ANÁLISIS DE LA TIPIFICACIÓN DE LEUCEMIAS POR CITOMETRÍA DE …

ANÁLISIS DE LA TIPIFICACIÓN DE LEUCEMIAS POR

CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD

JAVERIANA

OLGA MERCEDES PEÑA SERRATO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2000

ANÁLISIS DE LA TIPIFICACIÓN DE LEUCEMIAS POR

CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD

JAVERIANA

OLGA MERCEDES PEÑA SERRATO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

para optar el título de

BACTERIÓLOGA

DIRECTOR

JOHN MARIO GONZALEZ M.D. Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

BACTERIOLOGÍA

BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2000

2

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946: "La

Universidad no se hace responsable por los conceptos

emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado.

3

A Dios porque durante estos cinco años, al igual que durante toda mi vida, ha

estado a mi lado, levantandome en mis caidas y celebrando mis triunfos .

A mis padres al igual que a mis hermanos, especialmente a John Jairo, porque con su amor cariño y ayuda he logrado culminar esta etapa de mi vida, sin ustedes, sin su esfuerzo

sin sus deseos para que me superara, esto nunca habría sido posible.

A mis amigas del alma : Diana, Susana, y Constanza porque

estuvieron conmigo todo este tiempo compartiendo mis alegrias y tristezas, siempre estuvieron ahí

incondicionalmente, comprendiendome y brindandome su mano cuando más lo necesitaba.

A mis profesores, especialmente la Dra. Martha Mesa y el

Dr. Hugo Diez, porque me otorgaron los mejores conocimientos, y me enseñaron que para lograr lo que uno

desea hay que luchar bastante.

A todas estas personas, quiero decirle.... GRACIAS y aunque es una palabra tan corta, reune todos mis deseos de

comunicarles que para y por ustedes logré llegar a esta último escalón de mi carrera.

Siempre los llevare en mi mente y en mi corazón !

4

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Dr. Jhon Mario Gonzalez, Director de la unidad de

citometría de flujo, miembro del grupo de inmunobiología, y

profesor del departamento de microbiología de la Pontificia

Universidad Javeriana (PUJ), por haberme brindado esta

oprtunidad y haberme permitido demostrar mis capacidades como

estudiante al igual que como persona. Igualmente, agradezco a la

Dra Ana Maria Uribe, Dierctora del Departamento de Patología del

HUSI, Dra Jorleth Agudelo Forero y Dra Raquel Sandoval,

Bacteriologas del Centro Javeriano de Oncología, Dra Lucila

Zambrano, Directora de la Unidad de Citogenética del Instituto de

Genética Humana del PUJ, y a la Dra Luz Elena Parra, Directora

del Departamento de Estadística y Archivo del HUSI; a todas

ellas, por haberme colaborado en la recolección de la información

de la base de datos de este estudio y en su momento, por

haberme otorgado conocimientos propios de este trabajo.

5

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

1. Introducción 1

2. Marco Teórico 3

2.1. Hematopoyesis 3

2.1.1. Eritropoyesis 5

2.1.1.1. Ontogenia de Marcadores Celulares 7

2.1.2. Megacariopoyesis 7


2.1.3. Granulopoyesis 8

2.1.4. Monopoyesis 8

2.1.4.1 Ontogenia de Marcadores Celulares 10

2.1.5 Linfopoyesis 11


2.2. Leucemias 14

2.2.1. Leucemias Agudas 14

2.2.1.1. Etiología 15

2.2.1.2. Clasificación 15

2.2.1.3. Leucemia Linfoide Aguda (LLA) 16

2.2.1.3.1. Citoquímica 16

2.2.1.3.2. Características Clínicas 17

2.2.1.3.3. Alteraciones Cromosómicas 18

6

2.2.1.3.4. Inmunofenotipo 19

2.2.1.4. Leucemia Mieloide Aguda (LMA) 21

2.2.1.4.1. Citoquímica 21



2.2.1.4.4 Inmunofenotipo 26

2.2.2. Leucemias Crónicas 28

2.2.2.1 Leucemia Mieloide Crónica (LMC) 29

2.2.2.1.1 Características Clínicas 29


2.2.2.1.3. Clasificación 30


2.2.2.2. Leucemia Linfoide Crónica (LLC) 32




2.3. Citometría de Flujo 34

2.3.1. Fundamentos 34

2.3.2. Aplicaciones 36

3. Justificación 38

4. Objetivos 40

4.1. Objetivo General 41

4.2. Objetivos Específicos 41

5. Materiales y Métodos 41

7

5.1. Tipo de Estudio 41

5.2. Muestras 41

5.3. Equipos 41

5.4. Métodos 42

5.4.1. Protocolo de marcaje 42

5.4.2. Análisis de Archivos 46

5.5. Recolección de Información 49

5.5.1. Datos Diagnósticos 49

5.5.1.1. Diagnóstico Clínico 49

5.5.1.2. Mielograma 49

5.5.1.3. Diagnóstico Patológico 49

5.5.1.4. Cariotipo 49

5.5.2. Base de Datos 49

6. Resultados 51

7. Discusión 61

8. Conclusiones 64

9. Recomendaciones 65

10. Anexos 68

11. Bibliografía 75

8

INDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Características funcionales de las moléculas CD.

9

Tabla 2. Clasificación morfológica de las leucemias Linfoblástica

Aguda

17

Tabla 3. Alteraciones Cromosómicas en LLA

18

Tabla 4. Clasificación Morfológica FAB de Leucemia Mieloide

Aguda 23

Tabla 5. Alteraciones Cromosómicas

26

Tabla 6. Clasificación de la LMC

31

Tabla 7. Resumen de las características de los pacientes con

leucemia aguda

9

55

Tabla 8. Resumen de los hallazgos por citometría de flujo

en leucemias agudas

56


leucemia crónica

57


en leucemias crónicas

58


Patología no leucémica

59


en patologías no leucémicas

60

10

INDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Perfil de genes en hematopoyesis normal 6 Figura 2. Ontogenia de marcadores celulares en Granulopoyesis 10 Figura 3. Ontogenia de marcadores celulares en Monopoyesis 11 Figura 4. Ontogenia de marcadores celulares en Linfopoyesis de células T 12 Figura 5. Ontogenia de marcadores celulares en Linfopoyesis de células B 13 Figura 6. Fundamento de la detección de FSC y SSC 35 Figura 7. Gráfica de puntos de FSC / SSC 46 Figura 8. Gráficas de puntos de CD45 / SSC 47 Figura 9. Gráfica de puntos del control negativo 48 Figura 10. Gráfica de puntos de FL1 / FL2 48

11

ABREVIATURAS

AREBT: Anemia Refractaria con exceso de blastos en

transformación

CALLA: Antigeno de Leucemia Linfoide Aguda

CD: Clouster Designation

CIg: Inmunoglobulina de citoplasma

CRCP: Células de Repoblación a Corto Plazo

CRLP: Células de Repoblación a Largo Plazo

CSF-Meg: Factor Estimulador de colonias megacariociticas

F: Femenino

FB: Fase Blástica

FAB: Franceses Americanos y Britanicos

FCγγR: Receptor gamma para Fracción Cristalizable de las

inmunoglobnulinas

FITC: Tiocianato de Fluoresceina

FSC: Forward Scatter

HTLV-1: Virus de Leucemia T Humana

HUSI: Hospital Universitario San Ignacio

12

IgM cit: Inmunoglobulina M de citoplasma

IgM sup: Inmunoglobulina M de superficie

IgM Cneg: Inmunoglobulina M Control negativo

IgG: Inmunoglobulina G

IL-7R: Receptor de Interleucina 7

LLA: Leucemia Linfoide Aguda

LLA-B: Leucemia Linfioide Aguda de células B

LLA-T: Leucemia Linfoide Aguda de células T

LLC: Leucemia Linfioide Crónica

LM: Leucemia Mieloide

LMA: Leucemia Mieloide Aguda

LMC: Leucemia Mieloide Crónica

LMMC: Leucemia Mielomonocitica Crónica

LPS: Lipopolisacarido

M: Masculino

MO: Médula Ósea

MPO: Mieloperoxidasa

NO: No Observado

NR: No Realizado

13

NEG: Negativo

PAS: Acido Periodico de Shifft

PBS: Buffer Fosfato Salino

PE: Ficoeritrina

Phi: Cromosoma Filadelfia

POS: Positivo

PUJ: Pontificia Universidad Javeriana

R.L.: Reacción Leucemoide

RNAm: Acido Ribunocleico mensajero

S. M.D: Sindrome Mielodisplásico

SP: Sangre Periférica

14

RESUMEN

Las leucemias son neoplasias malignas que se caracterizan por la

proliferación o acumulación generalizada de células

hematopoyéticas, las cuales dependiendo de su agresividad y el

grado de diferenciación pueden dividirse en agudas y crónicas;

estas subclases a su vez pueden ser clasificadas como mieloides

o linfoides. Para el diagnóstico de esta patología se cuenta con

métodos morfológicos, citoquímicos, citogenéticos e

inmunológicos, siendo este último de gran importancia por el

hallazgo de marcadores específicos de linaje y curso de la

enfermedad.

El objetivo de este trabajo, fué analizar los casos de leucemias

provenientes del Hospital Universitario San Ignacio de Bogotá

(HUSI), a las cuales se les realizó inmunotipificación por

Citometría de flujo, con el fin de correlacionar estos datos con

otras ayudas diagnósticas y determinar la presencia de

maracadores atípicos. Para lograr este objetivo se recolectaron

15

los datos de los pacientes que acudieron a la Unidad de

Citometría de Flujo de la Pontificia Universidad Javeriana, en el

periodo comprendido entre Enero de 1999 y Septiembre de 2000.

Estos datos incluyen nombre completo, edad, tipo de muestra

(Sangre periférica o médula ósea), diagnóstico clínico y cuando

fué posible, cariotipo, mielograma, pruebas citoquímicas y

diagnóstico por patología del aspirado de médula ósea.

Se analizaron 47 muestras, de las cuales 25 (53%) pertenecían a

leucemias agudas. De estas, 18 (72%) eran de linaje linfoide

(LLA),en su mayoría provenientes de infantes con un promedio de

edad de 4 años (+/- 3,6), 7 de estas, expresaron marcadores de

linfocitos B, 3 de linfocitos T, 7 de ambos linajes y la restante fue

clasificada bajo criterio clínico como LLA. Adicionalmente, se

observó coexpresión de CD10/CD22 en y expresión aberrante de

CD13 y de CD33. Las leucemias de linaje mieloide (LMA), fueron

7 casos (28%), en su mayoría adultos con un promedio de edad

de 60 años (+/- 12,3); se presentó coexpresión de HLA-DR/CD13.

En la mayoría no se observaron anormalidades cromosómicas, a

16

excepción de la presencia de cromosoma Filadelfia en dos de

ellos.

