Aislamiento de microorganismos amilolíticos y producción de amilasa en cultivo sumergido y...

CC4020 Laboratorio de Microbiología industrial 24/06/2014© Laboratorio de Micología y Biotecnología Villena, G.K. Departamento Académico de Biología. Facultad de CienciasUniversidad Nacional Agraria La Molina. Lima - Perú

Aislamiento de microorganismos amilolíticos y producción de amilasa en cultivo sumergido y mediante fermentación en estado sólido.

Bazo, Isamar1; García, Katherine 1; Gonzales, Jaime1- & Rodríguez, Angel1

1 Pregrado- biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La Molina

Summary

Microorganisms with amylolytic activity were isolated from a sample of garden soil in the San Luis , Lima-Peru, with enrichment in situ. Penicillium sp strain was selected. Which showed a higher hydrolysis halo (9 mm) in a petri dish with isolation medium and cultured by a submerged fermentation systems (FS) and into a fermentation system solid substrate (FSS) for the production of extracellular amylases. The enzymatic activities obtained were ..... IU / ml and ...... IU / ml respectively in FS and FSS. Added to this, the volumetric productivity of the enzyme in FS (Γ E = 32.3112 gL-1h-1) was lower than the productivity volumentrica FSS (Γ E = 150.4192 gL-1h-1), showing the FSS system has a significant advantage in the production of enzyme over the FS system.

Resumen

Se aislaron microorganismos con actividad amilolítica a partir de una muestra de suelo de jardín del distrito de San Luis, Lima-Perú, con enriquecimiento in situ. Se seleccionó una cepa de Penicillium sp., la cual evidencio un mayor halo de hidrolisis (9 mm) en una placa Petri con medio de aislamiento y se cultivó por medio de un sistemas de fermentación sumergida (FS) y en un sistema de fermentación en sustrato sólido (FSS) para la producción de amilasas extracelulares. Las actividades enzimáticas obtenidas fueron de …..UI/ml y …… UI/ml en FS Y FSS respectivamente. Adicionado a esto, la productividad volumétrica de la enzima en FS (Γ E= 32.3112 gL-1h-1), fue menor que la productividad volumentrica en FSS (Γ E =150.4192 gL-1h-

1), mostrando así el sistema FSS una ventaja significativa en la producción de enzima sobre el sistema FS.

Introducción

El almidón es el principal polisacárido de reserva de los alimentos en la naturaleza y es la

principal fuente de carbohidratos en la dieta humana. La utilización de almidón para

aplicaciones industriales ha aumentado considerablemente en las últimas décadas (Rani,

2004). Las amilasas constituyen uno de los grupos más importantes de enzimas industriales

que presentan varias aplicaciones en la industria de los alimentos, textil y en fabricación de

etanol (Machado de Castro et al., 2010).

Las amilasas son enzimas extracelulares que se encuentran ampliamente distribuidas en

plantas, bacterias, hongos y animales, estas hidrolizan las moléculas de almidón en polímeros



compuestos de unidades de glucosa (Neerja et al., 2013). Las amilasas producidas por

microorganismos han sustituido con éxito a la hidrólisis química del almidón dentro de esta

industria. La primera enzima producida industrialmente era una amilasa a partir de una fuente

fúngica en 1894, que fue utilizada como una ayuda farmacéutica para el tratamiento de

trastornos digestivos (Pandey et al., 2000). Dos clases importantes de amilasa han sido

identificadas en microorganismos, llamadas α -amilasas y glucoamilasas. Las α –amilasas

(E.C 3.2.1.1) son enzimas que catalizan la hidrolisis de los enlaces glucosidicos internos los α

