CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA

ACTUALIZACIONES EN EL LABORATORIO CLÍNICO

ACTUALIZACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO

DE LA TUBERCULOSIS

CURSO 2007 - 2008 Nº 4

I.S.S.N.- 1988-7477 Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: Febrero 2008

53

Actualización en el diagnóstico de la

Tuberculosis

Dr. Jerónimo Jaqueti Aroca.- Médico Especialista Análisis Clínicos. Titulado Superior Especialista en el Laboratorio de Análisis Clínicos. Hospital de

Fuenlabrada. Madrid

1.- Introducción

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa de distribución mundial producida por

Mycobacterium tuberculosis. Debe su nombre a la formación de nódulos (tubérculos)

en los tejidos que afecta. Se estima que un 19-43% de la población ha sido infectada

por M. tuberculosis y que todos los años se producen más de 8 millones de casos

nuevos (1).

El genero Mycobacterium consta de más de 100 especies de bacilos ácido-alcohol

resistentes (BAAR) aerobios, no esporulados, inmóviles y no capsulados.

Clásicamente se han agrupado en virtud de su velocidad de crecimiento (lento,

mayor de una semana, y rápido, menor de una semana) y de la producción o no de

pigmentos cuando son expuestos a la luz (fotocromógenos, producen pigmento en

presencia de luz; escotocromógenos, producen pigmento en ausencia de luz; y no

cromógenos). El complejo Mycobacterium tuberculosis está formado por M.

tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti, y se incluye dentro del grupo de no

cromógenos de crecimiento lento (2). El desarrollo de estudios de genotipado ha

modificado algunos grupos y diferenciado nuevas especies (3,4). Una clasificación

sucinta de las micobacterias más frecuentes en humanos se recoge en la tabla 1.

54

Tabla 1.- Clasificación de las micobacterias más frecuentemente aisladas en muestras clínicas. Crecimiento

Producción de pigmento

Especie

Fotocromógenas M. asiaticum M. kansasii M. marinum M. simiae

Escotocromógenas

M. flavescens M. gordonae M. scrofulaceum M. szulgai M. xenopi

Lento (mayor de 1 semana)

No cromógenas

M. avium complex (M. avium y M. intracellulare) M. gastri M. genavense M. haemophilum M. malmoense M. nonchromogenicum M. shimoidei M. terrae M. triviale M. tuberculosis complex (M. africanum, M. bovis, M.tuberculosis) M. ulcerans

Rápido (menor de 1 semana)

No cromógenas

M. fortuitum complex (M. fortuitum, M. mageritense, M. mucogenicum, M. peregrinum, M. septicum) M. chelonae-abscessus complex (M. chelonae, M. abscessus, M. immunogenum) M. smegmatis complex (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi )

Las micobacterias no pertenecientes al complejo M. tuberculosis, productoras de

procesos infecciosos denominados globalmente micobacteriosis, han recibido

distintos nombres a lo largo del tiempo con mayor o menor fortuna: micobacterias

atípicas (con características diferentes de la especie “típica”, M. tuberculosis), MOTT

(Mycobacteria other than tubercule bacilli), micobacterias oportunistas, micobacterias

no tuberculosas, micobacterias ambientales, etc… que se utilizan indistintamente (5).

55

En este trabajo nos centraremos exclusivamente en el diagnóstico de la enfermedad

infecciosa causada por M. tuberculosis.

2.- Morfología, estructura y composición

M. tuberculosis suele tener una forma ligeramente curvada, de 1-4 micras de largo.

Se caracteriza por poseer una pared gruesa formada por varias capas de

glicopéptidos, polímeros de arabinosa y galactosa, ácidos micólicos y lípidos. Esta

estructura le conferiría la capacidad de resistir la acción decolorante de ácidos y

alcoholes una vez teñida.

3.- Patogenia y manifestaciones clínicas

El contagio se produce habitualmente por vía aérea a partir de pacientes con

lesiones pulmonares abiertas al exterior por un bronquio de drenaje. Los bacilos

expulsados con la tos pueden ser aspirados por otras personas, llegando hasta los

alvéolos y desencadenando la primoinfección. La transmisión digestiva de M. bovis

procedente de vacas enfermas ha desaparecido prácticamente gracias a la

pasteurización sistemática de la leche (6).

