cInstituto de Anatomía, Histología y Patología, Universidad Austral de Chile, Chile.

RESUMEN

La clasificación de los signos clínicos del lupus eritematoso sistémico de acuerdo a su importancia en mayor o menor grado ha permitido orientar hacia un diagnóstico definitivo confirmado con la utilización de técnicas serológicas e inmunohistoquímicas. Un perro de raza Pastor alemán de cinco años de edad se presentó en el Hospital Veterinario de la Universidad Austral con una historia clínica de fístulas perianales y lesiones interdigitales en sus cuatro miembros, persistentes durante tres meses, que fue tratado con antibióticos. Los signos clínicos observados fueron alopecia, eritema, despigmentación, ulceración, excesiva presencia de tejido de granulación y dolor en la zona perianal e interdigital de los cuatro miembros. Además, presentó aumento de volumen en las articulaciones carpales y tarsales manifestando dolor en movimientos de flexión y extensión. Por medio de biopsias de zonas interdigitales y perianales tanto de áreas lesionadas como sanas, se realizó un análisis histopatológico. El examen mostró una separación parcial de la unión dermoepidérmica, presencia de detritus celulares, vacuolización de las células epidérmicas basales, abundante infiltrado histiocítico y linfoplasmocítico en la dermis con acumulo de eosinófilos en los vasos sanguíneos. Con tinción PAS se pudo observar una membrana basal discontinua y engrosada tanto en la piel sana como dañada. Además, los análisis inmunohistoquímicos mostraron reacción en la unión dermoepidérmica a IgM, IgA y C3, pero no hubo reacción para IgG. Analizando los antecedentes clínicos, histopatológicos e inmunohistoquímicos se sugiere que el presente reporte es un caso de lupus eritematoso sistémico.

Key words: systemic lupus erythematosus, perianal furunculosis, autoimmune diseases.

Palabras clave: lupus eritematoso sistémico, furunculosis perianal, enfermedades autoinmunes.

INTRODUCTION

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoim-mune disease characterized by the production of a variety of autoantibodies (antinuclear antibodies, rheumatoid factor, antiphospholipid antibodies) which react against their own cellular antigens and also form immune com-plexes (IC) in circulating blood (Medlea and Hnilica 2006). The underlying cause of this loss of self- toler-ance is unknown. In SLE IgM and IgG autoantibodies fix complement producing a direct cytotoxic effect or render cells susceptible to phagocytosis. Autoantibodies may also bind to platelets or red blood cells, explaining the immune-mediated anemia and thrombocytopenia found in SLE. IC are deposited in different tissues such as the vascular endothelium, glomeruli, synovial membranes and

articular capsule, as well as the basal membrane of the epidermis (Scott et al 2003). The fixation of complement by IC is a central step in the pathogenesis of the tissue injury observed in SLE. Complement activation induces anaphylatoxin generation and neutrophil infiltration. The latter produces phagocytosis of IC, and release of lysosomal enzymes and free radicals. IC also lead to aggregation of platelets and activation of Hageman factor which in turn contribute to the inflammatory process, local ischemia and necrosis (Abbas 2005, Thurman and Holers 2006). SLE is rare in cats and not very common in dogs, except for the German shepherd and Collie breeds which seem to be predisposed to this condition (Medlea and Hnilica 2006). The disease has shown a much higher prevalence in certain research kennels, higher than can be accounted for by genetics. In fact, the disease has been linked to certain class I major histocompatibility complex molecules in a line of German Shepherds (Teichner et al 1990). It has been suggested that environmental influences may also play a role as the disease is aggravated by exposure to

216

J OJEDA ET AL

sunlight in both dogs and humans. Several studies have also linked the onset of SLE to transmissible factors such as viruses, parasites or other infectious agents (Berent and Cerundolo 2005, Menke et al 2008).


Clinical history: A 5-year old German shepherd dog, weighing 35 kg, was presented to the Veterinary Hospital of the Universidad Austral de Chile with a history of perianal fistulas (figure 1a) and interdigital dermatitis (figure 1b) diagnosed 2 months previously based on clinical examination. The dog was initially treated with amoxi clavulanic acid at a dose of 20 mg/kg/12 hours and 2% topical chlorhexidine every 12 hours during 15 days without showing any clinical improvement.

Clinical examination: The initial clinical examination revealed painful perianal fistulas and serous discharge, the interdigital zones of the four limbs demonstrated alopecia, erythema, depigmentation, ulceration, serous discharge and granulation tissue. Moreover, it was evi-dent that an increased volume of the carpal and tarsal articulations were causing a plantigrade footstep, and pain after forced flexion/extension evaluation (figure 1b). The hematology exam showed a normocytic macrocytic anemia (27% PCV) with slight regeneration and eosino-philia (2.8 mil/µL), while biochemical values (ALT: 55U/L, Creatinine: 87 µmol/L, GGT: 2U/L, Alkaline fosfatase: 159 U/L, Uremia: 2.65 mmol/L) and urine analysis were normal.

Histological studies: Skin biopsies of the perianal and interdigital areas were performed under general anes-thesia. All biopsies were taken from affected skin and included a 1 cm margin of healthy looking skin. The biopsies were placed in 10% neutral buffered formalin, embedded in paraffin, sectioned at 4 µm and stained with hematoxylin-eosin and Peryodic acid Schiff (PAS) for evaluation by light microscopy. The immunohistochemical characterization was performed using an antigen retrieval method (Peña-Münzenmayer et al 2005). In brief, tissue sections were incubated in buffer citrate-HCl pH 6.0 at 90°C in a microwave. Next, the sections were treated with 3% hydrogen peroxide for 15 minutes to inhibit endogen peroxidases. Then, the tissue sections were washed with phosphate-buffered saline and incubated consecutively with: polyclonal antibodies anti-IgG (P01214, DAKO, Carpintería, CA, USA), anti-IgM (P01215, DAKO), anti-IgA (P01216, DAKO) or anti-C3 (Q0368, DAKO) biotinylated secondary antibody, and then with streptavidin-peroxidase complex (Kit LSAB Plus, DAKO). Peroxidases were revealed with diaminobenzidine. The preparations were counterstained with hematoxylin. The controls included omission of the first antibodies and their substitution by non-immune mouse or rabbit IgG.


The histopathology exam revealed zones with epider-mal erosions, moderate vacuolization of epidermal basal cells, partial separation of the epidermodermal junction and cellular debris (figure 1c). An abundant histiocytic and lymphoplasmacytic infiltrate was detected under the epidermis, extending between the hair follicles and reach-ing the deep zone of the dermis (figure 1d). Aggregates of eosinophils were evident in blood vessels. In the affected skin, the epidermis, epidermodermal junction and papil-lary dermis revealed immunoreactivity for IgM and C3 (figure 2a). The dermis in healthy skin also showed deposits of IgM, C3 and in a minor degree IgA (figure 2b). Both affected and healthy skin failed to reveal immunoreactivity to IgG. In addition, PAS method revealed a loss of basal membrane in injuried skin with areas of partial thickening in both affected and non-affected skin (figure 2d).

The clinical and morphologic features of this condition suggested an immunological base for the lesions and the following therapy was carried out: i) prednisone 2 mg/kg once a day during 15 days, which was gradually tapered every 7 days until reaching a dose of 0.25 mg/kg prescribed for the length of the dog’s life; ii) ranitidine at 2 mg/kg once a day during 15 days; iii) cephalexine administered at 20 mg/kg every 12 hours during 10 days. Improvement of the perianal and interdigital lesions was apparent after 30 days of treatment without relapse. The immunosuppressor therapy was instituted as is usually prescribed for lupus and perianal furunculosis, and cases in which histopathol-ogy results support an immune-mediated process (Fournel et al 1992, Scott et al 2003, Doust et al 2005, Patterson and Camphell 2005).

Canine anal furunculosis is a chronic, painful, pro-gressive inflammatory and ulcerative disease suspected to be immunomediated (Patterson and Campbell 2005). Moreover, the general histopathological examination, including interdigital lesions, corresponds to interface dermatitis. These histological features are characterized by an inflammatory infiltrate that abuts or obscures the dermoepidermal junction, similar to those observed in other immuned-mediated conditions such as discoid lupus erythematosus, systemic lupus erythematosus, fixed ery-thema, toxic epidermal necrolysis, dermatomyositis and erythema multiforme (Crowson and Magro 2001). In the present case the clinical signs, the results of histopathology and immunohistochemistry exams suggested a diagnosis compatible with SLE.

SLE is an autoimmune multisystem disease of pro-tein manifestations with non-specific clinical signs. The guidelines of the American College of Rheumatology are valuable in establishing the diagnosis (Tan et al 1982). Based on this protocol, Berent and Cerundolo (2005) proposed SLE diagnosis based on the presence of certain signs classified as major and minor signs. The classifica-tion of signs from major (e.g. skin lesion, polyarthritis,

217

SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS, PERIANAL FURUNCULOSIS, AUTOIMMUNE DISEASES

Figure 2. a) Immunoreactivity for C3 complement in dermoepidermal junction in skin with erosion. b) Dermic IgM deposits in unin-volved skin. c) Immunohistochemical control in damaged skin incubated with mouse non immune IgG. d) Moderate thickening of the basement membrane (arrows) in uninvolved skin, PAS reaction. (a-d, counterstained with hematoxylin; bar: a-c, 100 µm; d, 60 µm). a) Se observa inmunorreacción para fracción del complemento C3 presente en unión dermoepidérmica de piel lesionada. b) Inmunorreac-ción de IgM en piel no lesionada. c) Control realizado con IgG de ratón en piel lesionada. d) Tinción PAS demuestra moderado engrosamiento de la membrana basal (flechas) en piel no lesionada. (a-d, contratinción realizada con hematoxilina; barra: a-c, 100 µm; d, 60 µm).

Figure 1. Interdigital (a) and perianal (b) lesions demonstrating alopecia, erythema and skin erosions. Hematoxylin eosin stain showed a dermoepidermal separation in lesional skin (c). Vacuolization of epidermal basal cells, abundant dermal histiocytic and lymphoplas-macytic infiltrate (d) Bar 60 µm. Lesiones alopécicas y eritema sobre la piel de las zonas interdigital (a) y perianal (b). Tinción de hematoxilina eosina muestra a la separa-ción de la unión dermoepidermal en piel afectada por lesiones (c). Vacuolización de las células basales de la epidermis, la dermis presenta abundante infiltrado histiocítico y linfoplasmocítico (d). Bar 60 µm.

