Aplicación de la Microbiología Predictiva en la determinación de la vida útil de los alimentos

Aplicación de la Microbiología Predictiva para la determinación de la vida útil de los alimentos

Enrique Alfonso Cabeza Herrera Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de Pamplona.

Campus Universitario, Km. 1, Vía Bucaramanga - Pamplona, Colombia. E-mail: [email protected] [email protected]

Fecha elaboración: 09/12/2011 - Fecha revisión: 15/06/2013.

1. Introducción

La preservación de los alimentos a través de los años ha sido necesaria para nuestra

supervivencia. Las técnicas de preservación utilizadas en el pasado (salazón, secado,

ahumado, calentamiento entendido como cocción, conservación a bajas temperaturas y la

fermentación) siguen siendo empleadas en conjunto con otros métodos en la actualidad,

apoyados en el conocimiento que diferentes disciplinas científicas han aportado al desarrollo en

este campo (Gram et al., 2002). Actualmente y debido a la cada vez creciente exigencia de los

consumidores por alimentos lo mas naturalmente posible, ha hecho que la industria

agroalimentaria busque alternativas de tratamiento de alimentos conservando la seguridad y la

calidad de los mismos.

Tradicionalmente se han empleado métodos físicos de proceso como las tecnologías térmicas

(pasteurización, esterilización, tindalización, refrigeración, congelación, etc.) y más

recientemente el empleo de atmósferas controladas y/o modificadas; entre los métodos

químicos destacan la acidificación, salazón y conservación en almíbar, mientras que la

conservación biológica se ha encaminado hacia los procesos de fermentación. Sin embargo,

nuevas formas de tratamiento y conservación de alimentos han ido apareciendo pudiendo

distinguir dos tipos fundamentales: Nuevas tecnologías térmicas (Calentamiento con

radiofrecuencias, procesado con microondas, calentamiento infra-rojo, infusión instantánea y

de calor elevado, calentamiento óhmico) y Tecnologías no térmicas (Alta presión hidrostática,

Campos eléctricos pulsados de alta intensidad, Campos magnéticos oscilatorios, pulsos

lumínicos intensos, irradiación, preservación química y bioquímica, etc.) que aún continúan

siendo foco de investigación.

Por otra parte, el objetivo que persiguen todos estos métodos es el de rendir un producto

nutricionalmente bueno, con un alto nivel de inocuidad y que su vida útil sea prolongada.

2. ¿Qué es la Vida Útil de un alimento?

La vida útil o caducidad de un alimento puede definirse como “el periodo de tiempo, después

de la elaboración y/o envasado y bajo determinadas condiciones de almacenamiento, en el que

el alimento sigue siendo seguro y apropiado para su consumo” (Dominic, 2004; Labuza, 1994),

es decir, que durante ese tiempo debe conservar tanto sus características físico-químicas,

microbiológicas y sensoriales, así como sus características nutricionales y funcionales. En

palabras de Dominic (2004), todos los alimentos poseen una caducidad microbiológica, una

caducidad química y/o físico-química y una caducidad sensorial; la cual depende de las

condiciones de formulación, procesamiento, empacado, almacenamiento y manipulación.

Según el Codex Alimentarius (1998) los alimentos perecederos son aquellos de tipo o

condición tales que pueden deteriorarse, entendiéndose aquellos como los alimentos

compuestos total o parcialmente de leche, productos lácteos, huevos, carne, aves de corral,

pescado o mariscos, o de ingredientes que permitan el crecimiento progresivo de

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microorganismos que puedan ocasionar envenenamiento u otras enfermedades transmitidas

por alimentos; así aquellos alimentos que son considerados como perecederos generalmente

poseen una vida útil de 7 días, y esta vida útil está limitada en la mayoría de los casos por el

decaimiento bioquímico o microbiológico (Labuza, 1994), mientras que los alimentos semi-

perecederos (conservas en general) la vida útil está limitada principalmente al deterioro

fisicoquímico y/o sensorial antes que el microbiológico (McMeekin y Ross, 2002; McDonald y

Sun, 1999).

El hecho que los alimentos son sistemas diversos, complejos y activos en que las reacciones

microbiológicas, enzimáticas y físico-químicas están interactuando de forma simultánea, hace

una tarea ardua el estudio de su vida útil. La preservación de los alimentos es dependiente de

la combinación de múltiples factores y un sin fin de reacciones bio-físico-químicas, y si

entendemos estas reacciones y sus mecanismos respectivos sería bastante exitosa la

limitación de aquellos factores que tienen mayor influencia o responsables en la alteración o

pérdidas de las características deseables en los alimentos, y a veces encauzar otras

reacciones hacia cambios beneficiosos.