En la mayoría de las ocasiones, los escasos bacilos que llegan hasta los alvéolos son

fagocitados y destruidos por los macrófagos; sólo un pequeño porcentaje de las

personas infectadas (aproximadamente el 10 %) llegará a desarrollar la enfermedad;

la mitad de ellas a los pocos meses de la infección, mientras que la otra mitad

necesitará de un largo periodo, a veces de años, para que se produzca la

reactivación de lesiones aparentemente curadas que albergan en su interior

micobacterias.

56

La llegada de M. tuberculosis a los alvéolos desencadena una serie de procesos de

respuesta tisular e inmunológica. En las 2-10 semanas posteriores a la infección se

produce una respuesta inmunológica celular desencadenada por los antígenos de la

membrana y del citoplasma de las micobacterias. Linfocitos, macrófagos, células

epitelioides y células gigantes de Langhans rodean a las micobacterias creando el

característico granuloma tuberculoso, que al cabo de un tiempo se reblandece en su

centro y deja un núcleo de necrosis caseosa (6).

En la mayoría de los casos se controla completamente la infección, reabsorbiéndose

el granuloma y quedando una pequeña cicatriz fibrosa que suele calcificarse. Si el

proceso no continúa, se habrá producido una infección sin enfermedad, con una

reacción positiva a la prueba de la tuberculina. En un 5% de los casos se producirá

una enfermedad activa, con signos síntomas radiológicos y clínicos y aislamiento de

las micobacterias (6).

En otro 5% de los casos se producirá una tuberculosis secundaria, habitualmente

debida a una alteración inmunitaria (malnutrición, administración de fármacos

inmunosupresores, diabetes, infección por VIH, etc…) que permite la reactivación de

micobacterias latentes (1). Esporádicamente, sobre todo en países con alta

endemicidad, se puede producir una reinfección exógena (6).

La primoinfección, más frecuente en niños y jóvenes, puede ser asintomática o con

síntomas leves de infección respiratoria, o presentar un cuadro más llamativo con

afectación del estado general, fiebre, hemoptisis, eritema nodoso, alteraciones

extrapulmonares, etc… En la mayor parte de los casos cura espontáneamente,

dejando evidencias radiográficas y positividad de la prueba de Mantoux. Más

raramente puede seguir un curso progresivo, con aparición de infiltrados pulmonares

57

y cavitación, y diseminación broncógena y/o hematógena (con localizaciones en

pleura, meninges, hígado, riñón, peritoneo, sistema osteoarticular). La tuberculosis

secundaria se suele localizar inicialmente en el pulmón, en forma de infiltrado o

nódulos que tienden a caseificarse y drenarse a través de un bronquio produciéndose

una caverna. Con menos frecuencia la tuberculosis comienza como una neumonía

aguda. Las adenopatías mediastínicas pueden comprimir a los bronquios ocasionando

atelectasias. Las formas extrapulmonares (más frecuentes en los infectados por VIH)

pueden afectar al riñón, sistema osteoarticular, pericardio, sistema nervioso central,

peritoneo, piel, etc…, variando los síntomas en función de la localización y de la

progresión de la enfermedad (1,6).

4.- Diagnóstico de Laboratorio 4.1.- Infección La infección por M. tuberculosis se detecta estudiando la respuesta de

hipersensibilidad retardada frente a antígenos específicos del bacilo. Actualmente, se

utiliza un derivado proteico purificado (PPD RT-23 en España). La técnica más usada

es la intradermorreacción de Mantoux, en la que se inyectan 2 U de PPD RT-23 en la

cara anterior del antebrazo, por vía intradérmica. A las 48-72 horas se mide la zona

de induración, considerándose positivas todas las induraciones ≥ 5 mm en personas

no vacunadas.

La especificidad de la prueba esta condicionada por exposición previa a otras

micobacterias o a la vacuna con Bacilo de Calmette-Guérin, ya que los antígenos

presentes en el PPD son comunes con otras micobacterias. La sensibilidad de la

prueba esta condicionada por una buena técnica de realización y lectura, y esta

requiere que se vea al paciente 48-72 horas después de la administración.

58

Recientemente se han desarrollado métodos de inmunodiagnóstico para cuantificar

esta respuesta inmunitaria, estimulando a los linfocitos con antígenos de las

micobacterias y determinando in vitro la liberación de interferon- (7). La técnica

alcanza un rendimiento mejor al sustituir el PPD por antígenos más específicos de M.

tuberculosis, como el early secretory antigen target-6 (ESAT-6) y la culture filtrate

protein 10 (CFP-10), ausentes en la vacuna antituberculosa y en micobacterias no

tuberculosas (8).

