Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming

Dra. María Alejandra Alvarezmalvarez@centromilstein.org.ar

Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César MilsteinCONICET- Fundación Pablo Cassará

Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones

Buenos Aires 2 de noviembre 2009

Molecular Farming• Se define como una estrategia alternativa de producir

moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales)

• Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad.

• La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año.

• Mercado actual: 50 mil millones de U$.

• Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.

Ventajas• Bioseguridad• Maquinara de síntesis proteica eucarionte• Producción en condiciones controladas

(sistemas confinados)

Aspectos críticos• Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para

resolverlo (humanización de glicoproteínas).

• Tiempo: optimización del esquema de producción

• DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio).

• Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.

Sistemas de producción

• Planta a campo• Sistemas confinados (cultivos in vitro,

invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)

Cultivos in vitro• Callos• Cultivos de órganos (raíces, tallos)

– Frascos agitados– Bioreactores

• Suspensiones celulares – Frascos agitados– Bioreactores

Raíces transformadas

•Rápido crecimiento

•Estado de organización

•Estabilidad de producción

Bioreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)

Bioreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces

Biorreactores para el cultivo de raíces

Bomba de aire

Ro

tám

etro

Bo

mb

ap

eris

tált

ica

Generador de niebla

Cámarade cultivoControlador Controlador

On Off

Intensidad

Filtro de aire

Condensadorde niebla

Adición de nutrientes

Bomba

Salida de aire

AireAire

Inóculo

Reservorio

Malla de inmovilización

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Suspensiones celulares

• Frascos agitados– Pequeños volúmenes– Conocimiento del

sistema– Estudios para escalado

Bioreactores

• Volumen 1 -3000 litros• Producción en gran escala• Modelo acorde al sistema y

escala de producción

Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales

Consideraciones para el diseño

• Crecimiento y demanda de oxígeno• Estado de agregación y propiedades

reológicas• Sensibilidad a las fuerzas de corte• Formación de espuma/ pared celular

Crecimiento y demanda de oxígeno• Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs)

– BY-2: 12 hs– NT-1, Xanthi: 18-24 hs

• Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: 0.02-0.1 x 10-9)

• A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno.

• Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación.• KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; células

animales: 0.25-10), rango restringido.• Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados),

altos niveles tóxicos.

Agregados-reología

• Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc.

• Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados

• Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).

Sensibilidad a las fuerzas de corte• Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a

bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5-10 µm), células animales ( diámetro: 10-100 µm)

• Alto volumen de vacuolas (90% volumen total)• Pared celular rígida, no- flexible.• Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y

estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar)

• Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación.

• Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados

Espuma/pared celular

• En la fase de crecimiento exponencial• Exacerbada durante la fase estacionaria• Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de

nutrientes y oxígeno: caída de la productividad• Crecimiento en pared, impeler, sensores.• Taponamiento de filtros de aire.• Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y

aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.

Estrategias para productos intracelulares

• Aumento de la tasa de crecimiento• Aumento de la concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch-/batch alimentado a alta densidad

celular• Cultivo semi-continuo o continuo para evitar

grandes agregados celulares y adhesión a superficies

Estrategias para productos extracelulares

• Mayor tasa de crecimiento• Mayor concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de

alta densidad celular• Recuperación de producto in situ• Mayor estabilidad de proteínas por agregado de

aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.

Tanques agitados

• Pros– Flexibilidad– Altos coeficientes de transferencia de masa– Homogéneos– Aplicable a cultivos de alta densidad– Permite trabajar en GMP

• Cons– Sistema de mezclado (shear stress)– Costos – Generación de calor– Riesgos de contaminación en válvulas

Agitador de paletas planas o Rushton

Agitador de paletas inclinadas

Neumáticos: burbujeo• Pros

– Fácil de escalar– Bajos costos– Bajos riesgos de contaminación– Sin generación decalor– Bajo shear stress

• Cons– Transferencia de oxígeno pobre– Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad– Formación de espuma a alta aireación

Neumáticos: airlift

• Pros– Direccionamiento del burbujeo– Buena transferencia de oxígeno– Menor shear stress, sin generación de

calor– Menores tiempos de mezclado– Menores costos, sencillez de escalado,

eficiente circulación de fluidos

• Cons– Mezclado ineficiente en cultivos de alta

viscosidad– Formación de espuma a alta aireación

Wave

• Pros– Shear stress– Transferencia de oxigeno– Costos operacionales

• Cons– Escalado– Transferencia de calor– Estrategias operacionales

avanzadas

De membrana

• Pros– Remoción de productos

extracelulares– Bajo shear stress– Bajos costos operacionales

• Cons– Escalado– Oxigenación– Baja transferencia de calor– Monitoreo on- line

Algunos ejemplos comerciales

Producto Sistema Compañía

Vacunas aviares Suspensiones celulares de tabaco (4-40 mg l-1)

Dow AgroSciences

glucocerebrosidasa Suspensiones celulares de zanahoria (Fase III)

Protalix Biotherapeutics

paclitaxel Suspensiones celulares de Taxus

Phyton Biotech

IPLEX (macasermin rinfabato )

Suspensiones celulares (2 g l-1)

Phyton Biotech+ Insmed

Eco-Pod

Reactor temporario para algas.Producción de biocombustibles.

Muchas gracias por su atenciónmalvarez@centromilstein.org.ar