TÉCNICAS DE BIOLOG ÍA MOLECULAR

Biotecnología para no biotecnólogos.Agosto de 2012

Agenda

� Avances históricos de la biología molecular� PCR.� Electroforesis.� Hibridación de ácidos nucleicos� Secuenciación.� Clonación.

AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

1941 Genes codifican las proteínas

1944 ADNporta la información genética

1953 Determinación de estructura del ADN

1956: 23 pares de cromosomas1967 ligasa

1970 Hind III

1975 SouthernBlotting1978: se clona el gen de la insulina humana.

1982 Tabaco,

1982: se produce insulinautilizando técnicas de ADN recombinante

1983 PCR 1987 PGH

1988: 1 patente de un OMG.1997: Clonación del primermamífero, "Dolly".

2010 Cyntia

PCR

Que proceso esta implícito?

Replicación

Polimerasa Chain Reaction : Reacción en Cadena de la Polimerasa

� Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1983.

� Ganó el premio N óbel de Química en 1993 por su invento.

� Utilizó el PCR para amplificación del gen de ββββ-hemoglobina humana, y el diagnóstico prenatal de anemia falciforme.

GENERALIDADES PCR

Método de síntesis in vitro de múltiples copias de una porción de ADN: Amplificación.

Cada ciclo

Aumento exponencial de ADN blanco

Molde para la síntesis de nuevo ADN

QUE REQUIERE LA REACCIÓN PCR?

ADN MOLDE

REACTIVOSREACTIVOS

BB

EE

CC

DD

AA

BUFFER Y MAGNESIO

dNTPs

Taq ADN polimerasa

INICIADORES

Reactivos necesarios para PCR:

� Amortiguador (Buffer)� MgCl2 : Cofactor para la función de la

polimerasa.� dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados ):

dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

Reactivos necesarios para PCR:

Cebadores “primers”:� Hebras de ADN de cadena sencilla sintéticas 20-24

nt de longitud� Diseño: unión complementaria ADN blanco� Anclaje de Taq ADN polimerasa

DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.

•En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli , pero esta essensible a las altas temperaturas, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

•Se reemplazó la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus”.

Polimerasa

Parque Nacional de Yellowstone

DESNATURALIZACIÓN95°-100°C

HIBRIDIZACION40°- 60°C

EXTENSIÓN68° - 72°C

CADA CICLOCADA CICLO

Comprende múltiples ciclos de un proceso de trespasos, cada uno realizado a diferente temperatura.

1 copia de ADN se

incrementa

2X copias después de x

número de ciclos.

30 ciclos: más de un

billón de copias a

partir de una copia de

ADN en menos de tres

horas!

� 1. Denaturación: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

El proceso de “PCR ” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o m ás:

2. Apareamiento o “anneling”:� Los cebadores “primers” previamente diseñados,

reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura.

3. Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De esta forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde.

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

Termociclador

�La PCR se realiza en un “ThermoCycler ”Termociclador.

�Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

En el PCR hay una amplificación exponencial

Ventajas del “PCR”

� A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

� El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.

� Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

� Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Desventajas del “PCR”

� Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

� Se necesitan “primers ” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

� La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN

� Puede contaminarse con otro ADN.

Aplicaciones

� Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.

� Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero y pantalón del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

Criminalística

Utilidad del PCR

http://www.youtube.com/watch?v=ROsueNRg-1M

PCR TODA UNA MELODIA …!

Preparación del corrido electroforético

� La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético

� Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes geles (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

� La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia.

Análisis de la Muestra• La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad

Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

Southern blot� Secuencias específicas de DNA, mediante el uso de

electroforesis en gel y de hibridación (sondas especificas).

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot

Previamente fragmentada.

Los fragmentos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis.

Sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon

El filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar

Northern blotSe utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda.

El nombre de la técnica deriva por analogía al Sout hern Blot.

•Western Blot o Inmunoblot

Secuenciación

La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioqu ímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucle ótidos (A, C, G y T) en un oligonucle ótido de ADN.

Química.Enzimática.

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas.

En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar.El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de

uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T).Los agentes químicos utilizados en cada caso son:

DMS (G),Ácido fórmico (A+G), Hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C).