4.2.- Enfermedad El diagnóstico de la tuberculosis se ha basado clásicamente en la observación

microscópica tras tinción de las muestras y su cultivo (1). Desde hace una quincena

de años se están desarrollando métodos de biología molecular que permiten una

detección e identificación más rápida de las micobacterias (1,9).

4.2.1.- Tinciones

Las micobacterias se tiñen mal con los colorantes habituales debido al elevado

contenido de lípidos de su pared celular. Para lograr que el colorante primario

penetre en las micobacterias se recurre al calor o a determinados detergentes según

el método utilizado. Una vez dentro, el colorante no se altera tras la exposición a

soluciones de alcohol y ácido. Esta propiedad, llamada ácido-alcohol resistencia, es

útil para la visualización de este grupo específico de bacterias. Además, las

micobacterias son capaces de formar complejos estables con ciertos colorantes como

la auramina. Los métodos más utilizados para la tinción de las micobacterias son:

4.2.1.1.- Tinciones de Ziehl-Neelsen o Kinyoun, basadas en la utilización de fucsina

fenicada como colorante primario. La primera requiere calentar la preparación para

59

permitir la entrada de colorante en las micobacterias, mientras que la de Kinyoun

utiliza cuerpos tensoactivos sin necesidad de calentar el colorante; y

4.2.1.2.- Tinciones de auramina o auramina-rhodamina, en las que las micobacterias

muestran fluorescencia bajo una luz ultravioleta.

La microscopía presenta una sensibilidad inferior al cultivo, oscilando entre un 22%

y un 80% (1). La sensibilidad es mayor al procesar muestras respiratorias; al

aumentar el volumen de muestra procesada (10); al concentrar las muestras, ya que

se precisa una concentración ≥10.000 bacilos/ml para que la muestra sea positiva

(9,11); o al utilizar tinciones de auramina, de sensibilidad similar a la de Ziehl-

Neelsen y más cómodas para el observador, y más sensibles que la de Kinyoun (12).

Cuando existan dudas con las técnicas fluorescentes se recomienda confirmar los

resultados mediante una tinción de Ziehl-Neelsen.

Los resultados falsos negativos suelen corresponder a muestras inadecuadas (saliva,

escaso volumen de orina, jugo gástrico sin neutralizar, etc...), errores en la técnica

(mala extensión y fijación, alteraciones en los colorantes, exceso de decoloración,

etc…), errores en la observación (pocos campos examinados, falta de atención, falta

de experiencia, cansancio, etc...). Los falsos positivos se deben a precipitados de los

colorantes, contaminación cruzada de los portaobjetos, contaminación del agua y

reactivos utilizados, y a la presencia de otros microorganismos ácido-alcohol

resistentes distintos de las micobacterias (corinebacterias, nocardias, actinomyces,

Rhodococcus, Tsukamurella, etc…) La presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes

en muestras con cultivo negativo también puede deberse a tratamientos previos con

antibióticos, descontaminación excesiva de las muestras o a un escaso tiempo de

cultivo (1).

60

Cuando la muestra se haya teñido con fucsina fenicada se deben examinar 300

campos con el objetivo de inmersión (x 1.000). En las tinciones fluorescentes se

puede trabajar con un aumento menor (x 200) y bastará con examinar 30 campos.

Es conveniente informar de la cantidad de BAAR encontrados (13).

4.2.2.- Identificación directamente en muestras clínicas Aunque no reemplacen al cultivo en el diagnóstico de la tuberculosis activa, las

técnicas basadas en la amplificación y reconocimiento de un fragmento de ARN o

ADN han mejorado notablemente aspectos como la rapidez en el diagnóstico inicial

de la tuberculosis (1). Se pueden dar resultados falsamente positivos al detectar

bacilos muertos, por lo que no se deben usar en pacientes con tratamiento

antituberculoso, y por contaminaciones de las muestras. Los falsos negativos se

pueden deber a muestras muy paucibacilares, a la presencia de inhibidores o a

problemas de extracción del ácido nucleico (14). A continuación se describen

brevemente las características de algunos métodos comercializados.