Esencialmente, la vida útil de un alimento depende de cuatro factores principales a saber: la

formulación, procesado, empaque y condiciones del almacenamiento. Sin embargo, si las

condiciones posteriores de manipulación no son las correctas, entonces la vida útil de los

mismos puede limitarse a un periodo menor que del cual haya sido establecido. Todos los

cuatro factores son críticos pero su importancia relativa depende de cuan perecedero es el

alimento. Generalmente, un alimento perecedero (almacenado en condiciones apropiadas)

tiene una vida útil media de 14 días siendo limitado en la mayoría de los casos por el

decaimiento bioquímico (enzimático/senescencia) o el decaimiento microbiano.

Con las nuevas tecnologías de empaque en atmósfera modificada/controlada (CAP/MAP) en

condiciones asépticas, tales alimentos pueden durar hasta 90 días (3 meses). Un alimento

semi-perecedero tiene una vida útil media de alrededor de 6 meses, tales como algunos

quesos, mientras que los alimentos no perecederos tienen una vida útil superior a 6 meses y

con una duración de hasta 3 años cuando son mantenidas bajo condiciones apropiadas de

almacenamiento (p.ej., la mayoría de las conservas).

3. Métodos para prolongar la vida útil

Desde antaño han sido diferentes los métodos que se han empleado para prolongar la vida útil

de los alimentos desde aquellos tales como la conservación en frío y/o la fermentación y que,

con el paso del tiempo se han ido perfeccionando al tiempo que han emergido otros. Se sabe

que en la antigüedad ya los romanos empleaban las bajas temperaturas “Congelación” para

prolongar la vida útil de sus alimentos mediante la conservación en vasijas que eran o bien

recubiertas en hielo o directamente vertido en el interior de las mismas con el alimento incluido.

Ya hacia finales de 1850, Louis Pasteur demuestra que la contaminación de los vinos era

asociada al desarrollo de cepas no aptas para su producción y mediante el tratamiento térmico

del zumo de uvas a 62ºC por 30 minutos, para luego permitir que se llevara a cabo una

fermentación natural y obteniendo así un vino con mejor calidad, luego si se inoculaba en

condiciones asépticas el mosto (zumo de uvas) tratado térmicamente con un estárter

proveniente de aquel vino “bueno”, se obtendría un nuevo vino de las mismas calidades.

Bueno, esto en la teoría porque hoy día sabemos que la calidad del vino está ligado no solo a

la cepa de levadura, sino al tipo de uva y algunas de sus propiedades como el grado o

concentración de azúcar, actividad de agua, etc.


Así las cosas, desde el punto de vista del procesado de los alimentos, podemos encontrar

diversas formas de clasificación de procesos – tecnologías – Métodos que permiten obtener un

producto final con unas cualidades nutricionales y de seguridad.

Desde el punto de vista del empleo de calor o no, se han distinguido tradicionalmente dos tipos

de procesamiento de alimentos: aquellos que involucran tecnologías térmicas y los que

involucran tecnologías no térmicas (métodos más modernos para el procesamiento de

alimentos o tecnologías emergentes), acompañados en todos los casos del empacado que

buscan favorecer la calidad de los alimentos preservando su vida útil.

Según la naturaleza del método de conservación, se pueden distinguir a). La conservación

biológica; b). La conservación química, y; c) la conservación física. De acuerdo con la

modernidad de la tecnología podemos distinguir entre tecnologías tradicionales y tecnologías

emergentes.

Naturaleza

del método

Tecnología tradicional Tecnología emergente

Biológica Fermentación: ácido láctica (homo-

hetero); alcohólica, mixta ácido-

alcohólica.

Fermentación tradicional con cepas

que han sido modificadas

genéticamente (OMG).

Química Agentes Inorgánicos (sales, azúcar,

etc.).

Agentes orgánicos: ácidos,

ahumado, gases, antibióticos.

Films o recubrimientos químicos.

Uso de bacteriocinas: Sustancias de

origen biológico – conservación

bioquímica.

Física Temperaturas altas.

Temperaturas bajas.

Concentración.

Evaporación – Deshidratación.

Tecnologías térmicas: Calentamiento

Ohmico, Microondas, Cocción al vacío.

Tecnologías no térmicas: Altas

presiones hidrostáticas, Campos

magnéticos oscilantes, Campos

eléctricos pulsátiles, pulsos lumínicos

intensos, irradiación, Ultrasonidos.