Secuenciación de Maxam-Gilbert (química)

Método enzimático de Sanger

Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson en 1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi.

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Método dideoxi de Sanger

Secuenciación de DNA

� Polimerización interrumpida de ADN.� Se lleva a cabo la polimerización de

ADN en presencia de derivadosdideoxi que detienen la polimerizaciónen diferente momento, obteniéndosefragmentos de diferente tamaño.

� Se examinan en electroforesis, se “lee”la secuencia directamente del gel.

Método dideoxi de Sanger

Método dideoxi de Sanger

Método secuenciación automática

Electroferograma de la secuenciación automática

Geles de secuencia

Secuencia automáticaSecuencia Manual

Secuenciación

CLONACIÓN

Tecnología del DNA recombinante

¿Qué es la clonación?

Proceso por el que se consiguen copias semejantes de un

organismo, célula o molécula ya desarrollado

de forma asexual. .

MODOS DE CLONACIÒN

� CLONACIÒN MOLECULAR

� CLONACIÒN CELULAR

� CLONACIÒN DE ORGANISMOS DE MANERA NATURAL

CLONACIÒN MOLECULAR

La clonación molecular se refiere al

proceso de aislar una secuencia de

ADN de interés, insertarlo en un

plásmido y obtener múltiples

copias de ella en un organismo

por acción de la DNA polimerasa. La

clonación se emplea

frecuentemente para amplificar

fragmentos de ADN que contienen

genes.

La clonación de cualquier secuencia de ADN incluye los siguientes pasos:

� Fragmentación: Inicialmente, el ADN de interés necesita ser fragmentado para proveer un segmento relevante de ADN de un buen tamaño.

� Ligación: Un procedimiento de ligación se emplea cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector.

� Transfección: Después de la ligación, el vector con el gen de interés se transfecta a una célula.

� Selección: Las células transfectadas se cultivan.

La

maravilla

de cortar y

pegar

Endonucleasas de restricción

• Pueden reconocer una secuencia característica de

nucleótidos dentro de una molécula de ADN y

cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado

sitio o diana de restricción, los sitios de restricción

cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las

que son reconocidos.

Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith 1978

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio37.swf::Restriction%20Endonucleases

Ligasas

Clonación molecular

Vector de clonación

• Plásmido.

• Bacteriófago.

• Cósmido: Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicasnecesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.

• YAC son cromosomas artificiales de levadura. 00 a 1000 kb.

• BAC es un cromosoma artificial bacteriano, hasta 300kb.

Tipos de célula anfitriona

• Procariotas

• Eucariotas

1. Agrobacterium. Uso de la bacteriaComo "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética.

2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula.3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópicas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Ingeniería Genética SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipetamuy fina.

7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivoen la célula.

Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

Tipos de clonación según el método:

• Partición o fisión gemelar: consiste en dividir un embrión, en el estadio de una célula en las primeras fases de su desarrollo, cada mitad o trozo desgajado del embrión se introduce en una zona pelúcida de otro óvulo, o en una cubierta artificial, y se implanta.

El resultado son individuos prácticamente idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas), pero diferentes a sus padres. Serían equivalentes a gemelos monozigóticos.No se debe considerar como clonación en sentido estricto.Tetra nació a partir de una fisión embrionaria.

• Paraclonación: transferencia de núcleos procedentes de blastómeros embrionarios o de células fetales en cultivo a óvulos no fecundados enucleados y a veces, a zigotos enucleados. El “progenitor” de los clones es el embrión o feto.

• Clonación verdadera: transferencia de núcleos de células de individuos ya nacidos a óvulos o zigotos enucleados. Se originan individuos casi idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas) y muy parecidos al donante (del que se diferencian en mutaciones somáticas y en el genoma mitocondrial, que procede del óvulo receptor).

TIPOS DE CLONACIÓN

• Clonación de organismos de manera artificial

• Clonación de organismos congelados

• Clonación humana

CLONACIÓN DE ORGANISMOS DE MANERA ARTIFICIAL

Técnica basada en la transferencia

nuclear, en la que participan dos

células; la que dona su material genético y la que lo acepta.

CLONACIÒN DE ORGANISMOS CONGELADOS

El principal problema de la congelación es la degradación del ADN.

