Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

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PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LÍQUIDO FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MONTERIA – CORDOBA 2008 1

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PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA

MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LÍQUIDO

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANACENTRO DE INVESTIGACIONES

MONTERIA – CORDOBA2008

1

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A. INFORMACION GENERAL

Título del proyecto Producción de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentación en estado líquido

Líder principal responsable del proyecto

Eder Durango Ballesteros

Miembros e integrantes Alfonso Batista JiménezIbeth Cepeda JiménezHéctor Alberto Tobón Guzmán

Unidad académica Facultad de Ingeniería AgroindustrialEmpresa donde realizará el proyecto

Universidad Pontificia Bolivariana

Fecha de inicio Junio de 2008

Fecha de finalización Junio de 2009Costo total del proyecto (incluyendo descargas –pago de personal -).

$ 21.826.281

Montos de contrapartida (Entidad o dependencia que cofinancia).

$ 9.427.881

Línea de trabajo o área del conocimiento en la cual se inscribe el proyecto.

Desarrollo de nuevos materiales y nuevas aplicaciones

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B. RESUMEN

El surgimiento de plantas de alcohol carburante de primera generación a partir de

almidón, en la región Caribe, implica la transformación de la materia prima por

procesos de hidrólisis mediante la acción de un complejo de amilasas capaces de

degradarlo en azucares. La implementación de hidrólisis enzimática conlleva

generar altos costos de producción, factor que genera una problemática en las

empresas de este género y a su vez en buscar soluciones para dicha temática.

Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicaciones

microbiológicas y biotecnológicas para la producción de un complejo de amilasa

microbial a partir de fermentación en un estado liquido, con el objeto de buscar

soluciones factibles en cuanto a la problemática planteada del proceso de

hidrólisis del almidón.

C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

1. Planteamiento del problema:

La tendencia actual y las altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollo

de nuevas técnicas agroindustriales. Actualmente, en Colombia se plantea un

déficit general en torno a la agroindustria enzimática a causa de la carencia de

investigación, infraestructura y poca motivación para desarrollar empresas que

basen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnología. Su

desarrollo, así como el de otras áreas de la biotecnología, está afectado por

problemas como la creciente brecha científica y tecnológica con respecto a los

países industrializados. Según la firma internacional, Frost & Sullivan, analistas

dedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas esta

seccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad de

estas. Según el estudio, para el año 2003 se generó cerca de 142 millones de

dólares solo en la industria alimenticia siendo el sector más innovador el de la

ingeniería genética a partir de organismos modificados, OGM. Con un 47.3%, las

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enzimas destinadas al procesamiento del almidón (amilasas) y los azucares

componen el sector mas amplio en la industria.1

Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzimático colombiano afecta gran

diversidad de industrias incluso las que están en vía de desarrollo como las de

alcohol carburante de primera generación cuya materia prima para producción es

el almidón, ya que para la transformación de ésta se hace necesario catalizar el

polisacárido por medio de un complejo de enzimas amilasas capaces de desdoblar

este compuesto; el uso de este complejo representa el 12% del valor total de

producción de alcohol a base de esta materia prima. En la costa Caribe el empleo

de estas enzimas esta concretamente en el Ingenio Sicarare (Codazzi-Cesar) y

en la planta piloto de CORPOICA-TURIPANA en Córdoba, lo que les incrementa

el valor por litro de producto dado la necesidad de importación de este complejo.

Las plantas de alcohol carburante de primera generación con base en almidón se

ven obligadas a importar complejos de amilasas para la hidrólisis del polisacárido,

lo que implica un aumento significativo en los costos de producción de las

compañías por el hecho de incurrir en gastos de importación, aranceles y demás

impuestos. Las enzimas a escala industrial, son importadas de diversos países de

Europa, Japón, Estados Unidos, Canadá y México.2

En conclusión, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primera

generación a partir de almidón ha establecido un hecho que evidencia la

necesidad de producir complejos de amilasas para reducir costos de operación.

Por lo que se plantea esta investigación para buscar alternativas de producción de

enzimas amilolíticas y su aplicación en las plantas de alcohol carburante en base

de almidón.

1 Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=34>. boletín 34 publicado en junio de 2004 [en línea]; consultado el 09 de febrero de 2008.2 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 10.

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2. Impacto esperado

Con este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnológicas para establecer

un protocolo de producción de un complejo de enzimas amilasas para catálisis de

almidón. Bajo esta temática se permitirá lograr avances en términos de

investigación en el área enzimática.

La profundidad de esta investigación radica en buscar fuentes orgánicas capaces

de producir complejos amilolíticos para hidrólisis del almidón con el fin de mejorar

el desarrollo de este proceso.

3. Marco teórico y estado del arte:

3.1 Antecedentes

Mundialmente, la producción de enzimas esta desarrollándose aun más, bajo el

principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicación de

esta industria gira en torno a países industrializados que tienen la capacidad de

investigar y producir a gran escala estas proteínas, lo cual margina a países

menos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrollo

en el campo biotecnológico. Sin embargo, esta afirmación no ha sido un

impedimento para que en diversos lugares del mundo se investigue en el área de

la enzimología y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reacciones

químicas.

Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influencia

directa en la degradación del almidón, uno de los productos alimentarios mas

explotados a nivel mundial.

Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp., aislado de

semillas de lentejas3. Este proyecto se llevo a cabo en Bogotá - Colombia y su

3 CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIÑEROS Y. Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogotá

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objetivo fue aislar microorganismos productores de amilasas para producir

enzimas hidrolíticas del almidón. El agente productor detectado fue una cepa del

genero Aspergillus sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este

microorganismo fue llevado a medio de cultivo en agar YPD bajo parámetros

específicos de incubación. Luego de 18 días se realizo cambio de sustrato a

salvado de trigo y se llevo a cabo pruebas de Lugol, medición de actividad

enzimática y extracción del complejo enzimático. Los resultados indican que las

amilasas presentes en el complejo enzimático obtenido del cultivo de Aspergillus

sp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de la molécula de

almidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC demostrando su carácter débilmente

ácido y su proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como medida

cuantitativa de la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la capacidad

enzimática amilolítica del complejo enzimático obtenido. En este trabajo se

confirmó teoría antes mencionada y la capacidad de hongos del género

Aspergillus sp., para la producción de amilasas.

Producción de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en

cultivos de aguas de lavado de dos empresas alimentarias4. El objeto de este

proyecto fue de analizar la producción de enzimas amilasas por cepas de

Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y cárnicas para

determinar la capacidad de producción de proteasas, amilasa y de depuración de

medio donde crecen. La metodología aplicada se baso en la creación de un medio

de cultivo de aguas de lavado con aplicación de nutrientes que mejoren la

adaptación del agente. Se implementó pruebas de azucares, niveles de nitrógeno

y fosforo y demanda química de oxigeno (DQO). Se analizaron los parámetros de

producción de enzima, pH, temperatura y concentración de iones. Los resultaron

indican que los niveles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente

– Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.4 SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering.

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dependientes de la concentración inicial de almidón en el medio de cultivo. Las

fuentes de nitrógeno (peptona, aminoácidos y extracto de levadura) fueron

totalmente influyentes en la producción de enzimas. El pH óptimo encontrado fue

de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50ºC.

Producción de amilasas de levaduras floculantes5. Este proyecto desarrollado

en Pakistán se destino en la consecución de seis especies de levaduras

productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de producción bajo el medio de

cultivo agar almidón y como fuente de carbono se agrego extracto de levadura,

almidón y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio estuvo

contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptación del

microorganismo incubado a una temperatura de 25ºC., se realizaron pruebas de

producción de enzima, degradación de sustrato, turbidimetría y velocidad de

crecimiento. Del la metodología ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura

correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabajó con saliva

humana, produciendo 28 U/ml, la cual presentó una estabilidad en el rango de 25-

60ºC. Los niveles de las demás cepas fueron muy inferiores al registrado

anteriormente.

Detergente con formulación enzimática de amilasa obtenida de Aspergillus

niger. Un estudio comparativo en detergentes comerciales6. El proyecto

manifiesta una problemática de la necesidad de compuestos naturales y eficaces

para la industria de detergentes. El presente articulo describe la producción,

purificación y parcial caracterización de un complejo de amilasa producido por A.

niger y uso potencial en formulación de detergentes. Se diseño un cultivo con

distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que mejor resultados

otorgará en cuanto a producción de amilasa se refiere. Se trabajo con medio APM

5 NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2003 6 MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent formulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005.

7

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usando residuos industriales de proteína de soy y almidón como fuente de

carbono además de minerales. Se realizaron ensayos analíticos con pruebas de

DNS, iodometría y control de los parámetros de pH y temperatura. El extracto

obtenido del complejo enzimático fue comparado en tres formulaciones

comerciales de detergentes para determinar su actividad de limpieza en equipos

de hospitales, cirugía y endoscopia. Los resultados indicaron que el

microorganismos con mejor performance en la producción de amilasa fue el

Aspergillus niger con una producción de 3.9 U/ml en medio sumergido y una

actividad excelente de degradación de en el rango de 50-55ºC y un pH de 4.0.

3.2Enzima amilasa: Acción y clasificación

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como

productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de

glucosa7 Esta familia de enzimas hidrolíticas esta compuesta por a proteínas

catalíticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran

ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy

importante en la degradación del almidón en la germinación de las semillas; en

tejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en diversas especies de

microorganismos como hongos y bacterias8.

7 ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P 950

8 TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind. apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623.

8

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Como bien es conocido las cadenas de almidón están compuestas por dos

grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por

atacar los enlaces 1,4-alfa-glicosídicos en el centro de la cadena de los

polisacáridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa,

maltosa y oligosacáridos.

La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y

pequeños compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de

degradar parcialmente la amilopectina y el glucógeno debido a que no es capaz de

desdoblar los enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificación

de la cadena del polisacárido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas

y bacterias, también cumple la función de degradar los enlaces 1,4-a-glucosídicos

pero comienza su acción por el extremo libre no reductor del almidón, liberando

maltosa al igual que la enzima alfa-amilasa. La hidrólisis se detiene en los puntos

de ramificación de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina límite. La

pululanasa o isoamilasa, también perteneciente a la esta familia, hidroliza los

enlaces 1,6-alfa-glicosídicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas.

Si existe un acompañamiento general del complejo de las amilasas se puede

lograr efectiva una degradación total del almidón. 9

En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmente

se reconoce a la comisión enzimologica (E.C.) quien es el encargado de identificar

a todas y cada una de las enzimas existentes. Este instituto reconoce la enzima

alfa-Amilasa como E.C. 3.2.1.1. Su nombre sistemático es alfa-1,4-glucan-4-

glucanohidrolasa. Otros nombres comunes en el comercio y el ámbito científico

son glucogenasa y endoamilasa. Estas se caracterizan en llevar a cabo la reacción

de endohidrólisis que se sitúa de los enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos en

polisacáridos que contienen 3 o más enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos. Los grupos

reducidos son liberados en una configuración alfa. Este termino alfa, esta

9 CARRILLO Leonor. Microbiología Agrícola. 2003.Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-16-5

9

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relacionado con la configuración anomérica inicial de los grupos de azucares

liberados10.

