Altamirano Cc

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA INGENIERA

AGROINDUSTRIAL

E.A.P. DE INGENIERA QUMICA

Optimizacin de un Mtodo para la Produccin

deBiomasa de Saccharomyces cerevisiae empleada en la

etapade Fermentacin del Mosto de Cerveza, desde un

nivel deLaboratorio a un nivel Piloto

TESIS

Para optar el Ttulo Profesional de Ingeniero Qumico

AUTOR

Carlos Alberto Altamirano Cahuancama

ASESOR

Jorge Luis Cardenas Ruiz

Abad Flores Paucarima

Lima Per

2013

El presente trabajo se realiz en las instalaciones del laboratorio de Microbiologa

Ambiental y Biotecnologa de la facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad

Nacional Mayor de San Marcos.

DEDICATORA

A mis padres Dora y Aquilino por su preocupacin permanente en Mi formacin y superacin personal. Siempre perduraran en mi corazn

A mis hijos Jos y lvaro, que la presente estimule el sendero que transiten en sus vidas.

A mi esposa Rosario por su tolerancia y respaldo

en cada uno de los actos de mi vida.

A mis hermanos Jadsn, Marco, Lino por su constante apoyo

y estimulo en cada uno de los actos de mi vida .Mi eterno

afecto y agradecimiento.

Al Dr. Abad Flores Paucarima, Maestro y amigo

por su brillantes intelectual y calidad humana mi

admiracin y eterno agradecimiento por

servirme de ejemplo como hombre de Ciencia y

formador del pensamiento crtico.

AGRADECIMIENTOS

Mi eterna gratitud:

Dr. ABAD FLORES PAUCARIMA, Catedrtico de la UNMSM responsable del

Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa Facultad de Ciencias

Biolgicas. Co-Asesor de Tesis.

Dr. JORGE CHVEZ PREZ, Catedrtico y Director del Instituto de Investigacin en

Bioqumica y Biologa Molecular de la UNALM. Revisor Externo

Mg. GILBERTO SALAS COLOTTA, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

de la UNMSM. Presidente del jurado de Tesis.

Mg. LEONCIO REYNA MARIAS, Catedrtico y Director de Escuela de Ing. QUMICA

de la UNMSM. Revisor de Tesis.

Ing. QUMICO JORGE LUS CRDENAS RUZ, Catedrtico de la Facultad de Qumica

Ingeniera Qumica e Ingeniera Agroindustrial de la UNMSM. Asesor de Tesis

RESUMEN

La Esterilizacin es un proceso fsico por el cual se consigue eliminar la carga

microbiana acompaante y sus esporas que contaminan un medio de cultivo e

instrumentos de laboratorio as tambin en la planta de procesos. Las caractersticas

del material problema a esterilizar son de relevante importancia al momento de elegir

entre los distintos mtodos de esterilizacin, que se pueden emplear como son:

Esterilizacin por calor seco, Esterilizacin por calor hmedo, Esterilizacin por

Radiacin Gama y UV, Esterilizacin por Filtracin.

El aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae a partir de un cultivo

contaminado es una prctica de gran relevancia para obtener un cultivo axnico. Las

metodologas que se emplean son los sub cultivos directos, medios selectivos,

sustancias qumicas inhibitorias o el uso de discos de antibitico, luego se identificar

las unidades formadoras de colonia de Saccharomyces cerevisiae por su morfologa

caracterstica debido a su comportamiento cultural de manera que todos los

individuos del mismo cultivo tengan la misma composicin gentica, es decir un clon

de clulas. Para posteriormente aislarlo y elegir la mejor metodologa de conservacin

de cepas a largo plazo, conservacin por congelacin, conservacin por liofilizacin o

mtodos de conservacin a corto plazo, para conservar convenientemente el cepario

de clulas de Saccharomyces cerevisiae.

Para llevar a cabo de manera ptima la produccin del mosto de malta de cebada se

utiliza la relacin ms conveniente de Agua/Malta de cebada (Cuadro 3) Los distintos

perfiles de temperatura (Cuadro 4) y la (Figura 17) que actan sobre la papilla de

Agua/Malta de cebada para activar el complejo enzimtico (Amilasa-Proteasa) que

hidrolice las cadenas lineales y ramificadas de polisacridos del almidn y de las

protenas. El pH ptimo (Cuadro 5) que active el complejo enzimtico para que las

enzimas adquieran la conformacin tridimensional que reconozca a su sustrato

unindose e hidrolizando los enlaces glucosdicos y peptdicos de la malta. El grado de

hidrlisis enzimtico es funcin del Tiempo de actividad enzimtica (Cuadro 6). Todas

estas variables de operacin actan de manera sinrgica para obtener de manera

ptima un caldo enriquecido (Cuadro 8) y (Cuadro 9) llamado mosto de malta de

cebada.

La propagacin de clulas de levadura a nivel de laboratorio (Figura 21) se realiza en

caldo estril de extracto de levadura, glucosa y peptona (YPG) bajo condiciones

aerbicas empleando aire estril, control estricto de la temperatura para que la

levadura Saccharomyces cerevisiae lo metabolice y sintetice su material celular

propagndose en el medio de cultivo. El criterio aplicando de escalamiento (Figura22)

por lo general es empleando un factor de alrededor de 1:10 para cada trasegado, y

una concentracin celular de 10-15x106 clulas/mL.

La dilucin sucesiva de una suspensin clulas de Saccharomyces cerevisiae (Figura28)

es un procedimiento que permite bajar la carga de clulas en un rango que se pueda

contar en cmara de Neubauer de manera cmoda y poder reportar de manera

confiable el nmero de clulas que se encuentran en dicha suspensin celular.

La Tincin vital de Clulas de Saccharomyces cerevisiae (Figura 43) se fundamenta en

la Bioqumica y es una tcnica rpida que permite discriminar en un cultivo celular

entre clulas que se encuentran en condicione de vitalidad o activas metablicamente

frente a las clulas muertas que coexisten en el mismo cultivo celular (Figura 38).

El Recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer Improved(Figura44)

es una tcnica de conteo celular directo en una celdilla cuadriculada subdividida en la

cual se deposita un cultivo celular diluido para ser enfocado al microscopio ptico, y

proceder al recuento de clulas y reportar el nmero de clulas por campo y as

obtener un promedio de clulas que se encuentran en la suspensin celular, por este

tcnica no discriminamos entre clulas vivas de las muertas, pero si combinamos esta

tcnica con la de Tincin vital podramos observar al microscopio las clulas

decoloradas (clulas vivas) de las clulas no decoloradas (clulas muertas ) y poder

hacer un recuento en cmara de Neubauer y saber cul es la concentracin viable con

que se est contando y si esta es ptima para ser utilizado como inoculo en la

fermentacin del Mosto de malta de cebada a nivel piloto (Figura 45).

La Propagacin de levaduras en la planta piloto de Cervecera es una actividad donde

confluyen la formacin de Ingeniero Qumico en sinergia con la Microbiologa

Industrial para poder disear y controlar de manera ptima minimizando los riesgos

de contaminacin del cultivo celular propagando la Biomasa de levadura hasta

alcanzar un volumen del 10% del volumen del mosto de malta de cebada a inocular

con una concentracin celular de 10-15x106 clulas vitales/mL para un ptimo

proceso fermentativo del mosto de malta de cebada.

INDICE GENERAL

Pg.