Con respecto a las leucemias crónicas, se presentaron 13 casos (

28 %), de los cuales 11 (85%) fueron de linaje mieloide (LMC),

provenientes en su mayoría de pacientes adultos con un

promedio de 58 años de edad (+/- 6.4), en este grupo se

observó con coexpresión de HLA-DR/CD13. También se

encontró un caso que morfológica y clínicamente pertenecía a

LMC, pero fenotípicamente poseía marcadores de LLA, lo que

indica que en una crisis blástica puede ocurrir una conversión del

tipo de leucemia. Los 2 casos restantes (15%) fueron leucemias

linfoides crónicas (LLC), los cuales arrojaron un promedio de edad

de 44 años (+/- 17.3); en ellos se observó coexpresión de

CD20/CD5, característico de estos casos. En su mayoría los

pacientes con leucemias crónicas, exhibieron cromosoma

Filadelfia, común en este tipo de leucemia.

Las patologías no leucémicas, fueron en total 9 casos ( 19 %),

17

provenientes de pacientes con un promedio de edad de 66 años

(+/- 29.3), en estos, se observó en unos casos ausencia y en otros

presencia de marcadores típicos de linaje, sin embargo, no se

evidenciaron coexpresiones ni marcadores aberrantes, al igual

que anormalidades cromosómicas.

Estos datos permiten concluir que el análisis de la expresión

fenotípica de las leucemias es un método de gran importancia

como ayuda diagnóstica en estas patologías, máxime cuando la

expresión de ciertos marcadores, no detectables por otras

técnicas, permiten tomar conductas terapéuticas adecuadas.

1. INTRODUCCION

Las leucemias son enfermedades malignas, derivadas de la célula madre

hematopoyética, caracterizada por la proliferación o acumulación neoplásica

generalizada de células leucopoyéticas (Tood, 1993). Dependiendo de su

agresividad y del grado de diferenciación de las células, dichas neoplasias

pueden presentarse en dos formas : leucemia aguda y leucemia crónica. La

primera se distingue por el bloqueo en la diferenciación celular que se

18

traduce en una acumulación masiva de células inmaduras o blastos

(Murphy,1996). La segunda forma, es decir, la leucemia crónica, se

caracteriza por una proliferación no regulada y por tanto una importante

expansión de distintos tipos de células diferenciadas .

Existen diferentes métodos que colaboran al diagnóstico de esta patología,

sin embargo en ocasiones no es posible distinguir el tipo de leucemia

tomando como base única la morfología celular. Dentro de estos se

encuentran las pruebas citoquímicas, citogenéticas e inmunológicas. La

inmunotipificación de la células malignas, es el método inmunológico más

usado, el cual busca verificar la presencia de marcadores de superficie o

Cluster Designation “CD”, de forma efectiva y rápida. Además, el

advenimiento de la citometría de flujo, unido a una amplia gama de

anticuerpos monoclonales específicos para CD, hacen de esta técnica una

de las herramientas de mayor utilidad en el diagnóstico de las leucemias.

Desde 1999, se realiza la inmunotipificación de leucemias por citometría de

flujo en la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana. Sin

embargo, para lograr que este análisis inmunológico sea óptimo y preciso

como ayuda diagnóstica de estas neoplasias, se debe realizar una

evaluación e interpretación adecuada de cada caso, para llegar así a

correlacionar sus resultados con otros métodos diagnósticos usados. Por

tanto, el propósito de este trabajo es revisar y definir una forma sistemática

19

de análisis de los resultados obtenidos por citometría de flujo de los casos

reportados en el periodo comprendido entre Enero de 1999 y Septiembre de

2000.

20

2. MARCO TEORICO

2.1. HEMATOPOYESIS

Las células circulantes en el sistema vascular periférico desempeñan

papeles esenciales dentro del organismo, como son, la cesión de oxígeno a

los tejidos dado por los glóbulos rojos, la hemostasia realizada por las

plaquetas, y las defensas del huésped dada por los linfocitos, monocitos y

granulocitos. Normalmente, dichas células poseen una vida media, por lo

cual necesitan permanecer en un continuo recambio sanguíneo (Fauci,

1998). Este proceso conocido como hematopoyesis, se puede definir como

la serie de fenómenos consecutivos que se inician a nivel unicelular con la

autoduplicación seguidos de diferenciación y maduración culminando con la

producción de elementos formes sanguíneos funcionales (Ruiz Arguelles,

1998).

Dicho proceso esta basado en la presencia de ciertas células de médula

ósea conocidas como células madre hematopoyéticas (Hematopoietic Stem

Cell, HSC), de las que proceden todas las células sanguíneas (Fauci, 1998);

estas células se encuentran en un número muy reducido en la médula ósea,

cerca del 0.01%, y efectúan un ciclo muy lento, además, gracias a métodos

de depuración, ha quedado claro que existen dos tipos de estas células,

21

llamadas comúnmente, células de repoblación a largo plazo (CRLP) y células

de repoblación a corto plazo (CRCP), las cuales, como sus nombres lo

indican, difieren en su capacidad proliferativa y por ende en su poder

radioprotector (Fauci,1998).

La HSC en su momento, puede tomar dos caminos: uno es el de la

autoduplicación y el otro es el de la diferenciación, pero aún, los motivos por

los cuales dicha célula decide tomar uno u otro camino son desconocidos,

aunque al parecer pueden estar implicados tanto factores humorales como

ambientales. Si la célula madre, decide diferenciarse puede dar origen a

alguna de las células progenitoras comprometidas ya sea de linaje mieloide

o de linaje linfoide.

La célula progenitora mieloide, posee la capacidad de dar origen a colonias

megacario/eritrocíticas, granulo/monocíticas y mixtas o independientes de

cada una de las anteriores nombradas. Además se caracteriza por ser CD34

positivo y presentar baja expresión de FcγR, igualmente es propio de este

estadío de diferenciación la presencia activa de genes que codifican para

factores de transcripción, los cules son indispensables para el proceso, como

son GATA-1, GATA-2, NF-E2, SCL, c-mpl. Las células que hacen parte de

las colonias megacario/eritrocíticas, como su nombre lo indica, pueden dar

origen a plaquetas o a glóbulos rojos, estas células por su parte, se

22

caracterizan por la ausencia de CD34, presencia de CD41 y CD42a y

además por la baja expresión de FcγR. De igual forma las células

granulo/monocíticas pueden dar origen a granulocitos o monocitos y además

son positivas para CD34, CD33, CD15, CD13 y en algunos casos para HLA-

DR y CD14, unidas a una alta expresión de FcγR, ambos tipos de células

poseen un perfil de genes propios de estadío. Así mismo, la célula

progenitora linfoide, posee la capacidad de dar origen a colonias linfoides T,

B o NK, con la característica de expresar IL -7R, HLA-DR además de

contener la enzima desoxinucleotidil transferasa (TdT) y poseer un perfil de

genes propio para cada momento de diferenciación (Kondo, 1997).

(Figura 1).

Durante los procesos de diferenciación y maduración se da la presencia de

marcadores celulares, los cuales poseen funciones específicas como se

muestra en la Tabla 1. Dichos procesos se da para cada uno de los linajes de

forma individual y se desarrollan como se presenta a continuación.

2.1.1. ERITROPOYESIS: Esta básicamente controlada por la eritropoyetina

Los precursores eritroides de la médula ósea son llamados de manera

23

Figura 1. La gráfica muestra el perfil de expresión de genes desde la HSC hasta las células

maduras. CMP. Progenitores Mieloides Comunes; CLP. Progenitores Linfoides Comunes:

GMP. Progenitores Granulo/Monocíticos; MEP. Progenitores Megacario/Eritrocíticos

(Akashi,2000)

24

colectiva normoblastos o eritroblastos. Durante su maduración, la célula

disminuye en forma gradual de tamaño, se da la condensación y expulsión

final del núcleo, e incremento en la producción de hemoglobina. Dichas

etapas de se conocen morfológicamente como pronormoblasto, normoblasto

basofílico, normoblasto policromatofílico, normoblasto ortocromático,

reticulocito y eritrocito. (Mckenzie, 1991).

2.1.1.1. Ontogenia de Marcadores Celulares : Los proeritroblastos

tempranos expresan CD36 y posiblemente CD41A , mientras que los tardíos

expresan glicoforina A. CD34 solamente es expresado en el inicio de este

estadío , entre tanto el CD71 esta presente durante todas las fases de

desarrollo eritroblástico.

La hemoglobina es un marcador especifico de linaje eritroide pero esta no es

detectada antes del estadio de maduración del normoblasto policromático

(Behm, 1999).

2.1.2. MEGACARIOPOYESIS: El desarrollo de este proceso se presenta en

respuesta a un estímulo que puede ser la masa plaquetaria, la cual

dependiendo de su aumento o disminución se produce el aumento o

disminución inverso de factores reguladores como el factor estimulador de

25

colonias megacariocíticas (CSF-Meg), la trombopoyetina y la IL-3.

(Mckenzie,1991)

2.1.2.1. Ontogenia Marcadores Celulares: Durante su proceso de

maduración, los megacarioblastos en su fase temprana expresan CD41A y

CD61 seguidos por la expresión de CD42B, CD4 , CD33 , CD34 y CD117 ;

cuando estos blastos se transforman en megacariocitos maduros expresan

CD36, CD41,CD42,CD61 y factor VIII . (Behm,1999)

2.1.3. GRANULOPOYESIS: Los granulocitos ( neutrófilos, basófilos,

eosinófilos) proceden de progenitores mieloides comunes (CMP), estas

celulas poseen un proceso de maduración muy similar iniciando por

mieloblasto, y seguido por las etapas de promielocito, mielocito,

metamielocito, granulocito en banda, finalizando en una célula segmentada

funcional . Cada uno de los distintos granulocitos sigue esta etapas de

forma independiente y dirigida hacia su respectivo linaje . (Mckenzie ,1991)

2.1.4. MONOPOYESIS: Los monocitos se forman en la médula ósea a partir

de CMP, que en su momento deciden diferenciarse hacia este tipo de linaje;

cuando esto ocurre se forman los monoblastos seguidos de los promonocitos

y partir de este se forma el monocito maduro . (Mckenzie 1991)

26

TABLA 1 CARACTERISTICAS FUNCIONALES DE LAS MOLECULAS CD

Principal expresión Funciones conocidasCD celular o propuestas

CD1a*+ Timocitos, células dendriticas Presentación de antigenos no peptídicos a algunas células T (incluyendo las celulas de Langerhans)