4. Métodos para la estimación de la vida útil

La estimación de la vida útil de un alimento es un requisito fundamental, y esta debe figurar,

salvo ciertas excepciones, en la etiqueta de los mismos. Es variada la metodología empleada

para estimar la vida útil, algunos de estos métodos pueden parecer un tanto ortodoxos pero de

acuerdo con Labuza (1994) suelen ser válidos. Algunos de estos métodos serán expuestos de

forma breve, mientras nos centraremos en los métodos de determinación de la vida útil a

tiempo real y determinación rápida de la caducidad “Test de vida útil acelerado” (Acelerated

Shelf Life Determinaton, ASLD) por ser los más empleados (Dominic, 2004; Labuza, 1994).

4.1. Empleo de valores de referencia

La vida útil de un nuevo producto puede estimarse basándose en los datos publicados en

diferentes bases de datos tales como las del ejército de los EE.UU. o por Labuza en: Shelf-life


dating of foods (1982), pero el problema en este caso es que estos datos son muy limitados,

por lo que no tienen información adicional salvo para productos similares, además, la mayoría

de estos datos tienen derecho de autor y no pueden ser usados para la predicción de la vida

útil, salvo dentro de la misma empresa para líneas similares sin necesidad de realizar pruebas

experimentales.

4.2. Estimación mediante asignación de “Turn Over”

Una segunda aproximación para estimar la vida útil es el uso de tiempos de distribución

conocidos para productos similares, mediante el análisis de la información de las etiquetas de

los mismos. En este caso tampoco se requiere de comprobación previa si se está seguro de

tomar este riesgo. Si se está empezando a desarrollar un nuevo producto, puede necesitarse

en este caso datos para determinar el tiempo de almacenamiento en condiciones caseras

reales para conseguir una buena estimación de la vida útil. Si no existe ningún producto similar

en el mercado, este método no puede usarse.

4.3. Pruebas de abuso de distribuciones

Este método de pruebas de abuso de distribuciones puede emplearse en el caso de estar

seguros de la vida útil de un producto o si este ya se encuentra en el mercado. En este caso, el

producto es recogido del punto de venta y se mantiene en el laboratorio simulando las

condiciones caseras. Este método ha sido usado por varios investigadores, sobre todo en

aquellos casos cuando algunos estados o países cambian la legislación, pero a pesar de esto,

no ha sido ampliamente reportado encontrándose según Labuza (1994), un solo estudio en la

literatura reportado por Gacula y Kubala, en 1975. Este método reproduce la vida útil basado

en la distribución y condiciones de almacenamiento caseras.

4.4. Empleo de quejas o reclamos de los compradores

Otro acercamiento para evaluar la vida útil que no requiere ningún estudio inicial es usar las

quejas o reclamos de los consumidores como una base para determinar cuál es el problema

que está ocurriendo. En los EE.UU. la mayoría de las empresas manejan un número telefónico

gratuito de atención al consumidor en los empaques, y la información recogida a través de

este, se carga a una base de datos sistematizada que incluye el tipo de queja, localización, etc.

A partir de estos datos, el departamento de I&D puede obtener una idea sobre el problema que

está ocurriendo y el modo en que se presenta. Normalmente se acepta que por cada queja o

reclamo reportado, entre 50–60 casos no son reportados. Estos clientes representan una

proyección de tres años de pérdida de volumen de venta. A partir de estos datos, pueden

calcularse los costos en ingredientes, proceso, empacado o si los cambios de la distribución

serían económicamente factibles para mejorar la vida útil. Este acercamiento global puede

usarse en conjunto con cualquiera de los tres métodos descritos anteriormente.

4.5. Pruebas de vida útil a tiempo real

Este tipo de pruebas evalúa el efecto de la temperatura “normal” de conservación sobre las

propiedades microbiológicas, físico-químicas y sensoriales de un alimento durante un periodo

de tiempo, entendiéndose como temperatura normal aquella que será empleada durante la

conservación comercial del producto, p.ej., en la evaluación de la vida útil de un yogurt se

emplearía una temperatura de 4ºC, la cual es la temperatura a la que se conservará el producto

comercialmente. Para la determinación de la vida útil de un alimento deberán considerarse las

variables microbiológicas, físico-químicas y sensoriales que mayor influencia tendrán sobre la

calidad del producto.


En torno a la evaluación microbiológica se ha planteado toda una discusión sobre qué grupo de

microorganismos deberían considerarse para la determinación de la vida útil, por un lado

encontramos el empleo de los recuentos viables totales (aerobios o anaerobios mesófilos,

psicrótrofos o psicrófilos) ya que este grupo se considera en microbiología de alimentos como

un indicador del nivel de contaminación de un producto, sin embargo surge el planteamiento de

la diversidad de especies que podrían en un momento puntual integrar este grupo y de cómo

podrían cambiar de lote a lote, de un periodo de tiempo a otro, o dentro de un mismo proceso.