– 1,4 y α -1,6 en el almidón de bajo peso molecular dando como productos unidades de

glucosa, maltosa y maltotriosa; dentro del origen microbiano, las amilasas de origen fúngico

han sido identificadas como más estables que las bacterianas a escala comercial. Por lo tanto

los intentos para optimizar las condiciones de cultivo se han realizado sobre las cepas

adecuadas de hongos. Entre los géneros de microorganismos productores de α –amilasas

están Aspergillus, Bacillus y Penicillium (Neerja et al., 2013). Por otro lado, Las glucoamilasas

(EC 3.2.1.3) de origen fúngico atacan enlaces α-1, 4, liberando moléculas de D-glucosa en la

configuración β; esta enzima también ataca enlaces α-1, 6 en puntos de ramificación en la

molécula de amilopectina, pero mucho más lentamente que en un α-1, 4 (Gomes et al., 2005).

La mayoría de los procesos industriales se utilizan enzimas para hidrolizar el almidón en

glucosa, normalmente en un proceso de dos pasos: licuefacción y sacarificación. En la primera

etapa, el almidón se gelatiniza mediante un tratamiento térmico en exceso de agua a

temperaturas superiores a 110 ° C. Durante el tratamiento térmico, el almidón también se

hidroliza por una α-amilasa termoestable, donde esta corta al azar los enlaces α-1,4 de las

cadenas largas de almidón para obtener como producto las maltodextrinas, que se añade a la

suspensión de almidón justo antes del tratamiento térmico. Debido a las diferencias en la

escala de tiempo del proceso de gelatinización y licuefacción enzimática, la pasta de almidón

se enfría hasta a 95 ° C y se mantiene a esta temperatura durante 60-90 minutos para

completar la licuefacción enzimática. Después de este paso en la segunda etapa, la mezcla se

enfría a aproximadamente hasta 60 ° C y las maltodextrinas producidas en la primera etapa

se hidrolizan completamente a la glucosa por una glucoamilasa, quien hidroliza los enlaces α-

1,6 del extremo no reductor de la cadena de dextrina, liberando la glucosa. El exceso de agua

se utiliza para facilitar la gelatinización y asegurar una mezcla suficiente durante la reacción

(Van der Veen et al., 2006).

Tradicionalmente, las amilasas han sido producidas por fermentación sumergida (SMF)

utilizando un proceso de una sola vía en solución y mediante medio sinteticos, pero en los



últimos años los procesos de fermentación en estado sólido (SSF) se han utilizado cada vez

más para la producción de esta enzima (Kunamneri et al., 2005). SSF es un proceso que

implica el crecimiento de microorganismos (principalmente hongos) en sustratos sólidos

húmedos en la ausencia de agua de flujo libre (Gutiérrez-Correa y Villena, 2003). El sustrato

solido puede proveer no solo soporte sino también nutrición. Las bacterias, levaduras y hongos

pueden crecer en sustratos sólidos y encontrar aplicaciones en los procesos de SSF mas los

hongos filamentosos son los mejores adaptados para SSF (Balkan y Ertan, 2007). La forma de

crecimiento de las hifas y la buena tolerancia a la baja actividad de agua aw) más la alta

condición de presión osmótica, hace a los hongos más eficiente para la bioconversión de

sustratos sólidos (Alva et al., 2007). Balkan y Ertan (2007) consideran que los principales

factores que afectan a la síntesis microbiana de la enzima en un sistema SSF incluyen la

selección de sustrato y microorganismo adecuado, tamaño de partícula del sustrato, la

concentración del inóculo y el nivel de humedad del sustrato; en el SSF, la selección de

sustrato sólido adecuado para el proceso de fermentación es un factor crítico y por lo tanto

implica la proyección de un número de materiales agroindustriales para el crecimiento

microbiano y la formación de producto, como salvado de trigo, hojas de maíz, paja de centeno

y de la paja del trigo son algunos de ellos. SSF en comparación con la fermentación sumergida

es más simple, requiere un capital inferior, tiene una productividad superior, los requerimientos

de energía son reducidos, medios de fermentación más simples y la ausencia de un riguroso

control de parámetros de la fermentación, utiliza menos agua produce agua residual en

menores cantidades, tiene un control más fácil de la contaminación bacteriana y requiere de

bajo coste de procesamiento downstream (Saranja y Stella, 2013).

