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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 7

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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OBJETIVOS

1. Extraer del tejido hepático o muscular el carbohidrato de reserva más importante en los mamíferos y

otros organismos.

2. Aplicar la hidrólisis del glucógeno como técnica in Vitro para obtener glucosa.

3. Cuantificar por el método de Antrona el glucógeno extraído de diferentes muestras biológicas y una

muestra problema.

4. Determinar el porcentaje de glucógeno presente en tejido hepático y muscular para diferentes

muestras biológicas.

5. Establecer que defectos enzimáticos producen valores aumentados o disminuidos de Glucógeno.

PREPARACIÓN PREVIA

1. Repase el proceso de la glucogenólisis y glucogénesis.

2. Lea el fundamento y el procedimiento de la practica.

INTRODUCCIÓN

El glucógeno es un homopolisacárido y fue aislado del hígado por primera vez por Claude Bernard en 1856.

Se ha encontrado en bacterias, algas, levaduras y también existe en animales inferiores como las ostras y

mejillones dándoles a estos alimentos una mayor consistencia y valor gastronómico.

El glucógeno es la reserva esencial de glucosa en los animales superiores; se sintetiza en todos los tejidos

animales, pero en mayor proporción en el citoplasma del hepatocito y miocito por la acción de dos enzimas la

glicógeno sintasa y la glucosil α (46) transferasa sobre un precursor de glucógeno (conformado por 8

residuos de glucosa) que esta unido a una proteína llamada glucogenina. La glicógeno sintasa permite la

unión secuencial de unidades de α D-glucosa provenientes de la UDP glucosa mediante enlaces lineales α

(1 4) y la glucosil α (46) transferasa forma puntos de ramificación por la transferencia de 7 residuos de

una rama interna hacia otra posición en la misma cadena o hacia otra cadena de glucógeno generando la

unión de dos residuos de glucosa con enlace α (1 6), esto hace que la estructura presente un aspecto

arborescente como la amilopectina. Las ramificaciones le dan al glucógeno un carácter compacto

permitiéndole ocupar una menor cantidad de espacio, como también permiten una alta solubilidad e

incremento de los extremos no reductores [1].

El peso molecular del glucógeno varía según su origen; es del orden de 1 a 5 x106, el hígado resulta de la

condensación de 30.000 unidades de glucosa. Su estructura molecular le confiere propiedades que se pueden

utilizar para aislarlo eficientemente, purificarlo y cuantificarlo mediante técnicas específicas.

PRINCIPIO

Para el análisis cuantitativo del glucógeno; el tejido es sometido a hidrólisis ácida con HCl para liberar

moléculas de glucógeno. El rompimiento del tejido también libera proteínas y otras sustancias que son

precipitadas por el ácido tricloroacético y el proceso de centrifugación. Las unidades de glucógeno liberadas

2

por el proceso de hidrólisis son solubles en el sobrenadante y son precipitadas al incubar éste con etanol en

frío. El glucógeno recuperado es hidrolizado para producir unidades de glucosa que en presencia de ácido

sulfúrico se deshidratan para producir furfurales que reaccionan con la Antrona generando un aumento de la

absorbancia que se lee a 625 nm contra una curva de calibración construida con estándares de glucógeno de

8 mg % -2 mg %.

MATERIAL DE PRUEBA

Hígado y músculo frescos (Estudiantes)

Ostras crudas. (Estudiantes)

PROCEDIMIENTO

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS ACIDA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos falcon de 15 ml y pese dos de estos con ayuda de un beaker o

espuma según sea el caso y guárdelos para el paso 10. Registre su peso en Tabla 1 análisis

cuantitativo Anexo 7.

2. Con ayuda de guantes y un bisturí corte un fragmento de la parte interna del tejido, asegurándose de

no tomar adipositos ni membranas.

3. Pese en balanza analítica entre 0.5- 1 g de tejido o una cuarta parte del tejido disponible y registre el

valor en la Tabla 1 análisis cuantitativo Anexo 7.