Entonces, ¿es seguro emplear este grupo como indicador de vida útil?......... Si se emplea este

recuento podríamos establecer que el valor máximo permitido oscilaría en torno a 106 ufc/ g o

mL, es decir, que la vida útil microbiológica caducaría en cuanto se alcance este nivel de

crecimiento en el producto final.

Desde mi punto de vista particular resulta más conveniente establecer la vida útil

microbiológica de un alimento cuantificando el crecimiento de microorganismos alterantes, y

dentro de este grupo establecer cuál de las especies es la que mayor incidencia va a tener

sobre la calidad final del producto. Por ejemplo, volvemos al caso del yogurt, en este producto

la vida útil podría evaluarse empleando el recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL). De todas

formas tampoco resultaría lógico emplear el recuento total de viables si sabemos que este

producto ha sido preparado empleando un cultivo iniciador o estárter.

4.6. Pruebas de aceleración de la vida útil (ASLT)

Las pruebas de aceleración de la vida útil es quizá la metodología más empleada hoy día para

calcular la vida útil de un alimento no perecedero o estable (alimentos esterilizados como por

ejemplo los enlatados). En esta técnica, se pretende estudiar varias combinaciones de

producto/empaque acabados bajo diferentes condiciones de abuso de temperatura,

examinando el producto periódicamente hasta el fin de la vida útil; los resultados obtenidos se

usan para proyectar la vida útil del producto bajo las verdaderas condiciones de

almacenamiento. Algunas empresas manejan base de datos de multiplicación microbiana

obtenidos del trabajo y la experiencia previa, los cuales emplean para obtener la vida útil real a

partir de los resultados encontrados en estas condiciones de abuso de temperatura.

Esta técnica se basa en la aplicación de la cinética de la velocidad de Arrhenius, el cual

establece que la velocidad de las reacciones químicas se duplica aproximadamente por cada

10ºC de aumento de la temperatura. Sin embargo, antes de establecer una sentencia final

sobre la validez o exactitud de predicción para una aplicación particular, es necesario examinar

una serie general de factores que influyen sobre la vida útil del producto. Estos incluyen (1)

propiedades estructurales / mecánicas de los alimentos, (2) propiedades extrínsecas tales

como la temperatura, Humedad relativa, atmósfera gaseosa, etc., (3) características intrínsecas

como el pH, aw, disponibilidad de nutrientes, potencial redox (Eh), presencia de

antimicrobianos, etc., (4) la interacciones microbianas y (5) factores relativos al proceso de

elaboración, mantenimiento y manipulación final.

Este método no está exento de problemas. Debe tenerse cautela en la interpretación de los

resultados obtenidos y su extrapolación a otras condiciones. Por ejemplo cuando se prueba

una relación producto/empaque, este empaque también tiene influencia sobre la vida útil y por

tanto si se modifica el empaque con permeabilidades diferentes al oxígeno, agua, anhídrido

carbónico durante el almacenamiento verdadero (almacenamiento comercial), la vida útil del

producto se tornara desconocida; y los resultados anteriores no pueden ser aplicables. Si las

condiciones de ASLT son escogidas de forma apropiada, y se usan los algoritmos adecuados

para la extrapolación, entonces la vida útil bajo cualquier distribución conocida puede ser

predecible. Estas predicciones son basadas en los principios fundamentales de pérdida de

calidad del alimento que se han descrito antes.


5. Estimación de la vida útil microbiológica: uso de herramientas predictivas.

Como ha sido comentado en muchas revisiones, la microbiología predictiva de alimentos se

constituye hoy por hoy en una herramienta valiosa para el sector agroindustrial, ya que permite

obtener resultados en menor tiempo minimizando el uso de materiales de laboratorio, mano de

obra, y reduciendo por tanto costos económico. Sin embargo, la microbiología tradicional aún

sirve de apoyo a la microbiología predictiva. El modelamiento predictivo que integra el

comportamiento microbiano con otras variables del proceso ha empezado a ganar interés en la

industria agroalimentaria para predecir la vida útil (Banks, 1994). Sin embargo, la determinación

de la vida útil es un tema complejo como es difícil predecir los efectos de las variables de

almacenamiento y las condiciones de abuso que un producto puede experimentar (Williams,

1992).

La gran variedad y número de microorganismos alterantes encontrados en los productos

alimenticios significa que los modelos de predicción de alteración son menos fáciles de

desarrollar que los modelos de microorganismos patógenos y su aplicación es mucho más

limitada (Pin y Baranyi, 1998). Al igual que ocurre con el análisis de riesgos y el HACCP, la

predicción de la vida útil debe considerar todas las etapas en la producción de un alimento.