218

J OJEDA ET AL

hemolytic anemia, glomerulonephritis, polymyositis, leu-copenia, thrombocytopenia) to minor (e.g. fever of unknown origin, CNS signs, oral ulceration, lymphadenopathy) are good guides to establish a diagnosis. This classification is useful, and when applied in conjunction with serologi-cal and immunohistochemical tests, can lead to a more accurate diagnosis (Patterson and Campbell 2005, Smee et al 2007). Skin damage is classified among the major signs and they mean about 15% of the lesions under the suspicion of SLE (Smee et al 2007). Thus, signs observed in the present case such as anemia, polyarthritis and skin lesions at interdigital and perianal zones are classified as major signs of SLE.

In the present study we used immunoperoxidase tech-niques to demonstrate the presence of IgM and C3 at the epidermodermal junction in involved skin (Choi et al 2004) and IgA in uninvolved skin. The lupus band test showing IgM or IgA deposits at the basal membrane has been par-ticularly important for the diagnosis of lupus erythematosus in humans. In addition, experimental models of systemic lupus erythematosus have demonstrated the presence of IgM and C3 at the dermoepidermal junction in damaged and non-damaged skin (Choi et al 2004). However, the im-munoglulin deposition does not necessarily correlate with cutaneous lesions their prevalence in SLE is high. A wide array of autoantibodies are produced in SLE, therefore, searching particularly for antinuclear antibodies (ANA) is an important diagnostic tool. Since other major signs of SLE had been documented (i.e. polyarthritis, immuno-mediated anemia) in this reported case, the use of ANA would not have been as essential to support a diagnosis of SLE. In this case, the lack of a positive ANA and/ or the major signs of SLE (in addition to the skin lesions) make the final diagnosis of SLE impossible. Thus only a probable diagnosis of SLE can be made. Some authors emphasize that the test for ANA is effective only when there are at least 2 major signs (Smee et al 2007) because the presence of ANA may be associated with SLE-related diseases (Hansson-Hamlin et al 2006). The relevance of the ANA test for SLE in dogs has often been questioned due to the presence of these antibodies in several bacterial, protozoan and tick-borne pathogens (Gershwin 2007). Histopathological evidence, antibody deposits for IgM, IgA and C3 and PAS analysis of epidermodermal junction help to support the final clinical diagnosis as an SLE case (Zipfel et al 1992, Jones 1993, Gerhauser et al 2006).

Dogs with articular, muscle inflammation and cutane-ous lupus manifestations improve after immunesupression treatment and may have a long term remission of clinical signs. Standard treatment for SLE with prednisone has been adequate to reach remission in the first week of treat-ment (Scott et al 2003). Nevertheless, many dogs do not improve with prednisone treatment and ciclosfosfamide or azathioprine may be needed. Azathioprine combined

with prednisone is a safe and potentially effective regimen treatment of SLE (Berent and Cerundolo 2005, Medlea and Hnilica 2006).

Discoid lupus erythematosus could be associated to a clinical history of anal furunculosis or perianal dermatitis (Gerhauser et al 2006). However, hematological findings, interdigital wounds, carpal arthritis and tarsal arthritis discard this differential diagnosis.

Some authors have proposed a similarity between canine anal furunculosis and Crohn’s disease. In humans, this ill-ness is the result of an imbalance of the immune response in the intestines in genetically susceptible individuals (Ahmad 2002, Newman and Siminovitch 2005). Since German shepherd dogs with anal furunculosis also have clinical and histological evidence of colitis (i.e. inflam-matory bowel disease), it has been suggested that enteral antigens could be a trigger forcanine anal furunculosis as well (Patterson and Campbell 2005). It has been speculated that immune complexes can damage perianal mucosa and subsequently induce furunculosis in SLE.

In conclusion, this was a case of chronic, erosive, and painful interdigital and perianal lesions with clinical characteristics of perianal fistula, developed in a German shepherd dog, and the histopathological and immunohis-tochemistry features were compatible with a diagnosis of SLE. Perianal lesions observed in this case represent an uncommon pattern of SLE. A complete study, including testing for circulanting antibodies in perianal dermatitis, can be useful in leading to an accurate diagnosis and treat-ment when there is suspicion of SLE, in orden to avoid the onset of other signs.

SUMMARY

The clinical signs of systemic lupus erythematosus (SLE) are not specific. The classification of signs according to their diagnostic importance from major to minor signs has proved to be useful, and when employed together with serological and immunohistochemical tests can lead to an accurrate diagnosis. Skin lesions are classified among the major signs corresponding to about 15% of lesions under the suspicion of SLE in dogs. A 5-year old German shepherd dog that was presented to clinical examination had developed perianal fistulas and infectious interdigital dermatitis. The dog was treated with antibiotics for 3 months and did not improve. Clinical signs included skin changes: alopecia, erythema, depigmentation, pain, ulceration and granulation tissue in the perianal zone and limbs, and articular changes: carpal and tarsal joint effusion and pain during the evaluation of forced flexion/extension. Histopathology from perianal and interdigital zones of affected skin revealed partial separation of epidermodermal junction and presence of cellular debris, moderate vacuolization of epidermal basal cells, and abundant dermal histiocytic and lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate and collections of eosinophils in blood vessels. The Peryodic acid Schiff (PAS) reaction showed basal membrane discontinuity in diseased skin and partial thickening in both affected and healthy skin. Both affected and healthy skin revealed immunoreactions of IgM, IgA and C3 but not of IgG at the epidermodermal junction. According to clinical, histopathology and immunohistochemistry evidence we suggest that the present report is a probable case of SLE.

219

SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS, PERIANAL FURUNCULOSIS, AUTOIMMUNE DISEASES

REFERENCES

Abbas A. 2005. Diseases of immunity. In: Kumar V, Abbas A, Fausto N (eds.) Pathologic Basis of Disease. 7th ed. Elsevier, Philadelphia, USA, Pp 227-235.

Ahmad T, A Armuzzi, M Bunce, K Mulcahy-Hawes, S Marshall, T Orchard, J Crawshaw, O Large, A de Silva, J Cook, M Barnardo, S Cullen, K Welsh, D Jewell. 2002. The molecular classification of the clinical manifestations of Crohn’s disease. Gastroenterology 122, 854-866.

Berent A, R Cerundolo. 2005. Systemic Lupus Erythematosus. Compend Contin Edu Pract Vet 11, 7-12.

Choi E, I Shin, H Youn, C Lee. 2004. Development of canine lupus erythematosus model. J Vet Med Serie A 51, 375-383.

Crowson A, C Magro. 2001. The cutaneous pathology of lupus erythe-matosus: a review. J Cutan Pathol 28, 1-23.

Doust R, L Griffiths, M Sullivan. 2003. Evaluation of once daily treat-ment with cyclosporine for anal furunculosis in dogs. Vet Rec 152, 225-229.

Fournel C, L Chabanne, C Caux, J Faure, D Rigal, J Magnol, J Monier. 1992. Canine systemic lupus erythematosus. I: A study of 75 cases. Lupus 1, 133-139.

Gerhauser I, A Strothmann-Lüerssen, W Baumgärtner. 2006. A Case of Interface Perianal Dermatitis in a Dog: Is This an Unusual Manifestation of Lupus Erythematosus? Vet Pathol 43, 761-764.

Gershwin L. 2007. Autoimmune diseases in domestic animals. Ann N Y Acad Sci 1109, 109-116.

Hannson-Hamlin H, I Lilliehöök, G Trowald-Wigh. 2006. Subgroups of canine antinuclear antibodies in relation to laboratory and clinical finding in immune-mediated disease. Vet Clin Pathol 35, 397-404.

Jones D. 1993. Canine Systemic Lupus Erythematosus. New insights and their implications. J Comp Pathol 108, 215-228.

Medlea L, K Hnilica. 2006. Autoimmune and immune- mediated skin disorders. Small Animal Dermatology: a color atlas and therapeutic guide. Elsevier, Philadelphia, USA, Pp 206-211.

Menke J, MY Hsu, KT Byrne, JA Lucas, WA Rabacal, BP Croker, XH Zong, ER Stanley, VR Kelley. 2008. Sunlight triggers cutaneous lupus through a CSF-1-dependent mechanism in MRL-Fas(lpr) mice. J Immunol 181, 7367-7379.

Newman B, K Siminovitch. 2005. Recent advances in the genetics of in-flammatory bowel disease. Curr opin Gastroenterol 21, 401-407.

Patterson A, L Campbell. 2005. Managing Anal Furunculosis in Dogs. Compend Contin Edu Pract Vet 27, 339-355.

Peña-Münzenmayer G, M Catalán, I Cornejo, CD Figueroa, JE Melvin, MI Niemeyer, LP Cid, FV Sepúlveda: 2005. Basolateral localization of native ClC-2 chloride channels in absorptive intestinal epithelial cells and basolateral sorting encoded by a CBS-2 domain di-leucine motif. J Cell Sci 118, 4243-4252.

Scott D, W Miller, C Griffin. 2003. Dermatología veterinaria. 6a ed. Intermédica, Buenos Aires, Argentina, Pp 741-749.

Smee N, K Harkin, M Wilkerson. 2007. Measurement of serum antinuclear antibody titer in dogs with and without systemic lupus erythematosus: 120 cases (1997-2005). J Am Vet Med Assoc 230, 1180-1183.

Tan E, A Cohen, J Fries, A Masi, D Mcshane, N Rothfield, J Schaller, N Talal, R Winchester. 1982. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 25, 1271-1277.

Teichner M, K Krumbacher, I Doxiadis, G Doxiadis, C Fournel, D Rigal, JC Monier, H Grosse-Wilde. 1990. Systemic lupus erythematosus in dogs: association to the major histocompatibility complex class I antigen DLA-A7. Clin Immunol Immunopathol 55, 255-262.

Thurman J, M Holers. 2006. The central role of the alternative comple-ment pathway in human disease. J Immunol 176, 1305-1310.

Zipfel W, M Hewicker-Trautwein, G Trautwein. 1992. Demonstration of immunoglobulins and complement in canine and feline autoimmune and non-autoimmune skin diseases with the direct immunofluorescence and indirect immunoperoxidase method. J Vet Med Serie A 39, 494-501.

221

Arch Med Vet 42, 221-227 (2010)

COMMUNICATION

Accepted: 14.07.2010.

* Rod Admar Gonzaga, 1346, 88040-900; Florianópolis, SC, Brasil; [email protected]

Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent challenge with Aeromonas hydrophila in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)

Hematología y título de aglutinación después de inmunización polivalente y desafío con Aeromonas hydrophila a tilapias del Nilo (oreochromis niloticus)

RL Bailonea, ML Martinsa*, JLP Mouriñoa,b, FN Vieiraa,b, FS Pedrottia,b, GC Nunesa, BC Silvaa,b

aLaboratório AQUOS - Sanidade de Organismos Aquáticos, Departamento de Aqüicultura Centro de Ciências Agrarias (CCA), Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.

bSetor de Microbiologia, Laboratório de Camarões Marinhos, Departamento de Aqüicultura, CCA, Universidade Federal de Santa Caterina, Florianópolis, SC, Brasil.

