H. FREDY ZEGARRA ARAGON

¿ QUE ES LA APOPTOSIS?

Por qué se dice que es una muerte celular programada ?

a) Mantención de un número constante de células, mediante la eliminación de las redundantes (tejidos sujetos a un activo recambio celular: hígado, médula ósea y mucosa del tracto digestivo ), permite un balance entre proliferación y muerte celular

b) Eliminación de células potencialmente peligrosas. ( que pueden desarrollar un proceso maligno.)

c) Función inmune: interviniendo en los mecanismos de defensa especialmente en infecciones virales (donde células infectadas sufren apoptosis inducida por linfocitos evitando la replicación viral y por lo tanto la propagación de la infección.)

d) Remodelación de tejidos embrionarios y organogénesis: • Durante la gestación se produce un exceso de neuronas : 50% son eliminadas por apoptosis, quedando el resto para constituir el SNC. • La apoptosis también participa en la involución de órganos como el timo en la pubertad, cambios celulares que inician la menstruación y en las glándulas mamarias cuando termina la lactancia

IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS

Célula sana

Todos los errores reparados

La célula intenta reparar errores

Injuria

Errores genéticos resultado de la

injuria

Algunos errores permanecen

Injuria adicional

Célula incapaz de reparar errores

La célula programa su muerte vía Apoptosis

APOPTOSIS

NECROSIS APOPTOSIS

Célula hinchada Célula encogida

Orgánulos dañados Orgánulos no dañados

Cromatina alterada Cromatina marginada

Célula lisada Cuerpos apoptóticos

Orgánulos destruidos Orgánulos intactos

Cromatina destruida Cromatina fragmentada

Contenido celular liberado Contenido celular retenido

Inflamación Fagocitosis

Fagocitosis No inflamación

TABLA Nº 1.- Diferencias entre los cambios morfológicos que ocurren en la necrosis celular y la apoptosis celular

CARACTERISTICA NECROSIS APOPTOSIS

Participación Celular Pasiva, carente de control genético Activa, controlado por un programa genético

Volumen celular Aumenta Se reduceCromatina Nuclear Condensación laxa y localización difusa Condensación compacta con marginización

nuclearNucleo Fragmentado Fragmentado

ADN Fragmentación irregular , patrón de barrido

Fragmentación internucleosomal, patrón de escalera

ARN Ribosomal Degradación irregular Fragmentación regular, aparición de bandas específicas

Orgánulos Se hinchan y tienden a fusionarse con lisosomas

Permanecen íntegros y no se fusionan con lisosomas

Membrana celular Conserva asimetría de fosfolípidos y se pierde la integridad

Aparición de fosfatidil serina en la lámina extracelular y se conserva la impermeabilidad

Citoesqueleto Se desorganiza Conserva su estructura

Citoplasma Se vierte al espacio intersticial Se conserva en los cuerpos apoptóticos

Activación de proteasas Inespecífica y asociada a disfunción lisosomal

Específica de la familia de las caspasas

Estrés Oxidativo Presente sólo en etapas tardías Presente desde etapas tempranas

Metabolismo lipídico Activación inespecífica de fosfolipasas Producción de Ac. Araquidónico , Ceramida y sus metabolitos derivados

Reacción infamatoria Presente AusenteCicatrización Presente a menudo con fibrosis Ausente

APOPTOSIS

NECROSIS

Deshidratación Celular

Condensación de la cromatina Preservación de la

integridad de la membrana

Cuerpos Apoptóticos

Fragmentación Nuclear

Ruptura de la membrana plasmáticaHinchamiento de célula

y mitocondrias

TABLA I. ALGUNOS FACTORES MODULADORES DE LA APOPTOSIS.

FACTORES EXTERNOSA) Estimulantes de las apoptosis Radiaciones ionizantes, radicales reactivos de oxígeno (ROS), Lipoproteínas de baja densidad oxidadas. Drogas citotóxicas (agentes alquilantes, antimetabolitos, antagonistas hormonales,

glucocorticoides, ciclosporina A).

Citocinas (TNF, TGF-b, IL-1b). Receptores transmembrana (receptor Fas/APO, rTNF, rNGF, rIFN-g).

B) Supresores de la apoptosis Factores tróficos de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-6, CSF, EGF).

FACTORES GENÉTICOSA) Genes estimulantes de apoptosis: ced-3, ced-4 (C. elegans), p53, lpr, Bax (mamíferos), Bcl-xS, cmyc.

B) Genes supresores de apoptosis: ced-9 (C. elegans), Bcl-2 (mamíferos), Bcl-xL.