Deben obtenerse datos exactos acerca de las materias primas utilizadas, la formulación de

productos, montaje de productos, técnicas de procesamiento, condiciones de higiene, tipo de

empacado empleado, almacenamiento y procesos de distribución y el manejo final del

consumidor. Sólo cuando todas estas áreas están representadas puede hacerse posible una

predicción fiable de la vida útil (McMeekin y Ross, 1996b; Dalgaard, 1995).

El realizar un estudio de vida útil puede implicar una amplia utilización tanto de recursos

tecnológicos como financieros. Sin embargo, el desarrollo de modelos de predicción podrían en

un plazo prudencial reducir el uso de estos recursos y mejorar el tiempo de utilización

(Neumeyer y col., 1997a). Los estudios se han llevado a cabo sobre una gran variedad de

alimentos para determinar la vida útil (por ejemplo en productos cárnicos: Devlieghere et al.,

1999; Kant-Muermans et al., 1997; Neumeyer et al., 1997a, b; Vankerschaver et al., 1996). Sin

embargo, estos estudios no han utilizado un modelo capaz de incorporar todas las variables

que puedan tener un impacto sobre el crecimiento microbiano. Los principales factores que

influyen en la estabilidad microbiana en los alimentos son la temperatura, pH y actividad de

agua. La temperatura en particular puede variar significativamente a través de la producción y

distribución (Geeraerd et al., 1998).

La mayoría de los estudios han utilizado modelos dependientes de la temperatura, tales como

el modelo de la raíz cuadrada (Ratwkosky et al., 1983) o el modelo de Arrhenius, y si bien es

cierto que con la mayoría de los alimentos la temperatura es el principal factor que afecta la

vida útil, no es la única variable (Einarsson, 1994; Gill y Jones, 1992a; Gill et al., 1988;

Einarsson y Ericksson, 1986). La mayoría de los modelos dinámicos propuestos (Baranyi et al.,

1993a, 1996b; Van Impe et al., 1995, 1992) es necesario el empleo de más de una variable

fluctuante para predecir con precisión la vida útil de los productos alimenticios. Los métodos

prácticos utilizados en la elaboración de modelos predictivos de vida útil necesitan avanzar más

(McDonald y Sun, 1999). Los métodos estándares de análisis microbiológicos aunque son

eficaces aún son lentos. Las investigaciones futuras deberían tener en cuenta el corto período

de vida de gran parte de alimentos refrigerados y el hecho de que los resultados son

necesarios rápidamente (Gibbs y Williams, 1990). El uso de técnicas microbiológicas más

rápidas que las actuales será necesario en el futuro.

Vamos a explicar dos métodos clásicos para la determinación de la vida útil de alimentos, un

primer modelo desarrollado por Monod-Hinshelwood para la estimación de la caducidad


microbiológica y en segundo lugar, el modelo de Arrhenius empleado fundamentalmente en la

estimación de la caducidad físico-química, aunque puede emplearse en la estimación

microbiológica como veremos en el ejercicio descrito en el numeral 6.

De todas formas cabe recordar que los modelos de predicción microbiológica son en muchos

casos generales y variados y por tanto pueden extrapolarse para la estimación microbiológica

de la vida útil de diversos alimentos.

5.1. El modelo de Monod-Hinshelwood (descrito por McMeekin y Ross, 2002)

Esta aproximación puede ser usada para el cálculo de la vida útil microbiológica. En palabras

de McMeekin y Ross (2002) “la experiencia ha mostrado que para la mayoría de los casos

donde están implicadas asociaciones de microorganismos alterantes, el tiempo en el cual

ocurre o se desarrolla la alteración de los alimentos está directamente relacionada con el

tiempo de generación de aquel microorganismo que juega el papel predominante en dicha

asociación”. Esto es, que si conocemos la microbiota alterante predominante en los alimentos

perecederos y sabemos cómo cambia su población en el tiempo (si asumimos que la

ocurrencia de alteraciones específicas se da después de la fase de latencia), puede

establecerse la vida útil del mismo mediante la siguiente relación (aproximación de Monod-

Hinshelwood):

𝑡𝑠 = log𝑁𝑠 − 𝑙𝑜𝑔𝑁0

𝑙𝑜𝑔2× 𝑇𝑔

Donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteración bajo las mismas

condiciones extrínsecas e intrínsecas medidas; Ns (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la

población de seguridad (valor máximo permisible antes de considerarse alterado el producto);

N0 (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la población inicial presente en el producto; Tg es

el tiempo de generación de la población alterante específica. Así una vez Ns y Tg han sido

determinados para esas condiciones de almacenamiento, es muy fácil determinar el tiempo de

vida útil reemplazando en la fórmula anterior, y por tanto, puede establecerse el mantenimiento

de la calidad de estos productos bajo estas condiciones. Por lo tanto, todo lo que se requiere

para estimar la vida útil de ese alimento es conocer la población inicial (N0).