CD1b Lo mismo que el CD1a La misma que Cd1aCD2 Células T, Células NK Molécula de adhesión (se une a LFA-3);activación de la molécula TCD3 Células T Se asocia al receptor del antigeno de la célula T ; transducción de

señales como resultado del reconocimiento del antígeno por células TCD4 Células T restringidas por el MHC de clase II Molécula de adhesión (se une a MHC de clase II);transducción de señalCD5 Células T; subpoblación de células B Ligando de CD72 ¿molécula de adhesión? CD7 Células madre hematopoyéticas ; subpoblación Transducción de señales

de células TCD10 Células B inmaduras y algunas maduras ; Metalopeptidasa de la superficie celular (CALLA)

progenitores linfoides , granulocitosCD11a++ Leucocitos Adhesión (se une a ICAM-1, -2)CD11b Granulocitos , monocitos , células NK Adhesión ; fagocitosis de particulas recubiertas por iC3b (opsonizadas)CD13 Monocitos , granulocitos Aminopeptidasa ; ¿papel en el estallido respiratorio?CD14 Monocitos Receptor de LPS ; ¿papel en el estallido respiratorio?CD15 Granulocitos La forma sialil es ligando de selectina CD16 Células NK, granulocitos , macrófagos Receptor de Fc delta de baja afinidad ; ADCC , activación de células NKCD19 La mayoria de las células B Papel en la activación de la célula B CD20 La mayoria o todas las células B ¿Papel en la activación o regulación de la célula B, canal iónico de calcio?CD21 Las células B maduras Papel en la activación de la célula B ; receptor de C3d,virus de Epstein-BarrCD22 Las células B Papel en la activación de la célula BCD24 Las células B , granulocitos ¿Papel en la coestimulación de las células T?CD25 Las células T y B activadas;macrófagos Complejos con el receptor IL-2R beta,deltac de alta afinidad ; crecimiento

activados de la célula TCD33 Monocitos, células progenitoras mieloides ?CD34 Precursores de células hematopoyéticas ; Ligando de la selectina-L

endotelio vascularCD36 Monocitos , plaquetas ¿Adhesión de plaquetas?CD38 Células plasmáticas, timocitos,células T activadas ?CD41 Plaquetas Agregación y activación plaquetaria; receptor del fibrinógeno y la

fibronectina ( se une a la secuencia R-G-D)CD42a Plaquetas , megacariocitos Adhesión plaquetaria , unión al factor de Von WillebrandCD42b Véase CD42a Véase CD42aCD45 Leucocitos Papel en la transducción de la señal (tirosina fosfatasa)CD56 Células NK Adhesión homotipica ; isoforma de la molécula de adhesión celular

neural (N-CAM)CD61 Plaquetas , megacariocitos, células endoteliales CD41

LeucocitosCDw65 Granulocitos ¿Papel en la activación del neutrófilo?CD79a Células B maduras Componente del receptor para el antígeno de la célula BCD79b Células B maduras Componente del receptor para el antígeno de la célula B

(Abbas, 1998)

27

2.1.4.1. Ontogenia de Marcadores Celulares de Linaje Mieloide y

Monocítico : Además de los marcadores presentados en las Figuras 2 y 3,

existen otras sustancias como la mieloperoxidasa (MPO) que es un

componente de gránulos azurófilos primarios y la lactoferrina que es una

enzima contenida en gránulos específicos secundarios, las cuales son

comúnmente usadas como marcadores de diferenciación mieloide, donde los

mieloblastos y promielocitos contienen MPO pero no lactoferrina, mientras

que los mielocitos, metamielocitos y neutrófilos poseen las dos. (Behm 1999)

Figura 2 La gráfica muestra la expresión de antigenos de diferenciación de linaje

grabulocitico. (Lee,1995)

2.1.5. LINFOPOYESIS: Se produce a partir de los progenitores linfoides

comunes (CLP) o llamadas comúnmente Células madres linfoides, los

cuales, pueden diferenciarse dentro de 1 o 2 progenitores intermedios:

MIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO NEUTRÓFILO

CD13 CD33 CD34

HLADR

CD13 CD33

CD11b CD15 MPO

CD13 CD33

CD11B CD15 MPO CD16

CD13 CD11b CD15 MPO CD16

28

Figura 3 La gráfica muestra los antigenos de diferenciación en el linaje monocitico.

(Lee,1995)

Células tempranas B o Células de triple linaje T/NK/células dendríticas

(Tucker, 2000). A nivel general, la linfopoyésis, puede dividirse en dos fases

diferentes : linfopoyésis independiente de antígeno, la cual tiene lugar en el

tejido linfoide primario, formando linfocitos T o B inmunocompetentes, y la

linfopoyésis dependiente de antígeno que ocurre en el tejido linfoide

secundario y empieza con el estimulo de los linfocitos T y B

inmunocompetentes, este tipo de linfopoyésis termina en la formación de

linfocitos T y B efectores que median la respuesta inmunitaria. La

identificación de estas etapas no es posible por medio de criterios

morfológicos, aunque si pueden indicar el grado de maduración y actividad

de estas células (Mckenzie,1995).

MONOBLASTO MONOCITO

CD13 CD33

CD11b CD34

HLADR CD4

CD13 CD33

CD11b CD14 CD4

29

2.1.5.1. Ontogenia de Marcadores Celulares :

• Estirpe T : Los linfocitos T son derivados de células pluripotentes de

médula ósea que expresan CD34, CD7, CD33 y posiblemente CD2. El

compromiso de estas HSC hacia linaje T tiene lugar en el timo bajo la

influencia de celulas estromales tímicas. Durante dicho proceso se

expresan distintos marcadores, como se muestra en la figura 4.

• Estirpe B : La diferenciación de la HSC a celulas B maduras se da a

través de 4 pasos que pueden identificarse por el patrón celular de

expresión de inmunoglobulinas y moléculas CD, como se muestran en la

figura 5.

Figura 4 La gráfica muestra la presencia de antígenos diferenciación en la estirpe de

linfocitos T . (Pui, 1993)

PROTIMOCITO TIMOCITO LINFOCITO T

TdT CD3c CD7 CD5

TdT CD3c CD7 CD5 CD1 CD2 CD4 CD8

CD2 CD3 CD5 CD7 CD4

Ó CD8

TCRαβ

30

Figura 5 La gráfica muestra las modificaciones antigénicas de la estrirpe de linfocitos B en

la maduración normal (Pui,1993)

PROGENITOR

DE CELULAS B C. PRE B

PRIMITIVAS CELULAS

PRE B CELULAS B

HLADR TdT

CD34

HLADR CD19 CD24 CD10 CD20 CD22c

HLADR CD19 CD24 CD10 CD22

cIg

HLADR CD19 CD24 CD22

sIg

31

2.2. LEUCEMIAS

Las Leucemias constituyen una proliferación o acumulación neoplásica

generalizada de celulas leucopoyéticas con invasión o sin ella de la sangre

periférica (Tood, 1993) . Craigie y Bennett en 1845 y Virchow en 1846

propusieron el nombre de sangre blanca o Leucemia, reconociéndola

además como entidad nosológica .

Por tradición y en aras de la simplicidad, la Leucemia se divide en Mieloide y

Linfoide, subclases que pueden ser agudas y crónicas. El fundamento de

esta distinción radica en dos conceptos : 1) Las dos estirpes provienen de

una célula madre medular común, divergen y luego maduran a lo largo de

vías paralelas separadas. 2) Los elementos principales que mantienen la

diferenciación parecen permanecer intactos aun en las células leucemicas.

(Lee , 1995).

2.2.1. LEUCEMIAS AGUDAS : Estas constituyen un grupo heterogéneo de

neoplasias que afectan a las células madres hematopoyéticas. Difieren entre

si con respecto al origen celular , presentación clínica , evolución y respuesta

al tratamiento. Dichas leucemias son el resultado de la proliferación

descontrolada de un clon maligno, el cual tiene ventajas de sobrevida con

respecto a las otras células normales y en consecuencia adquiere un

32

carácter dominante, conllevando al desarrollo de anemia, trombocitopenia y

granulocitopenia. (Kelley, 1990)

2.2.1.1. ETIOLOGIA : La etiología de la leucemia aguda es incierta , aunque

algunos factores son conocidos, tales como:

• Las radiaciones ionizantes

• Algunas drogas como el cloranfenicol y la fenilbutazona.

• Algunos antineoplásicos como los alquilantes.

• Virus como el HTLV-1.

Al parecer el nexo que une todos estos agentes inductores de leucemias

anteriormente mencionados y el desarrollo de esta patología, son los

oncogenes, los cuales participan en la regulación del crecimiento y

diferenciación en celulas normales. (Kelley ,1990)

2.2.1.2. CLASIFICACIÓN: Las leucemias agudas se clasifican de acuerdo

con el presunto origen celular. Un grupo internacional de investigadores

Franceses , Americanos y Británicos (FAB) desarrollaron en 1976 una

clasificación unificada para las leucemias agudas y síndromes

mielodisplásicos. Este sistema, se basa en la morfología de los blastos

medulares y periféricos en los frotis teñidos con colorantes de Romanovsky ,

suplementada si es necesario con métodos citoquímicos. En 1981 se

33

introdujeron modificaciones en la evaluación de los linfoblastos para

acrecentar la producibilidad y concordancia de la observaciones; en 1985 se

formularon criterios para el diagnóstico de la leucemia megacarioblástica

aguda. Dicha clasificación se adopto en todo el mundo para comparar los

resultados terapeuticos y aprovechar las divergencias biológicas entre los

subtipos (Tood, 1993).

2.2.1.3. LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA (LLA): Esta, puede

desarrollarse a partir de alguna celula linfoide bloqueada en un estadío

particular de desarrollo, incluyendo celulas de linaje potencial (Pui, 1998). De

acuerdo con el tamaño celular, configuración nuclear, cantidad y prominencia

de los nucleolos, cantidad relativa y aspecto del citoplasma se distinguen tres

subtipos de LLA, (Tabla 2). Uno de los problemas mas frecuentes en la

identificación de estos subtipos es la facilidad con que se confunden los

linfoblastos L2 con los mieloblastos M0 y M1. Para distingirlos se requieren

de técnicas citoquimicas y en ocasiones inmunologicas, otro incoveniente

existente es que alrededor del 10% de los pacientes con LLA exhibe blastos

heterogéneos, algunos L1 y otros L2

2.2.1.3.1. CITOQUIMICA: Los blastos son negativos para el negro Sudán B,

la peroxidasa y el naftol - ASD - cloroacetatosterasa. La reacción de

fosfatasa ácida es moderada a intensamente positiva en los blastos de un

20% de los casos de LLA. La mayoría de estos casos, son al parecer,

34

leucemias de celulas T. La tinción de PAS rara vez es positivo en algunos

linfoblastos (Tood, 1993).

TABLA 2 CLASIFICACION MORFOLOGICA (FAB) DE LA LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA

CARACTERISTICAS L1 L2 L3MORFOLOGICAS

Tamaño Celular Pequeño Grande GrandeCromatina Delicada o agrumada Delicada DelicadaNucleo Regular, puede ser Irregular , puede ser Regular ovalado a

hendidoo identado hendido o identado redondeadoNucleolos Irrelevantes o invisibles Unicos o mutiples , grande Unicos o mutiples , grande y

y prominentes prominentesCitoplasma Escaso Moderado ModeradoBasofilia Citplasmatica Leve Leve ProminenteVacuolas Variables Variables Prominente

(Tood, 1993)

2.2.1.3.2. CARACTERISTICAS CLÍNICAS : Los sujetos con este trastorno

suelen presentar sintomas de fatiga, fiebre y hemorragia. La linfadenopatía

generalizada, la esplenomegalia y la hepatomegalia son datos frecuentes.