α-amilasa bacteriana (EC 3.2.1.1). La α-amilasa hidroliza el enlace glucosídicos

interno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menos

viscosos, cuya ruptura está limitada por la presencia de los enlaces glucosídicos

a-1-6 en los puntos de ramificación de la molécula del almidón nativo

(amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen configuración a en la glucosa del

extremo reductor. Se piensa que la enzima actúa por la acción combinada de los

grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las a-amilasas obtenidas de Bacillus

subtilis var amyioliqítedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado por

molécula, que es necesario para la actividad de! enzima y que lo estabiliza en gran

medida frente a! calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de

dos horas a 85 °C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilización de ácido

clorhídrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formación de

productos de reversión. Debido a que los almidones de patata y de cereales

cerosos no pueden tratarse por gelatinización, se les somete a un proceso en dos

etapas, en el que se añade una segunda dosis de enzima y se continúa et

tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa11.

La enzima Beta-amilasa es reconocida en la comisión enzimológica como E.C.

3.2.1.2., su nombre sistemático corresponde al de 1,4-alfa-D-glucan

maltohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis de los enlaces

alfa-1,4-glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1

pasándolo de la configuración alfa a la beta; así como de remover las unidades de

maltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadena

polisacárida. Los grupos sulfihidrilos son esenciales para la actividad, por lo que la

10 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]

11 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.319

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enzima se inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales. 12. Su

producto es beta-maltosa.

Beta-amilasa ha sido descrita como una proteína abundante la cual se puede

encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de almacenamiento de almidón y

órganos de plantas13. Muchos Cereales contienen también la enzima beta-amilasa

y alfa-amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupa

aproximadamente 30% de contenido total de proteínas sintetizadas durante la

germinación. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el

punto de inactivación que presentan a un pH determinado. La enzima alfa-amilasa

es inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0. Mientras que a este mismo rango la

beta-amilasa es estable. La enzima E.C. 3.2.1.2., es inactivada en un pH alrededor

de 6.0-7.0, y en caso reciproco las alfa-amilasa son estables bajo estas

condiciones14.

Otra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la Glucoamilasa también

reconocida como amiloglucosidasa. En la nomenclatura internacional esta

identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucano

glucohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de

polisacáridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que están de manera

residual después de haberse expuesto la cadena a la acción de alfa y beta

amilasa15. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el

12 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11.

13 OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Jana´ına A.; PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during banana ripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology. p 41

14 OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases from malted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006. Carbohyfrates Polymers. P 72.

15 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]

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almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas. La

enzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificación

del almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La acción de la enzima causa

inversión de la configuración, produciendo beta-glucosa. Las glucoamilasas son

inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH 4 y 5.5, y

temperatura alrededor de 55-65 0C. La rata de reacción cae rápidamente a

medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre

almidones previamente sometidos a licuefacción16.

Amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3). Las amiloglucosidasas (glucoamilasa, a-amilasa o

a-1-4 glucohidrolasa) catalizan la etapa de hidrólisis de los enlaces α-1-4 del

almidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de β-glucosa a partir del

extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también se

hidrolizan, pero mucho mas lentamente, formándose un jarabe de glucosa, un

contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacá-

ridos grandes. El enzima es capaz de hidrolizar también, aunque lentamente, los

enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para

obtener glucosa pura sólida. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la in-

dustria de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4,5

y con períodos de incubación de 48-92 horas, para transformar las dextrinas

formadas por la a-amilasa en glucosa. El calcio la estabiliza frente a la desna-

turalización por el calor o los álcalis, y la hidrólisis puede llevarse a cabo fácil -

mente añadiendo el enzima soluble al almidón una vez que la a-amilasa ha rea-

lizado del 15 al 30 % de la hidrólisis posible17.

Una ventaja particular en el uso de enzimas en lugar de HCl para la hidrólisis del

almidón es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las

16 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11

17WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.320

12

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proteínas contaminantes no se hidrolizan hasta aminoácidos, que podrían dar

lugar a reacciones de pardeamiento. Después de la sacarificación con

amiloglucosidasa, el jarabe resultante se filtra para eliminar proteínas y grasas y

se purifica con columnas de carbón activo seguido de otras con resinas de

intercambio iónico.

La glucoamilasa es un enzima extracelular producido por diversas especies de

Aspergillus o Rhizopus. La amilogluosidasa de Rhizopus puede separarse en

isoenzimas con propiedades semejantes a los isoenzimas de A. niger. El enzima

es una glicoproteína que contiene mañosa, glucosa, galactosa y ácido urónico, y

tiene un pH óptimo de 4,3-4,5. Una de sus desventajas es su relativa falta de

actividad frente a los enlaces α-1-6, lo que hace necesario el uso de grandes dosis

o de grandes períodos de incubación para lograr el grado de hidrólisis deseado.

Por tanto, se ha propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzima

desramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de dextrosa del 1 al 2

%, a pesar de llevar a cabo la reacción a pH 5,5-6,0, en el que la amiloglucosidasa

es menos activa18.