4.2.2.1.- Amplicor MTB assay (Roche Molecular System, Branchburg, NJ): El método

se puede realizar de forma manual o automatizada (excepto la preparación de la

muestra), y la automatizada dispone de un control interno que se amplifica al mismo

tiempo que la diana y permite detectar la presencia de inhibidores. La sensibilidad

(con respecto al cultivo y datos clínicos) parece ser muy elevada en las muestras en

las que se han detectado BAAR, ya sean pulmonares o extrapulmonares, mientras

que no lo es tanto en las muestras extrapulmonares (14). La sensibilidad del método

puede verse afectada por factores como la carga bacteriana la distribución de las

micobacterias o la presencia de inhibidores en las muestras. Algunos autores han

observado un aumento de la sensibilidad al estudiar tres muestras secuenciales de

61

cada paciente (15). La especificidad es superior al 90%, y los falsos positivos suelen

deberse al uso de antibióticos o a reacciones cruzadas con micobacterias no

tuberculosas (14).

4.2.2.2.- Amplified M. tuberculosis Direct (AMTD2) assay (Gen-Probe, Inc., San

Diego, California): Es un método de amplificación isotérmica (42ºC). La sensibilidad

es también elevada en muestras pulmonares y extrapulmonares en las que se han

detectado BAAR (14). La sensibilidad es mejor cuando los pacientes se seleccionan

según la sospecha clínica de tuberculosis (16). La especificidad es superior al 90%, y

aumenta al elevar el punto de corte de la técnica sin que disminuya

significativamente la sensibilidad (17).

4.2.2.3.- LCx MTB assay, Abbott LCx probe system (Abbott Laboratorios, Illinois): Es

un método de amplificación que utiliza la reacción en cadena de la ligasa. El método

presenta una buena sensibilidad en muestras pulmonares con presencia de BAAR,

pero mucho menor en muestras sin BAAR y en muestras extrapulmonares (18,19).

Algunos autores han modificado el punto de corte, aumentando la sensibilidad sin

que disminuya prácticamente la especificidad (18).

4.2.2.4.- BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection

Assay (DTB) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.): Es una amplificación

isotérmica semiautomatizada (una extracción manual y laboriosa y una amplificación

y detección completamente automatizadas) basada en el desplazamiento de cadenas

de ADN (SDA, strand displacement amplification). Incluye un control interno para la

detección de inhibidores. Muestra muy buenas sensibilidad y especificidad tanto en

muestras pulmonares como extrapulmonares, siendo menor la sensibilidad en

muestras pulmonares en las que no se han detectado BAAR (14,20).

62

4.2.2.5.- INNO LiPA Rif.TB (Innogenetics, Ghent, Belgium): Es un método que

combina una hibridación con una amplificación para detectar al mismo tiempo M.

tuberculosis y resistencia a la rifampicina. En la detección directa, muestra una

elevada sensibilidad junto a una baja especificidad (21) La especificidad aumenta al

estudiar sólo muestras con presencia de BAAR (22).

4.2.2.6.- GenoType Mycobacteria Direct (GTMD) (Hain Lifescience GMBH, Nehren,

Germany): Es un método de amplificación basado en NASBA que detecta en el

mismo proceso M. tuberculosis y otras cuatro especies de micobacterias de

importancia clínica. La sensibilidad y especificidad son elevadas (23).

5.- Cultivos

El cultivo sigue siendo el estándar de oro para el diagnóstico de la tuberculosis

activa, pudiendo detectar una concentración <100 bacilos/ml. Además, el aislamiento

permite realizar estudios de sensibilidad frente a los fármacos antituberculostáticos.

La sensibilidad es del 80-85% con muy elevada especificidad (1)

Ya que la tuberculosis se puede producir en casi cualquier sitio del organismo, se

utiliza una gran diversidad de muestras para el estudio de micobacterias: esputo,

jugo gástrico, orina, líquido cefalorraquídeo, broncoaspirados, lavados bronquio-

alveolares, biopsias, etc...

Las muestras, correctamente identificadas, deben remitirse al laboratorio lo antes

posible. Es conveniente refrigerarlas si se preveen retrasos. Estas muestras no se

cultivan directamente, la mayor parte procede de áreas contaminadas por otros

microorganismos, mientras que en otras la concentración de bacilos es muy escasa.

Es necesario un tratamiento adecuado de las muestras, que comprende procesos de

homogeinización, concentración y descontaminación, antes de cultivarlas (1). Los

63

métodos más utilizados para la licuefacción y descontaminación incluyen

combinaciones de N-acetil-L-cisteína e hidróxido sódico (NaOH), laurilsulfato sódico y

NaOH y fosfato trisódico y cloruro de benzalconio. También se pueden usar de forma

aislada NaOH, ácido sulfúrico y ácido oxálico (24).