4. Homogenice en un mortero cada tejido con 0.5 g de arena lavada autoclavada mas 1 ml de ácido

clorhídrico 6 N hasta obtener una pasta de consistencia suave. Tenga cuidado de no esparcir el

tejido por todo el mortero, porque perderá tejido y por lo tanto analito.

5. Agregue 1 ml de solución salina fisiológica 0.85 % p/v.

6. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y transfiera la mayor parte del tejido macerado a un tubo de

15 ml.

7. Adicione 2.5 ml de TCA al 10% (p/v) y recupere la mayor parte del tejido remanente que queda en

el mortero y la mano.

8. Equilibre y centrifugue por 6 minutos a 4.000 r.p.m.

9. Tome el sobrenadante con ayuda de una micropipeta y pase a los tubos de 15 ml que pesó y rotuló

en el numeral 1.

10. Agregue 2 ml de etanol absoluto y deje en nevera 12 horas a 4° C, compruebe que queden bien

tapados cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos en una gradilla, si no los va a

procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

PRIMERA PARTE EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO POR HIDRÓLISIS BASICA:

1. Rotule el tubo y la tapa de 4 tubos de 1.5 ml (dos para músculo y dos para hígado), pese dos de

estos con ayuda de una espuma y guárdelos para el paso 5. Registre su peso en Tabla 2 análisis

cuantitativo Anexo 7.

2. Corte un fragmento de la parte interna del tejido con ayuda de guantes y un bisturí, asegurándose de

no tomar adipositos ni membranas para los diferentes tejidos y pese para cada uno entre 10- 60 mg en

la balanza analítica sobre un papel aluminio. Registre el valor que tomó en la Tabla 2 del Anexo 7.

3

3. Ponga cada uno de los tejidos en el tubo correspondiente que no peso, agregue 50 mg de arena

lavada autoclavada mas 60 μl de KOH 6 N y homogenice el tejido con ayuda de una varilla de

vidrio de punta roma hasta obtener una pasta de consistencia suave.

4. Agregue 600 µl de H2O fría, homogenice mediante agitación por vortex y centrifugue a 10.000

r.p.m por 2 min.

5. Recupere cada sobrenadante a los tubos que peso en el numeral 1 y adicione 200 µl de etanol al

80%. Asegúrese que estén bien tapados, cubra la tapa con papel parafilm o cristaflex y colóquelos

en una gradilla, si no los va a procesar al día siguiente guárdelos a -20 °C hasta su uso.

SEGUNDA PARTE CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO :

1. Programe el baño de María hasta que alcance la temperatura de ebullición.

2. Centrifugue los tubos de 15 ml y 1.5 ml a 4000 r.p.m por 5 min a 4 ° C, si hay lípidos elimine la

capa de grasa con ayuda de una micropipeta y vuelva a centrifugar. Asegúrese de que el pellet este

fuertemente unido para no perderlo.

3. Descarte el sobrenadante por inversión rápida del tubo y coloque sobre el tubo invertido una tolla

secante para eliminar la mayor cantidad de etanol posible.

4. Deje que cada muestra se evapore totalmente a temperatura ambiente en cámara de flujo laminar ó

con corriente de aire y establezca el peso del pellet recuperado (glucógeno), determine el factor de

dilución aproximado que debe aplicar para que las muestras entren en la curva de calibración (0.02

mg/ml-0.08 mg/ml), exprese el peso en mg /mL.

5. Resuspenda el precipitado en agua destilada mediante agitación por vortex y evite que queden

grumos sin disolver, si el peso obtenido es húmedo divida por 3 ó aplique la siguiente relación

verificando que su calculo entra en la curva de calibración, por ejemplo:

a. mg de Hígado /1-5 ml H2O

b. mg de Músculo / 0.5 -1 ml H2O

6. Tenga en cuenta la capacidad del baño de María antes de iniciar el procedimiento.

7. Encendida la cabina de extracción y dentro de ésta procese los estándares y las muestras de acuerdo

a los volumenes indicados en Tabla 1 (para los espectrofotómetros análogo y digital). Trabaje la

mitad del volumen para los colorímetros y el espectrofotómetro Perkin Elmer.