El resto de la cadena del polisacárido es atacado por la enzima isoamilasa o

pululasa, reconocida oficialmente como E.C. 3.2.1.68. Participa en la reacción de

hidrólisis de polisacáridos específicamente en los enlaces 1,6-alfa-D-glucosidicos;

su nombre sistemático es glucógeno alfa-1,6-glucoanohidrolasa. Su actuar es

directamente sobre la amilopectina, glucógeno y dextrinas, pero es incapaz de

hidrolizar el pululano y las alfa-dextrinas limite. Su misión en participar en la

reacción de hidrólisis de ramificación que contengan enlaces 1,6-alfa-glucosidicos

por lo que también se le conoce como enzimas desramificadora. Su nombre

sistemático es glucógeno 1,6-alfa-D-glucanohidrolasa19. El único producto de

18 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.32019 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]

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reacción es maltosa. La temperatura óptima está alrededor de 45 0C y el pH entre

4 y 5

3.3 Usos y aplicación de las enzimas

Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos,

a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de

trabajo). Además, lograr más material procesado con el mismo equipo y menos

consumo de energía también ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria

alimentaria nos ofrece la ventaja de:

• Reducir viscosidad (hidrólisis).

• Mejorar extracciones (degradación de pectina).

• Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).

• Causar separaciones (separación del suero en queso).

• Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos.

• Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos subproductos

indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de

producto.

• Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto único

(jarabe de alta concentración de fructosa).20

Las enzimas amilasas por su capacidad hidrolítica han tenido gran significancia en

las últimas décadas en diversas industrias que han visto una mejor manera de

optimizar sus procesos aplicando técnicas biotecnológica extensivas basadas en

enzimas. Industrias como la panadería, repostería, alimentaria, textilera,

cervecera, papel, azucarera entre muchas más han visto en estas proteínas una

gran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el

20 MUNDO ALIMENTARIO. Aplicación de las enzimas en la producción industrial. Consultado en: http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de febrero de 2008]

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mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de hidrolisis

química en la industria del almidón. Esto se debe a una característica esencial

dentro de esta familia de proteínas. La termoestabilidad de esta enzima,

industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos

procesos.21

3.4 Procesos industriales que aplican enzimas22

3.4.1 Industria del almidón y del azúcar. Dependiendo de las enzimas

utilizadas, a partir del almidón se pueden obtener jarabes de diferente composición

y propiedades físicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de alimentos tales

como gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas, alimentos para

bebés, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas básicas en la conversión

enzimática del almidón: licuefacción, sacarificación e isomerización.

3.4.2 Productos Lácteos. La aplicación de enzimas en el procesamiento de

leche está bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la producción de

queso, que tal vez representa el empleo más antiguo de enzimas en alimentos.

Otras enzimas que participan en la producción de quesos son las lipasas

presentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso, proporcionando

cambios característicos en el sabor. Para algunos quesos se pueden aumentar las

lipasas naturales, añadiendo enzima extra. Por otra parte, también se recomienda

agregar enzimas exógenas de tipo proteolítico para acelerar el proceso de

maduración de algunos quesos.

3.4.3 Molineros y Panadería. El uso de enzimas en estas industrias se debe

principalmente a la deficiencia en el trigo y en la harina, de las enzimas

naturalmente presentes. El contenido de a amilasa de la harina depende de las

21 ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P 950.22 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13

15

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condiciones de crecimiento y de cosecha. En climas húmedos la tendencia será a

tener alta actividad de a amilasa debido a germinación de los granos, en tanto que

en climas secos el nivel de a amilasa será bajo debido a escasa germinación. Esto

conlleva a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes de

harina.

3.4.4 Transformación del almidón.23Los procesos encaminados a la producción

de edulcorantes están basados en la degradación del almidón y han sido

empleados durante muchos años, aunque originalmente se llevaba a cabo

mediante hidrólisis catalizada por ácidos. Durante el curso del desarrollo y la

expansión de la transformación industrial del almidón, se ha producido un cambio

de la catálisis acida por el uso de enzimas. La elevada especificidad de estas

reacciones enzimáticas, acopladas con la gran actividad de las preparaciones

disponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y además

la formación de derivados indeseables se ha minimizado.

De todas las aplicaciones a escala industrial, la más afortunada es la producción

de jarabe de maíz con fructosa elevada (HFCS). El propósito de este proceso es

obtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de una

materia prima de bajo precio (almidón de maíz). Esta conversión requiere el uso

secuencial de tres enzimas. En primer lugar, el almidón (un polímero de la D-

glucosa) se degrada parcialmente, empleando alfa-amilasa microbial. Este

material es degradado posteriormente para rendir una solución donde el

carbohidrato presente está en forma de D-glucosa en una concentración del 94-96

%. La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentación y

farmacéuticas, pero su uso está restringido debido a su solubilidad limitada a

concentraciones elevadas y a su bajo poder edulcorante comparado al de la

sacarosa. Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una

23 GACESA, Peter; HUBBLE, John. Tecnologia de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza-España. 1990. p.111

16

Page 17: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosa

isómerasasa.

3.4.5 Productoras de Jugos de Frutas.24 Las primeras enzimas empleadas en

las industrias de jugos de frutas fueron las enzimas pécticas para la clarificación

del jugo de manzana. Actualmente las enzimas pécticas se usan en el

procesamiento de muchas otras frutas, junto con amilasas y celulasas. Durante el

procesamiento de los jugos cuando se desintegran los tejidos vegetales, parte de

la pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solución,

parte se satura con el jugo y parte permanece en las paredes celulares. Las

enzimas pécticas se usan para facilitar el prensado, la extracción del jugo y la

clarificación ayudando a la separación del precipitado floculante.

3.4.6 Fermentación Alcohólica25 El almidón proveniente de maíz, patatas,

cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento previo con

hidrolasas, con objeto de producir su licuación y sacarificación, antes de hacerlo

fermentar mediante levaduras u otros organismos para obtener alcohol utilizable.

