OBTENCIN DE METABOLITOS DE INTERS INDUSTRIAL PARA LA SALUD

AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO (Mini-prep)Plasmid DNA Isolation (Mini-prep).

Castillo Rojano E., Garca Rodrguez Martha V., Hurtado Romero G., Nstor Estrada J.Mayorga Reyes L., Gutirrez Magdaleno G.

Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud. Depto. de Sistemas Biolgicos. Licenciatura en Qumica Farmacutica Biolgica. Universidad Autnoma Metropolitana- Xochimilco, Calzada del Hueso Nm. 1100, Col. Villa Quietud, Delegacin Coyoacn, 04960, D.F. Mxico.

Resumen

El DNA plasmdico recombinante presente en una bacteria se asla por un mtodo rpido y sencillo llamado miniprep que consiste en la lisis bacteriana, precipitacin de protenas y DNA genmico, y finalmente precipitacin del DNA plasmdico. En esta prctica se obtuvo el plsmido mediante lisis alcalina el cual se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmdico. El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS produce la precipitacin de gran parte de las protenas. El tratamiento con RNAsa elimina el RNA as como valores de pH altos capaces de desestabilizar la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal y las protenas, y libera el ADN plasmdico al sobrenadante por lo tanto el aislamiento se completa con diferente grado de superenrrollamiento que se puede visualizar tras la separacin por electroforesis.

Palabras clave: DNA plasmdico, lisis alcalina, electroforesis, eficiencia de la purificacin

1. Introduccion Esta tcnica hace referencia a la extraccin de ADN de naturaleza plasmdica de un cultivo bacteriano.Existen diversos mtodos para el aislamiento de plsmidos. Las tcnicas de Miniprep o mini preparaciones de plsmidos, permiten la recuperacin de plsmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las clulas con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuracin superenrrollada del plsmido se mantiene estable. La lisis alcalina es el mtodo mayormente utilizado para el aislamiento de plsmidos circulares proveniente de clulas bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos bsicos. Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante centrifugacin. Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin mediante fragmentos de la pared celular del husped. Resuspender las clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa. Lisar las clulas con NaOH y SDS. Unin de las hebras de DNA y remocin de contaminacin mediante el acetato de potasio. Precipitacin del DNA plasmdico mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio). Enjuague del material gentico con EtOH al 70%. Resuspender el material gentico. Para obtener DNA plasmdico ste debe ser replicado en una clula anfitriona. Con frecuencia se utilizan cepas dh5- de E. coli por las facilidades que ofrecen para su manipulacin y por ser un organismo muy estudiado. El cultivo bacteriano debe provenir de una sola colonia, la cual debe ser cultivada en 5 ml de medio lquido utilizando el agente selectivo adecuado (antibitico). Los cultivos deben ser incubados toda la noche a 37C con agitacin a 150 rpm.Este mtodo explota las diferencias en las propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin entre el DNA plasmdico y el DNA cromosmico (fragmentado). La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS) provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura superenrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta de sal (acetato potsico), provoca que se cierre covalentemente el DNA plasmdico y la precipitacin de las protenas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potsica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosmico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y DNA cromosmico se separan por centrifugacin del DNA plasmdico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa.El objetivo de esta prctica es la obtencin del DNA del plsmido contenido en la cepa dh5- de E. coli, y anlisis mediante la separacin por electroforesis.

