Guatemala, 19 Guatemala, 19 –– 23 marzo 200723 marzo 2007

MarMaríía Teresa Acua Teresa Acuñña Calvoa Calvo

INCIENSA INCIENSA -- Costa RicaCosta Rica

Aislamiento de Aislamiento de Salmonella Salmonella spp. en alimentosspp. en alimentos20 de marzo 200720 de marzo 2007

IntroducciIntroduccióónn

�� ETAsETAs debidas a diferentes serovariedades de debidas a diferentes serovariedades de

SalmonellaSalmonella

�� Asociadas al consumo de alimentos contaminados Asociadas al consumo de alimentos contaminados

con con materia fecalmateria fecal humana o animal:humana o animal:

�� Gastroenteritis Gastroenteritis

�� Fiebre tifoidea y paratifoideaFiebre tifoidea y paratifoidea

�� Complicaciones graves de alta de letalidadComplicaciones graves de alta de letalidad

(ni(niñños, ancianos e os, ancianos e inmunocomprometidosinmunocomprometidos))

�� Ampliamente distribuido en la naturaleza: Ampliamente distribuido en la naturaleza:

�� Intestino de aves, reptiles y mamIntestino de aves, reptiles y mamííferosferos

�� SobrevivenciaSobrevivencia en el ambienteen el ambiente

�� Aguas, alimentos, excretasAguas, alimentos, excretas

�� Salud humanaSalud humana

�� GastroenteritisGastroenteritis

�� Fiebres entFiebres entééricasricas

�� Salud animalSalud animal

�� Abortos Abortos

�� DiarreasDiarreas

�� ProducciProduccióón de alimentos de origen animaln de alimentos de origen animal

�� Bajo rendimientoBajo rendimiento

�� Rechazo por riesgo para la saludRechazo por riesgo para la salud

�� ProducciProduccióón de alimentos de origen vegetaln de alimentos de origen vegetal

�� Rechazo por riesgo para la salud Rechazo por riesgo para la salud

�� Mayores costos de producciMayores costos de produccióónn

Aguas de riego, abonos orgAguas de riego, abonos orgáánicosnicos

Manejo posManejo pos--cosechacosecha

�� Agua para consumoAgua para consumo

�� TurismoTurismo

I

M

P

A

C

T

O

II

MM

PP

AA

CC

TT

OO

……IntroducciIntroduccióónn

La principal preocupaciLa principal preocupacióón de los gobiernos en relacin de los gobiernos en relacióón a los n a los

alimentos importados de otros paalimentos importados de otros paííses o regiones se relaciona con la ses o regiones se relaciona con la

inocuidad y con la preservaciinocuidad y con la preservacióón de la salud humana, animal y vegetaln de la salud humana, animal y vegetal

En la Ronda de Negociaciones Comerciales Multilaterales de Uruguay,

se aprobaron dos acuerdos con la finalidad de promover el comercio

ético y leal de productos entre los países, teniendo la salud como

prioridad:

�� Sanitario y Fitosanitario (SPS) Sanitario y Fitosanitario (SPS)

�� Barreras TBarreras Téécnicas al Comercio (TBT) cnicas al Comercio (TBT)

� Asegurar la aplicación de los reglamentos técnicos,

patrones y procedimientos analíticos:

� minimizar y/o eliminar el riesgo sanitario

� evitar obstáculos innecesarios al comercio

Recomendaciones Grupo TRecomendaciones Grupo Téécnico de Microbiologcnico de Microbiologíía de la Red a de la Red

Interamericana de Laboratorios de AnInteramericana de Laboratorios de Anáálisis de Alimentos lisis de Alimentos

(RILAA)(RILAA)