El cultivo se realiza en medios selectivos tanto líquidos (Proskauer-Beck, Sauton,

Sula, Dubos, Middlebroock 7H9) como sólidos, con huevo (Löwenstein-Jensen,

Petragnani, Coletsos, Stonebrink), los más utilizados, y con agar (Dubos,

Middlebroock 7H10, Middlebroock 7H11). Los medios sólidos permiten una buena

recuperación de las micobacterias y reconocer sus características fenotípicas. Los

medios líquidos suelen estar muy enriquecidos, por lo que el cultivo es más rápido

que en los sólidos y se recupera un mayor número de micobacterias. No permiten

distinguir los cultivos mixtos ni la morfología y pigmentación de las colonias (24).

Algunos se leen manualmente, como el MB redox, en el que el crecimiento precipita

partículas rosas-violetas; y el MGIT (Mycobacterial growth indicador tube), un medio

basado en el Middelbrook 7H9 con un indicador fluorescente; pero en los últimos

años se ha impuesto el medio líquido de Middlebroock para el diagnóstico rápido

automatizado, existiendo diversos sistemas comerciales: BACTEC, MGIT, MB/Bact y

ESP (Extra Sensing Power) (1,9,24). Sus características principales se describen a

continuación.

5.1.- Sistema BACTEC 460TB: Es un sistema semiautomático que utiliza 14C para

detectar el crecimiento. Es más rápido y sensible que los cultivos en medio sólido,

tanto para M. tuberculosis como para otras micobacterias, pero su principal

inconveniente es el uso de isótopos radiactivos (25).

64

5.2.- Sistema MB/BacT ALERT 3D: Es un sistema automatizado colorimétrico de

monitorización continua que detecta el crecimiento bacteriano por la producción de

CO2. El sistema avisa de la positividad del cultivo o del fin del periodo de incubación

fijado si es negativo. La sensibilidad y rapidez son mejores que con los medios

sólidos (26). La rentabilidad es similar a la del BACTEC (27), tanto en muestras

pulmonares como extrapulmonares (28), sin el inconveniente de la radioactividad.

5.3.- Sistema ESP Culture System II: Es un sistema automático no radiométrico de

monitorización continua que detecta el crecimiento mediante el consumo de oxígeno.

El sistema es más rápido y sensible que los medios sólidos, pero la sensibilidad es

algo menor que con BACTEC 460 (29) y similar a la del BACTEC MGIT, aunque el

tiempo de detección es más largo (30). No presenta el inconveniente de la

radioactividad.

5.4.- Sistema BACTEC MGIT 960: Es un sistema automatizado que utiliza el medio

MGIT y detecta el consumo de O2 mediante fluorimetría. No puede utilizarse con

muestras de sangre. La sensibilidad es algo menor que la del BACTEC 460, pero el

crecimiento es un poco más rápido (31), tanto en muestras con baciloscopia positiva

como negativa (32). No presenta el inconveniente de la radioactividad.

5.5.- Sistema BACTEC serie 9000: Es un sistema automatizado de hemocultivos

adaptado al cultivo de micobacterias mediante una modificación del programa

informático y el uso de un medio de cultivo y de un sensor de oxígeno específicos. El

rendimiento es similar al del BACTEC 460 (33), detectando peor las muestras con

baciloscopias negativas (34). Tampoco presenta el inconveniente de la

radioactividad.

65

6.- Pruebas bioquímicas

Se ha utilizado un amplio número de pruebas para la identificación de las

micobacterias. Se recomienda usar un conjunto de pruebas seleccionadas en función

de un agrupamiento previo por características de crecimiento, pigmentación y

morfología de las colonias. Las básicas para la identificación de M. tuberculosis son la

prueba de la niacina, la de reducción de nitratos y las de la catalasa (13).

6.1.- Prueba de la niacina: Se basa en la liberación de niacina al medio de cultivo

por M. tuberculosis y algunos aislados de M. africanum, M. simiae y M. chelonae.

6.2.- Prueba de reducción de nitratos: Las micobacterias difieren en su

capacidad para reducir los nitratos a nitritos mediante la presencia de la enzima

nitratorreductasa. Es muy útil para diferenciar las especies de micobacterias de

crecimiento rápido, así como algunas de crecimiento lento (M. tuberculosis, M.

kansasii, M.flavescens y M. szulgai son positivas).