Cuando se necesita mantener células de un organismo, es necesario utilizar un

criopreservanteCuando se congela una célula directamente, se

producen daños en la estructura celular debido a la cristalización del agua. El ADN

además se daña irreparablementeUn equipo de investigación japonés

ha clonado un ratón que ha permanecido 16 años congelado a -20 ºC. Utilizando células del

cerebro, las cuales mantienen en su citoplasma una mayor cantidad de glucosa, que funcionó como criopreservante, lo que

permitió mantener el ADN y las células nerviosas intactas durante todo ese tiempo.

CLONACIÓN HUMANA

La investigación tiene como

objetivo obtener células madre

para curar enfermedades.

CLONACIÓN CELULAR

Clonar una célula significa

derivar una población celular

a partir de una sola célula.

Ese es un importante

procedimiento in Vitro

cuando se desea la expansión

de una sola célula con ciertas

características.

CLONACIÓN DE ORGANISMOS DE FORMA NATURAL

Es crear un nuevo organismo con la misma información genética que una célula existente. Es un método de reproducción asexual, donde

la fertilización no ocurre.

En términos generales, sólo hay un progenitor involucrado. Esta forma de reproducción es muy común en organismos como las amebas y otros seres unicelulares, aunque la mayoría de las plantas y hongos

también se reproducen asexualmente.

LA CLONACIÓN DESDE EL PUNTO DE VISTA ÉTICO

Los problemas éticos surgen de la transformación que sufre la

reproducción ya que en la clonación por trasplante nuclear -hay un solo

‘progenitor’ genético, a diferencia de la reproducción sexual.

Actualmente, se enfrentan dos posturas principales acerca de este tema: • Algunas cosas que no sólo no

deberíamos hacer sino que ni siquiera deberíamos saber cómo hacerlas.

• No puede congelarse el desarrollo de la ciencia y la tecnología pues se privaría a la sociedad de bienes desconocidos pero imaginables.

LA CLONACIÓN DESDE EL PUNTO DE VISTA RELIGIOSO

Con frecuencia se cree que la fe y la ciencia son fuerzas opuestas, luchando para prevalecer una

sobre otra.En realidad, la religión es una guía para vivir, mientras que la ciencia es una herramienta que

nos muestra el esplendor de esa misma Creación, y que nos permite mejorar nuestras

vidas de acuerdo a nuestra fe.Como herramienta, la ciencia, nos corresponde a

todos decidir cómo usarla.

Como toda herramienta puede ser usada para beneficio de la humanidad, pero también,

puede prestarse para abusos.La clonación abre muchas posibilidades para aliviar el sufrimiento humano, pero también

presenta graves peligros. Por ejemplo, no sería moralmente aceptable experimentar o

descartar embriones humanos en la investigación.

Material de consultahttp://highered.mcgrawhill.com/sites/0072437316/student_view0/chapter14/ani

mations.html#

La oveja Dolly (5 de julio de 1996 - 14 de febrero de 2003)

Dolly fue en realidad una oveja resultado de una transferencia nuclear desde una célula donante diferenciada a un óvulo no fecundado y anucleadoCinco meses después nacío Dolly, que fue el único cordero resultante de 277 fusiones de óvulos enucleados con núcleos de células mamarias. Su nacimiento no fue anunciado hasta siete meses después, el 23 de febrero de 1997 . El 14 de febrero de 2003 (7 años), Dolly fue sacrificada debido a una enfermedad progresiva pulmonar

Los restos disecados de Dolly son exhibidos en el Museo Real de Escocia.). Sus creadores fueron los científicos del Instituto Roslin de Edimburgo (Escocia), Ian Wilmut y Keith Campbell.

Estrategia de clonación

“ El hombre fue creado a imagen y semejanza de El hombre fue creado a imagen y semejanza de DiosDios”” ,,

-- EstEstáá llamado a ser Dios, a crear y modificar la llamado a ser Dios, a crear y modificar la vida...........vida...........