Estas enzimas son α y β amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse en

forma de malta (cebada germinada), aunque este proceso es caro. La malla no

sólo contiene α y β amilasas sino también enzimas que degradan los enlaces α-1-

6 de las dextrinas limite. Recientemente se han añadido enzimas bacterianas para

suplementar las enzimas endógenas asociadas con el almidón. Por ejemplo, en

los procesos discontinuos americanos para la producción de alcohol para bebidas,

la adición de a-amilasa bacteriana durante la cocción para hidrolizar parcialmente

el almidón gelatinizado representa una ventaja, puesto que reduce la viscosidad

de la mezcla facilitando su agitación y mezclado. Posteriormente, la mezcla se

enfría y después se añade a-amilasa bacteriana para continuar la hidrólisis, que se

24 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 1425WISEMAN, John. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p. 335.

17

Page 18: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

completa mediante la adición de amiloglucosidasa. Después se inoculan en la

mezcla levaduras, de forma que continúe la sacarificación y fermentación

simultáneamente hasta el agotamiento de la dextrosa, y se destila el alcohol. La

producción comercial de alcohol industrial, destinado a usarse como carburante en

motores de combustión interna se ha incrementado rápidamente en las últimas

décadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentación de !a caña

de azúcar o de la yuca. También se ha propuesto el empleo de células

inmovilizadas. Se ha obtenido etanol a partir de melazas de caña diluidas, no

estériles, durante medio año.

3.4.7 Industria Cervecera. La cebada se utiliza tradicionalmente para la

fabricación de bebidas alcohólicas como la cerveza. En su producción se deben

considerar dos operaciones distintas: la maltería y la cervecería. La preparación

de la malta se logra por germinación de la cebada, durante la cual se incrementa

el contenido de alfa-amilasa. Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmente

presentes en el grano actúan sobre el almidón produciendo dextrinas y maltosa,

que sirven como sustratos para la fermentación posterior. La sacarosa es

hidrolizada por al enzima invertasa la cual queda divida en una molécula de

glucosa y una molécula de fructosa, ambas podrían ser asimiladas de forma

glucolitica. También las enzimas cumplen la función de transportar la maltosa y la

maltotriosa a las células de las levaduras para posteriormente ser convertidas en

glucosa por la maltasa26.

Otra aplicación patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el uso

de la enzima α-acetolactato descarboxilasa, aislada de Enterobacter aerogenes.

Esta proteína es capaza de desintegrar o eliminar el α-acetolactato y α-

acetohidroxibutirato de la cerveza recién fermentada en 24 horas a 10 °C para de

este modo conseguir niveles de Diacetilo y 2,3-Pentanodiona por debajo de los

26 CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com. consultado 05 de noviembre de 2007.

18

Page 19: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

umbrales permitidos para productos de este tipo. Se consigue con ello grandes

ahorros.27

Hay muchas enzimas disponibles comercialmente para el proceso cervecero, pero

todas ellas caen en tres categorías: proteasas, amilasas y glucanasas. La acción

de estas enzimas durante las primeras etapas consiste en mejorar la licuefacción

del almidón, regular el contenido de azúcar y nitrógeno, mejorar la extracción,

facilitar la filtración y controlar la turbidez. En la filtración del mosto reducción de

las gomas y de la viscosidad. En la ebullición, control de la turbidez, eliminación

final del almidón. En esta etapa se inactivan las enzimas. Durante la fermentación

y maduración la adición de enzimas sirve para controlar la turbidez.

3.4.8 Procesamiento de Carne. Las enzimas importantes para ablandar carne

son proteasas de origen vegetal o de microorganismos (Bacillus subtilis y

Aspergillus oryzae). Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o se

trata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un franco

ablandamiento sin provocar una proteólisis importante.

3.4.9 Industrias de Grasas y Aceites.28 El uso de enzimas en las industrias de

aceites y grasas es muy bajo, aunque se encuentran disponibles enzimas que

pueden resolver algunos problemas, por ejemplo minimizar los subproductos

indeseables. Las enzimas también se pueden usar para producir aceites y grasas

novedosas. Lipasas específicas, pueden seleccionar los ácidos grasos de algunas

posiciones del triglicérido, para incorporar determinados ácidos grasos, sin

cambiar los de otras posiciones. De tal manera que es posible modificar por

interesterificación el contenido de ácidos grasos, o por transesterificación lograr el

reordenamiento de algunos de ellos. Por ejemplo la mantequilla de cacao se

27 CASTAÑE,F.X.; DAMM, S.A.. Los tanques cilindro.-conicos y el tiempo de guarda de la cervzeza. Industria cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.

28 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

19

Page 20: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

requiere en la producción de chocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costo

fluctúan ampliamente. Sin embargo, aceites como el de palma son baratos y se

encuentra buen abastecimiento. Lo que se plantea es modificar el aceite de palma

por reacción con ácido esteárico mediante interesterificación enzimática. La grasa

resultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao.

3.5Producción y sustrato

Fuentes de enzimas. Las células microbianas son la fuente usual de enzimas

para uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales y

plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papaína, ficina y

bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina,

empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayoría de los enzimas

microbianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendo

una docena de hongos, pero se ha calculado que sólo aproximadamente el 2 ^o

de los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiados como fuente

de enzimas29.

Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasa

pancreática y tripsina) debido a que éstas pueden ser reemplazadas por otras

similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos,

aunque catalíticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades

que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicación. Los recientes avances en

este campo han permitido la adaptación de las técnicas del ADN recombinante

para posibilitar que ciertos genes de mamíferos sean clonados en las bacterias o

levaduras idóneas, facilitando así la producción de enzimas originariamente de

animales por medio de la tecnología convencional de la fermentación.

29 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.281

20

Page 21: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Las plantas también han sido fuente tradicional de un cierto número de enzimas. A

partir del látex producido por la papaya, higuera, piña y, en menor grado, otras

especies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la

ventaja de que su látex es fácil de obtener, principalmente a partir de los frutos y

utilizando mano de obra no cualificada.

Las enzimas microbianas son más útiles que los derivados de las plantas o

animales por la gran variedad de actividades catalíticas de que disponen, y porque

usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de forma

regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de superficie o

usualmente mediante técnicas de fermentación aeróbica de cultivos profundos,

técnica muy utilizada en la producción de antibióticos. Además los enzimas

microbianos son en general más estables que los homólogos de las plantas o

animales, y su proceso de producción es más fácil y seguro que el seguido con

plantas y animales. La manipulación genética y ambiental para incrementar el

rendimiento, o la actividad enzimática de las células haciendo a éste de interés

constitutivo30. Estas técnicas son especialmente importantes en el caso de la

actividad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en conversiones

multienzimas, cuando haya que eliminar los controles de regulación normales en

la síntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibición

por el substrato o el producto, mecanismo este último para prevenir la

sobreproducción del producto de una vía metabólica, o para obtener algunas otras

características favorables31.

Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formación del enzima y la

concentración de enzima en las células o en el caldo de fermentación para

minimizar los costos de producción de la enzima. El ideal es combinar de forma

óptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperación

30 GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1990. p.16.31 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. p.281

21

Page 22: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

y fermentación y el equipo más apropiado en buenas condiciones de trabajo.

Usualmente, las células crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados y

aireados, aunque un número significativo de enzimas importantes industrialmente

se obtienen en fermentadores sólidos o semisólidos, entre los que se incluyen la

lactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la pectinasa, una proteasa de

A. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de Mucor pusiüus32.

Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas

para usos clínicos e industriales, y acumulan productos de desecho en las

vacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimáticos y/o to-

xinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos desechos,

muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la célula, contaminando

y frecuentemente inactivando cualquier enzima extraído.

Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro de

ellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las más

comunes para las síntesis del almidón produciendo productos de bajo peso

molécula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por gran

diversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del suelo así

como bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras.

El principal genero que esta siendo tratado para la producción de dicha enzima es

el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este genero

son el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus

amyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos,

textiles, fermentación, papelería entre otros33.

32 WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p.282

33 ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organic substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150.

22

Page 23: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

También otros géneros han sido reportados en proyectos de investigación. La

especie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares entre

las cuales además de estar las amilasas se puede identificar las proteasas.

Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de enzimas34.

La inducción de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa-

1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón. La Glucosa, así como es

el producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la síntesis de

enzima como un mecanismo conocido como represión catabolitica. Sin embargo,

se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienen

como fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la producción de

amilasas35. Este hecho contrasta con los registrados en artículos de investigación

y compañías dedicadas a la producción de enzimas donde la fuente de producción

de las proteínas son microorganismos.

La producción industrial ha desarrollado técnicas de aprovechamiento de recursos

o residuos de producción de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimas

utilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos agrícolas. En años

recientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicación eficiente

del bagazo de caña de azúcar como medio de producción. Este es un subproducto

agroindustrial de extensa cadenas celulósicas. Esta es una importante fuente de

carbono que ha sido empleada en los últimos años para la producción de enzimas

y a su ves la fermentación de azucares para la elaboración de etanol. Se ha

identificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio y

sintetizar alfa-amilasa es el Bacillus subtilis36.

34 SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 94.

35 NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics of Aspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.5

36 RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource

23

Page 24: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Los medios de cultivo han facilitado para los microorganismos el desarrollo de

enzimas con propiedades físico-químicas muy deseables. La producción de alfa-

amilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientos

de fermentación. La concentración de metabolitos para el crecimiento de los

agentes microbiales es importante. Influye directamente la composición del medio

así como las fuentes de carbono, de nitrógeno y el contenido de sales

inorgánicas37.

En cuanto a términos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar la

producción de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se ha

demostrado que la temperatura esta ligada directamente a la velocidad de

reacción de la enzima, menor viscosidad en el sustrato y disminución de la

contaminación microbiana. Los microorganismos apropiados para la producción de

enzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento,

adaptación a nutrientes relativamente baratos y sin necesidad de inductores.

Además, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea fácil

aislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formación concomitante

de metabolitos tóxicos o inmunogénicos38.

También puede ser una estrategia útil la de seleccionar cepas que hiperproduzcan

enzimas a partir de organismos genéticamente modificados OMG que no tengan

necesidad de inductores debido a que sus centros represores están inactivos, a

que tienen una baja represión por los catabolitos, a que sufren retroinhibición o a

que tienen enzimas relativamente resistentes a la inhibición por el producto final.

Techonology. p.2

37 DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L..Application of a statistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC 16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 191

38 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985. P.271

24

Page 25: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

De hecho, a pesar de los enormes avances obtenidos recientemente en el campo

de la ingeniería genética, las técnicas clásicas de selección de enzimas son

todavía muy productivas, particularmente cuando se estudian ambientes nuevos

y/o exóticos, para buscar células microbianas que desarrollen enzimas con

propiedades exepcionales. Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos a

partir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nuevo azúcar, la

isomatulosa, de forma muy productiva a partir de una bacteria patógena del

ruibarbo. Muy recientemente se han hecho descubrimientos más excepcionales si

cabe, por ejemplo, los microorganismos que crecen a unos 250 ºC en fuentes

volcánicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas extremadamente

estables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora la

madera, que es capaz de degradar la celulosa y de fijar el nitrógeno39.