RESUMEN

Este trabajo evaluó el efecto de la vacuna polivalente sobre las respuestas hematológicas y inmunológicas de tilapias del Nilo desafiadas con Aeromonas hydrophila. Dos dosis, 1 x 104 y 1 x 108 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL, de vacuna conteniendo proporciones iguales de Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus durans inactivadas con formalina, fueron testeadas por inyección intraperitoneal (i.p.). Los peces fueron desafiados 10 días después de la vacunación i.p. con la dosis (DL50-96h) de 1 x 107 UFC de A. hydrophila/mL resuspendida en solución salina estéril. Por lo tanto, para analizar los parámetros hematológicos, la actividad antimicrobiana y aglutinante del suero de las muestras, fueron colectadas 48 h después del desafío. Antes de la infección experimental, el número de eritrocitos fue superior en los peces vacunados con 1 x 108 UFC/mL. Sin embargo, después del desafío, el número total de trombocitos fue mayor en los peces vacunados con la mayor dosis. Antes y después del desafío, el número total de leucocitos y el número de linfocitos presentaron mayores valores en los peces vacunados. El número de monocitos en los peces vacunados y en los inyectados con solución salina fue mayor antes del desafío. El mayor título de aglutinación frente A. hydrophila, P. aeruginosa y E. durans fue observado en los peces vacunados con 1 x 108 UFC/mL. Antes del desafío la actividad antimicrobiana del suero sanguíneo fue mayor en los peces no vacunados y en los vacunados con 1 x 108 UFC/mL, y mismo después del desafío los peces no vacunados y los inyectados con solución salina presentaron mayor actividad antimicrobiana. En este trabajo fue posible comprobar que después de 10 días la vacuna polivalente en la concentración de 1 x 108 UFC/mL estimuló la producción de eritrocitos, leucocitos, trombocitos y linfocitos circulantes reduciendo los niveles de glucosa.

Key words: oreochromis niloticus, vaccination, Aeromonas hydrophila, challenge.Palabras clave: oreochromis niloticus, vacunación, Aeromonas hydrophila, desafío.

INTRODUCTION

The rapid development of aquaculture allied to intensive production systems favour stress conditions in captive fish, leading to diseases and economic losses (Schreck 1996). One of the most important challenges in aquaculture is the enhancement of performance and disease resistance in reared fish. In this sense bacterial diseases are one of the limitant factors (Abdel-Tawwab et al 2008, Martins et al 2009a). Bacteria are part of microrganisms present in the water of rivers and ponds, and its pathogenic potential may be altered under physical and chemical characteristics of the environment (Walters and Plumb 1980). Gram nega-tive, worldwide and opportunist bacterium Aeromonas hydrophila, may cause disease in a several freshwater

fish species for example in cyprinid as related by Rahman et al (1997).

Antibiotics are frequently utilized in aquaculture to increase larval resistance but this practice can also result in microbial resistance, residual accumulation in tissue (Vadstein 1997) and fish immunesuppression (Van Muiswinkel et al 1985). The immuneprophylaxis as the specific and non-specific immune system stimulation is the key for sustainable aquaculture development (Gudding et al 1999). Vaccination with inactivated antigens as well as the probiotic addition in the diet of cultured fish may contribute to reduction of chemicals and antibiotics in aquaculture (Gudmundsdóttir and Björnsdóttir 2007, Jatobá et al 2008).

In Brazil, studies on fish immunology are scarce. The administration of vaccines against bacterial and viral diseases has demonstrated good results in relation to scientific and economic approaches by reducing the chemical use (Costa 2004). Several factors can interfere on fish immune response such as developmental stage, size, nutritional status, water

222

RL BAILONE Y COL

quality and vitamin supplementation (Tatner and Manning, 1983, Bly et al 1997, Nakanishi and Ototake 1997, Moraes and Martins 2004, Martins et al 2008a). On the other hand, the efficacy of the vaccine is strongly influenced by the type of administration, dose and nature of antigens, adjuvant addition, environment and water temperature (Tatner 1987, Lillehaug et al 1993, Bly et al 1997). Thus, information on the infectious agent and the host response must be considered for the development of an efficient vaccine (Gudmundsdóttir and Björnsdóttir 2007).

The resistance of fish can be evaluated by analyzing the survival rate after experimental infection (Wasson and Kelly 1990) as well as hematological and immunological parameters (Martins et al 2009a). A combined vaccine against Streptococcus iniae administrated intraperitoneally in tilapia has demonstrated more protection compared to a single isolate (Klesius et al 2000). The authors argued that antigen heterogenicity in Streptococcus exists and a combined vaccine may enhance fish response.

Park and Jeong (1996) reported improved resistance in tilapia injected with protein-bound polysaccharide (PS-K) against Edwardsiella tarda. Sarder et al (2001), found that lysozyme and phagocytic activities in tilapia were higher after challenge with A. hydrophila, but no difference was noted in the differential counting of leukocytes. On the other hand, Castro et al (2008) observed good results in turbot Scophthalmus maximus vaccinated against E. tarda characterized by the highest survival rate and antibody levels for at least six months after immunization.

According to Balfry et al (1997) lymphocyte number decreased after challenge with Vibrio parahaemolyticus but no difference in thrombocyte, neutrophill and mono-cyte was found. The study of Harikrishnan et al (2003) in carp infected by A. hydrophila showed an increase in the leukocyte number. But the opposite was foud in pacu Piaractus mesopotamicus experimentally infected with A. hydrophila (Garcia et al 2007). Martins et al (2008b) have reported that Enterococcus-injected tilapia showed not only a high number of thrombocytes, but also an increase in white blood cell and lymphocyte when compared to non-injected. Phagocytyc activity and circulating lymphocyte number were also enhanced after Enterococcus injection (Martins et al 2009a).

This study evaluated the effects of polyvalent vaccination containing A. hydrophila, Pseudomonas aeruginosa and E. durans, on the hematological and serum agglutination responses in Nile tilapia challenged with A. hydrophila.


The experiment was carried out at the Aquaculture Department, Laboratory AQUOS-Aquatic Organisms Health, CCA, UFSC, Florianopolis, Santa Catarina State, with GIFT tilapia from “Fundação 25 de Julho”, Joinville, SC, Southern Brazil.

The strains of A. hydrophila ATCC 7966, Enterococcus durans ATCC 19492, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia coli ATCC 25922 used in this assay were donated by Institute André Tossello (Campinas, São Paulo State), and cultured at the Microbiology Laboratory of Marine Shrimp Laboratory, UFSC, Florianópolis, SC.

LETHAL DOSE (LD50-96H) TO AERoMoNAS HYDRoPHILA

Fish with 196.97 ± 25.00 g weight and 18.53 ± 1.20 cm length were distributed in 150 L tanks with constant aeration and water renewal 30% a day, and fed ad libitum with a commercial diet 28% crude protein twice a day. After acclimation for 5 days, fish were intraperitoneally (i.p.) injected with 0; 1 x 105; 1 x 106; 1 x 107 and 1 x 108 Forming Colony Units (FCU)/mL per fish diluted in 1 mL esterile saline solution, in triplicates with 5 fish in each repetition. The water quality was daily monitored as follows: dissolved oxygen 5.54 ± 0.44 mgL; tempera-ture 24.93 ± 2.49 ºC; pH 7.29 ± 0.30; total ammonia 0.45 ± 0.48 mg/L.

After 96 h of mortality observation, DL50-96h was estimated for A. hydrophila by the method Trimmed Spearman-Karber (Hamilton et al 1977). Bacterial concen-tration that provoked 50% mortality in 96 h was utilized to challenge the fish. Furthermore, as an experimental vaccination, a previously reported lower dose (Martins et al 2008b) and a time collection that caused no severe mortality were used.

VACCINATION AND CHALLENGE

Bacterial strains of A. hydrophila, P. aeruginosa and E. durans were reproduced in separate tubes of 10 mL containing BHI broth (Brain and Heart Infusion, Difco), incubated at 30 ºC for 24 h under continuous agitation. After verifying the bacterial population, equal portions of bacteria were added to formalin 0.5%, being incubated again under agitation at 30 ºC for 24 h. Bacterial cultures were centrifuged at 4,000 g for 30 min, the supernatant with formalin was discarded and the pellet re-suspended in sterile saline solution. The vaccine was determined to be sterile by lack of growth in TSA (Tryptic Soy Agar, Difco) medium culture at 30 ºC for 24 h.

Fish with 255.52 ± 21.16 g weight and 21.28 ± 1.93 cm length were distributed in 150 L tanks with constant aeration and water renewal 30% a day. Fish were accli-mated for 10 days and fed ad libitum with a commercial diet 28% crude protein twice a day. Water quality was daily monitored as follows: dissolved oxygen 5.43 ± 0.48 mg/L; temperature 26.09 ± 3.13 ºC; pH 7.02 ± 0.32 and total ammonia 0.90 ± 0.67 mg/L.

The experiment was entirely randomized with i.p. vac-cinated fish with 1 x 104 and 1 x 108 FCU/mL polyvalent vaccine formalin-inactivated; control saline-injected fish and non-injected ones, 10 fish per treatment, in triplicates.

223

oREoCHRoMIS NILoTICUS, VACCINATION, AERoMoNAS HYDRoPHILA, CHALLENGE

Before inoculation and for blood collection fish were anethestized with a benzocaine solution (50 mg/L) (Ethic Committee n° 23080.024659/2007-99 CEUA/UFSC). Fish were maintained in starvation for 24 h before challenge by i.p. 1 mL of DL50-96h A. hydrophila (1 x 107 UFC/mL). This trial was carried out 10 days after immunization.

HEMATOLOGY AND GLUCOSE

Blood samples were collected before and 48 h after challenge with A. hydrophila. After fish anesthetizes, the blood was withdrawn from the caudal vein using a 3 mL (21G) syringe with 10% EDTA and a syringe without anticoagulant. Blood collected without anticoagulant was left to clot for 2 h at 25 ºC, and then centrifuged at 1,400 g for 10 minutes. Serum aliquot was taken with assist of a micropipette and stored at -20 ºC until analysis. Serum of 3 fish from the same experimental aquarium was pooled for immunological analyses. The blood col-lected with anticoagulant was used to produce duplicates of blood ex tensions stained with Giemsa/MayGrunwald (Rosenfeld 1947), for differential counting of leukocytes and total counting of thrombocytes and leukocytes. One aliquot was used to determine hematocrit (Goldenfarb et al 1971) and the rest was stored in glass flasks on ice to quantify the total number of erythrocytes in a hemo-cytometer. Total number of thrombocytes and leukocytes were counted in blood extension by the indirect method described by Ishikawa et al (2008). One aliquot of serum was used to determine glycemic index in spectrophotometer (Biotécnica® kit) at 505 nm.