En el presente estudio se empleó enriquecimiento in situ para aislar microorganismos

amilolíticos. La cepa seleccionada se utilizó para la producción de amilasas en dos diferentes

sistemas de fermentación; el sistema de fermentación sumergida en frascos agitados y

fermentación en sustrato sólido en salvado de trigo, además de determinar el sistema con

mayor rendimiento.

Materiales y métodos

Enriquecimiento in situ

Se tomó una muestra de suelo del distrito de San Luis, Lima-Perú (-12.078588, -77.003300),

del cual se seleccionó un área de 1m2 de suelo. Se retiró el material vegetal y se removió el



suelo hasta 5 cm de profundidad. El enriquecimiento se realizó con 500 g de almidón de papa

(chuño) de manera uniforme y se añadió una vez cada 7 días por el periodo de dos semanas,

luego de 4 días del último enriquecimiento se agregó 100 g cada día por el plazo de 3 días.

Asimismo, se mantuvo la humedad en el área.

Muestreo

Se tomó 100 g de suelo con tratamiento de enriquecimiento in situ y uno previo al tratamiento,

en un recipiente desinfectado y se guardó en un lugar fresco, pero no refrigerado.

Aislamiento de microorganismo amilolíticos

Se pesó 10 g de suelo y se añadió a un matraz Erlenmeyer con 90 ml de agua destilada estéril

(dilución 100) y se agitó por 10 minutos. Luego se realizó el método de las diluciones

sucesivas. Finalmente, se tomó 1ml de cada dilución y se sembró por incorporación en placas

petri con medio de aislamiento para hongos (10g almidón soluble, 0.5 g caseína, 1.4 g

NH4NO3, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4, 0.1 ml tritón-x-100, 15 g agar, 1000 ml agua destilada y

tetraciclina 100 g/ml). Las placas fueron incubadas por 4 días a 30º C.

Selección e identificación de hongos amilolíticos

Terminado el periodo de incubación, se utilizó una cámara de yodo metálico para observar los

halos de hidrólisis. Se seleccionaron cepas amilolíticas en base a la amplitud del halo incoloro.

Las colonias se identificaron morfológicamente hasta el nivel de género empleando el manual

de Barnett. Las colonias que presentaron mayor halo de hidrólisis se trasplantaron a tubos con

cuña de Agar Papa Dextrosa (PDA) los cuales se incubaron a 30º C por 3 días.

Preparación del inóculo

Se seleccionó la cuña de la colonia con mayor halo de hidrolisis de almidón. Las esporas se

lavaron con 10 ml de solución Twen 80 de 0.1% (v/v) y el recuento se realizó con la cámara de

Neubauer. Se diluyó hasta alcanzar una suspensión de 1 x 105 esporas ml-1, la cual se usó

como inóculo.

Cultivo Sumergido (FS)

Del inóculo se tomó 2.5 ml y se colocó en un matraz Erlenmeyer que contenía 80 ml de medio

de producción (20 g de almidón, 2.8 g NH4NO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g KCL, 0.03 g FeSO4, 0.5 g



CaCl2, 1 g peptona, 1000 ml agua destilada, pH 6.5) el cual se incubó en baño a 30º C con

agitación a 175 rpm por 4 días.

Cultivo en Sustrato Sólido (FSS)

Se añadió 2.5 ml de inóculo a un matraz Erlenmeyer que contenía medio de producción 7.5 g

salvado de trigo con 99.1% de almidón, 6 g torta de soya molida, 15 ml solución de sales

(KH2PO4 0.2%, MgSO4.7H2O 0.03%, CaCl2, agua de caño decantada). El frasco se incubó a

30º C por 4 días.