En resumen, la mayoría de los enzimas empleados comúnmente en la industria

son de origen microbiano y se producen por fermentación sumergida aerobia

convencional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento que

la fermentación en estado sólido. Se sabe mucho acerca de la selección de cepas

de organismos y condiciones de cultivo, aunque menos sobre la regulación de la

síntesis, degradación y secreción de la enzima por el organismo productor. Estas

enzimas son con frecuencia extracelulares, lo que facilita su aislamiento y

purificación.

4. Objetivos

4.1General

39 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985. P.272

25

Page 26: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Obtener amilasa microbiana por fermentación líquido para aplicación en procesos

agroindustriales de alcohol carburante a base de almidones.

4.2Específicos

• Identificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante técnicas

de aislamiento microbiológicas

• Determinar la cinética del crecimiento de los microorganismos aislados

mediante fermentación en estado líquido.

• Comparar la actividad del complejo enzimático obtenido con respecto a la

actividad de una enzima comercial STARGEN 001.

5. Metodología Propuesta:

5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismos

Los microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie

a contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días. Para ello se

realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrán en

bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén ejerciendo un

proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con 10% de harina

de yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al cabo del cual se

realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los

microorganismos con mayor capacidad de degradación, y se sembraran en medio

solido de YPS, para su purificación e identificación.

26

Page 27: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

5.2.1 Medio Sólido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) .40. De acuerdo con

distintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán cada uno

de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas

sobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para descartar contaminación

ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estéril sobre medio

el mismo cultivo.

5.2.2 Medio para fermentación. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1

Litro, de medio de cultivo YPS líquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de

levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4

7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y

harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarán a 110°C durante

15 minutos y se colocarán en agitación orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5

días.

El medio de cultivo para fomentación será inoculado con un complejo de dos

microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solución del complejo microbial.

5.2.3 Cuantificación de Biomasa del complejo41. Se hará determinación por el

método de peso seco y el método de proteínas.

Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5 días.

Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105

grados.

40 ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005. 41 KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and b-galactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152

27

Page 28: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Determinación de proteínas42. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El

proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado de las

muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le

determinara proteínas totales por el método de Biuret. Las muestras se

leerán a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos se

compararan con una curva patrón de BSA, para determinar la

concentración de proteínas presentes en la muestra.

5.2.4 Medición de producto43. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3

horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5 acido

dinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para

maltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y

maltosa respectivamente.

5.2.5 Medición de sustrato44. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentación

cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se

realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos

se compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca para

determinar la concentración presente de sustrato en la muestra.

5.2.6 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones de

proteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o BSA

de Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 % y se

diluirán como se muestra en la Tabla 3.

42 SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007. p. 99843 ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de 2006. p.951

44CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989.

28

Page 29: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Tabla 3. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Biuret.

Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una λ. = 550

nm

5.2.7 Curva de Calibración para Maltosa y Glucosa. Se establecerá una curva

con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de

las muestras de fermentación a unidades de actividad enzimática de la amilasa,

es decir, la liberación de un micromoles de azúcar reductor, calculado como

maltosa o glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo (ver Tabla 4).

Tabla 4. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Maltosa.

Tubos Solución (ml)

1 2 3 4 5 6

DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0Solución Estándar Maltosa o Glucosa al 0,5% 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0H2O 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

A las solución de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrán en

agua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hasta

completar 10 ml según la tabla, las lecturas se realizaran a λ = 520 nm para

maltosa y a 540 nm para glucosa

El complejo enzimáticos obtenido en cada muestra en los diferentes días, se

leerán a la misma longitud de onda que las curvas de calibración. Para ello se

realizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas,

glucosas y proteínas.

29

Tubos Solución (ml)

1 2 3 4 5 6

Biuret 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0Solución Estándar BSA 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0H2O 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

Page 30: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

5.2.8 Cinética del complejo enzimático. El comportamiento enzimático del

complejo obtenido por la fermentación líquida se comparara con el complejo

comercial de amilasa (stargen 001), determinando los factores que afectan la

acción catalítica del complejo de amilasas, analizándolos bajo un modelo

superficie de respuesta, con diseño compuesto central: 2^3 + principal, de

acuerdo con los niveles y factores mostrados en la tabla 5. Los datos obtenidos se

analizaran con el software estadístico Statgraphics versión 5.1

Tabla 5. Factores y niveles para evaluar la actividad enzimática

Factores UnidadesNiveles

Inferior SuperiorDosis ml de caldo enzimático/g de pulpa base seca 0.5 1.0pH Adimensional 4 5.5Temperatura ºC 30.0 50

6. Resultados Esperados

La base del estudio, análisis, desarrollo y aplicación de este proyecto es producir

un complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de determinar

la aplicabilidad de dichas proteínas en los procesos agroindustriales del

departamento. Este complejo servirá como base para la planeación de muchos

procedimientos industriales como la hidrólisis del almidón, el cual presenta

elevados costos en las empresas del departamento de Córdoba, especialmente

plantas de biocarburantes.

7. Estrategia Comunicación:

30

Page 31: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

Los resultados de este proyecto serán editados mediante formatos de informes o

trabajos de investigación en revistas y ponencias en encuentros de investigacion.