In the first collection (ten days after immunization), three fish per each treatment were used for blood collection and euthanized. For the second collection (48 h after challenge) the other seven fish were utilized finally used.

AGGLUTINATION TITER

The test for agglutination titer was realized individu-ally for each bacterium strain (A.hydrophila, E. durans and P. aeruoginosa) according to Yildirim et al (2003). The concentration of inactivated cells used in the test was of 0.8 in 550 nm wave length (DO550nm). Briefly, each well of a 96-round well microplate was plated with 50 μL of phosphate-buffered saline (PBS 0.2M monobasic phosphate, 0.2M dibasic phosphate, 0.11M sodium chloride, pH 7.4) and then 50 μL of serum was added to the first well, and diluted serum was serially diluted into the remaining wells. After that, 50 μL of each bacterium strain was added to each well and incubated in humidified air at 25 ºC for 18 h. The agglutination was measured as the amount of a required substance to react with a given amount of other substance, that was considered as reciprocal of the last dilution that presented agglutination.


Data were analized using the Bartlett test and hemato-logical parameters with no homogenicity in variance were transformed in log (x + 1) prior to analysis of variance with parcels subdivided in time (α < 0.05). Differences in means were detected by the Student Newman Keuls test (SNK), and agglutination titer data was log2 (x + 1) transformed prior to analysis.


LETHAL DOSE

The first mortalities occurred 11 h after challenge in all experimental units of the dose 1 x 108 UFC/mL (table 1). Except for saline-injected fish, all dead animals showed typical symptoms such as reddish on ventral body surface, scaleness, fin and integument hemorrhages with exposi-tion of muscular tissue. After 23 h the first mortality was detected in fish that received the dose 1 x 107 UFC/mL. Park and Jeong (1996) found mortality in tilapia 48 h after infection with E. tarda. Our results were similar to the findings of Sarder et al (2001) who observed tilapia mortality 12 h after infection with A. hydrophila. Balfry et al (1997) reported 28.9% mortality in black strain tilapia 24 h after challenge with V. parahaemolyticus. The mortality in saline-injected fish (6.66%) has probably been caused by injection handling stress corroborating the findings of Sarder et al (2001). The stress due to saline injection was related in the studies of Martins et al (2006) in pacu (Piaractus mesopotamicus).

Except for the increased mortality rate in fish that re-ceived 1 x 105 CFU/mL in relation to those that received 1 x 106 CFU/mL, the mortality was proportional to the concentration of pathogen inoculums. Fish inoculated with 1 x 107 CFU/mL showed 50% mortality (DL50-96h A. hydrophila). Contrarily to here observed, Wang and Wang

Table 1. Mortality rate in Nile tilapia 96 h after intraperitoneal injection of saline solution and crescent dosis of Aeromonas hydrophila/mL, to determine the DL50-96h. Tasas de mortalidad en tilapia del Nilo después de 96 h de la inyección intraperitoneal inyección de solución salina y la creciente dosis de Aeromonas hydrophila/mL, para la determinación de la DL50-96h.

Colony forming units of Aeromonas hydrophila/mL

Mortality (%)

Saline solution 6.66

1 x 105 39.96

1 x 106 26.64

1 x 107 53.28

1 x 108 79.92

224

RL BAILONE Y COL

(1997) found that injection with 1 x 107 CFU A. hydrophila/mL in tilapia and carp caused 100% mortality (DL100). It depends on several factors as environmental conditions and bacterial strain.

HEMATOLOGY AND GLUCOSE

As a result of stress, normal hematological parameters could be changed in infected fish (Martins et al 2008b). In this study, after challenge with A. hydrophila, the number of thrombocytes in the circulating blood of 1 x 108 vac-

cinated tilapia was higher than the number observed in non-vaccinated ones (table 2).

The results showed an increase in the number of total leukocyte and lymphocyte in 1 x 108 vaccinated fish in relation to other treatments either after immunization or challenge (table 3). In the studies of Harikrishnan et al (2003) in carp (Cyprinus carpio) infected i.p. with A. hydrophila, the number of leukocyte increased until 30 days after infection. In contrast to that observed by Harikrishnan et al (2003), in this work erythrocyte number and hematocrit did not alter after challenge. On

Table 2. Blood characteristics in the blood of Nile tilapia, before (6 days after immunization) and 48 h after challenge with Aeromonas hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 104 and 1 x 108 CFU of polyvalent vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection by SNK test of mean comparison (P < 0.05). Características de la sangre de tilapia del Nilo, antes (6 días después de la inmunización) y 48 h después de infectarlas con Aeromonas hydro-phila. Peces no infectados, e inyectados con 1 mL solución salina y peces vacunados con 1 x 104 y 1 x 108 CFU con la vacuna polivalente/mL. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test de comparación de medias SNK (P < 0.05).

Collection Treatment Glucose(mg/dL)

Hematocrit (%)

Erythrocyte (106/µL)

Thrombocyte (103/µL)

Leukocyte(103/µL)

Before challenge

Non-vaccinated 85.62 ± 45.88a 18.83 ± 4.19a 1.02 ± 0.30b 35.20 ± 5.41a 18.19 ± 1.50b

Saline 75.56 ± 55.00a 24.78 ± 2.80a 1.25 ± 0.14ab 46.66 ± 12.68a 21.80 ± 5.65b

1 x 104 21.91 ± 21.77b 26.83 ± 2.80a 1.34 ± 0.28ab 46.66 ± 6.49a 26.35 ± 5.20b

1 x 108 42.81 ± 18.69b 23.33 ± 4.93a 1.70 ± 0.22a 49.41 ± 10.41a 34.72 ± 10.09a

After challenge

Non-vaccinated 90.79 ± 38.75a 22.19 ± 2.82a 1.16 ± 0.07a 18.13 ± 10.77b 17.46 ± 9.58b

Saline 58.48 ± 44.25a 22.25 ± 3.26a 1.12 ± 0.08a 27.39 ± 5.21ab 19.12 ± 1.12b

1 x 104 34.17 ± 25.79b 22.33 ± 2.04a 1.17 ± 0.28a 30.44 ± 8.84ab 26.42 ± 3.28b

1 x 108 21.05 ± 17.24b 21.86 ± 1.91a 1.19 ± 0.12a 42.46 ± 4.21a 37.66 ± 4.21a

Table 3. Differential counting of leukocytes in the blood of Nile tilapia, before challenge (6 days after immunization) and 48 h after challenge with Aeromonas hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 104 and 1 x 108 CFU of polyvalent vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection by SNK test of mean comparison (P < 0.05). El conteo diferencial de leucocitos en la sangre de tilapia del Nilo, antes del desafío (6 días después de la inmunización) y 48 h después del desafío con Aeromonas hydrophila. Peces no vacunados, peces inyectados con 1 mL de solución salina y peces vacunados con 1 x 104 y 1 x 108 UFC de vacuna polivalente/mL. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test de comparación de medias SNK (P < 0.05).

Collection Treatment Basophill(103/µL)

Neutrophill(103/µL)

Lymphocyte(103/µL)

Monocyte(103/µL)

Before challenge

Non-vaccinated 0.58 ± 0.55a 7.83 ± 3.72a 9.51 ± 4.46b 0.27 ± 0.23b

Saline 0.26 ± 0.13a 11.08 ± 0.98a 9.55 ± 5.76b 0.91 ± 0.06a

1 x 104 0.33 ± 0.13a 9.50 ± 1.40a 14.21 ± 3.17b 1.66 ± 0.88a

1 x 108 0.47 ± 0.20a 8.51 ± 6.02a 22.63 ± 1.02a 0.98 ± 0.35a

After challenge

Non-vaccinated 0.27 ± 0.39a 6.92 ± 4.38a 10.11 ± 5.16b 0.08 ± 0.07a

Saline 0.05 ± 0.08a 10.62 ± 1.88a 8.44 ± 2.93b 0.00 ± 0.00a

1 x 104 0.00 ± 0.00a 9.36 ± 6.39a 10.89 ± 4.39b 0.19 ± 0.25a

1 x 108 0.17 ± 0.16a 9.99 ± 8.78a 20.28 ± 2.70a 1.08 ± 1.07a

225


the other hand, reduced glucose concentration either before or after challenge corroborated the findings of Harikrishnan et al (2003).

Reduced number of erythrocytes and hemoglobin concentration was reported in cichlid (Etroplus suratensis) infected by ulcerative epizootic syndrome (Pathiratne and Rajapakshe 1998). Although no difference was observed in erythrocyte number of A. hydrophila infected fish, our results showed an increase after immunization when compared to unvaccinated fish.

According to Haney et al (1992), a decrease in the eryth-rocyte number and hemoglobin concentration may be caused by bacterial agent. A decrease in the number of erythrocyte and hematocrit percentage suggests that erythrocyte has been destructed by leukocytic activity. On the other hand, increased hematocrit is a result of oxygen depletion (Kirk 1974). In the present study, the infection and/or vaccine did not cause alteration in hematocrit percentage.

Similarly to the present results, an increase in the number of thrombocyte, lymphocyte and hematocrit percentage was also found in tilapia after challenge with Enterococcus sp. (Martins et al 2008b). In contrast to the observations in this assay, Martins et al (2008b) did not relate influence of infection on glucose levels and erythrocyte number. They argued that this event occurred due to either insufficient inoculums to provoke these blood alterations or hematopoiesis. Contrarily to our results, Lamas et al (1994) and Balfry et al (1997) found a reduced number of lymphocytes in the blood of rainbow trout and tilapia, infected with V. anguillarum and V. parahaemolyticus, respectively. Our results with 1 x 108 bacteria-injected fish can be explained by the

fact that lymphocytes have migrated to injured site, as found by Martins et al (2009b).

After immunization the number of monocytes was sig-nificantly lower (P < 0.05) in non-vaccinated fish (table 3). Monocytes have phagocytic activity and differentiate in macrophages in order to migrate to an inflammatory site like a defense response (Griffin 1984, Martins et al 2009a). This is especially true by the fact that vaccinated and saline-injected fish showed an increase in these cells confirming their action on the fish defense system.

Glucose concentration can increase in short periods in order to supply the energetic demand in stress situ-ations as commented by Barton (2000). In this assay glucose levels did not alter before and after challenge in non-vaccinated and saline-injected fish. In 1 x 104 and 1 x 108 vaccinated fish glucose decreased after challenge (table 2). On the other hand, in infected carp treated with herbal extract an increase in the glucose concentration was observed 30 days after infection (Harikrishnan et al 2003). Our results confirmed the comments of Barton (2000). In fact, after both immunization and challenge, the fish was trying to supply the energetic demand in this situation of bacterial stress.