Resumen V

ndice de cuadros IX

ndice de figuras XI

Lista de abreviaturas XIII

1. INTRODUCCIN 1

2. FUNDAMENTOS TERICOS 2

2.1 LA CLULA DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae 2

2.1.1 Dimensin de las Clulas 3

2.2 CITOLOGA DE LA CLULA DE Saccharomyces cerevisiae 5

2.2.1 La pared celular 5

2.2.2 Espacio Periplasmtico 6

2.2.3 Membrana Citoplasmtica 6

2.2.4 El Ncleo Celular 10

2.2.5 Estructura de las Mitocondrias 11

2.3 OTRAS ESTRUCTURAS CITOPLASMTICAS 13

2.3.1 Las Vacuolas 13

2.3.2 Peroxisomas 13

2.3.3 El Retculo endoplasmtico 13

2.3.4 El aparto de Golgi 13

2.3.5 El Citosol 13

2.3.6 El Citoesqueleto 14

2.4 EL MICROSCOPIO PTICO 15

2.5 LAS ENZIMAS 18

2.5.1Factores que modifican la velocidad de las Reacciones Enzimticas 17

2.6 METABOLISMO CELULAR OXIDATIVO 20

2.7 VAS ANAERBICAS 22

2.7.1 Fermentacin alcohlica. 22

2.7.2 La fermentacin lctica 24 2.8 LA CIENCIA DE LA MACERACIN DEL MOSTO DE MALTA 24

2.8.1 Preparacin de la malta 24

2.8.2 Produccin del mosto de malta. 24

2.8.3 Fermentacin 25

2.8.4 Procesamiento final 26

2.9 CONCEPTO DE DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN 31

2.9.1 Desinfeccin 32

2.9.2 Esterilizacin 32

2.10 MTODOS DE ESTERILIZACIN 31

2.10.1 Esterilizacin por calor seco 31

2.10.2 Esterilizacin por calor hmedo 32

2.10.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV 33

2.10.4 Esterilizacin por Filtracin. 33

2.11 CONCEPTO DE CULTIVO PURO 34

2.11.1 Mtodo de aislamiento de Levaduras Saccharomyces cerevisiae 34

2.11.2 Caractersticas culturales de la colonia de Saccharomyces cerevisiae 36

2.12 METODO DE CONSERVACIN DE CEPA 36

2.12.1 Mtodos a largo plazo 37

2.12.1.1 Conservacin por congelacin 37

2.12.1.2 Conservacin por liofilizacin 37

2.12.2 Mtodo de conservacin a corto plazo 37

2.13 CULTIVO Y PROPAGACIN CELULAR 38

2.13.1 Propagacin de levadura en el laboratorio 39

2.13.2 Propagacin de levadura en la planta de cervecera 40

2.13.3 Efecto Pasteur 42

2.13.4 Efecto Crabtree 43

2.14 CONCEPTO DE CULTIVO CELULAR VIABLE Y VITAL 43

2.14.1 Evaluacin de la viabilidad de un cultivo de clulas de levadura 43

2.14.2 Evaluacin de la vitalidad de un cultivo de clulas de levadura 44

2.15 MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIN DE

MICROORGANISMOS VIABLES 45

2.15.1 Recuento directo 45 2.15.2 Medida de la masa de clulas 45

2.15.3 Recuento de viables 45

2.15.4 Medida del nmero de partculas 46

2.15.5 Medida de parmetros bioqumicos 46

2.15.6 Medida de actividad metablica de las bacterias 46

2.16 TINCIN VITAL DE CLULAS DE Saccharomyces cerevisiae 46

2.17 DILUCIN SERIADA DE LAS SUSPENSIONES CELULARES 47

2.18 CAMARA DE NEUBAUER IMPROVED PARA EL RECUENTO DE LEVADURAS 48

2.19 CRECIMIENTO DE LA POBLACIN CELULAR DEL INCULO 49

2.19.1 Ciclo de crecimiento para el cultivo por lotes 49

2.19.2 Cintica de crecimiento en un cultivo intermitente 51

2.20 ECUACIONES DE DISEO PARA EL BIORREACTOR IDEAL DISCONTINUO 53

2.20.1 Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes 54

2.20.2 Ventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes 56

2.20.3 Desventajas de un Sistema Fermentativo de Operacin por Lotes 56

3. HIPTESIS 57

4. OBJETIVOS 57

4.1 Objetivo general 57

4.2 Objetivos especficos 57

5. METODOLOGA 58

5.1 Plan de trabajo 59

5.2 Materiales y Mtodos 60

5.2.1 Mtodos de esterilizacin 60

5.2.1.1 Esterilizacin por calor seco 60

5.2.1.2 Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo 60

5.2.1.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV 61

5.2.1.4 Esterilizacin por Filtracin 61

5.2.2 Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae 62

5.2.3 Produccin de mosto de malta de cebada 65

5.2.4 Propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio 65

5.2.4 Propagacin de levaduras en la planta de Cervecera 67

5.2.5 Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae 67

5.2.6 Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae 70

5.2.7 Recuento de levaduras totales y viables en cmara de

Neubauer Improved 71

5.2.8 Determinacin de Azucares Reductores 77

5.2.8.1 Titulacin del Estndar de Glucosa 78

5.2.9 Modelo de regresin simple 79

6. RESULTADOS Y DISCUCIN 80

6.1 Mtodos de esterilizacin 80

6.1.1 Esterilizacin de instrumentos por calor seco 80

6.1.2 Esterilizacin de medios de cultivo por calor hmedo 80

6.1.3 Esterilizacin por Radiacin Gama y UV. 81

6.2 Aislamiento primario de clulas de Saccharomyces cerevisiae 81

6.3 Produccin de mosto de malta de cebada 83

6.4 Reactivacin y propagacin de clulas de levadura a nivel Laboratorio 83

6.5 Dilucin de una suspensin de clulas de Saccharomyces cerevisiae 91

6.6 Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae 91

6.7 Recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer Improved 94

6.8 Propagacin de levaduras en la planta piloto de Cervecera 95

7. CONCLUSIONES 104

8. ANEXO 105

8.1 LOS ORGANISMOS SON TRANSFORMADORES DE ENERGA 105

8.1.1 La Primera ley de la Termodinmica 106

8.1.2 La Segunda ley de la Termodinmica 107

8.1.3 Desequilibrio Metablico: Clave de la vida 108

8.1.4 El Adenosn Trifosfato (ATP) 109

8.1.5 La clula puede realizar tres clases principales de trabajo 111

8.2 LAS ENZIMAS 112

8.2.1 Clasificacin de las Enzimas 113

8.2.2 Sitio Activo 115

8.2.3 Mecanismo de Accin 116

8.2.4 La Gluclisis 116

8.2.5 Respiracin aerbica 118

8.2.6 Ciclo de Krebs 118

8.2.7 Transporte de electrones o Cadena respiratoria. 120

8.2.8 Fosforilacin Oxidativa 121

8.2.9 Hiptesis Quimiosmtica 122

8.3 OTRAS VAS CATABLICAS 125

8.4 FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL

METABOLISMO CELULAR 126

8.4.1 Temperatura 126

8.4.2 Actividad de agua (aw) 127

8.4.3 Potencial de Hidrogeniones (pH) 128

8.4.4 Potencial Redox 129

8.5 MEDIOS DE CULTIVO. 130

8.5.1En funcin de su consistencia: 130

8.5.2 En funcin de sus componentes nutricionales 131

8.5.3 Diseo de un medio de fermentacin 131

8.5.4 Requerimientos Nutricionales 132

8.6 MICROBIOLOGA Y CONTROL MICROBIOLGICO

EN LA INDUSTRIA CERVECERA 133

8.7 PRINCIPALES PUNTOS DE CONTAMINACIN MICROBIOLGICA 136

8.7.1 En las Materias primas 136

8.7.2 Durante la Fermentacin 137

, 8.7.4 En el Equipo de Dispensado 138

8.8 BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA (BPM) 138

8.8.1 Limpieza e Higiene 139

8.8.2 Control sanitario de personal e instalaciones 140

8.9 ASEGURAMIENTO DE LA SEGURIDAD DE LA CERVEZA 144

8.10 ANLISIS DE PELIGROS MEDIANTE EL CONTROL DE

PUNTOS CRTICOS (APCPC) 146

8.10.1 Materias primas 147

8.10.2 Durante el proceso 151

8.11 SEGURIDAD MICROBIOLGICA 152

8.11.1 Envasado 152

8.11.2 Manejo de aguas residuales 153

8.11.3 Manejo de desechos 153

8.11.4 Sabotajes 154

8.12 ALERGENOS 154

9. BIBLIOGRAFA 156

INDICE DE CUADROS

Pagina CUADRO 1. Poder de resolucin del Microscopio 15 CUADRO 2. Esquema bioqumico del proceso de fermentacin 24

CUADRO 3. Tabla de la relacin (Agua/Malta) del empaste en el mosto 26 CUADRO 4. Tabla Temperatura ptima para algunos procesos de empaste 26

