Aplicacin de enzimas

en Qumica orgnica

Procesos de Qumica Sostenible utilizando enzimas como catalizadores

Curso Posgrado Ciencias y Tecnologas Qumicas

1 aplicacin de enzimas en quimica organica : sintesis del R-Mandelonitrilo 1908 > 13.000 referencias de la utilizacin de enzimas desde mediado de 1970s El nmero de aplicaciones biocataliticas crece debido a: Mas quimicos organicos aceptan el uso de biocatalizadores

Aumenta el numero de nuevas enzimas que han sido identificadas

Aumenta el numero de enzimas disponibles comercialmente (Fluka, Sigma, Amano, Jlich Fine Chemicals, Novozymes, Diversa, Roche,etc..)

Enzimas ofrecen alta quimio-,regio- y estereoespecificidad

Aumenta la demanda de compuestos opticamente puros (eg. farmacos, cosmeticos, industria alimentacin)

Produccion de enzimas mas facil y barato

Mejora en la estabilidad enzimatica

Biocatalisis reduce los pasos de reaccion comparado a sintesis organica.

Biocatalisis es mas segura y Tecnologia Verde. Condiciones Suaves

Enzimas en Sintesis Orgnica

Curso Posgrado 2012

Drauz, K., Waldmann, H., Enzyme Catalysis in Organic Synthesis Faber, K., Biotransformation in Organic Chemistry

Curso Posgrado 2012

Oxidoreductasas (EC1)

Catalizan reacciones de oxidacin y reduccin

25% de todas las enzimas conocidas Dependiente de cofacor: NADH, NADPH Reciclaje del cofactor necesario Uso de celulas enteras Deshidrogenasas Oxigenasas Peroxidasas

Curso Posgrado 2012

NAD(P)+ NAD(P)H

N

N N

N

NH2

O

HO OH

CH2 OPO

O-OP

O

O-O CH2 N

NH2

O

OOR' HO

N

N N

N

NH2

O

HO OH

CH2 OPO

O-OP

O

O-O CH2 N

NH2

O

OOR' HO

HH

3.10 a, R' = Hb, R' = PO3=3.11

Curso Posgrado 2012

O

OHO

OH

P

P

H+ and 2 electrones son transferidos desde la unidad nicotimanida a la molecula aceptora cetona o ceto-cido Reaccion normalmente altamente estereoselectiva Sistemas de celulas enteras (eg levadura de panaderia) Mas recientemente enzimas aisladas Necesario acoplamiento de enzima regeneradora del cofactor.

Deshidrogenasas (EC 1.1.1.; EC 1.2.1., EC 1.4.1.) Curso Posgrado 2012

La aplicacin ms importante de oxidoreductasas en quimica organica Alcohol deshidrogenasa (ADH) en sntesis de alcoholes opticamente activos ADH en sntesis de cido 3-oxo-5-hidroxi- opticamente activos NAD(P)H regenerado directamente desde isopropanol Alta estabilidad de ADH en isopropanol y acetona

Deshidrogenasas: Sntesis de alcoholes y hidroxiacidos quirales

Curso Posgrado 2012

Otros Mtodos: fermentacin (e.g., Corynebacterium glutamicum productor de L-glutamateo, L-lisina) extraccin de hidrolisados de proteinas (e.g., L-cisteina, L-leucina, L-tirosina) Sintesis qumica: racematos Sintesis enzimatica: resolucion de racematos (esterasas, amidasas)

Curso Posgrado 2012

Deshidrogenasas: Sntesis de aminoacidos

Nutricin y aplicaciones mdicas

Acido glucnico

Y. Yang, Tetrahedron: Asymmetry. 2007,18,1799.

O

acetofenona

OHAlcohol Deshidrogenasa YMR226c 100 % (S)

ee>99% H2O

Curso Posgrado 2012

NADPH NADP+

glucosa

D-glucosa Deshidrogenasa

OH O

O O

(-)-calistatina A

OtBu

O OCl

O

OtBu

O OCl

OH

Alcohol deshidrogenasa

Reduccin asimtrica enzimtica de cetonas

H2O

E. Garcia-Urdiales et al. Chem. Rev. 2005, 105, 313.

NADPH NADP+

Curso Posgrado 2012

monooxigenasas - introduce una molecula de oxigeno dioxigenases - introduce dos moleculas de oxigeno Alta regio y estereoselectividad Reacciones complejas por mtodos quimicos (ej, hidrocarburos no activados) Limitaciones: bajos rendimientos, estabilidad