AGGLUTINATION TITER

After immunization and challenge fish vaccinated with 1 x 108 CFU inactivated bacteria/mL stimulated the ag-glutination titer against A. hydrophila, P. aeruginosa and E. durans (table 4). An increase in the agglutination titer in fish after immunization was reported by other authors. In the Studies on Seriola quinqueradiata vaccination

Table 4. Agglutination titer (log2 (x +1)) in the serum of Nile tilapia, before challenge (6 days after immunization) and 48 h after challenge with Aeromonas hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 104 and 1 x 108 CFU of polyvalent vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection by SNK test of mean comparison (P < 0.05). Título de aglutinación (log2 (x +1)) en el suero de tilapia del Nilo, antes del desafío (6 días después de la inmunización) y 48 h después del desafío con Aeromonas hydrophila. Peces no vacunados, peces inyectados con 1 mL de solución salina y peces vacunados con 1 x 104 y 1 x 108 UFC de vacuna polivalente/mL. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test de comparación de medias SNK (P < 0.05).

Collection TreatmentAgglutination titer

Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Enterococcus durans

Beforechallenge

Non-vaccinated 2.64 ± 0.92b 0.00 ± 0.0b 3.51 ± 1.39b

Salina 2.89 ± 0.49b 0.00 ± 0.0b 3.57 ± 1.79b

1 x 104 3.17 ± 0.55b 0.00 ± 0.0b 5.05 ± 0.97b

1 x 108 8.34 ± 0.58a 5.38 ± 1.12a 7.01 ± 0.99a

Afterchallenge

Non-vaccinated 2.08 ± 0.43c 0.53 ± 0.92b 4.73 ± 0.55b

Salina 3.23 ± 1.57bc 0.77 ± 1.34b 4.09 ± 0.00b

1 x 104 4.73 ± 0.55b 1.83 ± 0.43b 4.41 ± 0.55b

1 x 108 11.33 ± 0.58a 6.04 ± 0.57a 6.68 ± 0.57a

226

RL BAILONE Y COL

against Photobacterium damsela piscicida, Gravningen et al (2008) detected increased antibody levels three and four weeks after immunization.

Similar to our results, higher antibody levels for two weeks were reported in tilapia vaccinated intraperitoneally with A. hydrophila (Ruangpan et al 1986). On the other hand, Swain et al (2007) have related the efficacy of poli or monovalent vaccine in cyprinid fish (Labeo rohita) with the maximum values of agglutination titer after 4 weeks. In this assay, the highest agglutination titer was found after injection with 1 x 108 CFU bacteria/mL.

In conclusion, polyvalent vaccine at a concentration 1 x 108 CFU/mL stimulated the erythrocyte production, total leukocyte counting, monocyte and lymphocyte number, important cells involved on the specific and nonspecific immunological process.

Fish vaccinated with the highest dose also stimulated the thrombocyte and leukocyte production after challenge. An increase in the agglutination titer against A. hydrophila, P. aeruginosa and E. durans was found either after im-munization or challenge with A. hydrophila. However, further studies must be developed to solve the defense mechanisms in the Brazilian cultured fish to enhance the vaccine efficacy. Moreover, studies should be carried out to evaluate the cumulative mortality in fish treated with different vaccine doses regarding to field application and the duration of vaccine efficacy.

SUMMARY

This study evaluated the effects of polyvalent vaccination on the hematological and serum agglutination responses in Nile tilapia challenged with Aeromonas hydrophila. Two dosis, 1 x 104 and 1 x 108) Colony Forming Units (CFU)/mL, of vaccine containing the same amount of Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus durans formalin-inactivated were tested by intraperitoneal (i.p) injection. Fish were challenged ten days after vaccination i.p. with a DL50-96h of 1 x 107 CFU A. hydrophila/mL. Samples were collected 48 h after challenging fish to check the hematological parameters, antimicrobial activity and agglutination titer of serum, samples were collected 48 h after challenge. Before challenge, the number of erythrocytes was higher in fish vaccinated with 1 x 108 CFU/mL. After challenge, total number of thrombocytes was higher in fish that received the greatest dose of vaccine. Before and after challenge, total number of leukocytes and the number of lymphocytes showed the highest values in vaccinated fish. Before challenge, increased number of monocytes in vaccinated and saline-injected fish was observed. The highest agglutination titer against A. hydrophila, P. aeruginosa and E. durans was related in 1 x 108 CFU/mL vaccinated fish. Before challenge, high values of antimicrobial activity in non-vaccinated fish and 1 x 108 CFU/mL vaccinated ones was also related. Therefore, after challenge, non-vaccinated fish and saline-injected ones showed the highest antimicrobial activity. This study showed that 10 days after immunization with a polyvalent vaccine at a concentration 1 x 108 CFU/mL, there was an increase on erythrocytes, leukocytes, thrombocytes and circulating lymphocytes production, while the glucose levels were reduced.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) for financial support (CNPq 472968/2007-6) and grant to M.L. Martins (CNPq 301072/2007-8).

REFERENCES

Abdel-Tawwab M, AM Abdel-Rahman, NEM Ismael. 2008. Evaluation of commercial live bakers yeast, Saccharomyces cerevisiae as a growth and immunity promoter for Fry Nile tilapia, oreochromis niloticus (L.) challenged in situ with Aeromonas hydrophila. Aquaculture 280, 185-189.

Balfry SK, M Shariff, GK Iwama. 1997. Strain differences in non-specific immunity of tilapia oreochromis niloticus following challenge with Vibrio parahaemolyticus. Dis Aquat org 30, 77-80.

Barton BA. 2000. Salmonid fishes differ in their cortisol and glucose responses to handling and transport stress. North Am J Aquac 62, 12-18.

Bly JE, SMA Quiniou, LW Clem. 1997. Environmental effects in fish immune mechanisms. Dev Biol Stand 90, 33-43.

Castro N, AE Toranzo, S Nuñes, B Magariños. 2008. Development of an effective Edwardsiella tarda vaccine for cultured turbot (Scophthalmus maximus). Fish and Shellfish Immunol 25, 208-212.

Costa AB. 2004. Estratégias para o estudo de bactérias potencialmente patogênicas na piscicultura. In: Cyrino JEP, Urbinati EC, Fracalossi DM, Castagnolli N (eds). Tópicos especiais em piscicultura de água doce tropical intensiva, 1. ed. São Paulo: TecArt, cap. 13, Pp 387-404.

Garcia F, F Pilarski, EM Onaka, FR Moraes, ML Martins. 2007. Hematology of Piaractus mesopotamicus fed diets supplemented with vitamins C and E, challenged by Aeromonas hydrophila. Aquaculture 271, 39-46.

Goldenfarb PB, FP Bowyer, E Hall, E Brosious. 1971. Reproductibility in the hematology laboratory: the microhematocrit determination. Am J Clin Pathol 56, 35-39.

Gravningen K, M Sakai, C Mishiba, T Fujimoto. 2008. The efficacy and safety of an oil-based vaccine against Photobacterium damsela subsp. piscicida in yellowtail (Seriola quinqueradiata): A field study. Fish and Shellfish Immunol 24, 523-529.

Griffin RB. 1984. Random and directed migration of trout (Salmo gaird-neri) leukocytes: activation by antibody, complement, and normal serum components. Dev Comp Immunol 8, 589-597.

Gudding R, A Lillehaug, O Evensen. 1999. Recent developments in fish vaccinology. Vet Immunol Immunopathol 72, 203-212.

Gudmundsdottir BK, B Björnsdóttir. 2007. Review - Vaccination against atypical furunculosis and winter ulcer disease of fish. Vaccine 25, 5512-5523.

Hamilton MA, RC Russo, V Thurston. 1977. Trimmed Spearman-Karber method for estimating medial lethal concentrations in toxicology bioassays. Environm Sci Tech 7, 714-719.

Haney DC, DA Hursh, MC Mix, JR Winton. 1992. Physiological and hematological changes in chum salmon artificially infected with erythrocytic necrosis virus. J Aquat Anim Health 4, 48-57.

Harikrishnan R, MN Rani, C Balasundaram. 2003. Hematological and biochemical parameters in common carp, Cyprinus carpio, following herbal treatment for Aeromonas hydrophila infection. Aquaculture 221, 41-50.

Ishikawa NM, MJT Ranzani-Paiva, JV Lombardi. 2008. Metodologia para quantificação de leucócitos totais em peixe, oreochromis niloticus. Arch Vet Sci 13, 54-63.

Jatobá A, FN Vieira, CC Buglione Neto, BC Silva, JLP Mouriño, GT Jerônimo, G Dotta, ML Martins. 2008. Utilização de bactérias ácido-lácticas isoladas do trato intestinal de tilapia do Nilo como probiótico. Pesq Agropec Bras 43, 1201-1207.

Kirk WL. 1974. The effects of hypoxia on certain blood and tissue electrolytes of channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Trans Am Fish Soc 103, 593-600.

Klesius PH, CA Shoemaker, JJ Evans. 2000. Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (oreochromis niloticus). Aquaculture 188, 237-246.

227


Lamas J, Y Santos, DW Bruno, AE Toranzo, R Anadon. 1994. Non-specific cellular responses of rainbow trout to Vibrio anguillarum and its extracellular products (ECPs). J Fish Biol 45, 839-854.

Lillehaug A, A Ramstad, K Baekken, LJ Reitan. 1993. Protective im-munity in Atlantic salmon (Salmo salar L.) vaccinated at different water temperatures. Fish and Shellfish Immunol 3, 143-56.

Martins ML, FR Moraes, RY Fujimoto, EM Onaka, FR Bozzo, JRE Moraes. 2006. Carrageenin induced inflammation in Piaractus mesopotamicus (Osteichthyes: Characidae) cultured in Brazil. Bol Inst Pesca 32, 31-39.

Martins ML, DMY Miyazaki, FR Moraes, L Ghiraldelli, WB Adamante, JLP Mouriño. 2008a. Vitamin C and E supplemented diet influences the acute inflammatory response in Nile tilapia. Ciencia Rural 38, 213-218.

Martins ML, JLP Mouriño, GV Amaral, FN Vieira, G Dotta, AJM Bezerra, FS Pedrotti, GT Jerônimo, CC Buglione-Neto, G Pereira Jr. 2008b. Haematological changes in Nile tilapia experimentally infected with Enterococcus sp. Braz J Biol 68, 631-637.

Martins ML, FN Vieira, GT Jerônimo, JLP Mouriño, G Dotta, GM Speck, AMB Jatobá, FS Pedrotti, CC Buglione-Neto, G Pereira Jr. 2009a. Leukocyte response and phagocytic activity in Nile tilapia experimentally infected with Enterococcus sp. Fish Physiol Biochem 35, 219-222.