CUADRO 5. Tabla Valores ptimos de pH en la empaste de infusin 27

CUADRO 6. Tabla de Cambios en los rendimientos con el tiempo de extraccin. 27

CUADRO 7. Extractos y extractos de fermentacin 28

CUADRO 8. Composicin de carbohidratos en el mosto 29

CUADRO 9. Los aminocidos libres en mosto de cerveza 30

CUADRO 10. Composicin de Agar YPG suplementado con antibitico 35

CUADRO 11. Condiciones de esterilizacin en auto clave 35

CUADRO 12. Caracterstica cultural de Saccharomyces cerevisiae 36

CUADRO 13. Materias primas del mosto 58

CUADRO 14. Insumos para el aislamiento y propagacin de biomasa 58

CUADRO 15. Plan de trabajo 59

CUADRO 16. Procedimiento de propagacin de la levadura en el laboratorio 66

CUADRO 17. Propagacin N1 de Clulas de Saccharomyces cerevisiae

a nivel laboratorio 85

CUADRO18. Linealizacin N1 de la funcin 86 CUADRO 19. Propagacin N2 de Clulas de Saccharomyces cerevisiae a nivel laboratorio 87 CUADRO 20. Linealizacin N2 de la funcin 88 CUADRO 21. Propagacin N3 de Clulas de Saccharomyces cerevisiae a nivel laboratorio 89 CUADRO 22. Linealizacin N3 de la funcin 90

CUADRO 23. Tincin vital N1 de clulas Saccharomyces cerevisiae 91 CUADRO 24. Tincin vital N2 de clulas Saccharomyces cerevisiae 92 CUADRO 25. Tincin vital N3 de clulas Saccharomyces cerevisiae 92 CUADRO 26. Tincin vital N4 de clulas Saccharomyces cerevisiae 92 CUADRO 27. Tincin vital N5 de clulas Saccharomyces cerevisiae 93 CUADRO 28. Tincin vital N6 de clulas Saccharomyces cerevisiae 93 CUADRO 29. Concentracin celular en (clulas/mL) por el mtodo de Neubaur 94 CUADRO 30. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae en Biorreactor de Tanque Agitado 98 CUADRO 31. Linealizacin de la funcin 99 CUADRO 32. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae en Biorreactor de Tanque Agitado 100 CUADRO 33. Linealizacin de la funcin 101 CUADRO 34. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae en Biorreactor de Tanque Agitado 102 CUADRO 35. Linealizacin de la funcin 103 CUADRO 36. Diferencias entre catalizadores biolgicos y qumicos 113 CUADRO 37. Vitaminas hidrosolubles, sus coenzimas derivadas y sus funciones 114 CUADRO 38. Clasificacin de las Enzimas 115 CUADRO 39. Ecuacin de la Gluclisis 118 CUADRO 40. Balance parcial de la respiracin 120

CUADRO 41. Resumen de la gluclisis y de la respiracin 123

CUADRO 42. Clasificacin de los Microorganismos en funcin

de su temperatura Metablica 126

CUADRO 43. Clasificacin de los Microorganismos en funcin pH 128

CUADRO 44. El efecto bactericida Concentracin -Temperatura-Tiempo 142

INDICE DE FIGURAS

Pgina

FIGURA 1. Micrografa de clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae 3

FIGURA 2. Relacin entre rea superficial y el volumen celular 4

FIGURA 3. Simplificacin de la pared celular de la clula de Saccharomyces cerevisiae 6

FIGURA 4. Membrana plasmtica de la clula de Saccharomyces cerevisiae 8

FIGURA 5. Molcula de Fosfolpido 9

FIGURA 6. Microfotografa electrnica de una mitocondria 11

FIGURA 7. Esquema de la ultra estructura de una mitocondria 12

FIGURA 8. Componentes estructurales de la clula de Saccharomyces cerevisiae 14 FIGURA 9. Componentes del microscopio ptico 16

FIGURA 10. Esquema de un Microscopio ptico 16

FIGURA 11. Velocidad de reaccin enzimtica Vs Concentracin de sustrato 18

FIGURA 12. Efecto de la temperatura (a) y el pH (b) sobre la actividad enzimtica 19

FIGURA 13. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor competitivo y sin Inhibidor 19 FIGURA 14. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor no competitivo y sin Inhibidor FIGURA 15. Resumen del metabolismo de los glcidos en clulas eucariotas 22

FIGURA 16. Esquema de una clula de levadura Cerveza en fermentacin. 23

FIGURA 17. Curva de maceracin Temperatura Vs. Tiempo 28

FIGURA 18. Tincin del Mosto de cerveza con solucin de Yodo en Yoduro 29

FIGURA 19. Absorcin de carbohidratos por la Levadura Saccharomyces cerevisiae 30

FIGURA 20. Cepario de clulas de Saccharomyces cerevisiae en medio Agar YPG 38

Pgina FIGURA 21. Componentes de un equipo Biorreactor a nivel de laboratorio 39

FIGURA 22. Escalamiento del cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae 40

FIGURA 23. Dos tanques del sistema de propagacin levadura cervecera 42

FIGURA 24. Dilucin seriada de suspensin celular 48

FIGURA 25. Cmara de Neubauer Improved 48

FIGURA 26. Ciclo de crecimiento intermitente 51

FIGURA 27. Operacin del sistema de fermentacin por lote 54

FIGURA 28. Estriado por agotamiento sobre agar YPG 64

FIGURA 29. Metodologa de la Dilucin 69

FIGURA 30. Con nmero de Objetivo 4x 72

FIGURA 31. Con nmero de objetivo 10x 73

FIGURA 32. Con nmero de objetivo 40x 74

FIGURA 33. Sentido de conteo de clulas en cmara 75 FIGURA 34 Cultivo primario de Clulas contaminadas de Saccharomyces cerevisiae 82

FIGURA 35 Aislamiento de Saccharomyces cerevisiae en placa Petri Sobre Agar YPG suplementado con antibitico Tetraciclina 82

FIGURA 36 Cepario e Inoculo de clones de Clulas de Saccharomyces cerevisiae 84

FIGURA 37. Propagacin de Clulas de Saccharomyces cerevisiae Safale S-40 en medio de cultivo Mosto Cervecero en frasco Carlsberg. 84 FIGURA 38. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio 85

FIGURA 39. Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel Laboratorio 86

FIGURA 40. Grafica Ln N Cel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio 87


Pgina

FIGURA 42. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel Laboratorio 89


FIGURA 44. Micrografa de la Tincin vital de clulas de Saccharomyces cerevisiae 93

FIGURA 45. Muestra de Clulas de Saccharomyces cerevisiae sobre placa 95

FIGURA 46. Birreactor Batch modelo Tanque Agitado de capacidad Operativa de 1hL 96

FIGURA 47. Vista de perfil del Birreactor Batch modelo Tanque Agitado 97

FIGURA 48. Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto 98

FIGURA 49 Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel piloto 99

FIGURA 50 Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto 100

FIGURA 51 Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel piloto 101 FIGURA 52 Grafica Ln NCel/ml Vs T(h) a nivel piloto 102

FIGURA 53 Grafica de Concentracin [s] Vs T (h) a nivel piloto 103

FIGURA 54 Flujo de energa y materia en un ecosistema 106

FIGURA 55 Molcula de (ATP) 109

FIGURA 56 El ciclo del ATP 109

FIGURA 57 Oxido-reduccin de la coenzima NAD+ 111

FIGURA 58 Tipos de trabajo celular que utilizan ATP 111

FIGURA 59 Perfil de energa de una reaccin exergnica 112

FIGURA 60 Mecanismo de accin de una enzima 116

FIGURA 61 Resumen de las dos etapas de la gluclisis 117

FIGURA 62 Esquema simplificado del Ciclo de Krebs 119

FIGURA 63 Diagrama de la cadena respiratoria y de la Fosforilacin Oxidativa asociada 121 FIGURA 64 Esquema comparativo de la quimiosmosis en la mitocondria y el cloroplasto. 123