PROTEINAS EFECTORAS :: Caspasas

PROTEINAS REGULADORAS :: Familia Bcl-2

PROTEINAS ADAPTADORAS : FADD, TRADD, TRAF, RAIDD

COMPONENTES PRINCIPALES DE LA APOPTOSIS( PROTEINAS INVOLUCRADAS EN LA APOPTOSIS)

… aa – aa – aa – aa – aspartato – aa – aa – aa – aa – aa ….

CASPASAS SEGÚN SU FUNCIÓN

•Inflamatorias: Participan en la maduración de citoquinas, como IL-1 e interferón (caspasas 1,4, y 5).

•Efectoras: Participan en la degradación de sustratos apoptóticos (caspasa 3 ó CPP32, caspasas 7 y 2 y CED-3).

•Reguladoras: (caspasas 6 y 9 y caspasa 8, FLICE), activan a las caspasas efectoras.

TABLA 2.- Proteínas sustrato (blanco) de las caspasas

Proteína blanco Sitio de

hidrólisis

Caspasa Función de la proteína blanco

PARP1 DEDY-G 3 y 7 Reparación del ADN

UI-70 Kda2 DGPD-G 3 Procesamiento del ARN

DNA-PKCS3 DEVD-N 3 Reparación de brechas en el ADN de doble cadena

SREBP DEPD-S 3 y 7 Proteína que se une a elemento regulado por esterol

D4-GDI DELD-S 3 Regulador de Rho (GTPasa)

PKC-d DMQD-N 3 Degradado a su forma activa en apoptosis

Pro-IL1b YVHD-A 1 Degrada a citocina activa

C1 y C24 ? 3 y 7 Procesamiento del pre-ARNm (HnRNA)

Laminina A y B VEID-N 6 Mantenimiento de la forma de la membrana nuclear

Gas2 SRVD-G ? Componente del sistema microfilamento

Fodrina DETD-S ? Estructura del citoesqueleto asociado a membrana

Actina G LVVD-N ? Estructura del citoesqueleto

NuMa ? ? Mantiene la estructura nuclear

1Poli (ADP-Ribosa) Polimerasa 2Pequeña ribonucleoproteína de de 70 Kda 3Proteína Kinasa ADN dependiente 4Proteína heteroribonuclear

D(asp), E(glu), G(gli), H(his), I(Ile), L(leu), M(met), N(Asn), P(Pro), Q(gli), R(Arg), S(Ser), T(Thr), V(val), Y(Tyr).

Nombre Dominios Anclaje a

membrana

Función

Subfamilia Bcl-2

Bcl-2 BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica

Bcl-x1BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica

Bcl-w BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica

Mcl-1 BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica

A1 BH1, BH2 No Antiapoptótica

Subfamilia Bax

Bax BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica

Bak BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica

Bok BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica

Subfamilia BH3

Bik BH3 Si Proapoptótica

Blk BH3 Si Proapoptótica

Hrk BH3 Si Proapoptótica

BNIP3 BH3 Si Proapoptótica

Bim L BH3 Si Proapoptótica

Bad BH3 No Proapoptótica

Bid BH3 No Proapoptótica

Tomado de Adams y Cori, 1998

TABLA 2.- Clasificación de los miembros de la

familia Bcl-2

FASE DE ACTIVACION FASE DE EJECUCION

MUERTE CELULAR

M I T O CO N D R I A

Bloqueo por cerpinas

(crm-A)

Bloqueo por Bcl-2

C I T O P L A S M A

MEDIO EXTRACELULAR

Ligando

Receptor

Activación de Receptores TNF-I, APO/FAS o CD40

Activación de Caspasas 8, 10 y 1.

Producción de ácido araquidónico y ceramida

Producción de estrés oxidativo.

Caída transitoria del potencial de membrana mitocondrial.

Liberación del Cit C.

Activación de Caspasas 3, 6 y 7.

Participación de bax y Ced-4

Membrana celular

Representación esquemática de las fases de activación y ejecución durante la muerte por apoptosis . La activación del receptor de muerte como el receptor de TNF tipo I, el antígeno APO/FAS o

el CD40, encienden el programa de muerte. La activación de caspasas tanto en la fase de activación como de ejecución , amplifican el proceso antes y después de la inducción de cambios en el

funcionamiento mitocondrial. Cada fase va acompañada de cambios bioquímicos que participan en la muerte celular.