Martins ML, DMY Myiazaki, M Tavares-Dias, J Fenerick Jr, EM Onaka, FR Bozzo, RY Fujimoto, FR Moraes. 2009b. Characterization of the acute inflammatory response in the hybrid tambacu (Piaractus meso-potamicus malex Colossoma macropomum female) (Osteichthyes). Braz J Biol 69, 631-637.

Nakanishi T, M Ototake. 1997. Antigen uptake and immune responses after immersion vaccination. 1997. In: Gudding R, Lillehaug A, Midtlyng PJ, Brown F (eds). Dev Biol Stand, 90, 59-68.

Park KH, HD Jeong. 1996. Enhanced resistance against Edwardsiella tarda infection in tilapia (oreochromis niloticus) by administration of protein-boun polysaccharide. Aquaculture 143, 135-143.

Pathiratne A, W Rajapakshe. 1998. Hematological changes associated with epizootic ulcerative syndrome in the Asian cichlid fish Etroplus suratensis. Asian Fish Sci 11, 203-211.

Pickering AD. 1981. Stress and Fish. Academic Press, New York, USA, Pp 1-10.

Rahman MH, K Kawai, R Kusuda. 1997. Virulence of starved Aeromonas hydrophila to cyprinid fish. Fish Pathology 32, 163-168.

Rosenfeld G. 1947. Corante pancrômico para hematologia e citologia clínica. Nova combinação dos componentes do May-Grünwald e

do Giemsa num só corante de emprego rápido. Mem Inst Butantan 20, 329-334.

Ruangpan L, T Kitao, T Yoshida. 1986. Protective efficacy of Aeromonas hydrophila: vaccines in Nile tilapia. Vet Immunol Immunopathol 12, 345-350.

Sarder MRI, KD Thompson, DJ Penman, BJ McAndrew. 2001. Immune responses of Nile tilapia (oreochromis niloticus L.) clones: I. Non-specific responses. Dev Comp Immunol 25, 37-46.

Schreck CB. 1996. Immunomodulation: endogenous factors. In: Iwana G, Nakanishi T (eds). The fish immune system, organism, pathogen and environment. Academic Press, London, UK, Pp 311-337.

Swain P, A Behura, S Dash, SK Naya. 2007. Serum antibody response of Indian major carp, Labeo rohita to three species of pathogenic bacteria, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda and Pseudomonas fluorescens. Vet Immunol Immunopathol 117, 137-141.

Tatner MF, MJ Manning. 1983. The ontogeny of cellular immunity in the rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, in relation to the stage of development of the lymphoid organs. Dev Comp Immunol 7, 69-75.

Tatner MF. 1987. The quantitative relationship between vaccine dilution, length of immersion time and antigen uptake, using a radiolabelled Aeromonas salmonicida bath in direct immersion experiments with rainbow trout, Salmo gairdneri. Aquaculture 62, 173-185.

Van Muiswinkel WB, DP Anderson, CHJ Lamers, E Egberts, JJA Van Loon, JP Ijssel. 1985. Fish immunology and fish health. In: Manning MJ, Tatner MF (eds). Fish Immunology. Academic Press, London, UK, Pp 1-8.

Walters GR, JA Plumb. 1980. Enviromental stress and bacterial infec-tion in channel catfish, Ictalurus punctatus Rafinesque. J Fish Biol 17, 177-185.

Wang WS, DH Wang. 1997. Enhancement of the resistance of tilapia and grass carp to experimental Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda infections by several polysaccharides. Comp lmmunol Microbiol Infec Dis 20, 261-270.

Wassom DL, EAB Kelly. 1990. The role of the major histo-compatibility complex in resistance to parasite infections. Crit Review Immunol 10, 31-52.

Yildirim M, C Lim, P Wan, PH Klesius. 2003. Growth performance and immune response of channel catfish (Ictalurus punctatus) fed diets containing graded levels of gossypol-acetic acid. Aquaculture 219, 751-768.

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Fundada en 1969 ISSN 0301-732x

Revista seleccionada por los siguientes repertorios científicos internacionales: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publica, en español o inglés, contribuciones científicas originales en la forma de ar-tículos científicos, revisiones bibliográficas y comunicaciones cortas que pueden incluir observaciones clínicas, descripciones de técnicas o métodos, y avances en todos los aspectos de las ciencias veterinarias y bienestar animal.

ENVíO DE LA PUBLICACIóN

Los artículos deben ser enviados al Editor en forma electrónica a través de www.equipu.cl, e incluir:

• Unaversiónelectrónicadeltexto,cuadros(preferentementeen formato MS Word), figuras (en formato Excel, JPG o TIFF, 300 dpi) y una declaración de la responsabilidad de autoría, con la firma de todos los autores.

• Lostrabajosdebenseroriginalesy,porlotanto,nodebenestar en proceso de arbitraje en otra revista.

• Losartículosquesepresentensinconsiderarlasnormasdeestilo serán devueltos sin ser sometidos a revisión.

• Para experimentos conanimalesohumanos, elComité Editor podrá solicitar que se adjunte la autorización de un Comité de Bioética o instancia similar.

• SedeberáincluirunacartadirigidaalEditorsolicitandolapublicación de su trabajo y señalando a uno de los autores como responsable de la revisión de las pruebas de imprenta y de la correspondencia.

• Lapropiedadintelectualdelostrabajospublicadospertenecea los autores.

• LosrevisoresdeArchivos de Medicina Veterinaria asesoran al Comité Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado. Los autores podrán sugerir revisores. Todos los artículos enviados para publicación serán enviados a dos revisores seleccionados por el Comité Editor y pueden incluir, o no, los sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en los informes, se recurrirá a un tercero en carácter de árbitro-arbitrador, que asesorará al Comité Editor para decidir el destino del trabajo. Los revisores están obligados a mantener el carácter confidencial de toda la información de los trabajos, aun cuando no sean publicados.

• Previo a la publicación de un trabajo aceptado sedebe pagar un valor cuyo monto se señala en la Web www.veterinaria.uach.cl

FORMA Y PREPARACIóN DEL ARTíCULO

Tipos de artículos

Artículos de revisión: son realizados por expertos que re-sumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente se ajustan a un formato definido de presentación. Los autores deberían previamente consultar a los editores antes de iniciar el trabajo de revisión. El Comité Editor podrá solicitar a expertos el envío de artículos de revisión, los que también serán sometidos al proceso de arbitraje y edición. No deben exceder de 30 pági-nas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Sólo se aceptarán revisiones escritas en inglés.

Artículos científicos: éstos informan un nuevo avance en Ciencias Veterinarias basados en una investigación original. El formato de ellos deberá incluir summary, introducción, material y métodos, resultados, discusión, resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20 páginas, incluidos cuadros, figuras y referencias.

Comunicaciones cortas: informan de manera breve un avance, resultado de un experimento, observaciones clínicas o nueva metodología, ajustándose al siguiente formato: summary, introducción, material y métodos, resultados y discusión (sección conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 12 páginas, incluidos cuadros, figuras y referencias.

ESTILO Y FORMATO DE LA REVISTA

Presentación general: la revista publica artículos en español o inglés.

Los artículos deberán ser escritos con letras Times New Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio, en tamaño carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm en los cuatro bordes.

Todas las páginas deben ser numeradas de manera conse-cutiva en el ángulo superior derecho, y las líneas deberán ser numeradas en cada página, iniciándose con el número 1, junto al margen izquierdo, en todo el trabajo.

Los títulos de capítulos deben ser escritos en mayúscula, justificados al lado izquierdo, en líneas separadas y sin punto final. Ejemplo: MATERIAL Y MÉTODOS. En los subtítulos sólo la primera letra es mayúscula (Ejemplo: Diseño experi-mental) y deberá ser justificado al lado izquierdo. Subtítulo secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra cursiva. No deberán usarse subrayado ni numeración de sub-títulos o lista de ítems.

Las cifras deben ser escritas en números. Cuando están al inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera, deben ser expresadas en palabras. Un decimal deberá ser pre-cedido de un numeral usando punto cuando el artículo es en inglés o coma cuando el artículo es en español (Ejemplo: 0,5 no ,5). Múltiplos de mil deben escribirse separados por punto (Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad deberán ajustarse al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la práctica en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como “07 de septiembre de 1954” en el texto, pero pueden presentarse abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe expresar según las 24 horas cronológicas (Ejemplo: 13:00 h).

Para la nomenclatura química se deben utilizar las normas de la Sociedad de Bioquímica (Biochem J 209, 1-27, 1983), los fármacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres genéricos (en minúsculas), si es necesario colocar marcas y sus fuentes deberán ir a pie de página. Las enzimas deben ser identi-ficadas, cuando se mencionan por primera vez, según la Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Los términos en latín y sus abreviaciones que son de uso común en la literatura científica, tales como: in vitro, in vivo, ad libitum deberán ir en cursiva. Los valores de probabilidad deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Des-viación estándar, error estándar de la media e intervalos de confianza, se abreviarán en la forma siguiente: DE, EE y IC, respectivamente.

Título

El título del trabajo debe ser conciso, específico e informa-tivo. Sólo la primera letra será mayúscula, en negritas, centrado, iniciándose en la línea 10, sin usar marcas comerciales o abre-viaciones. Se deberá señalar, con superíndice (#) la fuente de financiamiento, si lo hubiese, que se detallará a pie de página. Separado por el espacio de una línea se deberá escribir el título en inglés.

Autores y direcciones

Los nombres de los autores se escribirán bajo el título separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido separando por comas entre los autores, ajustándose al siguiente ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al término de cada nombre de autor debe identificarse con una letra en superíndice, el nombre de la sección, departamento, servicio o institución a la que pertenece o perteneció dicho autor, durante la ejecución del trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la correspondencia, debiéndose señalar a pie de página el número de fax, correo electrónico y casilla de correo.

Pie de página

Serán usados para elaborar abreviaciones citadas en el título de cuadros, marcas comerciales, nombre y dirección de empresas. Deben ser indicados con números.

Summary

La segunda página debe contener un summary, de no más de 250 palabras y que describa los propósitos del estudio o investigación, el material y métodos empleados, los resultados principales y las conclusiones más importantes. No se deben emplear abreviaturas no estandarizadas. En línea aparte, separado por un espacio y justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras clave) en minúsculas, las que no deben ser más de 4.

Introducción

En la tercera página en la línea 1 se escribirá el título del capítulo. En la línea siguiente, con sangría, predeterminada de un tabulador en 5 espacios, se plantearán los antecedentes que sustentan el propósito del artículo, sin un despliegue extensivo del tema y utilizando sólo las referencias más pertinentes. Se deben indicar, cuando corresponda, la hipótesis que se postula y los objetivos de la investigación.