Oxigenasas (EC 1.13.; EC 1.14.) Curso Posgrado 2012

RH + O2 + NADPH + H+ ROH + H2O + NADP+

Citocromo P450 oxidasas: Oxidacin de intermedios metablicos: lpidos, hormonas esteroideas,etc.. Hemoproteinas: cofacor hemo

Curso Posgrado 2012

Building blocks para sintesis de polimeros, intermedios en sintesis de antibioticos, ingredientes de perfumes Hidroxilacin de acidos grasos de cadena larga (C12-C18) en posicin terminal () y subterminal (-1, -2

Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (I)

Curso Posgrado 2012

Sntesis de intermedios agroqumicos mediante hidroxilacion microbiana de heteroatomos (procesos LONZA)

A c h r o m o b a c t e r

P s e u d o m o n a s sp.

Oxigenasas: sintesis de acidos carboxilicos hidroxilados (II) Curso Posgrado 2012

Hidroxilacin de alcanos de cadena corta (ej., propanol, (R)-2-hexanol) productos qumicos commodity disponibles por biotransformacin

Curso Posgrado 2012 Oxigenasas: sintesis de alcoholes

Monooxigenasas Baeyer-Villiger- homologo biocatalitico a la oxidacion BV quimica Baja Estereoselectividad en BV por via qumica Alta estereoselectividad del proceso biocatalitico oxidacin de cetonas ciclicas y no ciclicas

Oxigenasas: sintesis de lactonas y esteres Curso Posgrado 2012

Enzimas dependiente de un grupo Hemo con hierro (Fe) o Vanadio (V) Usan peroxido o peroxido de hidrogeno como oxidante reaccion natural: HCl + H2O2 HOCl + H2O (cloroperoxidasa) Reacciones no naturales: oxidacin estereoselectiva de compuestos aromaticos

Peroxidasas (EC 1.11.1.-) Curso Posgrado 2012

NADH peroxidasa (EC 1.11.1.1), glutation peroxidasa (EC1.11.1.9) iodo peroxidasa (EC 1.11.1.8)

Peroxidasas: sintesis de alcoholes Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012 Peroxidasas: sintesis de alcanos epoxidados

Hidrolisis de enlaces C-O, C-N, C-C y otros enlaces Enzimas mas utilizadas en quimica organica No necesita cofactor Gran numero de enzimas disponibles comercialmente Reaccion reversible (esterification, amidacion, aminolisis, etc..) Relativa alta estabilidad bajo condiciones no naturales Amplio rango de sustratos

Hidrolasas (EC 3) Curso Posgrado 2012

Lipasas EC 3.1.1.3 Esterasas EC 3.1.1.1 Proteasas (peptidasas) EC 3.4 Amidasas and Acilasas EC 3.5

Las enzimas mas frecuentemente usadas en sintesis organica Funcion natural: hidrolisis de trigliceridos (aceites y grasas) Aplicacin: detergentes lavanderia, modificacion natural de aceites y grasas, etc., sintesis de pcompuestos opticamente puros

Acidos grasos glicerol

Lipasa

Diglicridos

Lipasa Lipasa

O

O

O

O

nO

nO

n

O

OH

O

O

n

O

n

OH

O

O

O

nO

n

OH

O

OH

O

n

OH

OH

O

O

n

HO

HO

HO

O

nO

nO

n

OH

OH

OH

Triglicridos

Monoglicridos

Lipasas EC 3.1.1.3

Curso Posgrado 2012

mecanismo de hidrolisis:

Lipasas EC 3.1.1.3 Curso Posgrado 2012

E: razon enantiomerica (calculado a partir de ee y conversion)

ee: exceso enantiomerico

Lipasas: resolucin de alcoholes

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

Burkholderia cepacia BCL (anteriormente: Pseudomonas cepacia) (Fluka, Amano)

Candida antarctica fracccin B (CAL-B) (Novozymes: Novozyme435, Chirazyme)