Debida a la infiltración leucémica de otros tejidos pueden aparecer sintomas

como el dolor en las piernas, cefalea, nauseas, y vómitos (Tood, 1993).

35

2.2.1.3.3. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La Tabla 3, enumera

varias de la anomalías cromosómicas recurrentes que se registran en la

LLA y los inmunofenotipos acompañantes. En general , las translocaciones

se asocian mas con los subtipos pre-B , B y T que con el pre-B primitivo.

Muchas de las fracturas cromosómicas responsables de estos

reordenamientos involucran a oncogenes y genes de las inmunoglobulinas o

los TCR .

TABLA 3 ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LLA

INMUNOFENOTIPO ALTERACION CROMOSOMICA GENES INVOLUCRADOS

LLA de estirpe B t(4;11) (q21:q23)

t(5;14) (q31;q32) IL3 , IgH

LLA de celulas pre-B t(1;19) (q23;p13) prl,E2A

LLA de celulas B t(8;14) (q24;q32) myc-c,IgH

t(2;8) (p11;q24) myc-c,Ig

t(8;22) (q24;q11) myc-c,Ig λ

LLA de celulas T t(11;14) (p13;q11) tcl-2,TCR αt(1;14) (p34;q11) TCR α

t(8;14) (q24;q11) myc-c, TCR α

t(10;14) (q24;q11) tcl-3, TCR αt(1;14) (p32;q11) TCR α

t(14;14) (q11;q32) TCR αt(7;9) (q35-36;q34) TCR β

t(7;14) (q35-36;q11) TCR βt(7;7) (p15;q11) TCR γ

t(7;14) (p15;q11) TCR γinv (14) (q11;q32) TCR α

inv (14) (q11;q32) tcl-1, TCR α

Variable t(9;22) (q34;q11) abl-c , bcr

IL3, Interleucina3 ; bcr,region de concentracion de fracturas ; If, interferon ; TCR , receptor de celulas T, IFN,

Interferon. (Lee,1995)

36

En la reorganizacion cromosómica los blastos revelan rasgos fenotipícos

linfoides y mieloides, no expresan inmunoglobulinas de superficie ni

citoplasmaticas, suelen ser CALLA negativo, y a menudo manifiestan

HLADR, en algunas ocasiones tiende a asociarse con leucocitosis llamativa y

esplenomegalia .

2.2.1.3.4. INMUNOFENOTIPO

• LLA pre-B temprana : las celulas leucemicas de LLA pre-B temprana

expresan CD19 , HLADR de superficie , CD22 y CD79 A de citoplasma,

aunque en gran parte muchas de ellas presentan baja expresión de CD22

de superficie y alta expresión de CD10, TdT y CD34. El marcador CD20

normalmente aparece con la producción de cadenas pesadas µ sobre

una menor proporción de blastos en algunos casos. CD45 generalmente

no es detectado o posee muy baja expresión .

• LLA pre-B : las celulas de este subtipo generalmente expresa CD19 ,

CD22 , CD79 y HLADR . Los linfoblastos de LLA pre-B exhiben

inmunoglobulina de citoplasma ( cIg ) µ pero no de superficie, así como

tampoco son detectadas las proteínas κ y λ . Casi en la totalidad de los

casos de este subtipo de LLA se expresan CD10 y TdT , pero solamente

37

las dos terceras partes de los mismos expresan CD34. Ademas no

expresan CD20 o su expresión es muy baja.

• LLA pre-B tardía : los blastos que expresan cadenas pesadas de cIg µ

y sIg (superficie) µ, sin expresar cadenas livianas κ o λ han sido

descritos como LLA pre-B transicional o tardía. La sIg µ en estos casos se

encuentra unida a CD79A y CD79B. Asi mismo, dichos blastos expresan

CD10 , usualmente TdT y algunas veces CD34.

• LLA-B : los blastos que expresan sIg µ vs cadenas livianas κ o λ son

clasificadas como LLA-B. Existen dos tipos de blastos con estas

características, los cuales son fenotipica y genotipicamente distintos. Un

grupo es caracterizado por ser blastos FAB L3 los cuales, expresan CD19,

CD22 y frecuentemente CD10, pero no presentan CD34 ni TdT. En

contraste, el otro grupo se caracteriza por ser blastos FAB L3 pero con

una fuerte expresión de CD20 y usualmente CD23. Además , existe un

subtipo infrecuente de LLA-B caracterizada por la presencia de blastos

con morfología L1 o L2 los cuales expresan TdT y CD34 y una baja

expresión de CD20, ademas la intensidad de sIg µ es muy baja

comparada con la LLA-B L3 .

38

• LLA-T : los blastos en LLA-T poseen CD7 de superficie y CD3 de

citoplasmática (cCD3), ademas expresan CD2, CD5 y TdT ; también

expresa CD45 pero usualmente con mayor intensidad que la LLA pre-B y

pre-B temprana. Generalmente del 40 al 45% de los casos de LLA-T son

CD10 positivos y/o CD21. Las celulas T-NK están asociadas con CD56 y

son detectadas en muy pocos casos. La identificación de subpoblaciones

inmunofenotipicos de LLA-T esta dividida entres estadíos : temprana

(CD7+, cCD3+, sCD3-, CD4- y CD8-) , común (cCD3+, sCD3- o CD3 bajo,

CD4+,CD8+ y CD1+) y tardía (CD3+,CD1-,y CD4+ o CD8+).

2.2.1.4. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (LMA) : La clasificación FAB

ampliada define 8 variantes de LMA, como se describen en la Tabla 4. Esta

patología esta caracterizada por un incremento en el número de células

mieloides en la médula ósea y una detención en su maduración,

frecuentemente resultando en insuficiencia hematopoyetica

(Lowenberg,1999)

2.2.1.4.1. CITOQUÍMICA : La mieloperoxidasa es intensa en la serie

granulocítica y débil en la monocítica. También puede ser positiva en los

mieloblastos indiferenciados que carecen de gránulos azurófilos (LMA-M1),

los linfocitos y precursores eritroides son peroxidasa negativos.

39

T A B L A 4 C L A S I F I C A C I Ó N M O R F O L Ó G I C A ( F A B ) D E L E U C E M I A M I E L O I D E A G U D A

C a r a c t e r i s i t i c a s C i t o q u i m i c a sC u e r p o s M i e l o p e r o x i d a s a C loroace ta to

S u b t i p o C a r a c t e r i s t i c a s M o r f o l o g i c a s d e A u e r o S u d á n b l a c k B e s t e r a s aM O Leucem ia m ie l ob lás t i ca M ie l ob l as tos s i n g ránu los N e g N e g N e g

s i n m a d u r a c i ó nM 1 Leucem ia m ie l ob lás t i ca M i e l o b l a s t o s c o n g r á n u l o s e s c a s o s P o s / N e g * P o s P o s / N e g

c o n m a d u r a c i ó n m í n i m a o a u s e n t e s M 2 Leucem ia m ie l ob lás t i ca M ie lob las tos con g ránu los , p rom ie loc i t os , P o s P o s P o s / N e g

c o n m a d u r a c i ó n a lgunos m ie loc i t osM 3 Leucem ia p rom ie l oc í t i ca P r o m i e l o c i t o s c o n g r á n u l o s p r o m i n e n t e s D o b l e P o s P o s P o sM 4 L e u c e m i a m i e l o m o n o c í t i c a M i e l o b l a s t o s y p r o m i e l o b l a s t o s > 2 0 % ; P o s / N e g P o s P o s

p r o m o n o c i t o s y m o n o b l a s t o s > 2 0 %M 5 a L e u c e m i a m o n o b l á s t i c a M o n o b l a s t o s g r a n d e s c o n c r o m a t i n a N e g N e g N e g

s in d i f e renc iac i ón y c i t o p l a s m a a b u n d a n t eM 5 b L e u c e m i a m o n o b l á s t i c a Monob las tos , p romonoc i t os , monoc i t os ; N e g N e g N e g

con d i f e renc iac ión monoc i tos i s pe r i f é r i ca M 6 Er i t ro leucemia P recu rso res e r i t r o i des mega lob lás t i cos P o s P o s N e g

( > 5 0 % ) ; m i e l o b l a s t o s ( > 3 0 % ) M 7 L e u c e m i a m e g a c a r i o b l á s t i c a Megaca r i ob las tos , mor fo log ia ¨ l i n fo ide ¨ N e g N e g P o s / N e g

(L1 ,L2 ,M1) , b ro tes c i t op lasmá t i cos

Pos, En general presente; DoblePos, abundante; Neg, en general ausente; Pos/Neg, puede o no estar presente (Lee,1995)

41

El Sudan black B, tiñe diversos lípidos y componentes celulares y el patrón

es similar al de la peroxidasa aunque la técnica podría ser positiva en

algunos mieloblastos sin gránulos azurófilos y peroxidasa negativos, pero los

linfocitos y los normoblastos son negativos, y los cuerpos de Auer son

sudanófilos. El Acido Periodico de Shiff (PAS) reacciona sobre todo con el

glucógeno celular, en linfoblastos de la LLA se registra incorporación de este,

pero en los mieloblastos de LMA puede ser positivos o negativos. Las

estearasas, como AS-D cloroacetato es positivo especialmente en la LMA-

M3 (promielocitos) (Lee, 1995)

2.2.1.4.2. CARACTERISTICAS CLÍNICAS : el inicio se asemeja al de una

infección aguda o incluso a un proceso séptico. Otros cambios incluyen

signos de insuficiencia granulocítica, con ulceraciones en mucosas y fiebre ;

el aumento de ganglios linfáticos, del bazo y del hígado es poco pronunciado,

puede presentarse una notable postración y malestar general y en los casos

no tratados son rápidamente progresivos (Tood, 1993).

2.2.1.4.3. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La Tabla 5, ilustra las

aberraciones cromosómicas mas frecuentes en la LMA. Con pocas

excepciones no existen diferencias entre los defectos estructurales y subtipos

FAB. A diferencia de lo que ocurre en la LLA , las alteraciones clonales de

LMA podrían afectar a los progenitores eritroides y megacariociticos ademas

del linaje mieloide.

42

TABLA 5 ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LMA

MORFOLOGIA ALTERACION CROMOSOMICA GENES INVOLUCRADOS

LMA - M2 t(8;21) (q22:q22) ETO-AML 1

LMA - M3 y M3v t(15;17) (q22;q12) PML - RAR αLMA - M3 t(11;17) (q23;q21) PLZF-RAR αLMA - M4Eo inb / del 16 (q22) CBFβ-MIH 11

LMA - M4 y M5 con eritrofagocitosis t(8;16) (p11;p13)

LMA - M2 baso del (12p)

LMA - M2 baso , M1 , M4 t(6;9) (p23;q34) DEK-CAN

LMA - M7 t(1;22) (p12-13;q13)

LMA - M2 , M4 , M5 Monosomia 7

LMA - M1 , M2 Monosomia 5 , del (5q)

Variable Trisomia 8

(Stasi,1995) ; (Lee, 1993)

2.2.1.4.4. INMUNOFENOTIPO : En la leucemia mieloblástica aguda con

poca diferenciación (M1), comúnmente se da la expresión de CD13, CD33,

CD34, CD65, CD117, y HLA-DR, pero en diferentes combinaciones. La

expresión de CD4, CD11b, CD15 y CD66 son menos frecuentes, esta

heterogeneidad, al parecer es debido a los diferentes tipos de LMA-M1

morfológicamente similares.