Entre párrafos debe conservar el interlineado y medio.

Material y Métodos

Separado por un espacio de la sección anterior, se deberá describir el capítulo con suficientes detalles para permitir a otros repetir el estudio. Después de la primera referencia en el texto a drogas o reactivos, se deben señalar el nombre genérico, dosis y vía de administración. Para el caso de equipo especializado se indicarán la marca, el modelo y el nombre del fabricante.

Los métodos estadísticos utilizados deben ser señalados como subtítulos: “Análisis estadístico” y deben incluir un adecuado detalle, que permita a los lectores establecer con precisión cómo han sido analizados y presentados los datos y las unidades de medidas en que están expresadas (medias aritméticas, desvia-ciones estándares, errores estándares de la media, medianas, rangos o límites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron paramétricas (Chi cuadrado, prueba “t“ de Student, Anova, etc.) o no paramétricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se deberán identificar el nombre, la versión y el proveedor del programa computacional utilizado, ejemplo: SPSS versión 9.0 para Win-dows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Resultados

Separado por el espacio de una línea de la sección anterior, se deberá describir el capítulo de resultados, presentado en forma concisa y lógica, sin discusión o referencia a otro trabajo. Los cuadros y figuras deben ser los mínimos necesarios y los datos no deben ser repetidos en el texto y tampoco deberán ser mostrados simultáneamente o reiterados.

Discusión

Esta sección, separada por una línea de la anterior, debe evaluar e interpretar los resultados, relacionándolos a los de otros estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos. Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, haciéndola de manera lógica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones

que no estén respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en trabajos aún no publicados.

Resumen

El resumen en español deberá ser escrito en hoja aparte, y deberá ajustarse a las mismas normas señaladas para el summary. Separadas por el espacio de una línea se deberán escribir las palabras clave en letras minúsculas, no debiendo ser más de cuatro y justificadas en el lado izquierdo.

Agradecimientos

Deben ser breves y sólo incluir personas o instituciones que han hecho una contribución directa, han provisto material necesario o dado las facilidades para la realización del estudio.

Referencias

La precisión con la que son señaladas las referencias es de responsabilidad de los autores y deben corresponder al artículo original; asegúrese que todos los artículos citados en el texto estén incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el texto, las citas se deben indicar entre paréntesis y en orden cronológico, citando el apellido del autor y la expresión “y col” después del apellido del primer autor, cuando son más de dos, Ej.: (Pérez 1994, Castro y Martínez 1996, Cifuentes y col 2002).

El listado de referencias debe ir en orden alfabético de acuerdo al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use el término anónimo entre comillas, tanto en el texto como en el listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor, solo o con más autores, deben ser escritas en orden cronoló gico. Las letras a, b, c, etc., deberían ser agregadas como superíndice cuando un autor escribe más de un trabajo en el mismo año. Los nombres de los autores deben escribirse en minúsculas, sin punto entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los siguientes ejemplos como guía.

Para artículos en revista: Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

Para capítulos en libros o publicaciones ocasionales:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total

nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006.

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

Para artículos y resúmenes publicados en series regulares:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998.

Valores sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Con-greso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

Para memoria de título:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Para tesis:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-

CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.Minimice el uso de resúmenes como referencias. Evite usar

“datos no publicados” o “comunicación personal” al menos que de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse referencia en el texto como pie de página, pero no debe aparecer en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han sido aceptados para publicación deben ser citados como “en prensa”; sin embargo, trabajos que han sido sometidos a publi-cación, pero no han sido aceptados todavía, deben ser referidos como “datos no publicados”.

Direcciones de páginas Web no deben ser incluidas en las referencias; si su uso es imprescindible, la dirección debe ser señalada en el texto como pie de página, incluyendo fecha de consulta.

INSTRUCCIONES COMPLEMENTARIAS

Cuadros

Las leyendas de los cuadros y figuras deben ser autoexpli-cativos y presentarse en español e inglés.

Los cuadros deben ser el menor número posible, presentados en hoja aparte, con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte superior. La información de los cuadros no debe repetir lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente con números arábigos, en el orden en que aparecen en el texto, asignándoseles un título breve y autoexplicativo que indique su contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un encabezamiento corto o abreviado. Sólo los encabezamientos de las columnas y los títulos generales se separan con líneas hori-zontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y no por líneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias, deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para todas las abreviaturas no estándar y las unidades de medidas deben ser agregadas entre paréntesis. Si se usan superíndices para señalar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el número

DIRECCIÓNComité Editor Archivos de Medicina Veterinaria

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chilee-mail: [email protected] - Fono-Fax: (56-63) 221459

www.veterinaria.uach.clwww.scielo.cl

Casilla 567, Valdivia, CHILE

Representante Legal:Víctor Cubillos Godoy

Rector de la Universidad Austral de Chile

de dígitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El ancho máximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para una columna, o los 170 mm para dos columnas.

Figuras

Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte inferior y numeradas consecutivamente usando números arábigos, según el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1. Denomine figura a cualquier ilustración que no sea cuadro, Ej.: gráficos, radiografías, ecografías, electrocardiogramas, fotografías, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente y acompañadas de una corta descripción que contenga la expli-cación de todos los marcadores, líneas y símbolos usados. Si la figura tiene secciones, éstas deben ser identificadas como a, b, c, etc., en la esquina superior derecha y deberán ser descritas en la leyenda.

Para el caso de fotografías, en el reverso y con lápiz a carbón, deben señalarse con flecha la orientación espacial, el número de la figura y el nombre del autor principal. Los símbolos, flechas o letras, empleados en las fotografías, deben tener un tamaño y contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Envíe las

figuras protegidas en un sobre grueso y de tamaño apropiado. Las figuras pueden diseñarse a una o dos columnas de ancho (80 y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de las figuras deben ser financiadas por los autores.

Cuando las figuras no son originales debe señalarse la autoría, y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorización del autor para ser reproducidas.

Pruebas de imprenta

Una prueba de imprenta será enviada al autor encargado de la correspondencia, para su lectura y corrección puntual, y debe ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicación.

La decisión final para la publicación del trabajo será en el momento en que el Comité Editor acepte las correcciones, que a sugerencia de los árbitros han realizado los autores. Modifica-ciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores no serán aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarán responsabilidad por la impresión de errores de los ar tículos que los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish or English, original scientific contributions such as scientific articles, reviews and short communications which can include clinical observations, descriptions of methods or techniques and advances in all aspects of veterinary science and animal welfare.

SUBMISSION OF MANUSCRIPTS

Manuscripts should be submitted to the Editor via the on line platform www.equipu.cl and it must include:

• Anelectronicversionofthetext,tables(preferablyinMSWord format), figures (in Excel format, JPG or TIFF, with 300 dpi), and a letter declaring authorship, signed by all authors.

• Themanuscriptsmustbeoriginal,andmaynotbeconsideredfor publication in another journal.

• Manuscriptsthatdonotconformtoeditorialrequirementswill be returned without review.

• TheeditormayrequireacopyoftheappropriateBioethicalCommittee Certification for manuscripts describing studies involving animals or humans.

• AcoveringlettertotheEditormustbeincludedrequestingpublication of the work, and naming the corresponding author who will also revise the proof of the article, should it be accepted for publication.

• Theintellectualpropertyoftheworkwillberetainedbytheauthors.

• RefereesofArchivos de Medicina Veterinaria will aid the Editorial Committee to determine whether the manuscript fulfills publication requirements. The authors may suggest possible referees. All articles submitted for publication will be assessed by two referees. The referees will be selected by the Editorial Committee, and may or may not include those nominated by the authors. In the case of a disagreement between the referee’s reports, a third referee will aid the Editorial Committee to reach a decision. Referees are obliged to keep all information from the articles confidential, including unpublished information.

• Previoustothepublicationofacceptedarticles,thepublicationcharge must be paid, the amount of which can be found at www.veterinaria.uach.cl.

PREPARATION AND FORM OF MANUSCRIPTS

Types of articles

Review articles: provide expert summaries of current knowledge in a particular field of veterinary science, and do not necessarily have a set format. Authors should consult with the Editor before initiating a review. The Editorial Committee may solicit an expert to prepare a review, which will also be refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length, including tables, figures and references. Only reviews in english will be accepted.

Scientific articles: report new advances in veterinary science based on original research. The format must include summary, introduction, material and methods, results, discussion, resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 20 pages, including tables, figures and references.

Short communications: briefly inform of an advance, experimental result, clinical observations or new methodology, with the following format: summary, introduction, material and methods, results and discussion (combined), resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 12 pages, including tables, figures and references.

JOURNAL STYLE AND LAYOUT

General presentation: The journal publishes articles in English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top right corner, and lines must be numbered on the left, starting with number one, on all pages.

Headings must be in upper case, left-justified on a separate line with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS. Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified; secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use underlining and do not number sub-headings or itemized lists.

In the text, numbers must be written in numerals. When a sentence begins with a number or when necessary for clarity, this should be written in words. A decimal point must be preceded by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the decimal in English and a comma in Spanish. All measurements should be reported in IS units unless it is normal practice in a discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit).

Founded in 1969 ISSN 0301-732x

Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour clock for times of day (e. g. 13:00 h).

Chemical nomenclature must be expressed using the Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983), generic names (in lower caps) must be used for medications. If brands and sources of medications need to be included, this should be included as a foot-note. Enzymes must be identified at first mention, in accordance with the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Latin terminology and abbreviations commonly used in scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must be italicized. Probability values must be presented as P<0.05 or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and CI, respectively.

Title

Titles should be short, specific and informative. The title is centred in bold, starting at line 10 without using trade names or abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript symbol # should be used to indicate the source of funding, with details given as a footnote, if appropriate.

Author’s names and addresses

Author’s names are written underneath the title, separated by a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Superscript letters should be used after each author’s name to identify the section, department, service or institute of the author where the work was conducted. The corresponding author is indicated using the superscript letter followed by an asterisk, with the full contact details, including fax number and email address indicated in the footnote.

Footnotes

These are used to define abbreviations used in table titles, commercial brands, the name and address of companies. They must be indicated with numbers.

Resumen

The second page must contain a summary in Spanish (Resumen), of no more than 250 words, that describes the objectives of the study or research, the material and methods used, the principal results and the most important conclusions. Non-standard abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified and separated by a space, up to four palabras clave (key words) should be identified.

Introduction

The subheading “Introduction” is written on the third page on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context of the study is briefly presented without an extensive revision of the theme, and only citing the most relevant references. When appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing between paragraphs must be kept.

Material and methods

Separated by one space from the previous section, this section should contain sufficient detail to allow others to repeat the study. When the first reference in the text is made to medications or chemicals, the generic name, dose and route of administration

should be indicated. For specialized equipment, the brand, model and manufacturer’s name must be indicated.