Recuperación de la enzima

Para el sistema (FS), la suspensión de enzimas se separó de la biomasa utilizando filtración al

vacío. Además se empleó papel filtro de peso conocido. El producto de la filtración se secó a

80º C por 2 días, la cantidad de biomasa se determinó por diferencia de peso seco. Para el

cultivo (FSS) se añadió 69 ml de tampón acetato 50mM, pH 4.8, se agitó homogéneamente a

200 rpm por 20 min y por filtración se separó el sobrenadante del precipitado.

Determinación de la actividad amilasa y proteínas solubles

Del sobrenadante obtenido de los dos sistemas de cultivo se determinó la actividad enzimática

mediante análisis de azúcares reductores liberados durante la hidrólisis de almidón, método de

Miller, empleando DNS como reactivo. La determinación de proteína soluble empleó el método

de lowry. Se entiende por unidad enzimática (UI) como la cantidad de enzima que libera 1µmol

por minuto por ml de extracto enzimático a 50ºC y pH 4.8.

Resultados

Enriquecimiento de suelo e identificación de microorganismos amilolíticos

En el estudio, el tratamiento de enriquecimiento favoreció el crecimiento de colonias con

capacidad amilolítica, ya que según el recuento de colonias se obtuvo un total de 20, de los

cuales 2 presentaron alta actividad amilolítica con un halo de hidrólisis de 9 y 5mm; mientras

que la muestra sin enriquecer, sólo 16 colonias con dos colonias significativas cuyos halos de

longitud son 9 y 4mm.



A partir de estas colonias se aisló dos colonias con halo de 9mm y tomando en cuenta su

morfología vegetativa se determinó su pertenencia al género Penicillium sp.

Así mismo, la cuantificación de esporas con la cámara de Neubauer, después del aislamiento,

determinó un total de 12; por eso, el inóculo con el cual se trabajó tuvo una concentración de

10 5 esporas/ml

Figura1. A) Placa Petri con cultivo microbiano de suelo enriquecido de San Luis a una dilución de 10 -3, señalando

colonia de la cepa amilolítica de Penicillum sp. Utilizada para producción de amilasas. B) Placa Petri con cultivo

microbiano de suelo sin enriquecer de San Luis a una dilución de 10 -3, señalándola colonia de la cepa amilolitica

Penicillium sp. C) Vista microscópica de Penicillium sp. A 400X proveniente de la cepa seleccionada de la placa A.

Producción de amilasas en FS y FSS

La producción enzimática del sistema FSS presentó una mayor cantidad de unidades de

enzima por litro de medio, como muestra el Cuadro 1, el sistema FS representa

aproximadamente el 21% del FSS.

Por otra parte, se puede apreciar que la cantidad de proteínas secretadas en FSS es en 25%

de la apreciada en FS.

Cuadro 1: Producción de amilasas de Penicillium sp.en sistemas FSS y FS tras 96 horas de

cultivo

Título de

enzima

Proteína

extracelularBiomasa

Sustrato

consumido

FS 3102 U*L⁻¹ 0.202 g*L⁻¹ 2.01 g*L⁻¹ 22 g*L⁻¹

FSS 14440 U*L⁻¹ 0.051 g*L⁻¹ - - - -


A B C


Parámetros: título de enzima=unidades enzimáticas/litro de medio de fermentación, Proteína extracelular=gramos de proteína/litro

de medio de fermentación, Biomasa= gramos de biomasa/ litro de medio de fermentación, Sustrato consumido=gramos de

glucosa consumida/litro de medio de fermentación

A partir de los datos obtenidos se evaluaron parámetros de productividad para ambos

sistemas fermentativos. Estos resultados se muestran en el Cuadro 2. Se puede apreciar que

la productividad volumétrica de amilasa en el FS es el 21% de la reportada para FSS. Además,

la actividad específica de la amilasa en FS es del 5% de la atribuida para la FSS.