En la LMA- M2, los blastos comúnmente expresan CD34, CD65 y HLA-DR,

aunque la expresión de CD13 y CD33 es característicamente muy baja o

algunas veces no es detectada.

43

En la leucemia promielocitica o M3, se da una variante microgranular

conocida como M3v que es morfologicamente semejante a la LMA-M3, estas

expresan CD9, CD13, CD33 y CD65, y usualmente no expresan CD34 y

HLA-DR. La expresión de CD11b y CD15 es variable. Se ha observado que

cerca de la mitad de los casos se da la expresión de CD2 asociado a celulas

T, aunque es más frecuente en el subtipo M3v.

En la leucemia mielomonocitica aguda o M4, se da la presencia de

componentes neoplásicos mieloides y monocíticos , asumiendo que

provienen de un precursor común, por ello, es normal encontrar la expresión

de CD4, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD33, CD34, CD45, CD65 y HLA-DR.

Dentro de este subtipo, también aparece una variante no muy común

conocida como LMA-M4Eo, la cual esta asociada con el incremento de

eosinófilos en médula ósea, o la ausencia de eosinofilia en sangre periférica,

sin embargo lo único encontrado en esta variante es la expresión

característica de CD2 asociado a celulas T.

En la leucemia monocítica aguda o M5, donde se presenta una gran cantidad

de monoblastos, promonocitos y monocitos ; generalmente se da la

expresión de HLA-DR, CD14, CD11b, CD33, CD65, CD15, CD36, en algunos

casos se exhibe la expresión de CD117, y solo en casos raros se presenta

CD34, y baja expresión de CD41 y CD61.

44

En la leucemia eritroblastica aguda o M6, los eritroblastos comunmente

presentan la expresión de CD36 , CD71 y glicoforina A y la hemoglobina es

detectada en formas eritroides más maduras, en algunas ocasiones se puede

dar la presencia de CD41A, CD42B y CD61, los cuales son antígenos

megacariociticos sugiriendo que estas células provienen de un progenitor

común de eritropoyesis y mecariopoyesis.

En la leucemia megacarioblástica aguda, se da la expresión de CD41A y

CD61 y algunas veces CD42B , en raras ocasiones se da la presencia de

CD4 , CD33 , CD13 , CD34, CD36 , CD45 , CD7 y HLADR. (Behm, 1999)

2.2.2. LEUCEMIAS CRONICAS : A diferencia de las leucemias agudas, los

clones de celulas malignas de la leucemia crónica retienen una cierta

capacidad normal de diferenciación y función, por lo menos en una fase

inicial. A medida que el clon maligno se expande, la capacidad de

funcionamiento normal desaparece en forma progresiva y disminuye

gradualmente la cantidad de células sanguíneas circulantes (Kelley. 1990).

2.2.2.1. LEUCEMIA MIELOCITICA CRONICA (LMC) : La LMC , se

caracteriza por una elevación considerable del recuento leucocitario y

acumulación de granulocitos maduros e inmaduros. Puede aparecer en

cualquier momento de la vida pero su frecuencia aumenta con la edad.

45

2.2.2.1.1. CARACTERISTICAS CLINICAS : Los pacientes con LMC pueden

presentarse con un grado mínimo de perdida de peso , anorexia o letargia ,

pero en la mayoría se muestra sorprendentemente asintomatico en el

momento del diagnóstico . El curso natural de la LMC puede ser dividido en

tres fases : una fase crónica de varios años de duración , una fase acelerada

cuya duración usualmente es medida en meses , y una fase terminal aguda o

blástica que persiste de varias semanas a meses. La mayoría de los casos

son diagnosticados en la fase crónica en donde el examen físico revela por lo

general una esplenomegalia de leve a moderada y el recuento leucocítico

total suele estar elevado en un rango de 30.000 a 50.000 celulas / ul ,

aunque puede superar en algunos casos las 100.000 celulas /ul. Recuento

diferencial revela porcentaje disminuido de linfocitos y un incremento

pronunciado de los granulocitos como una gama de madurez que varia entre

granulocitos polimorfonucleares y mielocitos. Los granulocitos muy

inmaduros , tales como los promielocitos o los mieloblastos , representan el 1

a 2% de todos los glóbulos blancos en el extendido de sangre periférica. La

médula ósea de la fase crónica de la LMC es sumamente hipercelular a

causa del numero elevado de precursores mieloides en todos los estadios de

desarrollo. Los recuentos leucocitarios diferenciales en sangre periférica y en

medula ósea son casi idénticos. La crisis blástica es la principal causa de

muerte y en pocas palabras es la conversión de la LMC en LMA (Kelley,

1990)

46

2.2.2.1.2. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La LMC se caracteriza por

la presencia de cromosomas Filadelfia (Phi), el cual es el resultado de una

translocación que afecta a los cromosomas 9 y 22 y origina la translocación

y la activación de un protooncogen. En esta aberración el gen c-abl es

translocado desde el cromosoma 9 al cromosoma 22 y el c-sis , desde el

cromosoma 22 al 9. Debido a esta translocación al cromosoma 22 , el gen c-

abl se yuxtapone con una secuencia especifica de DNA denominada la

región de agregación y ruptura (dcr). En las células de pacientes con LMC se

ha identificado RNAm quimérico c-abl / bcr de 8.2 kilobase que determina

una proteína de fusión quimérica con un PM de 210 kDa , que no es hallada

en las celulas normales. Dicha proteína (P210) ejerce una actividad

tirosinocinasa significativamente mayor que la proteína codificada por el c-

abl. La cantidad de producción de dicha proteína varia enormemente entre

los distintos pacientes y no siempre se correlaciona de manera directa con el

curso de la enfermedad. (Kelley,199)

2.2.2.1.3. CLASIFICACION : De acuerdo con la presencia o ausencia de

cromosoma philadelphia (Ph1) se distinguen dos subtipos principales de

LMC. Esta categorización es útil porque estos dos subgrupos exhiben

diferencias en las manifestaciones clínicas, evolución y sobrevida, (Tabla 6).

47

T A B L A 6 C L A S I F I C A C I O N D E L A L M C

Var iantes Cl in icas

LMC T ip i ca ( c romosoma Ph1 p resen te )

LMC A t ip i ca ( c romosoma Ph1 ausen te )

LMC t ipo juven i l

Var ian tes Mor fo lóg icas

Leucemia Eos inof í l i ca c rón ica

Leucemia Basof í l i ca c rón ica

Leucemia Monoc í t i ca c rón ica

Leucemia Neut ro f í l i ca c rón ica

(Lee, 1993)

2.2.2.1.4 INMUNOFENOTIPO : El linaje de procesos blásticos usualmente no

puede ser determinado por estudios morfológicos y citoquímicos pero sí son

de gran ayuda los estudios inmunofenotipicos. La crisis blástica del 40 al

50% de los casos infantiles es caracterizado por blastos de inmunofenotipo

mieloide (CD13+,CD15+,CD33+, ó CD65+ vs CD59A-, CD3-,CD41-). Sin

embargo , del 30 al 40% de los pacientes desarrollan crisis blástica de

celulas pre-B temprana (TdT+,CD19+,CD79A+,sIg- y cIg-) o en menos

cantidad con celulas pre-B (cIg µ +) (Lee,1995)

48

2.2.2.2. LEUCEMIA LINFOIDE CRONICA (LLC): La LLC es una neoplasia

hematológica que se caracteriza por la proliferación y acumulación de

linfocitos bastante maduros en sangre periférica, médula ósea, ganglios

linfáticos, bazo, hígado y otros órganos. En la mayoría de los casos , un solo

clon de linfocitos B sufre transformación maligna , pero algunas instancias

involucran linfocitos T monoclonales.

2.2.2.2.1. CARACTERISTICAS CLINICAS : Alrededor del 25% de los

pacientes con esta patología no refieren sintomas atribuibles. Se encuentra

linfocitosis , adenopatias o esplenomegalia en un examen de rutina o durante

la evaluación de enfermedades no relacionadas. El recuento leucocitario total

periférico se encuentra elevado en casi todos los pacientes y por lo general

supera las 20.000 celulas /ul y en el recuento diferencial se revela un

predominio de leucocitos morfológicamente maduros. En una fase temprana ,

la anemia y la trombocitopenia son infrecuentes , pero , a menudo se

presentan con la evolución de la enfermedad. La medula ósea suele ser

hipercelular con un número creciente de linfocitos morfológicamente

maduros. Las infecciones recurrentes causadas por la granulocitopenia y la

disminución de la inmunidad humoral son comunes durante el curso de la

LLC y en general se torna un problema dominante y continuo con la

evolución de la enfermedad, hasta llegar al punto en algunos casos de

causar la muerte. La transformación blástica aguda de la LLC es sumamente

rara. (Fauci,1998)

49

2.2.2.2.2. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : En alrededor del 50% de

los pacientes se detectan anomalías cromosómicas en donde predomina la

trisomía 12 sola o combinada con otros defectos citogenéticos. También se

advierte la presencia de 14q+ , 13q+ y 11q+. La mayoría de estos fenómenos

implican translocaciones de cromosomas dadores desconocidos. Las

correspondientes al cromosoma 14 exhiben puntos de fractura en la banda

q32. También se documentan de lesiones del cromosoma 11 con puntos de

fractura en 11q21 , 11q22 y 11q14. Ademas los defectos estructurales del

cromosoma 13 y las lesiones del 6 son comunes (Lee,1995).

2.2.2.2.3. INMUNOFENOTIPO : En el 95% de los casos la LLC deriva de la

transformación maligna de un solo linfocito B y su expansión clonal ; y en

ocasiones muy aisladas involucra a los linfocitos T. La presencia de CD5 es

una propiedad única de las celulas B de la LLC y su expresión es tan

característica que muchos autores consideran que su ausencia descarta el

diagnóstico de esta enfermedad. No obstante la variante prolinfocítica carece

de CD5. Algunos marcadores de superficie usuales en los linfocitos B

normales como el CD22 y los receptores de transferrina son infrecuentes en

esta patología . Generalmente, el fenotipo compuesto genralmente por CD5,

CD20 y CD23, es propio de celulas B de LLC, (Digiuseppe, 1998;

Matutes,1994).

50

2.3. CITOMETRIA DE FLUJO

Como su nombre lo indica, la citometría de flujo es una técnica utilizada para

el análisis de células, por medio de una medición simultánea de múltiples

características, célula a célula, en tiempos muy cortos.