8. Realice el procedimiento en una secuencia rápida, tape la parte superior de cada tubo con papel

parafilm o vinilpel y ábrale un pequeño orificio con un lápiz a cada uno. Esto se realiza para puedan

salir los vapores del ácido y de impedir que en el proceso de incubación dentro del baño de María

entren gotas de agua caliente producto de la condensación del vapor agua sobre el ácido y así

evitar accidentes.

Tabla 1. Metodología para cuantificación de glucógeno.

1 2 3 Músculo Músculo Hígado

2 mg/dl 4 mg/dl 8 mg/dl 1/5 1/25 1/200

Agua 0,6 ml 0.45 ml 0.3 ml

Patrón de

glucógeno 8

mg/ dL

0.15 ml 0.3ml 0,6 ml - - -

Muestra H 0,6 ml

Muestra M - - - 0,6 ml 0,6 ml

Antrona 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml 2,4 ml

Reactivo Blanco

Patrones Glucógeno Muestras

4

9. Incube en un baño de María en ebullición durante 10 minutos exactos.

10. Pare la reacción sumergiendo la base de los tubos en agua fría y lea contra el blanco de reactivos a

625 nm.

11. Descarte los residuos en el colector correspondiente, teniendo precaución de voltear la cara para

evitar accidentes en sus ojos y rostro.

CALCULOS

1. Calcule los mg de glucógeno recuperado por los dos métodos de acuerdo a los datos que proceso en

su Tabla 1 Anexo 7.

2. Registre los valores de la curva de calibración en la Tabla 2 Anexo 7 y estime los valores de

intercepto, pendiente, coeficiente de correlación y la concentración de glucógeno en las muestras

analizadas.

Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por

el método de la antrona.

Grupo Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido

ml

Fd mg/dL AbsConcentración

mg/dL

Blanco reactivos − − − −1 Estándar − − − 2.5

2 Estándar − − − 5

3 Estándar − − − 10

4 Hígado

5 Musculo

6 Hígado Eppendorf

7 Musculo Eppendorf

a

b

r

3. Exponga el resultado en porcentaje de glucógeno por peso de tejido húmedo o seco según sea el caso.

INVESTIGACIÓN PARA SU ARTÍCULO

1. ¿Qué otras moléculas precipitan con TCA al 10%?

2. ¿De qué esta conformado el pellet que se descartó?

3. ¿Por qué el etanol precipita el glucógeno?

4. ¿Cuáles métodos colorimétricos se pueden utilizar para cuantificar el glucógeno?

5. ¿Qué diferencia(s) hay en la síntesis de glucógeno para plantas (amiloplastos) y bacterias?

6. ¿Cuál es el método mas avanzado para cuantificar glucógeno?

7. ¿Cuál es la composición y el mecanismo de acción del lugol para producir colores característicos

con: el glucógeno, la amilosa, la amilopectina, la celulosa y el almidón? Elabore una tabla

comparativa.

5

RESULTADOS

1. Describa las diferencias y semejanzas entre el almidón y el glucógeno mediante estructuras.

2. Determine que reacciones que se llevaron a cabo en la práctica.

3. Procese la Tabla 1- 2 del Anexo 7 para músculo e hígado y calcule el porcentaje de glucógeno

hepático y muscular observado.

4. Anexe la curva de calibración e interpole las muestras analizadas, adjunte la Tabla 2 del Anexo 7

con la corrección por mínimos cuadrados (valores de coeficiente de correlación, pendiente e

intercepto), factores de dilución que aplicó a sus muestras y despeje la concentración de estas de los

datos obtenidos por corrección de mínimos cuadrados.

5. Determine el porcentaje de error de glucógeno en las diferentes muestras del valor obtenido al

despejar su concentración en mg/dL de los datos obtenidos por mínimos cuadrados teniendo en

cuenta que el porcentaje de glucógeno esperado en humanos para hígado es de 6% y para músculo

1-2%.

6. Discuta que ocurre a nivel metabólico con la cantidad de glucógeno hallado en las diferentes

muestras biológicas analizadas.

7. Determine con los análisis cuantitativos si la muestra problema analizada es normal o hay un defecto

enzimático, de ser así discuta a que problema(s) metabólico(s) podría corresponder y soporte sus

hallazgos con un artículo.