2. Materiales y mtodos 2.2. Soluciones y medio de cultivoSe realiz un medio de cultivo lquido LB + Ampicilina y tres soluciones: Solucin I (Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris pH 8.0 25 mM, RNAsa)Solucin II (NaOH 0.2 M, SDS 1%) Solucin III (CHCOOK + Acet. de potasio 5-3 M, ajustado a pH 5) Isopropanol grado biologa molecular2.3. Extraccin de Plsmidos (Mini-prep)Se Inocularon 3 colonias diferentes de clulas transformadas, que contienen el plsmido pyrG en 3 tubos falcon con 3 mL del medio LB + Ampicilina por 24 horas a 37C (overnight) transfiriendo 1.5 mL de la clulas en tubos estriles y se centrifugaron a 14300 rpm (revoluciones por minuto) por 3 minutos para formar un pellet de bacterias descartando el sobrenadante y resuspendiendo cada pellet en 300 l de la solucin 1 dejndolo incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. La Sol. 1 se encontraba a 4C. Despus se aadieron 300 L de la Solucin 2 a la misma temperatura mezclndola por inversin suave y se dej incubar a temperatura ambiente por 15-30 minutos. Se aadieron a continuacin 300 l de la Solucin 3 conservada a 4C mezclada por 15 minutos mediante vortex y se dej incubar en hielo por 5 minutos. Nuevamente se agit en vortex varios segundos y se centrifug por 25 minutos a 14,300 rpm.

Luego se tom el sobrenadante (en este sobrenadante se encontrar el DNA plasmdico) y con mucho cuidado y evitando tomar del sedimento, pues ste es la principal fuente de contaminacin por ADN cromosomal, se transifirieron 1.5 mL del sobrenadante a un tubo estril, se someti agitacin con vortex y se dej en incubacin por 5 minutos en hielo para posteriormente adicionar un volumen de 620 L de isopropanol, se mezcl por inversin e incub por 10 min a 4C para despus centrifugar por 20 minutos a 14300 rpm, se elimin el sobrenadante con cuidado para evitar que el Isopropanol volviera a entrar en contacto con el precipitado de DNA.El precipitado de DNA, casi invisible, se dej secar completamente para evitar que quede isopropanol que impida redisolverlo se dej secar unos 5 min y luego se le aadi 50 L de agua destilada para solubilizar el DNA y as resuspenderlo. La muestra que contiene al ADN plasmdico fue corrida en un gel de agarosa.

3. Resultados El mtodo empleado para la obtencin del plsmido se denomina "mtodo de lisis alcalina, el cual se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del DNA en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y su naturaleza circular.El tratamiento con alta concentracin de sal (acetato potsico) y SDS produce la precipitacin de gran parte de las protenas.El tratamiento con RNAsa elimina el RNA presente en la clula.

4.

Fig. 1 Marcador 100-10000 pb

Fig. 2 Extraccin del ADN plasmdico de DH 5 E. coli en gel de agarosa. (M) marcador; los carriles 1,2,3 y 4 con 3 l de muestra. (a) ADN genmico; (b) plsmido pyrG; (c) 10000 pb y (d) topoismeros.

1. DiscusinEl anlisis en gel de agarosa del ADN nos demuestra que la competencia y transformacin fue realizada de manera correcta, los resultados obtenidos son comparables con los de Sullivan y Tood con la misma metodologa. El marcado utilizado fue de 100 a 10000 pb (c en la figura 2), por tal razn las bandas b de cada carril pueden representar el ADN plasmdico con un peso de 10314 pb, debido y debido a ello se encuentran las bandas arriba del marcador (fig. 2 c), la banda a es ADN genmico por su elevado peso. Las bandas de la fig. 2 d son posiblemente topoisomeros.

5. Conclusiones

El ADN plasmdico fue extrado con xito de las clulas trasformadas, y esto fue corroborado por las marcas obtenidas en el corrimiento de la muestra en gel de agarosa. Siendo verificadas con el marcador usado de 100 a 10 000 pares de bases en el cul apareci aproximadamente a 10 400 pares de bases. Tambin se observa en el gel de agarosa una clara separacin del ADN plasmdico del resto del ADN de la bacteria, en base a los diferentes pesos moleculares, lo cual no sucedera si el ADN plasmdico se encontrara unido al ADN genmico.

6. Bibliografa

1. Sambrook, J. and D. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor, NY. Pp 5.8, 5.76. 2. Current Protocols and Molecular Biology. John Wiley and Sons, inc. 1999. Suplemento3. Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis : an introduction. Oxford, UK ; Malden, MA, Blackwell Pub.Impreso.

4. Osullivan, Tood (1992). Rapid Mini-Prep Isolation of High-Quality Plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and environmental microbiology; 59 (8), 2730-2733