Pgina

FIGURA 65 Resumen de la Gluclisis y de la Respiracin 124

FIGURA 66 Vas principales del catabolismo y anabolismo en la clula 125

FIGURA 67 Diagrama de flujo de la planta de produccin de Cerveza 147

Universidad Nacional mayor de San Marcos Facultad de Qumica e Ingeniera Qumica

1

1. INTRODUCCIN

Es un reto para el Ingeniero Qumico desarrollarse en el campo de la Industria Cervecera en la cual debe mantener un control total del proceso fermentativo orientado o dirigido, que garantice la estabilidad qumica y microbiolgica as como las caractersticas sensoriales de la cerveza final, no basta solo con emular las condiciones ptimas de operacin. Un problema operacional frecuente es no contar con una metodologa para cuantificar adecuadamente el requerimiento de un inculo de clulas de Saccharomyces cerevisiae su volumen y la concentracin de clulas/mL vitales y viables necesarias para la fermentacin ptima de un mosto de malta de cebada. Un defecto en el volumen y concentracin del inculo necesario para fermentar un mosto de malta de cebada, con una baja concentracin de clulas vitales y viables, trae como consecuencia prolongados tiempos de conversin y deficiente fermentacin, incompleta o truncada. Un exceso en el inoculo con alta concentracin de clulas vitales y viables, acelerara el procesos fermentativo pero le transfiere a la cerveza un sabor desagradable por la liberacin del material intracelular, como consecuencia de la autolisis que sufre el excesivo nmero de clulas de levadura. El proceso de fermentacin del mosto de malta de cebada implica un alto riesgo de contaminacin por el manipuleo de biomasa celular de levadura empleada como inoculo sobre un mosto de malta de cebada. Las clulas de Saccharomyces cerevisiae contaminadas con bacterias acido lcticas causan problemas grabes de turbidez, olores y bouquet anmalos en la cerveza final, El presente trabajo de Tesis propone como soluciones a estos problemas en el proceso de fermentacin durante la produccin de cerveza lo siguiente:

- El Ingeniero Qumico dedicado a la Industria Cervecera adquiera un conocimiento bsico de Microbiologa Industrial que le permitan minimizar los riesgos de contaminacin microbiolgica y concebir a las clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae como micro factoras las cuales bajo condiciones controladas de fermentacin, metabolizan el mosto de malta de cebada en un producto final comercialmente llamado cerveza.

- Estandarizar una tcnica de reactivacin, escalamiento y mtodo cuantificacin de un cultivo Axnico de clulas de Saccharomyces cerevisiae empleada como inculo para la fermentacin ptima del mosto de malta de cebada, en la produccin de cerveza.Para la realizacin del siguiente trabado de tesis se complement la formacin profesional en Ingeniero Qumica con una segunda carreara profesional en Biologa Microbiologa y Parasitologa en la misma casa de estudios. Para llevar a cabo el desarrollo experimental se dise y construy dos Biorreactores uno a nivel de laboratorio de 4L de capacidad, tipo Airlift y el segundo Biorreactor con capacidad de 100L tipo Tanque Agitado, para los estudios de reactivacin, propagacin y escalamientos sucesivos de los cultivos de clulas de Saccharomyces cerevisiae. Dichos equipos se encuentran en el Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa de la Facultad de Ciencia Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.


2

2.FUNDAMENTOS TERICOS

2.1-LA CLULA DE LEVADURA Saccharomyces cerevisiae

Las Levaduras comprenden a la actualidad, 39 gneros y 350 especies. Se identifican y clasifican basndose en caractersticas morfolgicas y fisiolgicas .Entre los aspectos morfolgicos considerados, se encuentran el tamao y las formas de las clulas, en medio slido y liquido especificados ya que pueden presentar Dimorfismo, el modo de reproduccin y si forma velo en la superficie o sedimenta en un medio lquido.Dentro de las caractersticas fisiolgicas consideradas, se encuentra si puede crecer y fermentar en un determinado carbohidrato y si puede usar o no determinadas fuentes de nitrgeno como los nitratos. Las clulas de levadura pueden ser ovales, esfricas, tener forma de limn o de cigarro puro, pueden dividirse mediante gemacin. La levaduras Saccharomyces cerevisiae son hongos unicelulares Eucariticos, hetertrofos, osmotrficos (no ingieren sus alimentos lo absorben por digestin externa del sustrato empleando exoenzimas) se reproducen por gemacin. Los Hongos son un grupo aparte no son consideradas clulas animales por que presentan pared celular externa que la recubre compuesta polisacridos de celulosa y quitina, tampoco son consideradas clulas vegetales ya que carecen de cloroplastos y no realizan fotosntesis.Una clula de una levadura de cerveza tpica tiene, cuando se halla completamente desarrollada entre 8 y 14 m de dimetro y una masa de materia seca de aproximadamente 40pg. Por tanto 1012 clulas desecadas pesan unos 40g. En vivo prensado, ese nmero de clulas pesan unos 200g. TUBB y HAMMOND en (1987)definieron las caractersticas ms importantes para una levadura de cervecera: - Una fermentacin rpida pero sin exceso de crecimiento en biomasa de la levadura - Una buena conversin de la maltosa y de la maltotriosa en etanol - Resistencia al etanol - Resistencia a la presin osmtica - Perfiles aromticos equilibrados y reproductibles - El carcter de flocular eventualmente - Una buena estabilidad gentica a lo largo del tiempo


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Figura 1 .Micrografa de clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae a mil aumentos (Gracias a Alastair Pringle AnheuserBusch,Inc.) - La barra representa 5 mm. Figura 284 Manual de elaboracin de la cerveza

2.1.1 Dimensin de las Clulas. Las clulas procariotas presentan tamaos que van desde 0.1- 0.2 mde ancho sin embargo las dimensiones de un Eucariota de tipo medio, como Saccharomyces cerevisiae .A efectos comparativos, una clula Eucariota puede variar de 2 a ms de 200 m De dimetro, por lo tanto las clulas procariotas son ms pequeas que las Eucariotas. Las clulas deben captar alimento y otros materiales a travs de su membrana plasmtica y deben eliminar los productos de desecho, generados en las distintas reacciones metablicas rpidamente antes de que estos se acumulen hasta niveles txicos para la supervivencia celular. Por lo tanto, las clulas son pequeas, de modo que en ellas las molculas recorren distancias cortas, lo que acelera las actividades celulares. Adems, a mayor superficie celular, mayor es el transporte de molculas a travs de la membrana, siendo importante para la continuidad de los procesos metablicos laproporcin superficie celular sobre volumen celular. Por lo tanto, el volumen celular aumenta ms que su superficie a medida que la clula crece, determinando el lmite superior al tamao de la clula en cuestin. Est clula slo podr iniciar el proceso de divisin celular (previa duplicacin de su ADN) o perecer.


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Con respecto a su tamao las clulas pequeas tiene ms superficie relativa disponible respecto de las grandes .Esto se hace ms patente en el caso de los cuerpos esfricos en los que el volumen es una funcin del cubo del radio, mientras que la superficie es una funcin del cuadrado del radio en relacin de la superficie/volumen (S/V) de una esfera puede ser expresado como 3/r por lo tanto una clula de radio pequea pose una relacin (S/V) mayor Por otra parte, debemos recordar que en las clulas el material Gentico (localizado en el ncleo, en clulas eucariontes), posee un rea limitada de influencia sobre el citoplasma circundante, que es el que incrementa marcadamente su tamao durante el crecimiento celular, siendo otra limitante del tamao celular la relacin ncleo/citoplasma.

Figura 2.Relacin entre rea superficial y el volumen celular. El tamao del volumen celular implica una disminucin de la relacin superficie/volumen


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2.2 CITOLOGA DE LA CLULA DE Saccharomyces cerevisiae