Si la anterior aproximación se aplica a diferentes temperaturas, entonces puede evaluarse el

efecto de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano, transformando los datos de velocidad

de crecimiento o tiempo de generación en una gráfica de dependencia de la temperatura (como

ha sido usada por Mossel e Ingram, 1955), y obtener una constante que indique como cambia

la velocidad de crecimiento con el cambio de la temperatura. En este caso debería

considerarse calcular k a diferentes intervalos de temperatura constantes (por ejemplo el

modelo de Q10; el cual muestra como varía k cada vez que se incrementa o disminuye en 10ºC

la temperatura de almacenamiento.

Un modelo similar había sido establecido por Svante August Arrhenius (Sueco, 1859-1927) en

1889, cuando descubrió que la velocidad de las reacciones químicas aumenta con la

temperatura, en una relación proporcional a la concentración de moléculas existentes.

5.2. El modelo de Arrhenius (efecto de la temperatura sobre la velocidad de alteración)

Las aproximaciones modernas de la Microbiología Predictiva de Alimentos han tratado de

entender y establecer un vínculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que

regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, etc.


La gran mayoría de los modelos secundarios son modelos de tipo cinético (McDonald y Sun,

1999; Labuza y Fu, 1993), de los cuales el más comúnmente usado ha sido el modelo de

Arrhenius.

Los modelos cinéticos para la determinación de la vida útil en alimentos son generalmente

basados en la ocurrencia de fenómenos y estos no han sido desarrollados para un alimento en

particular. Sin embargo, los parámetros experimentales y ambientales de un modelo pueden

aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es normalmente considerada

como el factor más importante en las reacciones de deterioro de los alimentos, especialmente,

para la alteración microbiana donde la velocidad de crecimiento específico y la fase de latencia

son altamente dependientes de la temperatura (Giannuzzi et al., 1998). La ecuación de

Arrhenius fue derivada empíricamente basada en consideraciones termodinámicas (Labuza y

Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reacción cambia cuando se emplean

diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994). La forma más simple de esta

ecuación es:

k = A 𝑒−𝐸𝑎𝑅𝑇

o

ln 𝑘 = ln𝐴 − 𝐸𝑎𝑅𝑇

Donde, k es la velocidad de reacción; A {(ufc/ml, g o cm2)/tiempo} es un factor pre-exponencial

–parámetro a ser determinado (intercepto de “y” en una gráfica de Lnk vs 1/T) –, R es la

constante de los gases (8.314 J mol-1

K-1

), T es la temperatura absoluta (K), y Ea es

denominada como la energía de activación de la reacción límite de velocidad-crecimiento (Ross

y McMeekin, 1994). Si en la ecuación anterior los valores de k son calculados a diferentes

temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una línea recta en la cual la

pendiente (m) es igual –Ea/R (Dominic, 2004; McDonald y Sun, 1999; Labuza et al., 1992;

Labuza y Riboh, 1982). Así el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificación de

Whiting y Buchanan (1993) como un modelo secundario.

Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el

crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento específico

(Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi et al., 1998), y la ecuación de Arrhenius puede escribirse

como:

μ = A 𝑒−𝐸𝜇𝑅𝑇

Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las gráficas

pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuación anterior no puede encajar muy bien por

debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas de crecimiento. Entonces, las

gráficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de

temperatura (McDonald y Sun, 1999; Labuza y Fu, 1993). Así la ecuación que ha sido utilizada

mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es

el modelo de la raíz cuadrara propuesto por Ratkowsky et al., en 1982 (Giannuzzi et al., 1998;

Neumeyer et al., 1997; Willocx et al., 1993; Adair et al., 1989).

𝜇 = 𝑔 ∗ (𝑇 − 𝑇0)


6. Ejercicio de estimación de la vida útil empleando modelos predictivos y test

acelerados de tiempo.

En el proceso de pasteurización de la leche a 72°C por 15 segundos se busca reducir la carga

total microbiana un 99,99%. El producto está pensado para ser mantenido en condiciones de

refrigeración (4ºC ± 0,5ºC). La variable microbiológica a controlar es el recuento total de

viables, cuyo límite máximo de crecimiento permitido es 4x104 ufc/ml. Si la carga inicial es de

10x106 bacterias por ml, al final del proceso se detecta que la población final remanente es de

1000 ufc/ml.