Tomado de: Documento “Posicionamiento del grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente a la adopción

de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación de los laboratorios de

análisis de alimentos” Agosto 2006

Los Los papaíísesses compartencomparten la la responsabilidadresponsabilidad porpor la la

inocuidadinocuidad de los de los alimentosalimentos, la , la cualcual debedebe mantenersemantenerse

a lo largo de a lo largo de todatoda la la cadenacadena alimentariaalimentaria

�� Los mLos méétodos analtodos analííticos deben ser confiables, reproducibles y ticos deben ser confiables, reproducibles y

factibles, por lo que se ha recomendado la adopcifactibles, por lo que se ha recomendado la adopcióón de n de

mméétodostodos normalizados normalizados o o mméétodos descritos por organizaciones todos descritos por organizaciones

con credibilidad internacional, con credibilidad internacional, como: como:

�� International Organization for Standardization (ISO) International Organization for Standardization (ISO)

�� Association of Official Analytical Chemists International (AOAC)Association of Official Analytical Chemists International (AOAC)

�� U.S Food and Drug Administration (FDAU.S Food and Drug Administration (FDA--BAM)BAM)

�� Food Safety and Inspection ServiceFood Safety and Inspection Service--USDA (FSIS)USDA (FSIS)

�� American Public Health Association (APHA)American Public Health Association (APHA)

�� International Commission on Microbiological Specifications for FInternational Commission on Microbiological Specifications for Food ood

(ICMSF)(ICMSF)

Tomado de: Documento “Posicionamiento del Grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente

a la adopción de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación

de los laboratorios de análisis de alimentos” Agosto 2006

Recomendaciones Grupo TRecomendaciones Grupo Téécnico de Microbiologcnico de Microbiologíía de la Red a de la Red

Interamericana de Laboratorios de AnInteramericana de Laboratorios de Anáálisis de Alimentos lisis de Alimentos

(RILAA)(RILAA)

�� Los mLos méétodos de laboratorio deben ser utilizados todos de laboratorio deben ser utilizados tal como tal como

son descritosson descritos,, sin realizar ningsin realizar ningúún cambio. n cambio.

�� El laboratorio sEl laboratorio sóólo debe realizar una lo debe realizar una verificaciverificacióón del n del

desempedesempeñño del mo del méétodotodo en sus instalaciones. en sus instalaciones.

�� Si alguno de los laboratorios desea utilizar un mSi alguno de los laboratorios desea utilizar un méétodo todo

nuevo o modificado, se recomienda que nuevo o modificado, se recomienda que ééste sea adoptado ste sea adoptado

despudespuéés de hacer una s de hacer una validacivalidacióón completa n completa para para

demostrar que el mdemostrar que el méétodo todo ““nuevonuevo”” presenta equivalencia al presenta equivalencia al

mméétodo normalizado.todo normalizado.

Tomado de: Documento “ Posicionamiento del Grupo Técnico de Microbiología de la RILAA frente a la adopción de métodos normalizados y con la necesidad de buscar la acreditación

de los laboratorios de análisis de alimentos” Agosto 2006

Recomendaciones Grupo TRecomendaciones Grupo Téécnico de Microbiologcnico de Microbiologíía de la Red a de la Red

Interamericana de Laboratorios de AnInteramericana de Laboratorios de Anáálisis de Alimentos lisis de Alimentos

(RILAA)(RILAA)

Norma: ISO 16140:2003 Norma: ISO 16140:2003

MicrobiologyMicrobiology ofof foodfood andand animal animal feedingfeeding struffsstruffs

((ProtocolProtocol for validation of alternative for validation of alternative methodsmethods))

1era etapa:1era etapa: Estudio comparativo en que las caracterEstudio comparativo en que las caracteríísticas de desempesticas de desempeñño o

del mdel méétodo alternativo son confrontadas con las del mtodo alternativo son confrontadas con las del méétodo normalizado todo normalizado

2da etapa: 2da etapa: Ensayo Ensayo colaborativocolaborativo en que participan 8 a 10 laboratorios en que participan 8 a 10 laboratorios

acreditados y coordinados por el laboratorio coordinadoracreditados y coordinados por el laboratorio coordinador

�� LLíímite de deteccimite de deteccióón y / o cuantificacin y / o cuantificacióón n

�� PrecisiPrecisióón relativan relativa

�� SensibilidadSensibilidad

�� EspecificidadEspecificidad

�� InclusividadInclusividad

�� ExclusividadExclusividad

�� RepetibilidadRepetibilidad

�� ReproducibilidadReproducibilidad

Salmonella Salmonella spp.spp.