Lipasas: resolucin de alcoholes

Curso Posgrado 2012

Lipasas: resolucin de cidos y esteres Curso Posgrado 2012

Cl OMe

Olipasa

Cl OMe

O

Captoprilo

Proceso DSM

Candida cylindracea

Curso Posgrado 2012

ee>99% E>100

Cproducto=100%

S-B. Ko et al.J. Org. Chem. 2007, 72, 6860-6864

OHLipasa inmovilizada

OAc

AcO100 % (R)

OH

+ 25C

Ph

Ph

Ph Ph

Ph

RuOC

PPh3Br

AgO 25C racemizacin

Curso Posgrado 2012

Lipasas: combo catalisis- Resolucion cinetica dinmica

Curso Posgrado 2012

BASF

Lipasa Burkholderia sp.: produccion en escala muti-tonelada de aril alquilaminas, alquilaminas, aminoalcoholes

Hidrolisis de esteres Solo algunas aplicaciones en sintesis de compuestos opticamente puros Moderada enantioselectividad y limitada disponibilidad comercial Esterasa de higado de cerdo (PLE)

Esterasas EC 3.1.1.1 Curso Posgrado 2012

Esterasa de higado de cerdo (PLE): extraccion directa, mezcla de isoenzimas Amplia especificidad de sustrato y alta estereoselectividad

esterasa de Bacillus subtilis: sntesis de Naproxeno (antiinflamatorio)

Curso Posgrado 2012 Esterasas: resolucin de cidos carboxilicos

esterasa de Arthrobacter globiformis: sntesis del acido crisantemico

Hidrolisis y sintesis de enlaces amido Sintesis termodinamicamente controlada: desplazamiento del equilibrio en presencia de disolventes, aumento de concentracion de producto de partida, o eliminando el producto Sintesis cineticamente controlada: activacion del grupo carboxilo (ester o amida).

Proteasas EC 3.4, Amidasas y Acilasas (EC 3.5)

Curso Posgrado 2012

Ventajas metodo enzimatica: suave condiciones de reaccin, alta regioselectividad, no racemizacion

Curso Posgrado 2012

NutraSweet

Proteasas: sntesis de pptidos

Kiotorfina (analgesico)

Aspartamo (x200 edulcorante)

Asp

Phe

Tyr Arg

Neotame (x8000-130000 edulcorante)

Phe

Asp

Penicillina G acilasa

Curso Posgrado 2012 Proteasas: sntesis de antibioticos -lactamicos

Fosfatasas-quinasas

Treonina/ serina PP

Curso Posgrado 2012

ADP ATP

Tirosina PP

Sacarosa PP

Desfosforilacin

Fosforilacin

ATPADP

Acetatoquinasa

HO OH

OH

HO OPO32-

OH

OPO32-

O

OH

O

Glicer ilquinasa

Curso Posgrado 2012

Fosforilacin de glicerol mediante gliceril quinasa (GQ)

(GQ)

Mas de 30 identificadas

Aldolasas tipo I: animales y plantas; activacion del donor por formacion de base de schiff como intermedio Aldolasas tipo II: bacterias y hongos y contienen un cofactor Zn2+ en el sitio activo Formacin del enolato: determinante Alta tolerancia de aceptores, restringido en sustratos donores

Aldolasas (EC 4.1.2.13) Curso Posgrado 2012

Aldolases: liasas que catalizan adicion estereoselectiva de un donor cetona a un aceptor aldehido (condensacion aldolica).

cetona

aldehido

enolato

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Fructose-1,6-bisphosphate_aldolase_4ALD_wpmp.png

Tipo I

b

a

R

O

X

Lys

NH

RX

H R'

O

His

NN

R

OX

H

Zn2+

H R'

O

donor

acceptor

acceptor

:

Mecanismo formacin de imina

Catalizado ion metalico

Curso Posgrado 2012

Tipo II

Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012 Nomenclatura de aldolasas

Curso Posgrado 2012 Aldolasas

Enlace c-c, genera centro estereognico

Curso Posgrado 2012 Aldolasas

Dos centros estereognicos

Dos centros estereognicos

Alfa y beta: Endoglicosidasas (END) Exoglicosidasas (EXO) Glicosintasas

Glicosidasas (EC 3.2.1)