2.2.1 La pared celular. La pared celular de los hongos posee diferentes constituyentes qumicos como polisacridos, protenas, lpidos y otras sustancias. La constitucin vara entre las diferentes especies. Tambin vara con la edad del hongo, ya que sustancias que pueden estar presentes en las hifas jvenes, desaparecen en las ms viejas o depositar otros materiales y enmascarar la presencia de constituyentes iniciales, tambin la composicin del medio, el pH y la temperatura, influyen en la composicin de las paredes de los hongos (Foster, 1949).Una clula de levadura de cerveza cuando se halla plenamente desarrollada tiene, una masa de materia seca, entre 8 y 14 pg. Por tanto 1012 clulas desecadas pesan unos 12g. El examen de microscopia revela que cada clula est rodeada de una pared y que en el interior de la misma se pueden distinguir pocas estructuras salvo una o ms vacuolas .Para observar su ncleo y varios otros orgnulos es necesario recurrir a las preparaciones teidas o a la microscopia de contraste de fases.Las clulas de Saccharomyces cerevisiae presenta una humedad de 70-80% y pared celular similar a las clulas de los vegetales la cual representa el 30% del peso seco total y tiene un grosor de 100-200nm. Est constituida aproximadamente de un 40% de glucano, 40% de mananos, 8% de protenas, 7% de lpidos,3% de sustancias inorgnicas,2% de hexosamina y quitina. El glucano est unido a una protena y representa el componente estructural ms abundante, se halla fundamentalmente en la cara interna de la pared. El manano tambin se encuentra ligado a la protena, a veces a travs de hexosamina, y tiende a localizarse en la superficie de la clula se encuentra cargada, debido a la presencia de grupos carboxilo y fosfato que al pH de la cerveza, la confieren una fuerte carga neta negativa y tiene hidrofobicidad, la carga negativa se atribuye a las cadenas fosfato localizadas en la pared externa de manoprotenas y puede demostrarse por tincin con Azul de cian. La hidrofobicidad es debida a los lpidos de la pared externa y a los grupos fosforilados del complejo de manoprotenas. Tambin se encuentran grupos amino, pero slo les confieren regiones locales de carga positiva .Las paredes celulares se pueden disolver mediante el uso de una preparacin enzimtica mixta.La pared celular es permeada por alguna de las enzimas secretadas por la levadura, el ms importante es la Invertasa, que hidroliza la sacarosa antes de que penetre a la clula, entre ellos se encuentra tambin la fosfatasa. Saccharomyces carlsbergensis segrega la melibiosa, pero Saccharomyces cerevisiae no. Algunas levaduras segregan cantidades apreciables de proteasas, pero las del gnero Saccharomyces slo tiene una actividad de este tipo limitada. La superficie celular de la levadura de fermentacin alta (ale) est cubierta por pequeas protuberancias microfibrilares (al parecer de manoprotenas) que les confiere una aspereza que le permite que las clulas asciendan a la superficie durante lafermentacin entre la capa externa de manoprotenas y la capa interna en la que predomina el glucano, existen una serie de capas intermedias compuestas de ambas especies qumicos.


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Molculas estructurales de la pared celular -D-Manosa y -D-N-Acetilglucosamina

Figura 3. Simplificacin de la pared celular de la clula de Saccharomyces cerevisiae

2.2.2 Espacio Periplasmtico. El espacio Periplasmtico es la zona fina entre la superficie externa de la membrana plasmtica y la superficie interna de la pared celular. Las protenas secretadas, que no son capaces de impregnar la pared celular se encuentran aqu .Esto incluye las enzimas como la Invertasa, fosfatasa cida y melibiosa .Por ejemplo, la sacarosa se descompone en el espacio Periplasmtico por accin de la enzima Invertasa en sus componentes fructosa y glucosa.

2.2.3 Membrana Citoplasmtica. Estructuralmente est compuesta por una bicapa fosfolipdica. El colesterol est presente en las clulas animales, pero est ausente, en general, en plantas, hongos y procariontes (salvo micoplasmas). La membrana

plasmtica tambin contiene mltiples protenas con diversas funciones. Podemos


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dividirlas en dos grandes grupos:

a) Protenas integrales de membrana, atraviesan la membrana de lado a lado

b) protenas perifricas de membrana, estn en contacto con la membrana, pero no la atraviesan.

Algunas son enzimas reguladoras, otros receptores hormonales. Existen tambin protenas transportadoras y canales reguladoras del movimiento de iones y molculas a travs de la membrana plasmtica, de all su enorme especificidad. Otra funcin importante de la membrana es la comunicacin intercelular y el reconocimiento de diversos tipos de molcula (hormonas, virus, anticuerpos, toxinas, etc.) que interactan con ella. En general esta funcin es llevada a cabo por glucoprotenas y glucolpidos, que se encuentran solo en el lado externo de la membrana plasmtica. Se cree que los glcidos juegan un importante papel en la adhesin entre clulas. A esta capa, de glucolpidos y glucoprotenas se la denomina glucoclix. La membrana Celular citoplasmtica de Saccharomyces cerevisiae es una estructura fina que rodea completamente a la clula. Es una estructura vital de tan slo unos 8nm. De espesor que constituye labarrera que separa el interior de la clula (el citoplasma) del exterior. Si se rompe la membrana, se destruye la integridad de la clula liberndose al medio los componentes que la integran y producindose la muerte celular o autolisis. La membrana citoplasmtica acta tambin como una barrera muy selectiva, permitiendo que en el interior de la clula se concentren determinados metabolitos y se excreten las sustancias de desecho.

-Composicin Qumica de la Membrana :

La estructura general de la mayora de membranas biolgicas es una bicapa lipdica. Los fosfolpidos poseen tanto regiones altamente hidrofbicas (cidos grasos) como regiones relativamente hidroflicas (glicerol) y pueden presentarse en mltiples formas qumicas distintas debido a la variacin en la composicin de cidos grasos y de los compuestos fosforilados que se unen al esqueleto de glicerol.Cuando los fosfolpidos se agregan en soluciones acuosas tienden a formar bicapa de manera espontnea, los cidos grasos se orientan hacia el interior, mantenindose en un ambiente hidrofbico,mientras que las porciones hidroflicas son expuestas a la fase acuosa la estructura de bicapa en la membrana representa probablemente la organizacin ms estable que puedan alcanzar la molculas lipdicas en un entorno acuoso. Esta unidad de membrana ,como se denomina, consta de una bicapa fosfolipdica en la que existen protenas embebidas las principales protenas de membrana poseen una regin altamente hidrofbica que interacciona con las zonas apolares de los cidos grasos, y atraviesan las membranas presentes de regiones superficiales tanto en el exterior como en el interior de la clula, la estructura global de la membrana citoplasmtica se estabiliza mediante puentes de hidrgeno e interacciones hidrofbicas. Adems algunos cationes como el Calcio y el Magnesio tambin contribuyen a la estabilidad de la membrana a travs de las interacciones inicas con los grupos polares de carga negativa presentes en los fosfolpido.


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La capa externa de la membrana citoplasmtica contacta con una variedad de protenas implicadas en la unin del sustrato y el procesamiento de grandes molculas para el transporte al interior celular (protenas periplasmticas) la cara interna de la membrana citoplasmtica se orienta hacia el citoplasma e interacciona con protenas involucradas en reacciones de obtencin de energa y otras importantes funciones celulares. A pesar de que las representaciones esquemticas de la membrana tiene un aspecto rgido la membrana citoplasmtica es en realidad bastante fluida, pues los fosfolpidos y las protenas presentan una considerable libertad de movimiento dentro de la membrana la medida de viscosidad de la membrana demuestran que su viscosidad es semejante a la de los aceites de bajo grado. Por tanto las membranas pueden ser consideradas como mosaico fluido en el existen protenas globulares con orientaciones especficas que atraviesan la bicapa lipdica, que presenta a la vez una estricta organizacin y una elevada movilidad. Este tipo de organizacin confiere importantes propiedades funcionales a las membranas.

Figura 4. Membrana plasmtica de la clula deSaccharomyces cerevisiae


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Estructura qumica de Fosfolpido

Figura 5. Molcula de Fosfolpido -Funcin de la membrana citoplasmtica: Desde luego, si la biomenbrana fuera una barrera impermeable por completo, la clula estara totalmente aislada del medio y los organelos de su interior estaran incomunicados entre s. Por el contrario si las