6.3.- Prueba de la catalasa: Todas las micobacterias, excepto algunos aislados de

M. tuberculosis y de M. bovis resistentes a la isoniacida producen catalasa. Las

especies se pueden diferenciar estudiando la cantidad de catalasa producida y su

termoestabilidad.

7.- Métodos de identificación cromatográfica

Permiten identificar especies mediante la determinación cualitativa de la

composición lipídica de la pared de las micobacterias. Las de mejor rendimiento son

la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución. Su coste y

complejidad han hecho que se vean relegadas frente a los métodos de detección

genética (24).

66

8.- Métodos de amplificación de ácidos nucleicos

Utilizan la hibridación con sondas de ácidos nucleicos, la amplificación de secuencias

de ADN, la secuenciación de la unidad ribosomal 16S, la amplificación a tiempo real y

el uso de arrays.

8.1.- Hibridación: Permiten detectar el ARN ribosómico de las micobacterias a partir

de medios sólidos y líquidos (35,36). La técnica es rápida y específica, pero sólo

permite identificar una especie cada vez, por lo que se debería hacer un diagnóstico

presuntivo antes de comenzar la técnica, y sólo están comercializadas sondas para

un pequeño número de micobacterias (9).

8.2.- Amplificación de secuencias específicas: Las dianas más usadas corresponden al

gen hsp65 y a la subunidad ribosomal 16S. El análisis posterior se puede realizar

mediante polimorfismo de los fragmentos de restricción, hibridación y secuenciación

(37-39).

8.3.- Amplificación a tiempo real: Se basan en la realización de forma simultánea de

la amplificación de una diana y su reconocimiento mediante hibridación. Los sistemas

comercializados se basan en el desplazamiento de cadenas de ADN (SDA, strand

displacement amplification) y la detección por fluorescencia (40). El método presenta

muy buenas sensibilidad y especificidad (41)

8.4.- Arrays de ADN: Son conjuntos de sondas de ADN colocadas en un soporte

sólido con una disposición prefijada, lo que permite detectar simultáneamente

diferentes secuencias de ácidos nucleicos (42). Este método, precedido de una

amplificación, se ha aplicado a la identificación de las micobacterias, permitiendo la

identificación de varias especies a la vez (43,44).

67

9.- Conclusión

Frente a los métodos clásicos, las técnicas de biología molecular permiten adelantar

un diagnóstico con una fiabilidad elevada. A pesar de los avances realizados en los

últimos años en este campo, el diagnóstico se sigue basando en la observación de

las muestras teñidas, el cultivo y la correlación con los datos clínicos.

68

Bibliografía

1.- American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification of

Tuberculosis in Adults and Children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1376-

1395.

2.- Casal Román M. Mycobacterium tuberculosis. En: Perea Pérez EJ, Ed.

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Ed. Doyma, Barcelona, 1992: pág.

754-766

3.- Tortoli E. Impact of Genotypic Studies on Mycobacterial Taxonomy: the New

Mycobacteria of the 1990s. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 319–354.

4.- Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Clinical and Taxonomic Status of Pathogenic

Nonpigmented or Late-Pigmenting Rapidly Growing Mycobacteria. Clin Microbiol Rev

2002; 15: 716–746.

5.- Casal M. Cómo denominar a las micobacterias diferentes a Mycobacterium

tuberculosis y a M. leprae. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21: 296-8.

6.- Sauret Valet J. Tuberculosis. En: Rodés Teixidor J, Guardia Massó J, Eds.

Medicina Interna. Ed. Electrónica. Barcelona: Masson, S.A.; 1997: pág. 1141-1152

7.- Domínguez J, Ruiz-Manzano J. Prueba de la tuberculina: ¿es la hora del

cambio?. Arch Bronconeumol 2006; 42: 47-48

8.- Mori T, Sakatani M, Yamagishi F, Takashima T, Kawabe Y, Nagao K, et al. Specific

Detection of Tuberculosis Infection. An Interferon- –based Assay Using New

Antigens. Am J Respir Crit Car Med 2004; 170: 59-64.

9.- Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis:

feasibility and applicability in the field. Eur Respir J 2005; 26: 339-350.

69

10.- Warren JR, Bhattacharya M, De Almeida KNF, Trakas K, Peterson LR. A

minimum 5.0 ml of sputum improves the sensitivity of acid-fast smear for

Mycobacterium tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1559–1562.