Details of all statistical methods used must be given at the end of this section under the sub-heading “Statistical analysis” and should include adequate detail to allow readers to determine precisely how data have been analysed and the units that are used to express the results (mathematical mean, standard deviation, standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits, etc.). The use of parametric (Chi-square, student’s T-test, ANOVA, etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses must be indicated. The name, version and sources of computational statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version 9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Results

Separated by one space from the previous section, this section should contain a concise and logical description of the results obtained without discussion or reference to other work. The minimum number of tables and figures should be included to present the pertinent data without repetition, and data presented in tables and figures should not be repeated in the text.

Discussion

This section, separated by one space from the previous section, should evaluate and interpret the results and relate these to other relevant results. The results should not be repeated and new results must not be presented in this section. Care should be taken to ensure that the discussion is developed in a logical and concise manner, and conclusions are reached, as well as a discussion of their relevance. Conclusions that are not directly supported by the data of the study or other unpublished studies should not be presented.

Summary

The summary is written in English, and must be presented on a separate page. The summary should contain the same elements as the “Resumen”. On a separate line, following the summary, left-justified in small caps and separated by a space, up to four key words should be identified.

Acknowledgements

This section should be brief, and should only include people or institutions that have made a direct contribution, provided necessary material or have provided the facilities for the study’s development.

References

The accuracy of the reference section is the responsibility of the authors and references must be verified against the original article. Please ensure that all articles cited in the text are included in the reference list and vice versa. In the text, citations should be listed in parentheses in chronological order, citing authors’ names, and using et al after the first author’s name where there are more than two (e.g. Pérez 1994, Castro and Martínez 1996, Cifuentes et al 2002).

The reference list must be ordered alphabetically according to the first author’s name, and all authors’ names and initials must be included. When no author is given, use the term “Anonymous” in both text and reference list. References with the same author, single or with coauthors, should be listed in chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended as a superscript when more than one work is cited from the

same author within the same year. Authors names should appear with the initials and first letter of the surname in upper caps and the remainder of the surname in lower caps, with no dots between initials. Journal titles and names of books should be in italics using standard abbreviations. Use the following examples as a guide:

For journal articles:Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

For chapters in books or occasional publications:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total

nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006..

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

For articles and proceedings published in regular series:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998. Valores

sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

For dissertations:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

For Theses:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-

CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Minimise the citation of abstracts as references. Authors are specifically discouraged from citing “unpublished data” or “personal communication”, unless this information exists in written form, in which case the text should be referred to as a footnote, but this should not appear in the list of references. References to papers which have been accepted but not published should be cited as “in press”, whereas manuscripts which have been submitted for publication but not accepted should be referred to as “unpublished data”.

Web pages should not be included as references. If so required, web page addresses should be written as footnotes, including date of consultation.

COMPLEMENTARY INSTRUCTIONS

Tables

The titles to tables and figures should be self-explanatory and must be presented in both Spanish and English.

The number of tables should be kept to a minimum and presented on separate pages with their respective titles in English and Spanish at the top. Information in tables must not be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively with Arabic numbers in the order in which they are referred to in the text. The brief title to the table should indicate the contents of the table and should be understandable without reference to the text. Each column of each table must have a short or abbreviated heading. Only column headings and general titles should be separated with horizontal lines. Data columns should be separated by spaces and not vertical lines. When additional explanatory information is required, this should appear at the foot of the table. Explanatory information for non-standard abbreviations and units should appear within parentheses. If superscripts are used to indicate significant differences between values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column. Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80 mm for one column or 170 mm for two columns.

Figures

Figures should be submitted on separate pages, with their respective titles in English and Spanish at the bottom and numbered consecutively using Arabic numerals in the order they are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies, ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive caption that contains an explanation for all markers, lines and symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections, these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and must be described in the caption.

The reverse of photographs must be marked using graphite pencil with the number of the figure, the first author and an arrow showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or letters used should be of an adequate size and contrast to be easily visible. Photographs should be submitted in a protective, adequately sized envelope. Figures may be one or two column-widths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured figures must be met by the authors.

The authorship of non-original figures must be acknowledged, and when appropriate, authorization to reproduce these figures must be provided.

Proofs

A proof will be sent to the corresponding author for proof-reading, and must be returned within the specified time. Otherwise the Editor reserves the right to carefully proof-read the article but without assuming responsibility for errors, to continue with the publication process.

The final decision regarding acceptance of the manuscript will be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript following correction according to the referees’ comments. Alterations to the proof that do not correspond to minor errors will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept any responsibility for printed errors which were not noted by the authors at the time of proof-reading the proof.

ÁBALOS, PedroACOSTA, GerardoADARMES, HéctorAGUIRRE, IsabelALBERIO, RicardoALFARO, MartaALFARO, AnaALOMAR, DanielANTICEVIC, SoniaAPAOBLAZA, ArielARAYA, ArielARIAS, SergioBAHUAUD, DianeBARR, FrancesBIANCHI, GianniBORIE, ConsueloBONTEMPO, ValentinoBORROFKA, SusanneBRIONES, MarioBURGOS, RafaelCARMONA, JorgeCARRILLO, BernardoCARVALLO, FranciscoCASTRO, FidelCEBALLOS, AlejandroCELEDóN, OrfeliaCERóN, José JoaquínCHIHUAILAF, RicardoCONCHA, IlonaCONTRERAS, PedroCORTI, PauloDE LOS REYES, MónicaDUCHENS, MarioDUFFY, SergioESCOBAR, ArturoFARÍAS, CarlosFELMER, RicardoFERNÁNDEZ, HeribertoFERREIRA, AdelinaFIGUEROA, CarlosFREEMAN, LarryFOLCH, HugoFRANJOLA, ReneFUENTEALBA, CarmenGAGLIOSTRO, GerardoGAJARDO, GonzaloGALECIO, SebastiánGALLEGUILLOS, MarcoGALLO, CarmenGANDARILLAS, MónicaGARCÍA-PÉREZ, AnaGIL, HoracioGIL, MónicaGONZÁLEZ-ACUñA, DanielGOYCOECHEA, óscar

GUTIÉRREZ, ClaudioGUTIÉRREZ, LuisHENRÍQUEZ, J EduardoHERMOSILLA, CarlosHIDALGO, M. AngélicaHUAQUÍN, LauraILLANES, óscarIRAIRA, SergioIVERSEN, MartinJARAMILLO, RobertoJEREZ, VivianaKAUSEL, GudrunKENNEDY, MarkLAGGER, José RodolfoLANUZA, FanciscoLAPORTE, JoséLARRAÍN, RafaelLATORRE, AlejandraLATORRE, EtelLEDESMA, PaolaLEóN, RicardoLETELIER, ClaudiaLEYÁN, VíctorMAGNADOTTIR, BergljotMARTÍNEZ, EmilioMARTÍNEZ, MarioMEDINA, GonzaloMÉNDEZ, GabrielaMERINO, VictoriaMIERES, MarceloMOLINA, EduardaMONTI, GustavoMORALES, María A.MORÁN, José M.MOREIRA, MarcosMUñOZ, PamelaMUñOZ, LisandroMUñOZ-ZANZI, ClaudiaMURCHISON, ElizabethMURÚA, RobertoNEIRA, MiguelNEIRA, RobertoNORO, MirelaNOVALES, ManuelNÚñEZ, María JoséNÚñEZ, IvánNÚñEZ, RafaelOJEDA, JavierOLIVA, DoloresOLIVA, MarceloOLIVA-HERNÁNDEZ, JorgeORTEGA, MarceloORTEGA, CésarORTLOFF, AlexanderOTTO, Bárbara

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

El Comité Editor agradece a los revisores del volumen 42, 2010

PARRAGUEZ, VíctorPERALTA, óscarPÉREZ, BenignaPÉREZ, RubénPÉREZ, PatricioPERFUMO, CarlosPOKNIAK, JoséPOMROY, BillPRITCHARD, JoyPULIDO, RubénQUEZADA, ManuelRAMÍREZ, AlfredoREBBECK, ClareRECABARREN, SergioREINHARDT, GermánRÍOS, CarolinaRIVEROS, LuisROBLES, CarlosROMERO, AlexROSENFELD, CarlaRUBILAR, LuisRUDORF, HeikeRUIZ, ÁlvaroSALMAN, MoSAñUDO, CarlosSHOEMAKER, CraigSIEVERS, GeroldSMITH, PedroSMULDERS, Juan PabloSTEHR, WolfgangTAMAYO, RafaelTARABLA, HéctorTELLO, LuisULLOA, JorgeVALDEBENITO, IvánVALENZUELA, EduardoVALENZUELA, GastónVANASCO, BibianaVARGAS, LuisVERA, MilbaVERDUGO, ClaudioVERSTEGEN, MartinVILA, FernandoVITS, LucíaVON BRAND, ElisabethVON KEYSERLINK, NinaWARAN, NathalieWIEGAND, RobertoWIGGER, AntjeWILLIAMS, José de JesúsWINKLER, FedericoWITTWER, FernandoYÁñEZ, AlejandroYUNG, VerónicaZÁRRAGA, Ana María

SUSCRIPCIóNARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Estimado lector:

Para renovar la suscripción anual de nuestra revista (3 números, abril/agosto/diciembre) puede visitar nuestra página web en www.veterinaria.uach.cl, opción suscripciones y pago online, o bien, remitir cheque por $ 15.000 (quince mil pesos) a nombre de la Universidad Austral de Chile, dentro de un sobre dirigido al Comité Editor, adjuntando el presente cupón.

SeñoresComité EditorRevista Archivos de Medicina VeterinariaUniversidad Austral de ChileCasilla 567Valdivia - Chile

Nombre o razón social .......................................................................................................................................

Dirección. ............................................................................................................................................................

Ciudad ................................................................................ Fono........................................................................

País .....................................................................................................................................................................

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIASUBSCRIPTION FORM

Yearly Subscription - 3 issues - US $ 50.00

Dear reader:

To renew your annual subscription (3 issues, april/august/december), please order through our website at www.veterinaria.uach.cl where you can pay online. Cheque payments should be made to Universidad Austral de Chile and sent to the following address, enclosing the subscription form below:

Comité EditorRevista Archivos de Medicina VeterinariaUniversidad Austral de ChileP.O. Box 567Valdivia - Chile

Name ....................................................................................................................................................................

Address ................................................................................................................................................................

City .......................................................................................................................................................................

Code .....................................................................................................................................................................

Country ................................................................................................................................................................

ANDROS IMPRESORESwww.androsimpresores.cl

Archivos de Medicina Veterinaria Vol 42 No3 2010

Documents

Transcript of Archivos de Medicina Veterinaria Vol 42 No3 2010