8. Elabore una tabla que resuma las enfermedades que se originan por defectos en glucogénesis y

glucogenólisis, esta debe describir la enzima deficiente; el tejido (hígado / músculo); características

de la enfermedad; estructura del glucógeno normal, similar a almidón, amilopectina, dextrina,

dextrina límite etc; concentración de glucógeno normal, aumentada, disminuida etc y tratamiento.

BIBLIOGRAFÍA

1. NELSON, D. L., & COX, M. M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry. New York: Worth

Publishers 736-739.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTA

1. ALEMANY, M. Y FONT, S. Prácticas de Bioquímica. España: Alambra, 1983.

2. PLUMMER, R.D. Bioquímica Práctica. México: Mc Graw-Hill Latinoamérica, 1981.

3. RENDINA, G. Técnicas de Bioquímica Aplicada: México Interamericana, 1974.

4. WILBRAHAM, A.C. Y MATTA, M. S. Introducción a la Química Orgánica y Biológica. México:

Addison-Wesley. Iberoamericana, 1989.

5. WHITE, A. Y HANDLER, R. Principios de Bioquímica. Bogotá: Mc Graw-Hill, 1982.

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Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo

Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Musculo Musculo Musculo Musculo Musculo

1

2

3

4

5

6

7

8

Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo Cuantitativo

Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Hígado B Musculo Musculo Musculo Musculo Musculo

1

2

3

4

5

6

7

8

Grupo

ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno

Tabla 1 Glucógeno recuperado por hidrólisis ácida, básica y sin hidrólisis

Peso mg tubo

15 ml vacio

Peso mg tubo 15

ml vacio

Peso mg tubo 15

ml con

glucógeno

Peso mg glucógeno

observado

Peso mg

glucógeno

observados

mg glucógeno

esperados

Peso mg tubo 15 ml

con glucógeno

mg glucógeno

esperados

mg glucógeno

esperados

Peso mg

glucógeno

observado

Peso mg tubo 1.5 ml

con glucógeno

Grupo

% Error

% Error % Error

% Error mg glucógeno

esperados

Peso mg tubo

1.5 ml vacio

Peso mg tubo 1.5

ml vacio

Peso mg glucógeno

observado

Peso mg tubo

1.5 ml con

glucógeno

7

Grupo 1Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido

ml

Fd mg/dL AbsConcentración

mg/dL Grupo 2

Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido mlFd mg/dL Abs

Concentración

mg/dL

Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5

2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5

3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10

4 Hígado 4 Hígado

5 Musculo 5 Musculo

6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf

7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf

a a

b b

r r

Grupo 3Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido

ml

Fd mg/dL AbsConcentración

mg/dL Grupo 4

Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido mlFd mg/dL Abs

Concentración

mg/dL

Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5

2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5

3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10

4 Hígado 4 Hígado

5 Musculo 5 Musculo

6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf

7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf

a a

b b

r r

Grupo 5Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido

ml

Fd mg/dL AbsConcentración

mg/dL Grupo 6

Glucógeno

mg

Volumen

Resuspendido mlFd mg/dL Abs

Concentración

mg/dL

Blanco reactivos − − − − Blanco reactivos − − − −1 Estándar − − − 2.5 1 Estándar − − − 2.5

2 Estándar − − − 5 2 Estándar − − − 5

3 Estándar − − − 10 3 Estándar − − − 10

4 Hígado 4 Hígado

5 Musculo 5 Musculo

6 Hígado Eppendorf 6 Hígado Eppendorf

7 Musculo Eppendorf 7 Musculo Eppendorf

a a

b b

r r

Tabla 2. Datos de la curva calibración de glucógeno y valores de glucógeno en muestras problema por el método de la antrona.

ANEXO 7. Aislamiento y Cuantificación de Glucógeno

8

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Grupo

Peso tejido Hígado y Musculo Esquelético

Cuantitativo H

Hidrólisis Ácida

Cuantitativo M

Hidrólisis Ácida

Cuantitativo H

Hidrólisis Básica

Cuantitativo M

Hidrólisis BásicaCualitativo H Cualitativo M