�� Microorganismos pertenecientes al gMicroorganismos pertenecientes al géénero nero Salmonella Salmonella se se

aislaronaislaron inicialmente en muestras de origen clinicialmente en muestras de origen clííniconico

�� Poco tiempo despuPoco tiempo despuéés se empezs se empezóó a sospechar de la a sospechar de la

contaminacicontaminacióón de algunos alimentos con bacterias de n de algunos alimentos con bacterias de ééste ste

ggééneronero

�� ParecParecíía la lóógico aplicar los procedimientos existentes, con gico aplicar los procedimientos existentes, con

algunas modificaciones, para el analgunas modificaciones, para el anáálisis de alimentos. Sin lisis de alimentos. Sin

embargo se hizo evidente que esta prembargo se hizo evidente que esta prááctica no era ctica no era

adecuada debido a muchas razones.adecuada debido a muchas razones.

La recuperaciLa recuperacióón de n de SalmonellaSalmonella a partir de un a partir de un

alimento estalimento estáá relacionado a diferentes factores :relacionado a diferentes factores :

�� Se encuentra en cantidades menores en muestras Se encuentra en cantidades menores en muestras

de alimentos que en muestras clde alimentos que en muestras clíínicasnicas

�� Su recuperaciSu recuperacióón se dificulta porque han sido n se dificulta porque han sido

sometidas a condiciones adversas resultando assometidas a condiciones adversas resultando asíí

dadaññadas y debilitadasadas y debilitadas

�� La naturaleza de algunos alimentos altera las La naturaleza de algunos alimentos altera las

caractercaracteríísticas y el modo de accisticas y el modo de accióón de los medios n de los medios

de cultivo, dificultando la recuperacide cultivo, dificultando la recuperacióón del patn del patóógeno geno

�� La manipulaciLa manipulacióón de la muestra despun de la muestra despuéés de la s de la

recoleccirecoleccióón:n:

�� Ej.: En carnes crudas la flora competitiva puede ser un factor Ej.: En carnes crudas la flora competitiva puede ser un factor

importanteimportante

�� Se pueden encontrar variaciones de muestra a muestra y entre Se pueden encontrar variaciones de muestra a muestra y entre

un tipo de carne y otroun tipo de carne y otro

…La recuperación de Salmonella a partir de un alimento está relacionado a diferentes factores:

…La recuperación de Salmonella a partir de un alimento

está relacionado a diferentes factores :

�� Para propPara propóósitos epidemiolsitos epidemiolóógicos el analista debe ser mgicos el analista debe ser máás s

exhaustivo: exhaustivo:

�� Adicionando medios de enriquecimiento, otros medios de cultivo, Adicionando medios de enriquecimiento, otros medios de cultivo,

utilizando dos temperaturas de incubaciutilizando dos temperaturas de incubacióón, intensificando el nn, intensificando el núúmero mero

de colonias a picar, y/o utilizando mde colonias a picar, y/o utilizando méétodos de todos de screeningscreening rráápidospidos

LaboratorioLaboratorioClinicaClinica

EpidemiologEpidemiologííaaAmbienteAmbiente

Esquema bEsquema báásicosico

Presencia de Presencia de SalmonellaSalmonella spp. en alimentosspp. en alimentos

DiaDia 1 1 PrePre--enriquecimiento en medio lenriquecimiento en medio lííquido no quido no

selectivo: selectivo: permite a las salmonelas que están en

bajos niveles y/o lesionadas “resucitar” y proliferar

�� HomogenizaciHomogenizacióón del alimento (1: 9)n del alimento (1: 9)

Licuar, remojo, triturado, batidoLicuar, remojo, triturado, batido

�� Incubar: tiempo y temperatura definidosIncubar: tiempo y temperatura definidos

DiaDia 2 2 Enriquecimiento en medio lEnriquecimiento en medio lííquido quido

selectivo:selectivo: permite a las salmonelas proliferar y a la

vez suprime el crecimiento de microflora competitiva

�� Incubar: tiempo y temperatura definidosIncubar: tiempo y temperatura definidos

DDíía 3 a 3 Plateo selectivo Plateo selectivo

Suprime el crecimiento de microflora competitiva y permite el Suprime el crecimiento de microflora competitiva y permite el

crecimiento de colonias de crecimiento de colonias de SalmonellaSalmonella bien aisladasbien aisladas

�� Incubar: tiempo y temperatura definidosIncubar: tiempo y temperatura definidos

BGSBGSBGS

HEHEHEXLDXLDXLD

BSBSBS

BGABGABGA

XLT4XLT4XLT4

DDíía 4 a 4 SelecciSeleccióón de colonias tn de colonias tíípicas y atpicas y atíípicas ypicas y

siembra en TSI y LIAsiembra en TSI y LIA

�� Incubar: tiempo y temperatura definidosIncubar: tiempo y temperatura definidos

DDíía 5 a 5 ConfirmaciConfirmacióón bioqun bioquíímicamica

�� BQ convencional BQ convencional

�� API, API, VitekVitek

H2S (+) HH22S (S (--))

Antígenos flagelares H

Antígenossomáticos O

DDíía 6a 6 ConfirmaciConfirmacióón seroln serolóógicagica

•• AntisuerosAntisueros polivalentes polivalentes ““OO””

•• AntisuerosAntisueros polivalentes polivalentes ““HH””

•• Reporte de resultados:Reporte de resultados:

Presencia de Presencia de Salmonella Salmonella spp. spp.

en 25 gramos o en 25 gramos o mlml del productodel producto

CuCuáál esquema de aislamiento l esquema de aislamiento

debo utilizardebo utilizar??

La selecciLa seleccióón del mn del méétodo de aislamiento de todo de aislamiento de

SalmonellaSalmonella depende bdepende báásicamente de :sicamente de :

�� El socio comercial (paEl socio comercial (paíís importador)s importador)

�� El alimento a analizar (matriz)El alimento a analizar (matriz)

�� Flora acompaFlora acompaññante ante

�� Si se trata de un anSi se trata de un anáálisis de rutina o si es para lisis de rutina o si es para

fines epidemiolfines epidemiolóógicos (investigacigicos (investigacióón de brote)n de brote)

TemperaturaTemperatura

Tiempo /Tiempo /

Agua peptona Agua peptona

BufferizadaBufferizada (APB) (APB)

CocoaCocoa: APB +/: APB +/--NDFMNDFM

18 +/18 +/-- 2 h 2 h

37 37 °°C +/C +/-- 11°°CC

Caldo LactosaCaldo Lactosa

Agua + VB 1%Agua + VB 1%

CTS + sulfato ferrosoCTS + sulfato ferroso

Caldo NutritivoCaldo Nutritivo

CTS + sulfito de CTS + sulfito de

potasiopotasio

NFDMNFDM

Ajusta PH Ajusta PH

24 h 24 h

35 35 °°CC

Caldo lactosa Caldo lactosa

Agua + V B1%Agua + V B1%

C.T.SC.T.S

CTS + sulfito de potasioCTS + sulfito de potasio

Caldo LSTCaldo LST

Ajusta PH Ajusta PH

24 h +/24 h +/-- 2 h2 h

35 35 °°C C

Agua peptona Agua peptona

BufferizadaBufferizada

(APB) (APB)

2020--24 h 24 h

3535°°C +/C +/-- 22°°C C

PrePre--EnriqEnriq..

Alimentos para Alimentos para

consumo humano y consumo humano y

alimentacialimentacióón animal, n animal,

muestras ambientalesmuestras ambientales

Aplicable:Aplicable:

S.S. TyphiTyphi y y S.S. ParatyphiParatyphi

Huevo, lHuevo, láácteos cteos

frutas y vegetales frutas y vegetales

pescado, mariscospescado, mariscos

carnes y sustitutoscarnes y sustitutos

especias, dulcesespecias, dulces

Huevos , lHuevos , láácteoscteos

alimentos crudos,alimentos crudos,

Alimentos altamente Alimentos altamente

contaminados, contaminados,

alimentos para alimentos para

animalesanimales

Carnes, Carnes,

productos de productos de

carne y huevoscarne y huevos

No aplicable: No aplicable:

S. S. TyphiTyphi

AplicableAplicable

ISOISO6579:20026579:2002

BAMBAM20032003

AOACAOAC20002000

USDAUSDA10/01/0410/01/04

EtapaEtapa

Esquemas de aislamiento para Esquemas de aislamiento para Salmonella Salmonella spp. en alimentosspp. en alimentos

TemperaturaTemperatura

TiempoTiempo

Alimentos de alta y baja Alimentos de alta y baja

carga microbiana:carga microbiana:

�� Medio RappaportMedio Rappaport

VassiliadisVassiliadis

Alta y baja carga Alta y baja carga

24 h +/24 h +/-- 2 h2 h

42 42 °°CC +/+/-- 0.20.2°°CC

��Caldo Tetrationato Caldo Tetrationato TTTT

baja cargabaja carga

24 h +/24 h +/-- 2 h2 h

35 35 °°CC +/+/-- 0.20.2°°CC

alta carga alta carga 24 h +/24 h +/-- 2 2 hrshrs

43 43 °°CC +/+/-- 0.20.2°°CC

�� Medio RappaportMedio Rappaport

Vassiliadis con soyaVassiliadis con soya

24 h +/24 h +/-- 3h3h

41.5 41.5 °°CC +/+/-- 11°°CC

�� Caldo Tetrationato Caldo Tetrationato

MullerMuller KauffamanKauffaman

con con novobiocinanovobiocina

((mKTTnmKTTn))

24 h +/24 h +/-- 3 h3 h

37 37 °°CC +/+/-- 11°°CC

�� Caldo Caldo

Selenito CistinaSelenito Cistina

�� Caldo Caldo

TetrationatoTetrationato

24 h +/24 h +/-- 2 2 hrshrs

35 35 °°C C

�� Medio RappaportMedio Rappaport

Vassiliadis Vassiliadis modifimodifi

�� CaldoTetrationatoCaldoTetrationato

(Hajna)(Hajna)

2222--24 h24 h

42 42 °°CC

EnriquecimientoEnriquecimiento

ISOISO6579:20026579:2002

BAMBAM20032003

AOACAOAC20002000

USDAUSDA10/01/0410/01/04

EtapaEtapa

Esquemas de aislamiento para Esquemas de aislamiento para Salmonella Salmonella spp.spp. en alimentosen alimentos

BQ use medios BQ use medios

apropiados apropiados ((TSI, urea, lisina TSI, urea, lisina

decarboxilasadecarboxilasa, ,

ONPG, VP, indolONPG, VP, indol))

TSI , LIA, BHITSI , LIA, BHI

24 h +/24 h +/-- 2 h2 h

35 35 °°CC

TSI y LIATSI y LIA

24 h +/24 h +/-- 2 h2 h

35 35 °°CC

TSI y LIATSI y LIA

24 h+/24 h+/-- 2 h2 h

35 35 °°C +/C +/-- 22°°CC

IdentificaciIdentificacióón n

BQ presuntivaBQ presuntiva

1 colonia 1 colonia

sospechosa por sospechosa por

placaplaca

Inocule en ANInocule en AN

24 h +/24 h +/-- 3 h3 h

37 37 °°C +/C +/-- 11°°CC

1 colonia sospechosa de 1 colonia sospechosa de

cada placa o dos colonias cada placa o dos colonias

atatíípicaspicas

Inocule en ATS o ANInocule en ATS o AN

24 h a 35 24 h a 35 °°CC

2 o m2 o máás colonias s colonias

sospechosas de sospechosas de

cada placacada placa

3 colonias 3 colonias

sospechosas por sospechosas por

placaplaca

SelecciSeleccióón de n de

coloniascolonias

XLD (2 placas) XLD (2 placas)

24 h +/24 h +/-- 3 h 3 h

37 37 °°C +/C +/-- 1 1 °°CC

Otro medio BGA Otro medio BGA

y/o BGA y/o BGA

XLD y HE XLD y HE

24 h +/24 h +/-- 2 h 2 h

35 35 °°C +/C +/-- 1 1 °°CC

XLD, HE, BSXLD, HE, BS

24 h +/24 h +/-- 2 h 2 h

35 35 °°CC

XLT 4 y BGSXLT 4 y BGS

1818--24 h 24 h

35 35 °°C +/C +/-- 22°°CC

Plateo selectivoPlateo selectivo

ISOISO6579:20026579:2002

BAMBAM20032003

AOACAOAC20002000

USDAUSDA10/01/0410/01/04

EtapaEtapa

Esquemas de aislamiento para Esquemas de aislamiento para Salmonella Salmonella spp.spp. en alimentosen alimentos

La La sostenibilidadsostenibilidad de los recursos de de los recursos de

laboratorio depende del uso inteligente laboratorio depende del uso inteligente

que se de a los mismosque se de a los mismos

InvestigaciInvestigacióón de patn de patóógenos en alimentos genos en alimentos

durante la investigacidurante la investigacióón de brotes ETAn de brotes ETA

�� Experiencia en INCIENSAExperiencia en INCIENSA

�� Solicitar al nivel local:Solicitar al nivel local:

�� Muestras de casos asociados al brote, a fin de identificar el paMuestras de casos asociados al brote, a fin de identificar el pattóógeno geno

involucrado involucrado (incluyendo manipuladores de alimentos)

�� RecolecciRecoleccióón de muestras de alimentos sospechosos como probable n de muestras de alimentos sospechosos como probable

fuente de infeccifuente de infeccióónn

�� Realizar la investigaciRealizar la investigacióón epidemioln epidemiolóógica oportunamente gica oportunamente (formularios de

brotes)

�� Se procesan en el laboratorio Se procesan en el laboratorio úúnicamente aquellos alimentos que nicamente aquellos alimentos que

muestran evidencia epidemiolmuestran evidencia epidemiolóógica que los implique como probable gica que los implique como probable

vehvehíículo de infecciculo de infeccióón. Se busca especn. Se busca especííficamente el patficamente el patóógeno geno

identificado en los casos clidentificado en los casos clíínicos. nicos.

--------11S.S. Typhimurium Typhimurium

øø atatíípicopico**

1515HerediaHeredia, 1999, 1999

ChicharronesChicharrones de de cerdocerdo

((sospechososospechoso: : no enviaron

muestras)

0000S.S. TyphimuriumTyphimurium DT104* DT104*

((multirresistentemultirresistente**)**)

77San JosSan Joséé, 2004, 2004

MayonesaMayonesa caseracasera----44S. S. EnteritidisEnteritidis232232HerediaHeredia, 2002, 2002

ArrozArroz cantoncantonééss--------S.S. EnteritidisEnteritidis170 170 Alajuela, 2001Alajuela, 2001

Papas a la Papas a la francesafrancesa1111S.S. EnteritidisEnteritidis øø1*1*697697AlajuelaAlajuela, 1999, 1999

SintomSintom..AsintomAsintom..

AlimentoAlimentoManipuladoresManipuladores

PatPatóógenosgenos en en vehvehíículosculos de de infecciinfeccióónnPatPatóógenogeno identificadoidentificado

en en casoscasos clclíínicosnicos

N N °°

casoscasosProvinciaProvincia, ,

aaññoo

Algunos ejemplos de vehAlgunos ejemplos de vehíículos de infecciculos de infeccióónn

identificados en brotes por identificados en brotes por SalmonellaSalmonella

Costa Rica, 1999Costa Rica, 1999--20042004

Fuente: Centro Nacional de Referencia en Bacteriología, INCIENSA

* Fagotipo confirmado en el LCDC-Canadá.

** Cepa resistente a AN, AMP, CHL, TCY, S3, S.

Muchas gracias!!!Muchas Muchas

gracias!!!gracias!!!