11.- Murray SJ, Barrett A, Magee JG, Freeman R. Optimisation of acid fast smears for

the direct detection of mycobacteria in clinical samples. J Clin Pathol 2003; 56: 613–

615.

12.- Somoskövi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O’Donnell D, Parsons LM, Salfinger M.

Lessons From a Proficiency Testing Event for Acid-Fast Microscopy. Chest 2001; 120:

250-257.

13.- Nolte FS y Metchoock B. Mycobacterium. En, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,

Tenover FC, Yolken RH, edit; Manual of Clinical Microbiology. 6th ed, Washington CD:

ASM PRESS; 1995; pág. 400-437.

14.- Piersimoni C, Scarparo C. Relevance of Commercial Amplification Methods for

Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Samples. J Clin

Microbiol 2003; 41: 5355-5365.

15.- Rajalahti I, VuorinenP, Nienminen MM, Miettinen A. Detection of Mycobacterium

tuberculosis Complex in Sputum Specimens by the Automated Roche Cobas Amplicor

Mycobacterium Tuberculosis Test. J Clin Microbiol 1998; 36: 975-978.

16.- Catanzaro A, Perry S, Clarridge JE, Dunbar S, Goodnight-White S, LoBue PhA, et

al . The Role of Clinical Suspicion in Evaluating a New Diagnostic Test for Active

Tuberculosis. Results of a Multicenter Prospective Trial. JAMA 2000; 283: 639-645.

17.- Alcalá L, Ruiz-Serrano MJ, Hernangómez S, Marín M, García de Viedma D, San

Juan R, et al. Evaluation of the upgraded amplified Mycobacterium tuberculosis direct

70

test (gen-probe) for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory and

non-respiratory specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 2001; 41: 51-56

18.- Lumb R, Davies K, Dawson D, Gibb R, Gottlieb T, Kershaw C, et al. Multicenter

Evaluation of the Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis Ligase Chain Reaction

Assay. J Clin Microbiol 1999; 37: 3102-3107

19.- Tortoli E, Tronci M, Trosi CP, Galli C, Lavinia F, Natili S, et al. Multicenter

evaluation of two commercial amplification kits (Amplicor, Roche and LCx, Abbott)

for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary

specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 33: 173-179

20.- Piersimoni C, Scarparo C, Piccoli P, Rigon A, Ruggiero G, Nista D, et al.

Performance Assessment of Two Commercial Amplification Assays for Direct

Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory and

Extrapulmonary Specimens. J Clin Microbiol. 2002; 40: 4138–4142.

21.- Viveiros M, Leandro C, Rodrigues L, Almeida J, Bettencourt R, Couto I, et al.

Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for Rapid Identification

of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and Detection of Rifampin Resistance

in 360 Smear-Positive Respiratory Specimens from an Area of High Incidence of

Multidrug-Resistant Tuberculosis. J Clin Microbiol 2005; 43: 4880-4884.

22.- Tortoli E, Marcelli F. Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of Mycobacterium

tuberculosis DNA directly in clinical specimens and for simultaneous determination of

rifampin susceptibility. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26:51–55.

23.- Franco-Álvarez de Luna F, Ruiz P, Gutiérrez J, Casal M. Evaluation of the

GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis

71

Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical Samples. J Clin Microbiol

2006; 44: 3025-3027

24.- Alcalde Fernández de Vega F, Esteban Moreno J, González Martín J, Palacios

Gutiérrez JJ. 9ª. Micobacterias. En: Cercenado E, Cantón R, eds. Procedimientos en

Microbiología Clínica. Madrid: Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica, 2005.

25.- Anargyros P, Astill DS, Lim IS. Comparison of improved BACTEC and

Lowenstein-Jensen media for culture of mycobacteria from clinical specimens. J Clin

Microbiol. 1990 June; 28(6): 1288-1291

26.- Palacios JJ, Ferro J, Ruiz Palma N, García JM, Villar H, Rodríguez J, et al. Fully

Automated Liquid Culture System Compared with Löwenstein-Jensen Solid Medium

for Rapid Recovery of Mycobacteria from Clinical Simples. Eur J Clin Microbiol Infect

Dis 1999;18:265-273.

27.- Harris G, Rayner A, Blair J, Watt B. Comparison of three isolation systems for the

culture of mycobacteria from respiratory and non-respiratory samples. J Clin Pathol

2000; 53: 615-618.

28.- Brunello F, Favari F, Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC

460 TB Systems for Recovery of Mycobacteria from Various Clinical Specimens. J Clin

Microbiol 1999; 37: 1206-1209.