2.3.1. FUNDAMENTOS : La citometría de flujo, esta basada en la medición

de múltiples parámetros celulares, como son :

• Tamaño relativo (Forward Scatter ó dispersión frontal), la cual esta

relacionada con el área de la superficie celular, y que es detectada a lo

largo del eje de luz incidente en dirección frontal.

• Granularidad relativa (Side Scatter ó dispersión lateral), la cual esta

relacionada con la granularidad o complejidad celular y que es detectada

por la luz reflejada y refractada a 90º del rayo láser (Figura 4).

• Intensidad de fluorescencia relativa, la cual es directamente proporcional

a la cantidad de sitios de ligazón, dicha fluorescencia es emitida por

fluorocromos los cuales, son sustancias químicas que tienen la propiedad

de absorber fotones de alta energía procedentes de radiación ultravioleta

o del espectro visible (espectro de absorción), lo que produce una

51

redistribución de sus electrones corticales de tal forma que algunos de

ellos pasan a ocupar una órbita más alejada del núcleo (excitación), dicha

situación es inestable por lo que el electrón tiende a volver a su estado

fundamental o primitivo, emitiendo la energía absorbida en una longitud de

onda distinta (espectro de emisión (Paul,1989) .

Figura 6 La gráfica muestra la detección de Forward Scatter y Side Scatter.

Para el correcto desempeño de un citómetro de flujo, este necesita de un

sistema combinado de :

∗ Componentes fluídicos : los cuales sirven para introducir y focalizar las

células a evaluar. Esta, es un sistema de circulación con un solución

tampón que permite el paso de las células.

∗ Componentes ópticos : Gracias a estos se da la excitación y colección

óptica, la cual depende de un láser que posee generalmente una longitud

Detector de luz frontal α área de superficie celular

Fuente de luz incidente

Detector de luz lateral α complejidad celular

52

de onda de 488 nm. Igualmente, cuenta con un conjunto de lentes , los

cuales son utilizados para regular y focalizar el rayo láser. También

consta de un sistema de espejos ópticos y filtros, para dirigir las longitudes

de onda especificadas por la luz colectada hacia detectores ópticos

designados.

• Componentes electrónicos : Los cuales convierten las señales ópticas a

señales electrónicas proporcionales y establece interfaces con el

computador para transferir los datos (Becton Dickinson, 1999).

2.3.2. APLICACIONES DE CITOMETRIA DE FLUJO : La citometría de flujo,

es una herramienta de gran utilidad en citología , inmunología, hematología

y anatomía patológica. A continuación se mencionan las aplicaciones mas

frecuentes, así como las susceptibles de ser utilizadas en estudios de

citología :

• Análisis fenotipicos de células sanguíneas (Darnell, 1997)

• Cuantificación de ADN y ciclo celular

• Determinación de la viabilidad celular

• Evaluación de la activación celular

• Análisis de reticulocitos

• Detección de anticuerpos en suero

53

• Cuantificación de potencial de membrana celular

• Determinación de pH Intracelular

• Medida del calcio intracelular

• Aplicaciones en citopatologia : dentro de estas tenemos el lavado

bronquioalveolar , en donde su estudio es de gran importancia para el

diagnostico de diversas enfermedades pulmonares, otro de gran

importancia, es para el estudio del liquido cefaloraquideo. (Viguer, 1995).

54

3. JUSTIFICACION

En la segunda mitad del siglo XX se han realizado avances importantes en el

tratamiento de las leucemias que cambiaron de modo notable el concepto

que prevalecía de que la palabra leucemia era sinónimo de muerte a muy

corto plazo. Estos avances han permitido que en la actualidad se curen gran

parte de las personas que la padecen, especialmente en el caso de las

leucemias agudas (Ruiz Arguelles, 1998). Sin embargo, a pesar de los

avances en tratamiento, según el Instituto Nacional de Cancerología de

Bogotá, en 1999 las neoplasias del sistema hematopoyético y

reticuloendotelial, dentro de las cuales se encuentran las leucemias,

ocuparon el tercer lugar de más alta incidencia. En la ciudad de Santa fe de

Bogotá se presentaron el 82% del total de los casos reportados (Ministerio de

Salud/1997), y la tasa de mortalidad de leucemias es de 1 a 2 casos por

100000 habitantes (Registro Poblacional, Cali,1991-1996).

El pronóstico y la respuesta al tratamiento en leucemia se basa

principalmente en la realización de un diagnóstico oportuno, el cual depende

55

obviamente, tanto del cuadro clínico del paciente así como de las pruebas

que se realicen, especialmente las de tipo morfológico, inmunológico y

genético.

De esta forma, al ser la inmunoitipificación por citometría de flujo una técnica

de gran utilidad en el diagnóstico de dicha patología, es necesario que esta

sea correcta, óptima y precisa ; por esta razón, se decidió verificar y definir

una forma sistemática de análisis de los resultados obtenidos de las

muestras de leucemias procesadas por dicha técnica en la Pontificia

Universidad Javeriana durante Enero de 1999 y Septiembre de 2000 y

correlacionar dichos resultados con las demás ayudas diagnósticas para así

lograr una adecuada interpretación de los mismos y posteriormente la

aplicación de un tratamiento adecuado y oportuno.

56

4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL

Realizar un análisis completo de la inmunofenotipificación de las muestras de

leucemias efectuada por citometría de flujo, en el periodo comprendido entre

Enero de 1999 y Septiembre de 2000.

4.2. ESPECIFICOS

Reunir todos la información de cada uno de los casos de leucemias que

incluya tanto los datos personales como las demás ayudas diagnósticas

realizadas en los mismos.

Confirmar los criterios del análisis de citometría de flujo realizado en todos

los casos de leucemias que ingresaron.

Comparar los resultados obtenidos por citometría de flujo con los demás

métodos útiles para el diagnóstico de las leucemias en cada uno de los

casos.

57

5. MATERIALES Y METODOS

5.1. TIPO DE ESTUDIO

Este trabajo es un estudio de tipo observacional descriptivo o de casos en

serie.

5.2. MUESTRAS

Las muestras, provenían de pacientes que fueron remitidos

Hemato/Oncología del Hospital Universitario San Ignacio (HUSI), los cuales,

por criterio médico y para corroborar su diagnóstico era necesario realizarles

inmunotipificación por citometría de flujo. Dichas muestras, procedían de

medula ósea o en algunos casos, debido a los antecedentes clínicos, de

sangre periférica.

5.3. EQUIPOS

Citómetro de flujo: Facs Calibur (Becton Dickinson), U.S.A.

Cámara de flujo Laminar: Jouan ( Hotte LC2.12), Francia.

58

Centrfuga: Jouan (MR 22), Francia.

Nevera: Supernordico (4ºC)

Vortex: Thermolyne (Maxi Mix II)

5.4. METODOS

5.4.1. PROTOCOLO DE MARCAJE

• Se procede con la realización de un primer marcaje de la muestra, el cual

posee anticuerpos marcados con fluorocromos anti CD, tanto de linaje

mieloide como linfoide entre los que se encuentran CD3, CD5, CD7,

CD10, CD13, CD20, CD22, CD33; algunos anticuerpos utilizados

reconocen moléculas compartidas para los dos linajes, como son : CD45 y

HLA DR. En la prueba, además se utilizan controles de isotipo

(IgG1a/IgG2), los cuales se utilizan como control negativo. De cada uno de

los anticuerpos mencionados anteriormente se agregan 10 ul, en el

siguiente orden :

• Tubo 1 : CD45.PerCP/CD3. FITC

• Tubo 2 : IgG1a.FITC/IgG2.PE

• Tubo 3 : CD10.FITC/CD22.PE


59


• Tubo 6 : HLA-DR.FITC/CD13.PE

• Posteriormente, se adiciona la muestra, la cual, dependiendo del recuento

de leucocitos totales presentes en la misma, se lleva a una concentración

final de 10,000células/ul, para luego agregar un volumen de 50ul.

• Se mezcla en vortex, a cada uno de los tubos y se llevan a incubación por

30 minutos a 4ºC y en oscuridad.

• Posterior al tiempo de incubación, se realizan dos lavados con PBS-azida

de sodio 0.1%, de 5 minutos y a 2,000 rpm cada uno.

• Se lisan los eritrocitos, realizando una dilución 1/10 del solución de lisis

con un volumen final de 1,000ul, para cada tubo.

• Se mezcla en vortex a todos los tubos, y se lleva a incubación por 10

minutos exactos, en oscuridad y a 4ºC.

• Se realizan dos lavados con PBS-azida de sodio 0,1% por 5 minutos a

2,000 rpm cada uno, y luego se resuspende la muestra en PBS-

Paraformaldehido 0,5%, 500ul, el cual permite la fijación y preservación de

60

las células al momento de su adquisición.

• Luego de procesar y adquirir las muestras en el citómetro de flujo, es

posible observar si esta es de línea mieloide (CD13, CD33) o linfoide, de

tipo T (CD3, CD7, CD5) o de tipo B (CD20, CD22) dependiendo ello, del

tipo de marcadores positivos encontrados, así, para confirmar esto se

realizar un segundo marcaje:

• Leucemias mieloides : este segundo marcaje se realiza con anticuerpos

anti CD14 y anti CD16, los cuales aclararán si la leucemia mieloide es de

tipo granulocítica (CD16) o monocítica (CD14).

• Leucemias linfoides : este segundo marcaje solo es necesario cuando

luego del análisis se observe que la leucemia es linfoide y que además los

marcadores positivos para linfocitos son de línea B. De esta forma se

evidenciará que tan madura o inmadura se encuentra la leucemia linfoide

B, dependiendo ello de la presencia o ausencia de IgM citoplasmática y de

superficie. Para este marcaje es necesario seguir los siguientes pasos :

◊ Se marcan 3 tubos , cada uno con el nombre, la fecha, y el anticuerpo que

se adiciona a cada uno, en el siguiente orden:

61

∗ Ig M citoplasmática control negativo (IgM Cneg)

∗ IgM citoplasmática (IgM cit)

∗ IgM de Superficie (IgM sup)

◊ Se realiza el proceso de permeablización, el cual es necesario, solo en el

tubo control y en el IgM cit, por ser marcajes intracelulares, adcionando

50ul de la muestra y una dilución 1/10 del buffer de permeabilización con

un volumen final de 1.000ul a cada tubo, mientras que al tubo de IgM sup,

solo se adiciona muestra.

◊ Se mezcla en vortex y se lleva a incubación por 15 minutos a 4ºC.

◊ Se lava 2 veces con PBS por 5 minutos a 2.000 rpm, solo a los tubos a los

que se le realizo el proceso de permeabilización.

◊ Se adicionan 4ul de anticuerpo anti IgM a todos los tubos, menos al de

IgM Cneg, pues este es el control de la prueba.

◊ Se mezcla en vortex y se lleva a incubación por 30 minutos a 4ºC y luego

se lava dos veces con PBS-azida de sodio 0.1%, pero solo los tubos a los

que se les agrego anticuerpo.

◊ Se agrega a todos los 3 tubos, 10 ul del anticuerpo secundario, que en

62

este caso sería el Goat anti mouse IgG total marcada con FITC, se realiza

vortex y se lleva a incubación por 30 minutos a 4ºC en oscuridad.