Curso Posgrado 2012

EXO END

Curso Posgrado 2012 Glicosidasas en sintesis de oligosacaridos

-galactosidasa

Curso Posgrado 2012

Glicosintasas en sintesis de glicoderivados Curso Posgrado 2012

Curso Posgrado 2012

N

S

COOH

S

N N

S

HN

ONN

NN

O

Cefazolina

N

S

COOH

H2N

O OAc

N

S

COOH

OAc

HN

OO

NH2

HOOC 3

Cefalosporina C

HOOHO

OH

OH

OH

N

S

COOH

OAc

HN

ONN

NN

O

Clulas Cephalosporium acremonium ATCC 48272

-Econmico -Regio y Enantioselectivo -Limpio -Alto rendimiento

D-amino oxidasa/ Glutaril acilasa

Penicilina G acilasa

HS

N N

S

OH

ONN

NN

pH 7, 30C, H2O

pH 7, 30C, H2O

Sntesis de Cefazolina: Uso de mtodos Biocatalticos

Curso Posgrado 2012

4 pasos

Ruta Qumica

N

S

COOH

OAc

HN

OO

NH2

HOOC 3

Cefalosporina C

N

S

COOH

S

N N

S

HN

ONN

NN

O

Cefazolina

N

S

COOH

H2N

O OAc

6 pasos

4 pasos

Woodward Premio Nobel 1965

-Disolventes txicos -Pasos de Purificacin -Bajos rendimientos

Sntesis de Cefazolina: Ruta Qumica

Curso Posgrado 2012

27 pasos

17 pasos

L-cisteina

C. Cuevas y col. Org. Lett..2000, 2, 2545.

Ecteinascidina ET-743

Cianosafracina B

20 pasos

Pseudomonas fluorescens

Escala Kg

E.J. Corey. J.Am.Chem.Soc,1996,118,9202.

Semisintesis de Ecteinascidina ET-743 a partir de Metabolitos

Sntesis Total: 32 pasos

Ikeda, Y. et al. J. Antibiot. 1983, 36, 1279.

pH 7, 30C, H2O

Fermentacin

Curso Posgrado 2012

http://images.google.es/imgres?imgurl=http://www.scienceclarified.com/images/uesc_02_img0068.jpg&imgrefurl=http://www.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html&h=423&w=327&sz=59&hl=es&start=18&tbnid=as1v8Y1iMKG7_M:&tbnh=126&tbnw=97&prev=/images%3Fq%3Dbacteria%2Bpseudomonas%2Bfluorescens%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D%26sa%3DN

Anlogo 1700 veces mas soluble en agua

Lipasa C. antarctica

Modificacin enzimtica del Taxol: Mejora Biodisponibilidad

Termolisina

acilacin

hidrlisis

Curso Posgrado 2012

desglicosilacin

Glicosilacin enzimtica

Diversificacin qumica

Vancomicina

Sntesis enzimtica de anlogos de Vancomicina Curso Posgrado 2012

Sntesis de azucares a partir de glicerina HO OH

OHGlicerol

HO OPO32-

OH

HO OPO32-

O

O

OPO32-

OHDHAP

H

OH

OPO32-

OOH

2-O3POOH

D-fructosa 1,6-difosfato

Gliceril-1-fosfato

Fructosa 1,6-dif osfatoaldolasa

DHAPdeshidrogenasa

Glicer ilquinasa

+

ATP

ADP

Acetatoquinasa

OPO32-

O

OH

O

Gliceraldehido-3-fosfato

gliceraldehidofosf atodeshidrogenasa

NAD+

NADHO2

H2O2

NADH oxidasa

catalasaH2O O2

NAD+

NADH O2

H2O2

NADH oxidasa

catalasaH2OO2

Curso Posgrado 2012

Nmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17Nmero de diapositiva 18Nmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Nmero de diapositiva 22Nmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24Nmero de diapositiva 25Nmero de diapositiva 26Nmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31Nmero de diapositiva 32Nmero de diapositiva 33Nmero de diapositiva 34Nmero de diapositiva 35Nmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Nmero de diapositiva 38Nmero de diapositiva 39Nmero de diapositiva 40Nmero de diapositiva 41Nmero de diapositiva 42Nmero de diapositiva 43Nmero de diapositiva 44Nmero de diapositiva 45Nmero de diapositiva 46Nmero de diapositiva 47Nmero de diapositiva 48Nmero de diapositiva 49Nmero de diapositiva 50Nmero de diapositiva 51Nmero de diapositiva 52Nmero de diapositiva 53