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membranas fueran del todo permeables todas las sustancias podran pasar indistintamente de una regin a otra. En realidad no ocurre ninguno de tales extremos. Ms bien las propiedades de transporte de membrana son intermedias, se trata de divisiones semipermeables, algunas sustancias pueden atravesarlas pero otras no. Segn la sustancia y membrana de que se trate, adems la membrana es el lugar donde se asientan muchas protenas, muchas de las cuales son enzimas o estn implicadas de una u otra manera en el transporte de sustancias hacia el interior y hacia el exterior de la clula, tambin la membrana celular es el sitio donde se produce energa en la clula la membrana puede estar en una forma energticamente cargada en la que existe separacin de los protones (H+) y de los iones hidroxilo (OH-) a travs de su superficie esta separacin de carga es una forma de energa potencial presente en una batera cargada ,este estado energtico de la membrana se conoce como Fuerza Motriz de Protones (FMP) Es el responsable del mantenimiento de muchas de las funciones celulares que requieren energa, tales como alguna forma de transporte, la movilidad y la biosntesis de la Moneda energtica de la clula es decir el ATP. En el interior de la clula (el citoplasma) contiene una solucin en fase acuosa de sales, azcares, aminocidos, vitaminas, coenzimas y una gran variedad de otras sustancias solubles. Las caractersticas hidrofbicas de la membrana le permiten funcionar como una barrera estricta .Aunque algunas pequeas molculas hidrofbicas, pueden pasar la membrana por difusin, las molculas hidroflicas y cargadas no lo atraviesan y deben ser transportadas de modo especfico.Incluso, una sustancia tan pequea como el ion de hidrgeno (H+) no es capaz de pasar la membrana citoplasmtica por difusin. El transporte de las sustancias hacia adentro y hacia afuera de las clulas, as como su traslado entre el citoplasma y las diversas organelassubcelulares (mitocondria, ncleo, etc.) est determinada por la membrana y constituye una de las funciones ms importantes de stas. 2.2.4 El Ncleo Celular. Las diversas partes de una clula eucaritica interactan de forma integrada. Esto es posible porque existe un centro primordial de control: el ncleo celular. Una membrana doble, la envoltura nuclear (constituida por dos unidades de membrana), controla el transporte, muy selectivo, de sustancias entre el ncleo y el citoplasma. El pasaje se realiza a travs de los poros nucleares. La envoltura nuclear posee ribosomas adheridos a la cara citoplasmtica y una estructura proteica en su parte interna llamada lamina nuclear, que sirve como esqueleto al ncleo. En el interior del ncleo, se encuentra el material gentico (ADN) asociado a protenas bsicas llamadas histonas, formando una estructura fibrilar muy enrollada denominada cromatina y el nuclolo, sitio de ensamblaje de los ribosomas (estructuras esenciales para la sntesis de protenas, formados por ARN ribosomal y protena). El ARN ribosmico se sintetiza en el nuclolo, y las protenas ribosmicas en el citoplasma, para pasar despus al ncleo y de all al nuclolo, donde se unen al ARN ribosomal para formar los ribosomas. Rodeando al ncleo encontramos el citoplasma, coloide donde predominan como constituyentes agua, iones, enzimas y donde se encuentran incluidos los organelos celulares.


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El citoplasma se encuentra separado del ambiente exterior por la membrana plasmtica. 2.2.5 Estructura de las Mitocondrias. Las mitocondrias estn rodeadas por dos membranas, una externa que es lisa y una interna que se pliega hacia adentro formando crestas. Dentro del espacio interno de la mitocondria en torno a las crestas, existe una solucin densa (matriz o estroma) que contiene enzimas, coenzimas, agua, fosfatos y otras molculas que intervienen en la respiracin. La membrana externa es permeable para la mayora de las molculas pequeas, pero la interna slo permite el paso de ciertas molculas como el cido pirvico y ATP y restringe el paso de otras. Esta permeabilidad selectiva de la membrana interna, tiene una importancia crtica porque capacita a las mitocondrias para destinar la energa de la respiracin para la produccin de ATP.La mayora de las enzimas del ciclo de Krebs se encuentran en la matriz mitocondrial. Las enzimas que actan en el transporte de electrones se encuentran en las membranas de las crestas. Las membranas internas de las crestas estn formadas por un 80 % de protenas y un 20 % de lpidos. En las mitocondrias, el cido pirvico proveniente de la gluclisis, se oxida a dixido de carbono y agua, completndose as la degradacin de la glucosa. El 95 % del ATP producido se genera, en la mitocondria. Las mitocondrias son consideradas organoidessemiautnomos, porque presentan los dos cidos nucleicos (del tipo procarionte)

Figura 6. Microfotografa electrnica de una mitocondria. Se observan las invaginaciones de la membrana interna que forman las caractersticas crestas, que identifican esta Organela.


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Figura 7. Esquema de la ultraestructura de una mitocondria. (a) Esquema tridimensional, (b) Esquema de un corte al M.E.T. (c) Cresta mitocondrial (detalle).

Como puede apreciase en la fig.7 (c), las crestas mitocondriales aparecen cubiertas por partculas en forma de hongo, que tienen un tallo ms fino que las unen a la membrana. Estas estructuras son las llamadas partculas F1 y representan una porcin de la ATPasa especial que interviene en el acoplamiento entre la oxidacin y la fosforilacin. Las partculas F1 se encuentran en la membrana interna, del lado relacionado con la matriz; le confieren una asimetra caracterstica relacionada con la funcin de la ATPasa (este punto se ver ms detalladamente al referirnos a la hiptesis Quimiosmtica).Para concluir, es importante destacar que el ciclo de Krebs se lleva a cabo en la matriz mitocondrial; mientras que el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa se producen a nivel de las crestas mitocondriales. Ingreso al ciclo de Krebs.


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2.3 OTRAS ESTRUCTURAS CITOPLASMTICAS

2.3.1 Las Vacuolas. Las Vacuolas son parte de un sistema intramembranoso que incluye el retculo endoplasmtico, y son fcilmente visibles con el microscopio de luz. Ellos sirven de almacenes dinmicos de nutrientes y ofrecen un lugar para la degradacin de las macromolculas. Tambin son claves en las protenas intracelulares .El trfico de las levaduras. La forma y el tamao de las vacuolas durante el ciclo celular .Las clulas maduras contienen grandes vacuolas que se fragmentan en pequeas vesculas en la formacin de yemas, se inicia ms tarde el ciclo celular, las pequeas vacuolas se funden para formar producir una vacuola nica en la clula madre e hija. Las vacuolas estn delimitadas por una sola membrana llamadatonoplasto que contiene proteasas e hidrolasas, y que tiene metabolitos como aminocidos. El retculo endoplasmtico, el complejo de Golgi y vescula, esta secuencia permite el transporte de las protenas solubles y unidas a la tanto para secrecin extracelular y para el manejo de vacuolas. 2.3.2 Peroxisomas. Los Peroxisomas son vesculas rodeadas por una sola membrana .los Peroxisomas en las levaduras realizan una variedad de funciones y son tambin los sitios de los cidos grasos, y de los cidos hidrolticos de degradacin celular, El nmero y el volumen de Peroxisomas es variable y depende de las condiciones externas. 2.3.3 El Retculo endoplasmtico. El retculo endoplasmtico es un orgnulo grande formado por una red de tbulos y sacos comunicados entre s, que se extiende desde el ncleo. Interviene en las funciones relacionadas con la sntesis de protenas, metabolismo de lpidos y algunos esteroidesas como el transporte intracelular, est conformado por el Retculo endoplasmtico rugoso por el alto nmero de Ribosomas adheridos a su membrana, el Retculo endoplasmtico liso no tiene Ribosomas y participa en el metabolismo de lpidos. 2.3.4 El aparto de Golgi. Son sculos aplanados rodeados de membrana y apilados unos encima de otros, cuya funcin es completar la fabricacin de algunas Protenas. Funciona como una planta empaquetadora, modificando vesculas del Retculo endoplasmtico rugoso. 2.3.5 El Citosol. El Citosol es la sede principal de la sntesis de protenas y de la degradacin .El citosolest contenido dentro de la membrana plasmtica y rodea al Ncleo, representams de la mitad del volumen celular y est conformado de Ribosomas libres y de proteosomas que son los responsables de la digestin de las protenas que pueden ser perjudiciales para la clula, el citosol junto con las organelos excepto el ncleo constituye el citoplasma


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2.3.6 El Citoesqueleto. El citoesqueleto es un entramado tridimensional de Protenas que provee soporte interno en lasclulas, organiza las estructuras internas de la misma e interviene en los fenmenos de transporte, trfico y divisin celular, consta demicrofilamentos, filamentos intermedios y microtbulos.

Figura 8. Componentes estructurales de la clula de Saccharomyces cerevisiae


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2.4 EL MICROSCOPIO PTICO.