Iones

Bcl-2

Bcl-x

l

Apaf 1

Bax

Bax

PI-3 K Procaspasa-3 Caspasa-3

Procaspasa-9

Caspasa-9 CITOSOL

Membrana Mitocondrial

Externa

Espacio Intermambrana

Receptor de Factor Trófico

Cit C

Cit C

Bad

Akt-Kinasa

Cit C

Cit C

Corte se sustratos MUERTE

12-3-3

Membrana citoplasmática

AUSENCIA DE FACTOR TRÓFICO: Activación de Caspasas

Figure 23-50. Current models of the intracellular pathways leading to cell death by apoptosis or to trophic factor–mediated cell survival in mammalian cells. The details of these pathways in any given cell type are not yet known. (a) In the absence of a trophic factor. Bad, a soluble pro-apoptotic protein, binds to the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xl, which are inserted into the mitochondrial membrane. Bad binding prevents the anti-apoptotic proteins from interacting with Bax, a membrane-bound pro-apoptotic protein. As a consequence, Bax forms homo-oligomeric channels in the membrane that mediate ion flux. Through an as-yet unknown mechanism, this leads to the release of cytochrome c from the space between the inner and outer mitochondrial membrane. Cytochrome c then binds to the adapter protein Apaf-1, which in turn promotes a caspase cascade leading to cell death.

LA FALTA DE FACTORES TRÓFICOS PROMUEVE LA ACTIVACIÓN DE LAS

CASPASAS

Bcl-2

Bcl-x

l

Apaf 1

Bax

Bax

PI-3 KProcaspasa-3

Procaspasa-9

CITOSOL

Membrana Mitocondrial

Externa

Espacio Intermambrana

Receptor de Factor Trófico

Cit C

Bad

Akt-Kinasa

Cit C

12-3-3

Membrana citoplasmática

Factor Trófico

P

ATP

ADP

PRESENCIA DE FACTOR TRÓFICO: Inhibición de la activación de

Caspasas

Figure 23-50. (b) In the presence of a trophic factor such as NGF. In some cells, binding of trophic factors stimulates PI-3 kinase activity, leading to activation of the downstream kinase Akt, which phosphorylates Bad. Phosphorylated Bad then forms a complex with the 14 - 3 - 3 protein. With Bad sequestered in the cytosol, the antiapoptotic Bcl-2/Bcl-xl proteins can inhibit the activity of Bax, thereby preventing the release of cytochrome c and activation of the caspase cascade. [Adapted from B. Pettman and C. E. Henderson, 1998, Neuron 20:633.] (Fuente: Lodish et al., 2000)

LA PRESENCIA DE FACTORES TRÓFICOS

INHIBE LA APOPTOSIS

Activación de esfingomielinasa

CERAMIDA

JNK/SAPK

TNF

TNFR

TRADDFADD

RAIDDRAID

TRAF

Caspasa-2

Caspasas Efectoras

Caspasa-3

Caspasa-6

Caspasa-7

Supervivencia celularNF-kB

APOPTOSIS

p50

p65IkB

p50

p65

Bcl-2

FIGURA Nº 1. Apoptosis inducida por Factor de Necrosis Tumoral

Endonucleasas

Fragmentación del ADN

Toxinas, hormonas, Factores de crecimiento, citoquinas, oxido

nítrico, etc

Fas L

Fas

FADD

Pro-Caspasa 8

p18

p18

p11p11

Smac/Diablo IAP

Bid

Cit C

Caspasa-8

Caspasa-3

APOPTOSIS

Pro-Caspasa-3

Cit CPro-

Caspasa -9

Caspasas Efectoras

Caspasa 9

Caspasa-3 Caspasa-6 Caspasa-7

dATP

Apoptosoma

Bcl-XL

FLIP

APAF - 1Pro-

Caspasa -9 Cit C

FIGURA Nº 2. Apoptosis inducida

por Fas

Pro-Caspasa-3

Caspasa-3

APOPTOSIS

¿

APOPTOSIS

CAD

Granzima B

Célula Efectora Citolítica(lifocitos T citotóxicos, y NK)

Degranulación Granzima B

PerforinaCa2+ Ca2+

Ca2+

II

C A

D

C A

D

FIGURA Nº Inducción de apoptosis por Granzima A

Topo IIHMG1

HMG2

Fragmentación del DNA

Liberación de Citocromo C

Célula tumoral o

infectada por virus

Luz UV Radiación g

Daños Redox de desintoxicación Drogas / Xenobióticos

¿ … ?

Complejo del Poro de Permeabilidad transicional:

ANT, VDAC

APAF - 1

Cit C

Cit C

Pro-Caspasa-9

Cit CPro-

Caspasa-9

dATP

Caspasa 9APOPTOSIS

Cit C

Figura N° Vía Intrínseca de la Apoptosis

ADNMITOCONDRIA

Luz UV Radiación gStress Quimioterapia

Daños Redox de desintoxicación Drogas / Xenobióticos

¿ … ?