◊ Se lava 2 veces todos los tubos con PBS por 5 minutos a 2000RPM, y

luego se resuspende el pelled con PBS-paraformaldehido 0,5%, 500ul.

5.4.2. ANALISIS DE LOS ARCHIVOS: Toda la adquisición de las muestras,

como su respectivo análisis se realizaron bajo el programa Cell Quest

(Becton Dickinson). Inicialmente se realiza una gráfica de puntos de Forward

scatter (FSC) y Side Scatter (SSC), en la cual se podía visualizar la

morfología celular con respecto al tamaño y la granularidad (Figura 7).

FIGURA 7 La gráfica muestra la distribución de las células con respecto a su tamaño y

granularidad (FSC/SSC)

R1

63

Seguidamente, se realiza una gráfica de puntos con CD45 vs SSC, ello con

el fin de dividir la población total con respecto a su expresión de CD45 y su

complejidad celular. (Figura 8).

FIGURA 8. Gráfico de puntos donde se muestra la expresión de CD45 (FL3) y la

complejidad de una muestra de médula ósea.

A partir de estas dos gráficas se selecciona la población a estudiar, esto se

logra delimitando la población de interés sobre la primera gráfica FSC vs

SSC, para luego observar su distribución en la segunda gráfica CD45 vs

SSC. Posteriormente se realiza una gráfica para observar el control de

isotipo (Figura 9), el cual debe dar negativo, de esta forma, se puede crear

un cuadrante que logrará definir las poblaciones positivas y negativas para

todos los marcadores utilizados. Por último, se habren gráficas de puntos

para cada uno de dichos marcadores, en las cuales se coloca en el eje de las

X a FL1 (FITC), y en el eje de las Y al FL2 (PE). (Figura 10).

64

FIGURA 9. Gráfico de puntos mostrando la delimitación del cuadrante basado en el control

de isotipo.

FIGURA 10. Gráfico de puntos en donde se muestra la distribución celular con respecto al

marcaje en FL1 (FITC) y en FL2 (PE).

65

5.5. RECOLECCION DE INFORMACION

5.5.1. DATOS DIAGNOSTICOS:

5.5.1.1. Diagnóstico Clínico: Gracias a la colaboración de la Unidad de

Estadística del HUSI, se revisaron cada una de las historias clínicas de los

pacientes, de las cuales se reconfirmó, el nombre completo, la edad y el

diagnóstico clínico.

5.5.1.2. Mielograma: Los datos sobre el mielograma fueron obtenidos de la

Unidad de Hemato/oncología del HUSI.

5.5.1.3. Diagnóstico Patológico: Las biopsias de médula ósea, fueron

confirmadas por parte de la Unidad de Patología del HUSI.

5.5.1.4. Cariotipo: Gracias a la ayuda prestada por el Instituto de Genética

Humana de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ), fue posible la

recolección de datos del cariotipo de cada uno de los pacientes a los que se

les realizó dicho examen.

5.5.2. BASES DE DATOS: Con el propósito de organizar toda la

información existente en la UCF y además, cumplir con uno de los objetivos

de este trabajo, se creó una base de datos, a la cual, se le anexo ademas

66

los diagnósticos patológicos, y exámenes extras como mielograma y

cariotipo. Vale la pena aclarar, que no todos los pacientes, poseían esta

información extra, ello debido a su estado clínico, el cual en algunas

ocasiones no ameritaba el desarrollo de dichos exámenes. Toda esta

información recolectada se procesó en Excel 7.0 (Microsoft)

67

6. RESULTADOS

Los resultados de este trabajo son mostrados en forma de tablas dentro de

las cuales se recolectó toda la información de cada uno de los pacientes,

dividiéndolas en tres grupos : leucemias agudas, leucemias crónicas y

condiciones no leucemicas ; el criterio para esta selección estuvo basado en

la aproximación diagnóstica dada por el médico tratante. Igualmente, las

muestras fueron ordenadas de acuerdo a la fecha de arribo a la unidad de

citometría de flujo, dándosele un código numérico iniciado en 1.

De 47 casos que llegaron a la unidad de citometría de flujo, 25 (53%)

pertenecían a leucemias agudas. En la Tabla 7, se resumen los datos de

individuos con leucemia aguda y las ayudas diagnósticas que se les

practicaron; a partir de esta, se determinó que el recuento de leucocitos

promedio fue de 46.7x10e9/L (+/- 57.3), el porcentaje promedio de blastos

fue de 53% (+/- 33.8), en sangre periférica y en médula ósea del 81%

(+/- 29.6). Adicionalmente, dentro de los pocos casos de LLA a los que se les

realizó pruebas citoquímicas, se encontró positividad para el PAS, y

negatividad para el SUDAN; así mismo, morfológicamente, se encontraron

68

dos casos de L1, dos de L2 y dos de L3 y cariotípicamente no se presentaron

anomalías cromosómicas a excepción de dos casos con cromosomas

Filadelfia, dos con deleciones y uno con trisomía. Con respecto a las LMA

morfológicamente se encontró un caso de M2, uno de M3, uno de M4 y dos

de M4 o M5. Dentro de estos, algunos fueron negativos para PAS y positivos

para SUDAN y ninguno presentó anomalías cromosómicas.

Del total de leucemias agudas, 18 (72%) eran de linaje linfoide (LLA)

(Ver Anexo A)provenientes en su mayoría de infantes con un promedio de

edad de 4 años (+/- 3.6); siete de estas, expresaron marcadores de linfocitos

B, tres de linfocitos T, siete de ambos linajes y la restante fue clasificada bajo

criterio clínico como LLA simplemente. Adicionalmente se observó

coexpresión de CD10/CD22 en 7 de los casos, además se encontró un caso

de expresión aberrante de CD13 y otro de CD33. Por otra parte, de las

Leucemias mieloides agudas (LMA) (Ver Anexo B) fueron en su mayoría de

pacientes adultos con un promedio de edad de 60 años (+/- 12.3), se

encontró un total de 7 casos (28%), presentándose en cuatro de ellos la

coexpresión de HLA-DR/CD13, y la expresión aberrante de CD7 en uno de

estos. Vale la pena resaltar, que en la mayoría de estos casos con curso

clínico agudo, se presentaron altos porcentajes de HLA-DR con un

promedio de expresión del 52% (+/- 29,5), junto a una expresión media de

CD45. (Tabla 8)

69

Se encontraron un total de 13 (28%) casos de leucemias crónicas, en estos

se presentó un alto recuento de leucocitos totales, con un promedio de

74,3X10e9/L (+/- 55.9), junto con un promedio bajo del porcentaje de blastos

en sangre periférica y médula ósea, siendo estos de 24%(+/- 29.9) y 25%

(+/- 32.6), respectivamente. En la mayoría de los casos se exhibió la

presencia de cromosoma Filadelfia y en algunos de ellos, el diagnóstico por

patología fue compatible tanto para LMC (4 casos) como para LLC (1caso),

(Tabla 9 )

De estos casos con curso crónico, 11 (85%) fueron de linaje mieloide (LMC)

en su mayoría adultos con un promedio de edad de 58 años (+/- 6.4)

(Ver Anexo C) observándose en dos de estos casos una coexpresión de

HLA-DR/CD13 y de CD14/CD16 en uno de ellos. También se encontró un

caso que morfológica y clínicamente pertenecía a LMC, pero

fenotípicamente poseía marcadores de LLA (Ver Anexo D). Los 2 casos

restantes, fueron Leucemias linfoides crónicas (LLC), las cuales arrojaron un

pomedio de edad de 44 años (+/- 17.3) (Ver Anexo E), en donde se observó

coexpresión de CD20/CD5. (Tabla 10)

Por último, se encontraron 9 (19%) casos pertenecientes a patologías no

leucémicas, los cuales provenían en su mayoría de pacientes adultos con un

promedio de edad de 66 años (+/- 29.3), los cuales presentaron un recuento

de leucocitos promedio de 42.7x10e9/L (+/- 71.2) con un porcentaje

70

promedio de leucocitos totales en sangre periférica del 10.2% (+/- 11.3), al

igual que en médula ósea con un promedio del 4.5% (+/- 5.4). Con respecto

al diagnóstico patológico y citoquímico en su mayoría no fueron realizados,

así mismo, las alteraciones cromosómicas estuvieron ausentes o

no se realizaron, a excepción de un caso que presentó deleción

en el cromosoma número 7, (Tabla 11).

Adicionalmente en estas patologías no leucémicas se observó en algunos

casos la presencia y en otros la ausencia de marcadores específicos de

linaje, además no se presentaron coexpresiones ni expresiones aberrantes,

además la expresión de CD45 y HLA-DR era relativamente normal con

respecto al tipo región analizada. (Tabla 12)

Vale la pena aclarar, que en todos los grupos de clasificación, existieron

casos a los que no se les realizaron alguna (s) prueba diagnóstica, estos no

fueron tomados en cuenta dentro de lo relatado anteriormente, pero se

designaron con la abreviatura NR, en los cuadros que se presentan a

continuación.

71

Tabla 7. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA

(Ver carpeta “ACCESORIOS”)

72

Tabla 8. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIAS AGUDAS


73

Tabla 9. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON LEUCEMIA CRÓNICA


74

Tabla 10. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIAS CRÓNICAS


75

Tabla 11. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON PATOLOGÍA

NOLEUCÉMICA


76

Tabla 12. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN PATOLOGÍAS NO

LEUCÉMICAS


78

7. DISCUSION

El análisis de la inmunotipificación de leucemias por citometría de flujo

realizado en este trabajo fue llevado a cabo, mediante la recolección de

datos de cada uno de los casos y una evaluación detallada de cada uno de

los resultados encontrados, ello para lograr una adecuada interpretación y

correlación de los mismos, lo anterior permitió definir los siguiente :

Los casos de leucemias agudas, al encontrarsen dentro de la población

infantil especialmente en la LLA, fue concordante con lo que se halla en la

literatura internacional (Sandler, 1997). Además, mostraron un recuento

leucocitario promedio alto y un porcentaje promedio de blastos alto en

médula ósea y sangre periférica, típico de estas patologías (Lee, 1995). La

negatividad del Sudan Black en la LLA y la positividad en la LMA, es de

esperarse, pues este, tiende a teñir los gránulos de los precursores

mieloides, mientras que el PAS por su parte pude ser positivo en ambas

patologías al ser un colorante que reacciona principalmente con el glucógeno

celular, pero con la diferencia de mostrar un aspecto distinto en cada una,

por esto no es de asombro, encontrar positividad en LLA y negatividad en

LMA (Tood, 1993). Con respecto a los hallazgos morfológicos de la LLA y la

79

LMA son tota lmente concordantes con los resultados de citometría, pero sin

tener en cuenta la clasificación FAB, a excepción de un caso de LMA-M4, en

el que se encuentra la presencia de CD14, que es frecuentemente positivo

en este subtipo de LMA; aunque si se observan los casos de LLA, partiendo

de los diferentes subtipos de esta, se puede decir que lo observado

fenotípicamentera en su mayoría LLA pre B, ello por la presencia de

marcadores propios de dicho subtipo (HLADR, CD20, CD10, IgMcit)

(Darnell, 1997). Igualmente, vale la pena resaltar la relación entre la regiones

analizadas y sus respectivas expresiones de CD45 y HLA-DR, la cual, al ser

en la mayoría de los casos población blástica, tienden a poseer un alto

porcentaje de HLA-DR, por ser este una molécula característica de

inmadurez celular en estos casos, y la expresión de CD45 media, que es

típica de esta población; sin embargo la relación entre HLADR y la población

blástica de los casos no fue estadísticamente significativa (r:0.36). También,

es importante resaltar los casos de LLA que mostraron expresión de

marcadores de ambos linajes, los cuales podrían ser argumentados por el

hecho de que el inicio de la leucemia se dio a partir de una célula progenitora

más temprana que la que se da en los casos en donde la expresión es

restricta de un linaje específico ya sea B ó T, ello, observándose desde el

punto de vista de la diferenciación normal de estas células (Kondo, 1997).