29. -Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, Gismondo MR, Bono L, Gesu G, et al.

Multicenter Comparison of ESP Culture System II with BACTEC 460TB and with

Lowenstein-Jensen Medium for Recovery of Mycobacteria from Different Clinical

Specimens, Including Blood. J Clin Microbiol 1998; 36: 1378-1381.

72

30.- Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Comparison of the BACTEC

MGIT 960 and ESP Culture System II for Growth and Detection of Mycobacteria. J

Clin Microbiol 2000; 38: 4167-4170.

31.- Tortoli E, Cichero P, Piersimoni C, Simonetti MT, Ges G, Nista D. Use of BACTEC

MGIT 960 for Recovery of Mycobacteria from Clinical Specimens: Multicenter Study. J

Clin Microbiol 1999; 37: 3578-3582.

32.- Somoskövi A, Ködmön C, Lantos A, Bártfai Z, Tamási L, Füzy J, et al.

Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated

BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen

Medium. J Clin Microbiol 2000; 38: 2395-2397.

33. – Zanetti S, Ardito F, Sechi L, Sanguinetti M, Molicotti P, Delogu G, et al.

Evaluation of a Nonradiometric System (BACTEC 9000 MB) for Detection of

Mycobacteria in Human Clinical Samples. J Clin Microbiol 1997; 35: 2072–2075.

34.- Pfyffer GE, Cieslak C, Welscher HM, Kissling P, Rüsch-Gerdes S. Rapid Detection

of Mycobacteria in Clinical Specimens by Using the Automated BACTEC 9000 MB

System and Comparison with Radiometric and Solid-Culture Systems. J Clin Microbiol

1997; 35: 2229-2234.

35.- Musial CE, Tice LS, Stockman L, Roberts GD. Identification of mycobacteria from

culture by using the Gen-Probe Rapid Diagnostic System for Mycobacterium avium

complex and Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol. 1988; 26: 2120–

2123.

36.- Badak FZ, Goksel S, Sertoz R, Nafile B, Ermertcan S, Cavusoglu C, et al. Use of

Nucleic Acid Probes for Identification of Mycobacterium tuberculosis Directly from

MB/BacT Bottles. J Clin Microbiol. 1999 May; 37(5): 1602–1605.

73

37.- Plikaytis BB, Plikaytis BD, Yakrus MA, Butler WR, Woodley CL, Silcox VA, et al.

Differentiation of slowly growing Mycobacterium species, including Mycobacterium

tuberculosis, by gene amplification and restriction fragment length polymorphism

analysis. J Clin Microbiol. 1992; 30: 1815–1822.

38.- Kirschner P, Springer B, Vogel U, Meier A, Wrede A, Kiekenbeck M, et al.

Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination:

report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J Clin Microbiol 1993; 31: 2882–

2889.

39.- Suffys PN, da Silva Rocha A, de Oliveira M, Dias Campos CE, Werneck Barreto

AM, Portaels F, et al. Rapid Identification of Mycobacteria to the Species Level Using

INNO-LiPA Mycobacteria, a Reverse Hybridization Assay. J Clin Microbiol. 2001; 39:

4477–4482.

40.- Little MC, Andrews J, Moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, et al. Strand

Displacement Amplification and Homogeneous Real-Time Detection Incorporated in a

Second-Generation DNA Probe System, BDProbeTecET. Clin Chem 1999; 45: 777-

784.

41.- Wang SX, Sng LH, Tay L. Preliminary study on rapid identification of

Mycobacterium tuberculosis complex isolates by the BD ProbeTec ET system. J Med

Microbiol 2004; 53: 57-59.

42.- Doménech-Sánchez A, Vila J. Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de

ADN en la microbiología médica. Enferm Infecc Microbiol Clin 2004; 22: 46 - 54

43.- Park H, Jang H, Song E, Chang CL, Lee M, Jeong S, et al. Detection and

Genotyping of Mycobacterium Species from Clinical Isolates and Specimens by

Oligonucleotide Array. J Clin Microbiol 2005; 43: 1782–1788.

74

44.- Sanguinetti M, Novarese L, Posteraro B, Ranno S, De Carolas E, Pecorini G, et al.

Use of Microelectronic Array Technology for Rapid Identification of Clinically Relevant

Mycobacteria. J Clin Microbiol. 2005 December; 43(12): 6189–6193.

CON LA COLABORACIÓN DE: