UNIVERSIDAD AUTONOMA DE ZACATECAS FRANCISCO GARCA SALINAS REA DE CIENCIAS DE LA SALUD UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICAS P.E. DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO QUINTO SEMESTRE GRUPO C ALFA AMILASA SALIVAL

Presentan ABRAHAM LOPEZ ARELLANO CARLOS ALBRTO JASSO JASSO MARTIN MARTNEZ HERNNDEZ

Determinar las condiciones ptimas en las cuales la amilasa salival tiene su mayor actividad enzimtica. Cuantificar la glucosa producida por la enzima.

AMILASA SALIVAL

ALMIDON

GLUCOSA

La amilasa salival es una enzima que posee la misma especificidad que la amilasa del jugo pancretico: reduce el almidn a molculas de oligosacridos. El pH ptimo de la amilasa salival es de alrededor de 7. pero la enzima es activa a un pH de entre 4 a 11.

La

digestin de los carbohidratos comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan con la milasa salival (ptialina) que degrada los enlaces alfa 1,4 del almidn liberndose Maltosa, lucosa y dextrinas de almidn que poseen todos los enlaces alfa 1, 6 de la amilopectina.

El

almidn es una mezcla de dos polisacridos, amilosa (10-20%) y amilopectina (80-90%), ambos formados por unidades de glucosa.

Pesar 2 g de lmidn

Poner a calentar 20 mL de agua

Disolver el almidn en 20 mL de agua fra

Incorporar el almidn disuelto al agua hirviendo durante 3 min.

Llevarlo a la tarja y esperar que enfri

Colocar la solucin en un matraz de aforo de 100 mL y aforar.

pH=7

Realizar clculos para preparar soluciones buffer de:

pH= 3

pH= 9

Amilasa alival

pH optimo

[E] optimo

[ ] optimo

Agregar a 3 tubos 2 mL de solucin Buffer a diferentes pH 3,7,9.

Agregar 2 mL de solucin buffer de pH 7

Agregar 2 mL de solucin buffer de pH 7

Agregar 2 mL de Almidn al 2%

Agregar 2 mL de Almidn al 2%

ariar la concentracin del sustrato

ariar la temperatura

Agregar 2 mL de Amilasa alival

ariar concentracin enzimtica

Agregar 2mL de la enzima

Agregar 2mL de la enzima

Ponerlos a un bao maria de 37 C

Ponerlos a un bao maria de 37 C

Ponerlos a un bao maria de 37 C

Temperatura adecuada

Tiempo de reaccin

Agregar 2 mL de solucin buffer de pH 7

Agregar 2 mL de solucin buffer de pH 7

Agregar 2 mL de sustrato

Agregar 2 mL de sustrato

Ponerlos a un bao maria de 37 C

Agregar 2mL de la enzima

Pr

L

l

Agregar a una placa de porcelana y una gota de lugol

Aadir una gota de la reaccin contenida en el tubo

Observar el color y parar hasta que se haya hidrolizado

Repetir los pasos para los dems tubos de ensaye

Colocar 7 tubos de ensaye de 10x100 en una gradilla y marcarlos del 1-7 para identificarlos

colocar en una celda la solucin blanco (tubo #1) y calibrar el espectrofotmetro.

en otra celda colocar la muestra standar y anotar la absorbancia registrada en el espectro.

adicionar a cada tubo 1000 microlitros del reactivo(glucosaLS reactivo enzimatico)

retirar los tubos del bao maria y lllevarlos al espectofotometro(ahi se llevara a cabo la lectura de absorbancia a 505 nm)

despus se irn colocando cada muestra que se tiene en lo los tubos 3-7 y se tomaran las lecturas correspondientes a cada uno.

llevar estos tubos a bao maria por 10 minutos, con temperatura de 37C

estos tubos estaran dentro del bao maria 37 C otros 5 minutos aprox

con las absorbancias ya determinadas podremos calcular la cantidad de glucosa que tiene cada muestra y saber cual es el factor ptimo

despues adicionar al tubo #2, 10 microlitros de glucosa solucion standar

en los tubos del 3-7 se adicionaran 10 microlitros de las muestras que contengan la enzima(en el tubo que corresponda)

Datos del reactivo: Grupo Mer Lab Glucosa-LS Qumica Clnica Cdigo 8001502 GLUCOSA-LS

Presentacin 1x 250ml Glucosa solucin estndar (100ml/dl) Glucosa LS reactivo enzimtico.

100 Factor= Solucin Estndar

Tubos pH [E] [ ] Temperatura Tiempo Lugol

1 3 2ml 2 mL 37 C 46 seg hidrolizo

2 7 2 mL 2 mL

3 9 2 mL 2 mL

15seghidrolizo

82 seg hidrolizo

tubo

1

2 2ml

3 2ml

4 2ml

5 2ml

Solucin buffer 2ml ph 7 T centigrados 37

37

37

37

37

Concentracin 0.5ml de enzima

1ml

1.5ml

2ml

2.5ml

Concentracin 2ml de sustrato

2ml

2ml

2ml

2ml

Lecturas de AbsorbanciaNumero de tubo Absorbacias a 505 nm 1 2 3 4 5 0.005 0.019 0.020 0.060 0.047 0.004 0.017 0.020 0.063 0.047 0.006 0.019 0.020 0.062 0.046 Promedio de absorban cias 0.005 0.018 0.020 0.061 0.046Cantidad de glucosa en mg/dl

3.90625 14.0625 15.625 47.65625 35.9375

ABSORBANCIAS VARIACION ENZIMA

0.07 0.06 0.05 0.04

ABSORBANCIAS ARIACION ENZIMA 0.02 0.01 0 2 AB 4 5 RBANCIAS ARIACI N ENZIMA

3

1

0.03

tubo Solucin buffer pH 7

1 2ml

2 2ml 37 2ml

3 2ml 37 2ml

4 2ml 37 2ml

5 2ml 37 2ml

T 37 centigrados Concentrac 2ml in de enzima Concentrac 0.5ml in de sustrato

1ml

2ml

3ml

4ml

Lecturas de AbsorbanciaNumero de tubo Absorbacias a 505 nm Promedio de Cantidad de glucosa absorbancias en mg/dl

1 2 3 4 5

0.001 0.003 0.079 0.054 0.032

0.0030 0.003 0.079 0.059 0.033

0.003 0.003 0.079 0.060 0.032

0.002 0.003 0.079 0.057 0.032

1.5625 2.3437 61.7187 44.5312 25.2604

ABSORBACIAS VARIACION SUSTRATO

0.08 0.07 0.0

0.05 0.04 0.03 0.0 ABSORBACIAS ARIACION SUSTRATO

0

3 4 5

ABSORBACIAS ARIACION SUSTRATO

0.0

tubo

1

2

3

4

5

Solucin buffer 2ml ph 7 T centigrados 20

2ml 30 2ml 2ml 1.32 min

2ml 37 2ml 2ml 46 seg

2ml 40 2ml 2ml

2ml 50 2ml 2ml

Concentracin 2ml de enzima Concentracin 2ml de sustrato Tiempo 1.30 min

1.40 min 1.55min

Tubos pH [E] [S] Temperatura Tiempo Lugol Glucosa

1 7 2ml 2ml 37 El necesario 15 seg 71.78 mg/dL Tubos 15 seg Absorbancia 0.229

Lectura de Absorbancia

Discusin La enzima que utilizamos fue la amilasa salival y un sustrato de almidn, como todas las enzimas sta tiene sus condiciones ptimas en donde su actividad enzimtica es mxima, por lo cual utilizamos procesos en los cuales variamos estas condiciones para determinar el punto ptimo en cada condicin en la cual esta actividad enzimtica era mayor.

Variando los distintos factores que modifican la actividad enzimtica de la alfa amilasa salival pudimos determinar las condiciones ptimas a las que trabaja de mejor manera.

Berne Y

Levy Fisiologia. Matthew N. Levy,Bruce M. Koeppen, Bruce A. Stanton. Pg-452 Elsevier Espaa, 2006- 836 pg. Cox M. M. y Nelson, D.L. (2006). Lehninger. Principios de Bioqumica. Barcelona. Editorial Omega