Así mismo, la presencia de marcadores aberrantes, se atribuye en la

presencia de progenitores inmaduros, como por ejemplo CD7 en un caso de

LMA, el cual, según algunos trabajos ha sido encontrado sobre células de

80

normales CD34+ que exhiben potencial mieloide (Stasi,1995), con respecto a

las expresiones de CD13 y CD33 en casos de LLA, coincide con el hecho de

que este tipo de expresiones es muy común en adultos (Hon Pui, 1991). Por

otra parte, la presencia de cromosoma Filadelfia en dos de los casos de LLA,

refieren algo de asombro, pues aunque no es anormal encontrarlos, si son

escasos en este tipo de patología ; pero al parecer, la proteína que codifica

este cromosoma generalmente es distinto a la que se halla en el cromosoma

de la LMC (Kelley,1990).

En las leucemias crónicas, se presentó una población adulta en su mayoría,

coincidiendo esto con lo encontrado en literatura, en donde la alta incidencia

de LMC y LLC se presenta en esta población (Byrd,1998; Epsatein,1999);

adicionalmente también se encontró un recuento leucocitario alto, típico de

las leucemias en general y un porcentaje promedio de blastos bajo tanto en

sangre periférica como en médula ósea, lo que es normal en las leucemias

de curso crónico. Igualmente la presencia de cromosoma Filadelfia fue alta

en esta población, que es típico de esta patología (Epstein,1999). Con

respecto al inmunofenotipo, los dos casos de LLC, que coexpresaron de

CD20/CD5 es lo más encontrado fenotípicamente en estas leucemias

(DiGiuseppe, 1998). Con respecto al caso que morfológica y clínicamente era

LMC pero presentaba marcadores de LLA, al parecer puede indicar que el

paciente se encontraba en un estado de crisis blástica en el que se estaba

dando una conversión tanto de linaje como de curso de la enfermedad

81

(Lee, 1995).

En las patologías no leucémicas, aunque se encuentra un recuento de

leucocitos tanto alto como bajo, el porcentaje de blastos en sangre periférica

y médula ósea es relativamente bajo, coincidiendo esto con los diagnósticos

clínicos que son generalmente síndromes mielodisplásicos (Lee,1995). Así

mismo, la no presencia de marcadores atípicos, ni de aberraciones ni

coexpresiones indican la normalidad aparente de las células, confirmándose

ello por su expresión de CD45 vs SSC; en estos casos, los estudios por

citometría de flujo no fueron relevantes como ayuda diagnóstica, solo

descartaron cuadros leucémicos.

82

8. CONCLUSIONES

♦ La realización de una base de datos, al igual que la confirmación de los

criterios de análisis por citometría de flujo, es de gran utilidad para la

correlación y la realización de un buen análisis de los casos.

♦ La edad, el recuento leucocitario y los porcentajes de blastos.

Generalmente tienden a coincidir con el tipo de leucemia presente.

♦ La información de cada tipo de diagnóstico no es de gran valor cuando

se analiza de forma individual, a diferencia de cuando se relaciona con los

demás métodos.

♦ Existió una buena concordancia entre las diferentes ayudas diagnósticas

usadas.

♦ El análisis de citometría de flujo es de gran utilidad, especialmente en

casos de conversión blástica, en donde por morfología en algunas

ocasiones no es posible determinar.

83

9. RECOMENDACIONES

♦ Siempre que una muestra de leucemia llegue a la Unidad de Citometría

de flujo de la Pontificia Universidad Javeriana, debe traer consigo la

información básica del paciente como nombre completo, edad, sexo,

mielograma, datos de sangre periférica y diagnóstico clínico presuntivo :

ello con el fin de tener antecedentes claves, que pueden ser de utilidad

para la realización de un buen análisis.

♦ El reporte de citometría de flujo no solo debería llevar los porcentajes de

los marcadores utilizados, sino que también se le debería anexar las

gráficas de puntos de FSC/SSC y CD45/SSC, y además la de los

marcadores más relevantes para cada caso ; esto con el propósito de

permitirle al médico la observación y correlación de los marcadores con

respecto a la región analizada.

♦ A la entrega del reporte de citometría de flujo, se debería realizar la

discusión del caso con los responsables de las demás ayudas

84

diagnósticas, ello con el objetivo de correlacionar todos los resultados

obtenidos y poder aportar opiniones que sean de utilidad para el

diagnóstico definitivo del caso y por ende un oportuno y óptimo

tratamiento.

♦ Para la continuidad de este trabajo, podría sugerir estudiar la relevancia

de las expresiones aberrantes en la clínica y curso de la enfermedad.

85

10. ANEXOS

86

Anexo A. CASO DE LLA

Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000

Quad Events % Gated % TotalUL 25 0.30 0.25UR 549 6.62 5.49LL 4209 50.72 42.09LR 3516 42.37 35.16



Region Events % Gated % TotalR1 8859 88.59 88.59

R1









87

Anexo B. CASO DE LMA

Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000




R1










88

Anexo C. CASO DE LMC

Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10000










R1




89

Anexo D. CASO DE LMC EN T RANSFORMACION BLASTICA

Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000










R1Region Events % Gated % Total

R1 7651 76.51 76.51



90

Anexo E. CASO DE LLC

Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000







R1







91

Anexo F. PREPARACION DE REACTIVOS

Stock PBS 25X

188gr de K2HPO4

33gr de NaH2PO4.H2O

188gr de NaCl

Para prepararar 1L, disolver totalmente en 900ml de agua destilada.

Estabilizar pH en 7.4, Completar volumen a 1000ml con agua destilada.

Concentración utilizada de trabajo: 1x

Stock PBS - Azida de Sodio 1%

1gr de Azida de Sodio

Disolver en 100ml de PBS 1x

Concentración utilizada para trabajo: 0.1%

Stock PBS - Paraformaldehido 5%

5gr de Paraformaldehido

Disolver en 100 ml de PBS 1x

Concentración utilizada para trabajo: 0.5%

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11. BIBLIOGRAFIA

1. Abbas, A; Lictman, A; Pober, J. Inmunología Celular y Molecular. 3ª ed.

España : Interamericana. 1999. p. 519

2. Akashi, K; Traver, D; Miyamoto, T. A clonogenic common myeloid

progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000, 404 :193-

197.

3. Beckton Dickinson. Citometría de flujo, análisis celular Multiparametrico

Inmunolab. Laboratorios C.A. Colombia. 1999.

4. Behm, F ; Campana, D. Immunophenotyping Studies of Childhood

Hematologic. Memphis. 1999.

5. Byrd, J; Army, W. Introduction:Chronic lymphocytic leukemia. Seminars in

Oncology,1998. 25:4-5

6. Darnell, C; Foon, J. Recent advances in flow cytometry: aplication to the

diagnosis of hematologic malignancy. Blood, 1997. 90:2863-2879

7. DiGiuseppe, J ; Borowitz, M. Clinical Utility of Flow Citometry in the

Chronic Lymphoid Leukemia. Seminars in Oncology, Febrero1998, 25 : 6-

10.

93

8. Epstein,F. The Biology of chronic myeloid leukemia. The New England

Journal of Medicine. 1999, 341:164-171

9. Fauci, A . Harrison Principios de Medicina Interna. 14a. De. España :

McGraw Hill-Interamericana. 1998. p. 278-780

10. Hon Pui, C; Raimondi, C; Head, D; Schell, M; Rivera, D; Mirro,J; et al.

Characterization of childhood acute Leukemia with multiple myeloid and

lymphoid at diagnoses and relapse. Blood, 1991. 78:1327-1337

11. Hon Pui, C ; Behm, F . Clinical and Biologic Relevance of Immunologic

marker studies in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood,1993,

82 :343-362.

12. Instituto Nacional de Cancerología. Distribución de Casos Nuevos de

Cancer por Grupos de Edad y sexo según Localización Topográfica.

Bogotá. ESE. 1999.

13. Kelley, J. Principios de Medicina Interna . 9ª ed. España: Medica

Panamericana. 1990

14. Kondo, M; Weissman, I; Akashi, K. Identification of clonogenic common

lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 1997, 91 : 661-672.

15. Lowenberg, B ; Downing, J ; Burnett, A. Acute Myeloid Leukemia. New

England Journal Medicine, Septiembre 1999 ; 341 :14

16. Mckenzie, S. Hematología Clínica, 1991. 1ra ed. México : El Manual

Moderno S.A. 1991.

17. Ministerio de Salud. Morbilidad por Consulta Externa. Bogotá. Archivo

maestro SIS 103.1997.

94

18. Murphy, GP ; Lawrence, W ; Lenhard, RE. Oncología Clínica. 2da ed.

Washington D.C. : OPS. 1996.

19. Paul, W. Fundamental Immunology. 2ª ed. New York: Kaves press. 1989.

p. 781-815

20. Ruiz Arguelles, G. Fundamentos de Hematología. 2da ed. Mexico :

Medica Panamericana.1998.

21. Registro Poblacional de Cancer. Mortalidad de Leucemias en Colombia

para Ambos Sexos - Tasa por 100000 Habitantes, 1991-1996. Cali. 1996.

22. Sandler, D; Rots, Julie. Epidemiology of leukemia in children and Adults.

Seminars in Oncology, 1997, 24: 3-11

23. Stasi, R; Taylor, D; Venditti, A; Del Poeta, C; Aronica; D; Bastianelli, et al.

Contribution of Immunophenotyping and Gentyping Analyses to the

Diagnosis of Acute Leukemia. Ann Hematology. 1995, 75 :13-27

24. Tood, J. Diagnóstico y Tratamiento Clínico por el Laboratorio. 9ª ed.

Barcelona : Masson. 1993. p. 713-735.

25. Tucker, L, Misson JR. Fates of Human B-cell Precursors. Blood. 2000,

96, 1 : 19-23

26. Viguer, J ; Garcia, R. Laboratorio y Atlas de Citología. España :

McGrawHill-Interamericana.1995.

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