El descubrimiento y estudio temprano de la microbiologa progres con la invencin y mejora de los microscopios en el siglo XVII. Los microscopios de varios tipos son an herramientas indispensables para el estudio de las clulas.Los microscopios primeramente usados en el Renacimiento tanto como los que son utilizados en los laboratorios hoy, son microscopios pticos. La luz visible pasa a travs de la muestra y de las lentes de vidrio por donde la luz es refractada (doblada) de tal manera, que la imagen del espcimen es amplificada cuando se proyecta en el ojo. Dos valores importantes en microscopia son el aumento y el poder de resolucin. Entendemos por aumento a las dimensiones aparentes de los objetos comparados con su tamao real. El poder de resolucin es la medida de la nitidez de la imagen; es la capacidad del instrumento para brindar imgenes distintas de dos puntos cercanos.El microscopio ptico nunca puede resolver detalles menores a 0,2nm, la medida de una pequea bacteria. Esta resolucin es limitada por la longitud de onda de la luz visible usada para iluminar la muestra. Los microscopios pticos o de luz pueden aumentar efectivamente alrededor de 1000 a 1500 veces el tamao de la muestra real; si se incrementase el aumento la imagen proyectada sera borrosa. La mayora de las mejoras en microscopia de luz del comienzo de este siglo ha involucrado nuevos mtodos para aumentar el contraste. Sin estas tcnicas sera imposible para el ojo humano el conocimiento del mundo celular. La mayora de las organelas son demasiado pequeas para ser visualizadas por la microscopia de luz. El poder de resolucin est inversamente relacionado con la longitud de onda (l) de la radiacin que un microscopio usa y un haz de electrones tiene longitudes de onda mucho ms cortas que la luz visible.

Cuadro 1. Poder de resolucin del Microscopio

En cualquier tipo de microscopio, el poder de resolucin depende de la longitud de onda (l) y de la apertura numrica (AN) del objetivo (la capacidad de colectar la luz). As, el lmite de resolucin, que es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales, y responde a la siguiente ecuacin:

Lmite de resolucin=0,61 l /AN

A su vez,

AN = n . seno a

Donde, n es el ndice de refraccin del medio que atraviesa el haz y a es el ngulo de apertura ntese que el lmite de resolucin es inversamente proporcional al poder resolutivo del instrumento, de modo tal que cuanto mayor sea ste, menor ser el lmite de resolucin conseguido.


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Figura9.Componentes del microscopio ptico

Figura 10 Esquema de un Microscopio ptico


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2.5LAS ENZIMAS Todas las reacciones que se efectan en los seres vivos son catalizadas por enzimas. Estas hacen posible que las reacciones metablicas se desarrollen a un ritmo razonable, compatible con la vida. El trmino catalizador se emplea para referirse a cualquier sustancia que acelera el transcurso de una reaccin qumica, sin intervenir en ella ni como reactivo ni como producto. El catalizador no provoca la reaccin solo afecta la velocidad con que ocurre la misma. Esto es posible porque los catalizadores disminuyen la energa de activacin como lo indica el siguiente grfico 2.5.1 Factores que modifican la velocidad de las Reacciones Enzimticas.

Una determinada reaccin qumica ocurre solo en condiciones termodinmicas favorables, esto es cuando la energa de los reactivos o sustratos es mayor que la energa de los productos. La velocidad con que dicha reaccin ocurrir depende de distintos factores como ser la cantidad de reactivo o sustrato que interviene, la temperatura, el pH, etc. Como hemos mencionado, las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones qumicas, sin embargo no las provocan, por lo tanto la concentracin de enzimas es otro de los factores que modifican la velocidad de la reaccin as como tambin aquellas sustancias que pueden inhibir la accin de la enzima (inhibidores). 1. Concentracin de sustrato.-En general a medida que aumenta la cantidad de reactivos o sustratos la velocidad tambin aumenta. En el caso de las reacciones qumicas conviene aclarar que la velocidad se mide como cantidad de producto formado por unidad de tiempo, las unidades sern: g/s, mol/s, mol/min, etc. De este modo cuanto ms reactivo tenemos, ms producto se formar. En el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, el efecto de la cantidad de sustrato es el siguiente: A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la velocidad contina aumentando ya no lo hace en forma lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reaccin alcanza una velocidad mxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona de saturacin). Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas se encuentran todos interactuando con las molculas de sustrato, por lo tanto hasta que no finalice la reaccin la enzima no puede unirse a otro sustrato.


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Figura 11.Velocidad de reaccin enzimtica Vs Concentracin de sustrato 2. Concentracin de enzimas.-La concentracin de enzimas es otro de los factores que modifica la velocidad, cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor ser la velocidad que se alcanzar, debido a que necesito ms cantidad de sustrato para alcanzar la saturacin. 3. Temperatura.-En general las reacciones ocurren ms rpidamente cuando se le otorga calor, ya que el aumento de la temperatura hace que aumente la energa cintica de las molculas y de esta manera reaccionen con facilidad. Cuando las reacciones estn catalizadas por enzimas se produce primero un efecto complementario, es decir, la velocidad va aumentando conforme al aumento de temperatura, sin embargo la velocidad llega a un punto ptimo a partir del cual la velocidad comienza a decaer. No nos olvidemos que las enzimas son protenas, por lo tanto son susceptibles a la desnaturalizacin, es decir que la velocidad decae porque las enzimas pierden su actividad biolgica como consecuencia de la desnaturalizacin. Algunas enzimas son termoestables, es decir su actividad biolgica permanece an a temperaturas mayores a 90 C. 4. pH.-El grfico de actividad en funcin del pH es similar al de la temperatura, es decir a pH extremos las protenas se desnaturalizan, por lo tanto la actividad biolgica decae. Algunas enzimas no varan su actividad con el pH sino que esta se mantiene constante en un amplio rango. Otra tendr el pH ptimo cido o bsico teniendo en cuenta el medio en donde actan.


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Figura 12. Efecto de la temperatura (a) y el pH (b) sobre la actividad enzimtica 5. Inhibidores.-Aunque hay muchos ejemplos de inhibidores, los mecanismos de inhibicin pueden ser de dos clases: reversibles e irreversibles, tambin hay mecanismos intermedios.

Figura 13. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor competitivo y sin inhibidor 5.1. Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima, generalmente se unen covalentemente a algn aminocido del sitio activo. Existen algunos inhibidores que se conocen como sustrato suicida, que se enlazan al centro activo y qumicamente se transforma en una especie reactiva que modifica en forma irreversible al aminocido del sitio activo. 5.2. Inhibidores reversibles: este tipo de inhibidores se disocian fcilmente de las enzimas, dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos y los no competitivos. 5.2.1Los inhibidores competitivos:compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte


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alcanzndose la velocidad mxima.

Figura 14. Perfil de una reaccin en presencia de inhibidor no competitivo y sin inhibidor 5.2.2. Los inhibidores no competitivos:se enlazan a un sitio distinto del sitio activo, de manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo enzima sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos. El efecto de estos inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de manera que se llega a una velocidad mxima menor que si no tuviera el inhibidor. No es raro observar algunos inhibidores a los cuales no se les puede comprobar el mecanismo exacto de inhibicin, siendo en algunos casos un tipo de inhibicin mixta. 2.6 METABOLISMOCELULAR OXIDATIVO El proceso por el cual las clulas degradan las molculas orgnicas alimenticias llamada(Sustrato) para obtener energa recibe el nombre de Respiracin celular. La respiracin celular es una reaccin exergnica, donde parte de la energa contenida en las molculas de alimento es utilizada por la clula para sintetizar ATP. Decimos parte de la energa porque no toda es utilizada, sino que una parte se pierde.Aproximadamente el 40% de la energa libre emitida por la oxidacin de la glucosa se conserva en forma de ATP. Cerca del 75% de la energa de la nafta se pierde como calor de un auto; solo el 25% se convierte en formas tiles de energa. La clula es mucho ms eficiente.La respiracin celular es una combustin biolgica y puede compararse con la combustin de carbn, bencina, lea. En ambos casos molculas ricas en energa son degradadas a molculas ms sencillas con la consiguiente liberacin de energa.Tanto la respiracin como la combustin son reacciones exergnicas.Sin embargo existen importantes diferencias entre ambos procesos. En primer lugar la combustin es un fenmeno incontrolado en el que todos los enlaces qumicos se rompen al mismo tiempo y liberan la energa en forma sbita; por el contrario la respiracin es la degradacin del alimento con la liberacin paulatina de energa. Este control est ejercido por enzimas


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especficas.En segundo lugar la combustin produce calor y algo de luz. Este proceso transforma energa qumica en calrica y luminosa. En cambio la energa liberada durante la respiracin es utilizada fundamentalmente para la formacin de nuevos enlaces qumicos (ATP).La respiracin celular puede ser considerada como una serie de reacciones de xido-reduccin en las cuales las molculas combustibles son paulatinamente oxidadas y degradadas liberando energa. Los protones perdidos por el alimento son captados por coenzimas.El oxgeno interviene en la sntesis de esteroles y del cido nicotnico, si estos compuestos estn presentes en el medio las levaduras pueden desarrollarse en anaerobiosis total. En el caso contrario parta la supervivencia de la levadura es necesario 0.0015mg. de oxigeno por gramo de biomasa para llevar a cabo la sntesis de esteroles. La respiracin ocurre en distintas estructuras celulares. La primera de ellas es la gluclisis que ocurre en el citoplasma. La segunda etapa depender de la presencia o ausencia de O2en el medio, determinando en el primer caso la respiracin aerbica (ocurre en las mitocondrias), y en el segundo caso la respiracin anaerbica o fermentacin (ocurre en el citoplasma).La oxidacin de la glucosa es una fuente principal de energa en la mayora de las clulas. La primera fase de este proceso es la gluclisis, en la cual la molcula de glucosa (6C), se escinde en dos molculas de cido pirvico (3C). Este paso produce un rendimiento neto de 2 molculas de ATP y dos molculas de NADH.La segunda fase de la degradacin de la glucosa es la respiracin aerbica que ocurre en tres etapas: ciclo de Krebs, transporte de electrones y fosforilacin oxidativa.En ausencia deO2 el cido pirvico de la gluclisis se convierte en etanol o cido lctico mediante fermentacin. En el curso de la respiracin las molculas de cido pirvico se fraccionan en grupos acetilos; los cuales ingresan al ciclo de Krebs. En este ciclo los grupos acetilos se oxidan por completo a CO2, se reducen cuatro aceptores de electrones (tres NAD+ y Un FAD) y se forma GTP.La etapa final de la respiracin es el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa (se dan acopladamente). En este paso intervienen una cadena de transportadores de electrones que transportan los electrones de alta energa aceptados por el NADH y el FADH2 viajando cuesta abajo hacia el oxgeno. En tres puntos de su descenso por toda la cadena transportadora, se liberan grandes cantidades de energa que propulsan el bombeo de protones haca el espacio intermembranoso de la mitocondria. Esto crea un gradiente electroqumico a travs de la membrana interna. Cuando los protones atraviesan el complejo ATP sintetasa hacia la matriz, la energa liberada se utiliza para sintetizar molculas de ATP. Este mecanismo por el cual se cumple la fosforilacin oxidativa se conoce como hiptesis Quimiosmtica


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Figura 15. Resumen del metabolismo de los glcidos en clulas eucariotas 2.7VAS ANAERBICAS El cido pirvico puede tomar por una de varias vas. Dos son anaerbicas (sin oxgeno) y se denomina fermentacin alcohlica y Fermentacin lctica. A la falta de oxgeno, el cido pirvico puede convertirse en etanol (alcohol etlico) o cido lctico segn el tipo de clula. Por ejemplo, las clulas de las levaduras pueden crecer con oxgeno o sin l. Al inocular clulas de Saccharomyces cerevisiae sobre un mosto cervecero y almacenarlos en forma anaerobia, las clulas de levaduras convierten el mosto en cerveza al convertir la glucosa en etanol. Cuando el azcar se agota las levaduras dejan de fermentar y en este punto la concentracin de alcohol est entre un 5-8 %segn sea la concentracin de azucares y de la cepa de levadura utilizada.La formacin de alcohol a partir del azcar se llama fermentacin.

2.7.1 Fermentacin alcohlica. El cido pirvico formado en la gluclisis se convierte anaerbicamente en etanol. En el primer caso se libera dixido de carbono, y en el segundo se oxida el NADH y se reduce a acetaldehdo.Otras clulas, como por ejemplo los glbulos rojos, las clulasmusculares y algunos microorganismos transforman el cido Pirvico en cido lctico.En el caso de las clulas musculares, la fermentacin lctica, se produce como resultado de ejercicios extenuantes durante los cuales el aporte de oxgeno no alcanza a cubrir las necesidades del metabolismo celular. La acumulacin del cido lctico en estas clulas produce la sensacin de cansancio muscular que muchas veces acompaa a esos ejercicios.


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Figura 16.Esquema de unaclula de levadura Cerveza en fermentacin. de la glucosa enla hierba deasimilarpara producirsubproductos de la fermentacinde etanolyCO2, el oxgeno se asimilaa laproduccin demembrana

Glucosa

Clula de levadura

Oxigeno

Mosto cervecero

Glucgeno

Glucosa

Lpidos/esteroles

Biosntesis

Componentes

de la membrana

Celular

Ruta de

Embden-

Meyerhof

Piruvato

Fermentacin

Alcohlica

Etanol Dixido de

Carbono


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2.7.2 La fermentacin lctica. En esta reaccin el NADH se oxida y el cido pirvico se reduce transformndose en cido lctico.

La fermentacin sea sta alcohlica o lctica ocurre en el citoplasma.

Cuadro 2.Esquema bioqumico del proceso de fermentacin

A) Alcohlica : 2 cido pirvico + 2 NADH 2 etanol + 2 CO2 + 2 NAD+

B) Lctica : 2 cido pirvico + 2 NADH 2 cido lctico + 2 NAD+

La finalidad de la fermentacin es regenerar el NAD+ permitiendo que la gluclisis contine y produzca una provisin pequea pero vital de ATP para el organismo.

2.8LA CIENCIA DE LA MACERACIN DEL MOSTO DE MALTA

2.8.1 Preparacin de la malta.-Tiene como objetivo obtener un paquete rico en enzimas azucares fermentesibles y polisacridos. Para hacer esto, el grano de cebada tiene que ser puesto a germinar a una temperatura de 10 a 16 C, una humedad de 42 a 46 % y un tiempo de 60 horas. Despus, la cebada germinada se seca usando aire caliente iniciando con un calentamiento suave hasta alcanzar la temperatura final dependiendo de las caractersticas que se deseen en la malta. Normalmente las temperaturas de secado para maltas lager son de 55 a 70 Cy de 60 a 95 Cpara maltas ale. Finalmente se realiza la molturacin de los granos tostados de la malta 2.8.2 Produccin del mosto de malta.Losgranos enteros de malta son sometidos a la etapa de molturacin para obtener smolas y harinas acompaada de la cascara que se debe ser conservada lo ms enteras posible, para ser utilizadas como medio filtrante en el proceso de obtencin del mosto. La malta ya molida se mezcla con agua formando la pasta (Cuadro3)y en ocasiones se adicionan entre un 10 y 20% de otros tipos de granos no germinados como fuentes de almidn, tales como el arroz o el maz, que proporcionan un sabor ms ligero. La mezcla se calienta gradualmente empleando una distribucin de temperaturas, tiempo y pH que


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figuran (Cuadros 4,6,5) con la finalidad de activar de forma ptima un consorcio de enzimas como las proteasas, las -glucanasas la -amilasa y la - amilasa que se encuentran en la malta para hidrolizar los componentes de la malta, formando una papilla nutritiva. La solucin se filtra y al lquido obtenido se le aade el lpulo. Finalmente la solucin se somete a ebullicin por una hora aproximadamente para obtener el mosto.Las proteasas hidrolizan las protenas de la malta, dando como resultado la formacin de pptidos y aminocidos, que ms adelante, durante la fermentacin servirn como nutrientes para la levadura. Las -glucanasas hidrolizan los glucanos presentes en la cebada; la degradacin de estos polmeros es importante para disminuir la viscosidad del mosto. La -amilasa hidroliza la amilosa y la amilopectina originando maltosa y dextrinas. Las amilasas que se activan entre 60 y 70 Chidrolizan los enlaces (14) de la amilosa y la amilopectina en diferentes puntos del polmero sin acercarse a los puntos de ramificacin y a los extremos de la cadena.Al llevarse la coccin del mosto se cubren 7 objetivos tecnolgicos: (1) Concentracin de slidos en el mosto. (2) Extraccin de los componentes del lpulo. (3) Inactivacin de las enzimas de la malta. (4) Esterilizacin del mosto. (5) Elimin

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