Cuadro 2: Comparación de parámetros de productividad de amilasas de Penicillium sp. en

sistemas de FSS y FS tras 96 horas de cultivo

Parámetro

s

evaluados

FS FSS

AE 3101.8792 UIL⁻¹ 72.059 Ug⁻¹

YE/x 1541.3064 UIg⁻¹ -

YE/s 140.9945 UIg⁻¹ -

YE/Pr 15318.2700 UIg⁻¹ 285041.0715 Ug⁻¹

YX/s 0.0915 gg⁻¹ -

ΓE 32.3112 UIL⁻*h⁻¹ 150.4192 UL⁻¹h⁻¹

ΓX 0.0210 gL⁻¹h⁻¹ -

Γ E/X 16.0553 UIg⁻¹h⁻¹ -

Para FS: AE (actividad enzimática)=unidades de enzima/litro de medio sólido, YE/x=unidades de enzima/gramo de biomasa

formada, YE/s=unidades de enzima por gramos de sustrato consumido, YE/Pr=unidades de enzima/gramo de proteína extracelular

producida, YX/s=gramo de biomasa producida /gramos de sustrato consumido, ΓE=productividad volumétrica de amilasa,

ΓX=productividad volumétrica de biomasa, Γ E/X=productividad volumétrica especifica de amilasa. Para FSS: AE = Unidades de

enzima/gramos de sustrato inicial, YE/Pr= unidades de enzima/gramos de proteína secretada, ΓE =unidades de enzima/litro de

medio solido/hora

El sistema FS obtuvo una actividad específica (YE/Pr) que fue 18,6 veces inferior al del sistema

FSS. Mientras que en la productividad especifica fue 4,655 veces superior en FSS que en FS.

La actividad enzimática de ambos sistemas no es comparable debido al medio de cultivo

distinto y su difícil extrapolación.



Los parámetros como YE/x, YE/s, YX/s, ΓX y Γ E/X no se compararon entre los sistemas de

fermentación debido a su dificultad para determinar la biomasa del sistema FSS.

Discusiones

El aislamiento de microorganismos amilolíticos a partir de muestras de suelo del distrito de

San Luis, Lima-Perú, se realizó con el fin de evidenciar hongos capaces de producir amilasas

y proponer un proceso de producción industrial a pequeña escala, con lo cual la

determinación de parámetros facilita una mejor interpretación del funcionamiento y efectividad

de la enzima de acuerdo al sistema utilizado. En consecuencia, el enriquecimiento es

necesario para proliferar a esos microorganismos específicos presentes en pequeñas

cantidades que no se pueden detectar con facilidad si existen otros en mayor cantidad (Tortora

et al, 2007). Al proporcionar el sustrato y condiciones que favorecen el desarrollo de hongos

particulares, se puede apreciar un incremento de estos para su posterior aislamiento.

La identificación y aislamiento de Penicillium sp es congruente con la teoría, pues según datos

conocidos, los hongos aislados fácilmente del suelo son: Aspergillus, Cladosporium, Fusarium,

Penicillium y Trichoderma. Estos hongos filamentosos son importantes porque establece una

malla de hifas que determinan la estructura del suelo (Sagardoy y Mandolesi, 2004) y muchos

de estos se utilizan actualmente en la producción de enzimas amilasas, glucanasas,

degradadoras de contaminantes como arsénico en la biorremediación, entre otros. Así mismo,

la baja tasa reproductiva de Penicillium sp. no se relaciona con la información previa del

género, que debido a ser un patógeno oportunista, es considerado como un estratega r (Leigh,

2008), por esta razón, se atribuye este efecto a las condiciones de cultivo no óptimas para la

especie aislada.