En la primera clonaciEn la primera clonacióón humanan humana““ De la costilla del hombre Dios hizo la mujerDe la costilla del hombre Dios hizo la mujer”” , , Dios inventDios inventóó la clonacila clonacióón, El hombre al estar n, El hombre al estar llamado a ser Dios, deberllamado a ser Dios, deberíía clonar incluso al a clonar incluso al

mismo hombremismo hombrecomo lo hizo Dios.......como lo hizo Dios.......

¿Para que clonar animales?- Modelos animales- Factorías farmacéuticas- Evitar extinciones- Aprender- Humanizarlos (Transplantes)- !Mascotas ¡

CLONACION DE ORGANOS

El mundo de las células madre

CLONACION NO REPRODUCTIVA

CLONACIÓN HUMANA

-- ““ revivirrevivir ”” personas queridas, genios.personas queridas, genios.-- Tener hijos sin hombres.Tener hijos sin hombres.-- ExperimentaciExperimentacióónn-- ¿¿Ganarle la batalla a muerte?Ganarle la batalla a muerte?

Influencia del ambienteInfluencia del ambienteHerencia extra nuclear / proteicaHerencia extra nuclear / proteica

--Infertilidad (genInfertilidad (gen éética, tica, tratamiento enfermedad).tratamiento enfermedad).

Al clonar seres vivos, no se Al clonar seres vivos, no se camina en contra de la camina en contra de la experiencia de la naturaleza, experiencia de la naturaleza, que invirtique invirti óó miles de amiles de añños para os para lograr la reproduccilograr la reproduccióón sexual, n sexual, asegurando que los individuos asegurando que los individuos que nazcan sean siempre que nazcan sean siempre diferentes.?diferentes.?

Las plantas que se usan como modelos de aprendizaje en Ingeniería Genética Vegetal son:

Arabidopsis thaliana,Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Solanum tuberosum (papa).

Estos modelos son útiles para “aprender haciendo” y ayudar a resolver problemas identificados por los agricultores nacionales, mientras se capacitan los miembros de los Centros o Unidades de Investigación que se quieran preparar.

Ingeniería Genética: MODELOS VEGETALES

• 1987 secreción de Beta-lactoglobulinaen leche de ratón.

• Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para desórdenes

como hemofilia.

• Hormonas de crecimiento humano en tejido de cerdo.

• Antitrombina humana III, anti-coagulante sanguíneo secretada en

leche de cabras transgénicas.

• Cabras transgénicas para producir

BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araña.

Ingeniería Genética NUEVOS ANIMALES

Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento.

ARROZ DORADO con beta caroteno de

genes de narciso y de Erwinia uredovora,

pigmentos que se transforman en pro-

vitamina A al ser ingeridos.

ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.

ARROZ con aa esenciales.

Ingeniería GenéticaNUEVOS ALIMENTOS

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ciencias dominantes emergentes

Genómica

Transcriptómica

Proteómica

¿Qué podría pasar ?

¿Qué esta pasando?

(Dhingra et al. 2005)

La complejidad de un organismo no está determinada por la complejidad de su genoma sino por la complejidad de su

PROTEOMA

Un mismo genoma

Diferente proteoma

PROTEOMA PROTEÓMICA

Corresponde a la totalidad de las proteínas codificadas por un

genoma

Se ocupa del estudio de las proteínas producidas en una

condición determinada

(Dhingra et al. 2005)

INTRODUCCIÓN

Aproximaciones…….. INTRODUCCIÓN

Proteómica de expresión

Proteómica Funcional

Proteómica estructural

INTRODUCCIÓN

(Dhingra et al. 2005)

Electroforesis en dos dimensiones

(Tomado de Cuervo 2010)

Electroforesis en dos dimensiones

(Tomado de Cuervo 2010)

Análisis de los geles bidimensionales

a) Electroforesis en condiciones denaturantes (gel de poliacrilamida al 12%), de extractos provenientes de las fases exponencial y de latencia de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B. b) Electroforesis bidimensional de proteínas intracelulares (fase de latencia). Proteínas (300 µg) extraídas con ultrasonido, en buffer fosfato con Pefabloc 10 mM. Primera dimensión: tiras pH 4-7 (18 cm). Tinción con Blue Silver.

Espectometría de masas: Ionización INTRODUCCIÓN

Espectrograma de masasINTRODUCCIÓN

(Chen & Yates 2007)