Complejo del Poro de Permeabilidad transicional:

ANT, VDAC

APAF - 1

Cit C

Cit C

Pro-Caspasa-9

Cit CPro-

Caspasa-9

dATP

Caspasa 9APOPTOSIS

Cit C

Figura N° Vía Intrínseca de la Apoptosis

ADNMITOCONDRIA

canal de aniones dependiente de

voltaje

transportador de nucléotidos de

adenina

Figura N° . p53 y detención del Ciclo Celular. Mecanismos que reconocen el ADN dañado, detienen la degradación de p53 y modifican a la proteína p53. (1). P53 estimula la transcripción de p21 (2) y GADD45 (3). El producto de p21 inhibe el complejo Ciclina / CDK, lo cual evita la fosforilación de Rb (Retinoblastoma) la cual continua para inhibir el Factor de transcripción E2F, bloqueando por lo tanto la progresión celular a

través del Ciclo Celular (evitando que entre a la Fase S). p53, también estimula la transcripción del gen GADD45 (Grow Arrest and DNA Damage) que cofifica para una enzima reparadora del ADN. Si el daño no es reparado, los genes apoptóticos son activados (4).

(1)

(2)(3)

Luz UV Agentes químicos

CkL

CdK

p53

GADD45

Transcripción del gen GADD45 Transcripción del gen p21

Transcripción del gen Bax. Activa la apoptosis

Transcripción del gen IGF-BP3. Inhibe señales antiapoptóticas

Reparación del ADN dañado

Rb

E2F(-)

(4)

Bloqueo de la progresión del Ciclo Celular

Complejo Ciclina / CdK

FIGURA Nº

Deprivación de citoquinas

DNA dañado Drogas Citotóxicas

Ligando de muerte

Ej. FasL

Receptor de muerte

Ej. Fas

FADD

Activación de caspasa 8

p53

Proteínas BH3 solamente

Pro-sobrevivencia Miembros de la familia Bcl-2

Bax/Bak

Daño mitocondrial

Liberación de citocromo c

Apaf-1

Activación de

caspasa 9

Activación de caspasas efectoras

Adaptadores

Activación de caspasas iniciadoras

Proteólisis de proteínas vitales

APOPTOSIS

FLIP

Smac/Diablo

IAPs

ENFERMEDADPor inhibición de apoptosis

Cáncer Colorrectal Neuroblastoma Glioma Leucemias y linfomas Hígado PróstataEnfermedades Autoinmunes Miastenia grave Lupus eritematoso sistémicoEnfermedades inflamatorias Asma bronquial Enfermedad inflamatoria intestinal Inflamación pulmonarInfecciones víricas Adenovirus Baculovirus

Por Exceso de ApoptosisSida Linfocitos TEnfermedades neurodegenerativas Enfermedad de Alzheimer Retinitis pigmentosa Esclerosis lateral amiotrofica Epilepsia Enfermedad de Parkinson Enfermedades hematológicas Anemia aplasica Linfocitopenia T CD4+ Síndrome mielodisplasico Deficiencia de G6PD Daño Tisular Infarto de miocardio Daño isquémico renal Accidente cerebrovascular Riñón poliquistico

TABLA Nº 6. 4.- Enfermedades asociadas a apoptosis

Tomado de Ramírez Chamond R. y col.

METODO DESCRIPCION

Microscopia óptica y electrónica

Electroforesis del DNA en geles de

agarosa.

Citometria de flujo

Cambios en el núcleo

TUNEL

Ioduro de propidio

Hoescht 33342

Cambios en la membrana

Anexina V

Cambios morfológicos: Condensación de la

cromatina, encogimiento citoplasmático, etc.

Se observa el patrón en escalera del DNA degradado.

Adición enzimática de nucleótidos marcados con

fragmentos de ADN de doble hebra.

Entra en las células por un aumento de la

permeabilidad de la membrana.

Entra en todas las células. Tiñe el núcleo y permite

observar la condensación de la cromatina

Tiene una alta afinidad por la fosfatidil serina en la

superficie celular

TABLA Nº 6.5. Técnicas utilizadas para la determinación de apoptosis

TECNICA DESCRIPCION

Microscopía óptica y electrónica

Cambios morfológicos (condensación cromatínica, encogimiento citoplasdmático

Electroforesis del ADN Patrón en escalera de ADN degradado en uno o múltiples nucleosomas.

TUNEL Adición enzimática TdT de nucleótidos marcados en fragmentos de ADN de una doble hebra.

ISNT Adición enzimática (ADN Polimerasa I de nucleótidos marcados en fragmentos de ADN de una sola hebra.

Tinción con Yoduro de propidio

Entra en la célula con aumento de la permeabilidad de la membrana (células necróticas y fases tardías de la apoptosis).

Hoescht 33342 Entra en todas las células y tiñe el núcleo permitiendo observar una condensación cromatínica

Anexina V-FITC Detecta fosfatidil serina en la superficie celular para la cual tiene gran afinidad la anexina

PRINCIPALES TECNICAS USADAS PARA LA DETECCIÓN DE APOPTOSIS

..GRACIAS ...