Estudios realizados en producción enzimática con este tipo de sistemas han concluido que si

bien el sistema FS proporciona mayor control de factores ambientales como temperatura y

pH, el sistema FSS constituye una alternativa aprovechable, debido a que concentra los

metabolitos y los procesos de purificación son menos costosos (Espinel y López, 2009;

Saranraj y Stella, 2013). Además, el soporte y sustrato usado en este sistema es semejante a

la textura del hábitat natural de Penicillium, lo cual genera un mejor rendimiento en la

producción de enzimas (Espinel y López, 2009).

Por otra parte, se compararon los sistemas de fermentación empleados para la producción de

amilasas. De acuerdo a los resultados obtenidos, la mayor producción de amilasas por el



hongo Penicillium sp. fue superior en el sistema de fermentación en sustrato sólido (FSS)

respecto al sistema sumergido (FS). Esto concuerda con estudios previos realizados utilizando

ambos sistemas de fermentación (Moreira et al., 1999). La proteína secretada en FSS es

menor a la de FS, y al confluir con el título de enzima se puede apreciar que no toda las

enzimas secretadas en FS tienen actividad amilolítica, caso contrario, FSS presenta menos

enzimas que realizan mayor actividad enzimática. Esto se debe a que el cultivo de

microorganismos sobre diferentes sustratos o soportes sólidos depende de diferentes

parámetros y factores ambientales como son: el tipo de microorganismo y la cantidad de

inóculo; la humedad y la actividad de agua; la aireación y la transferencia de oxígeno; la

regulación de la temperatura y del pH (Campos, 2008). Estos resultados se complementan con

el Cuadro 2, donde la productividad volumétrica ΓE permite contrastar los razonamientos

anteriores, demostrando que FSS tuvo mayor eficiencia al degradar el almidón del medio.

Es importante mencionar que se debe tener en cuenta todos los parámetros que afectan a la

actividad óptima de la enzima. Las amilasas de Penicillium sp. muestran en estudios anteriores

rangos de pH, temperatura, sales y otros componentes; por ejemplo, Espinel y López (2009)

contribuyen con datos particulares de Penicillium commune usando como sustrato Manihot

esculenta Crantz (yuca), entre ellos tenemos de la actividad enzimática de α-amilasa a partir

de 48 horas fue de 8,21 U/mL para la FFS y 6,15 U/mL para la FLS, con pH óptimo de 6 y

temperatura de 70 ºC; adicionalmente, se considera la disponibilidad del ion Ca+ y la

presencia de EDTA, debido a que este ión está relacionado con interacciones adicionales

favorables que contribuyen a la neutralización de las cargas negativas en la de los dominios

estructurales A y B de la enzima. Al comparar con las características del Penicillium aislado, se

observa que el pH al cual fue sometido estuvo en el rango ligeramente ácido a neutro, esto

concuerda no solo con el ensayo en P. commune, sino también con otros productores de

amilasas (Oliveira et al, 2011; Alva et al, 2007), en cuanto a la temperatura, no se puede

concluir sobre el tema, ya que en la práctica no se realizó diferentes tratamientos para

determinar un rango óptimo; pero se considera que se encuentra dentro del rango porque ha

sido apto para distintos géneros en sistemas FSS (Xu et al., 2008; Saranraj y Stella, 2013 )

A pesar de las ciertas ventajas en productividad que puede ofrecer el sistema de FSS, se

presenta desventajas que hacen que el sistema de FS siga siendo el más utilizado a nivel

industrial para la producción de enzimas. Esto es debido a que al momento de escalar el

proceso de FSS a niveles industriales surgen diversos problemas de ingeniería a causa de



gradientes de humedad, temperatura, pH, O2, entre otros que surgen por la heterogeneidad del

sistema (Saranraj y Stella,. 2013).

Por último, se concluye que el sistema FSS presenta mayor ventaja que el sistema FS con

respecto a la producción de amilasas del microorganismo aislado Penicillium sp. y que este, es

un potencial productor de dicha enzima. No obstante, es necesario el estudio de este

microorganismo para condiciones industriales, ya que los factores que afectan a este sistema

son difíciles de controlar.

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