Determine la vida útil a 4ºC empleando los datos del test acelerado de tiempo durante 12 horas

mostrados a continuación:

Tiempo (min) 10ºC 20ºC 30ºC

ufc/ml

0 1000 1000 1000

58 1047 1479 3162

115 1096 2188 9772

173 1148 3236 30903

230 1202 4786 95499

288 1259 7079 295121

346 1318 10471 912011

403 1380 15488 2818383

461 1445 23442 8128305

518 1514 34674 21379621

576 1585 51286 45708819

634 1660 75858 75857758

691 1738 112202 100000000

749 1820 165959 112201845

Para el cálculo de la vida útil pueden emplearse varios modelos predictivos, pero vamos a

comenzar con la aproximación de Arrhenius.

1. El primer paso una vez obtenida la población en unidades logarítmicas (ln ufc ml-1

) es

calcular la velocidad de crecimiento específica (µ) para cada temperatura. Esta puede

obtenerse de diversas maneras, una es graficando en las ordenadas el ln ufc ml-1

en fase

exponencial y en las abscisas el tiempo (min), y a partir de esta gráfica obtener la

ecuación de la recta en cuyo caso la pendiente es igual a la velocidad de crecimiento

específica (ufc ml-1

min-1

). Otra forma es calculando µ a partir de la siguiente expresión:

𝜇 = 𝑙𝑛𝑁𝑓 − 𝑙𝑛𝑁0

(𝑡𝑓 − 𝑡0)

También puede emplearse el uso de software específicos como el DMFit, MicroFit, etc.


10ºC – (283K) 20ºC (293K) 30ºC (303K)

µ (ln ufc/ml*min) 0,000799 0,006838 0,019400

1/T (1/K) 0,003534 0,003413 0,003300

2. Con los resultados de µ para cada temperatura procedemos a calcular las constantes del

modelo de Arrhenius: energía de activación (Ea) y el Factor pre-exponencial A. Para este

caso graficaremos en las ordenadas el lnµ a cada temperatura y en las abscisas el inverso

de cada temperatura absoluta (1/T). Recordemos que cuando se grafica de esta forma, la

pendiente de la recta (m) que se obtiene es igual a: –Ea/R (y que por tanto Ea = –m*R,

que en todos los casos será positiva); y el intercepto en el eje “y” cuando X=0 es el factor

pre-exponencial en logaritmo (LnA).

Figura 1. Relación entre la velocidad de crecimiento vs temperatura mediante la

cinética de Arrhenius

De la gráfica podemos inferir que:

Ea = – (m*R)

R = 8,314472 J mol-1

K-1

Ea = – (–13679 Ln ufcK/ml*min * 8,314472 J/molK)

Ea = 113733,662 Ln ufc*J/ml*min*mol.

LnA = 41,371 Ln ufc/ml*min

3. Una vez obtenidos los parámetros procedemos a calcular µ a 4ºC (277ºK) reemplazando

en la ecuación de Arrhenius.

Ln𝜇 = Ln𝐴 − 𝐸𝑎𝑅𝑇

Ln𝜇 = 41,371(Lnufc

ml ∗min)−

113733,662 (Ln ufc ∗ J

ml ∗min ∗mol)

8,314472 (J

mol ∗ K) ∗ 277K

Ln 𝜇 = 43,27(Ln ufc

ml ∗min)− 47,13 (

Ln ufc

ml ∗min)

y = -13679x + 41,371R² = 0,9688

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 0,00345 0,0035 0,00355

Ln

µ (

Ln

ufc

/ml*

min

)

1/T (1/°K)


ln𝜇 = − 8,01167Ln ufc

ml ∗min

μ = 0,0003316Ln ufc

ml ∗min

Por tanto, la velocidad de crecimiento específico a 4ºC es de 0,0003316 Ln ufc/ml*min.

4. Procedemos a estimar entonces la vida útil a 4ºC. Si nuestro valor límite es 4,0x104

ufc/ml

(10,5966 Ln ufc/ml). Si tenemos que por cada minuto se incrementa 0,0003316 Ln ufc/ml

{recordemos que µ se obtiene del Ln ufc/ml vs tiempo (min)}, en cuanto tiempo se

alcanzarán las 10,5966 Ln ufc/ml que es nuestro valor límite?

5. Podemos usar una sencilla regla de tres:

1 min 0,0003316 ln ufc/ml

X? 10,5966 ln ufc/ml

𝑋 = 1𝑚𝑖𝑛 ∗ 10,5966 𝐿𝑛 𝑢𝑓𝑐/𝑚𝑙

0,0003316 𝐿𝑛 𝑢𝑓𝑐/𝑚𝑙

X = 31955,97 minutos, aproximadamente 31956 minutos, o el equivalente a 22

días.

Con el empleo de la cinética de Arrhenius, obtendríamos un producto con una vida útil

media de 20 a 22 días si se conserva a temperatura de 4°C.

Si usamos la aproximación de Monod-Hinshelwood, debemos conocer el tiempo de generación

a la temperatura problema, en este caso a 4ºC.