Además,

8. Estrategias con el medio

A través de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o externas,

es un medio apto para la promulgación del objeto, método, resultados y alcance

del estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar el propósito de

llevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de los efectos que

traería consigo aplicarlo en escala industrial.

9. Cronograma de actividades

Tiempo

Actividad

Meses

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Recopilación de bibliografíaTajado de chips de yuca y selección de lugar para contaminación microbialAislamiento e Identificación de microorganismosPreparación de los medios de cultivo solido y liquidoMuestreo y análisis del medioEstudio de la cinéticaComparación de cinética con STARGEN 001Interpretación de los resultadosPublicación de informe final

31

Page 32: Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

10.Bibliografía

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11. Usuarios Directos e Indirectos

Entre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentran:• Plantas de alcohol carburante• Grupos y centros de investigaciones

12. Posibles Pares Evaluadores

Nombres y Apellidos

Cargo Institución Teléfono

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D. Presupuesto

Tabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION

RUBROSFUENTES

TOTALFacultad de Ingeniería Agroindustrial

Patrocinador

PERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400EQUIPO $ 1.480.000 $ 30.864.040 $ 32.344.040MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841VIAJESBIBLIOGRAFIA *SOFTWAREPUBLICACIONES*SERVICIOS TECNICOSCONSTRUCCIONESMANTENIMIENTOADMINISTRACIONOTROS*

TOTAL $ 47.196.281

Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS

RUBROS AÑO 1 AÑO 2 AÑO 3 TOTALPERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400EQUIPO $ 32.344.040 $ 32.344.040MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841VIAJES

BIBLIOGRAFIA

SOFTWARE

PUBLICACIONES

SERVICIOS TECNICOS

CONSTRUCCIONES

MANTENIMIENTO

ADMINISTRACION

OTROS

TOTAL $ 47.196.281

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Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL Participante

NombreFORMACION FUNCION

DEDICACION HORAS

DEDICACIONNo. MESES

RECURSOS(en pesos colombianos)TOTAL

FUENTE 1Eder Durango

BallesterosMsC. Biotecnología Investigador Principal 4. 12 Fac.de Ing. Agroindustrial $ 4.665.600

Alfonso Bautista Jiménez

MsC. Microbiología Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000

Ibeth Cepeda JiménezEsp, Ing. De alimentos. Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000

Héctor Tobón Guzmán Ing. Agroindustrial Auxiliar 6. 12 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 5.788.800 TOTAL $ 12.398.400

Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR

EQUIPO JUSTIFICACIONRECURSOS

TOTALPatrocinador

Plancha de calentamiento marca schott - modelo slk2- con placa en cerámica

Preparación de muestras y pruebas de análisisX

$ 620.000 Termómetro digital Censar temperatura de las muestras X $ 863.040 Espectrofotómetro Análisis y determinación de compuestos en muestra X $ 25.000.000Nevera-congelador de 9 pies Conservación de muestras X $ 700.000 Cronometro digital. Cassio modelo hs-3 Control de tiempo en las pruebas X $ 81.000 Agitador magnetico Homogenización y preparación de medios X $ 2.100.000 Refractómetro digital portátil Medición de alcohol X $ 1.500.000 TOTAL $ 30.864.040

Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR

EQUIPO JUSTIFICACIONUNIDAD(ES) A LA

CUAL PERTENECE EL EQUIPO

Horas de asignación al

proyecto

Valor hora

Valor total

Agitador orbital Agitación de los medios de cultivo Lab. De biotecnología 8 $ 800.000Centrífuga eba20 Separación de sólidos Lab. De biotecnología 2 $ 280.000pHmetro Medición de ph de las muestras y soluciones Lab. De biotecnología 1 $ 150.000Balanza analitica Pesaje de reactivos para soluciones Lab. De biotecnología 2 $ 250.000TOTAL $ 1.480.000

Tabla 6. DESCRIPCIONDE LOS MATERIALES A UTILIZAR

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MATERIAL JUSTIFICACIONRECURSOS

TOTALUnidades

AcadémicasPatrocinador

Erlenmeyer 250 ml Recipiente para cultivos $ 2.900,00 $ 2.900,00 Erlenmeyer 600 ml Recipiente para cultivos $ 4.060,00 $ 4.060,00 Erlenmeyer 1000 ml Recipiente para cultivos $ 348,00 $ 348,00 Transferpipetas de 100 a 1000 Control de muestras tomadas $ 2.320,00 $ 2.320,00

glucosa anhidra (500g)Preparación de estándares para curvas de calibración

$ 389.760 $ 389.760

maltosa (100g)Preparación de estándares para curvas de calibración

$ 121.800 $ 121.800

BSA (500G)Preparación de estándares para curvas de calibración

$ 136.787 $ 136.787

agar pdaMultiplicación y aislamiento de microorganismos

$ 206.480 $ 206.480

extracto de levadura (500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 215.667 $ 215.667 sulfato acido de potasio(250g) Suplemento para el medio de cultivo $ 275.500 $ 275.500 sulfato de magnesio heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 313.200 $ 313.200 sulfato de manganeso tetrahidratado(100g) Suplemento para el medio de cultivo $ 53.522 $ 53.522 sulfato de zinc monohidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 266.800 $ 266.800 sulfato de hierro heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 232.000 $ 232.000 cloruro de cobalto hexahidratado(125g) Suplemento para el medio de cultivo $ 143.376 $ 143.376 sulfato de amonio(1kg) Suplemento para el medio de cultivo $ 89.320 $ 89.320 TOTAL $ 2.453.841

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