1. El primer paso y para este caso, debemos calcular k para cada temperatura, aunque

tenemos varias opciones, emplearemos en este caso la fórmula:

𝑇𝑔 = 𝑙𝑛2

𝜇

Donde Tg equivale al tiempo de generación.

10ºC – (283K) 20ºC (293K) 30ºC (303K)

µ 0,000799 0,006838 0,019400

Tg = (0,693/µ) 867,33 min 101,35 min 35,72 min

2. El segundo paso es graficar el Log10Tg para cada temperatura experimental en las

ordenadas y la Temperatura en las abscisas.


Figura 2. Relación entre el tiempo de generación (expresado en unidades Log10) vs

temperatura de crecimiento.

3. A partir de la ecuación de la recta calculamos el Log10Tg a 4ºC.

Si y = –1,27ln(x) + 5,8484, entonces a 4ºC (x).

Log10Tg = –1,27*ln(4) + 5,8484

Log10Tg = –1,27*1,386 + 5,8484

Log10Tg = –1,761 + 5,8484

Log10Tg = 4,0878

Tg = 104,0878

Tg = 12240,7 min a 4°C

4. Con los datos anteriores de Tg a 4ºC, procedemos a establecer la vida útil mediante la

ecuación:

𝑡𝑠 = Log𝑁𝑠 − 𝐿𝑜𝑔𝑁0

𝐿𝑜𝑔2× 𝑇𝑔

𝑡𝑠 = 4,602 − 3

0,301× 12240,7 𝑚𝑖𝑛

𝑡𝑠 = 65148,16 𝑚𝑖𝑛

𝑡𝑠 = 45,2 𝑑í𝑎𝑠

Con el empleo del modelo de Monod-Hinshelwood, obtendríamos un producto con una

vida útil media de 45 días si se conserva a temperatura de 4°C.

y = -1,27ln(x) + 5,8484R² = 0,9978

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

0 5 10 15 20 25 30 35

Lo

g10

Tg

(min

)

Temperatura (°C)


7. Conclusión.

Si la vida útil estimada para este producto a 4ºC es de 22 días con el modelo de Arrhenius,

como margen de seguridad puede establecerse una vida útil de 18 a 20 días a 4ºC. Sin

embargo, con la aproximación de Monod-Hinshelwood la vida útil se ve prolongada a 45 días.

En este caso como margen de seguridad podríamos establecer una vida útil de 40 días.

Tal y como explica Labuza y Fu (1993) o McDonald y Sun (1999), cuando se emplea el modelo

de Arrhenius para el crecimiento bacteriano, las extrapolaciones de las gráficas pueden no

mostrar linealidad, y por lo tanto, el modelo anterior no puede encajar muy bien por debajo o

por encima de las temperaturas evaluadas para el crecimiento, lo anterior puede evidenciarse

al comparar las Figuras 1 y 2, donde se observa que la relación tanto de la velocidad de

crecimiento como del tiempo de generación frente a la temperatura no es lineal, sino de tipo

exponencial o logarítmico, es decir, se asemeja más al proceso de crecimiento bacteriano, que

por regla general es fisión binaria, la cual es de tipo exponencial. Claro que debemos recordar

que no todas las bacterias siguen este proceso de crecimiento tal y como ocurre con

Streptomyces spp. (Formación de hifas y esporulación); Mixobacterias (Formación de cuerpos

fructíferos y esporulación); Hyphomicrobium spp. (Gemación); Nocardia spp. y Micoplasmas

(Formación de filamentos y septación).

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Anexo 1. Diversos valores de R (Constante de los gases ideales).

Valor de R Unidades (V·P·T-1·n-1)

8.314472 J·K-1·mol-1

0.0820574587 L·atm·K-1·mol-1

83.14472 cm3·bar·mol-1·K-1

8.20574587 × 10-5 m3·atm·K-1·mol-1

8.314472 cm3·MPa·K-1·mol-1

8.314472 L·kPa·K-1·mol-1

8.314472 m3·Pa·K-1·mol-1

62.36367 L·mmHg·K-1·mol-1

62.36367 L·Torr·K-1·mol-1

83.14472 L·mbar·K-1·mol-1

0.08314472 L·bar·K-1·mol-1

1.987 cal·K-1·mol-1

6.132440 lbf·ft·K-1·g-mol-1

10.73159 ft3·psi·°R-1·lb-mol-1

0.7302413 ft3·atm·°R-1·lb-mol-1

998.9701 ft3·mmHg·K-1·lb-mol-1

8.314472 × 107 erg·K-1·mol-1

Aplicación de la Microbiología Predictiva en la determinación de la vida útil de los alimentos

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