ACTUALIZACION EN RESISTENCIA BACTERIANA Y NORMAS CLSI...

ACTUALIZACION EN RESISTENCIA BACTERIANA Y NORMAS CLSI 2010

Detección de Resistencia en

Bacterias Gram negativas

María Victoria Ovalle

Bacterióloga

Mecanismo de Resistencia a los antibióticos β lactámicos

� Impermeabilidad: porinas

�Bombas de Eflujo

Mecanismo de Resistencia a los antibióticos β lactámicos

�PBP: Poco usual

�Producción de enzimas: Más común

Resistencia Natural

Germen R. Natural R. Inusual

E. coli -- Col, Imi, Me

Klebsiella spp Amp, Ti Col, Imi, Me

Proteus mirabilis Col, Te, C Imi, Me

Proteus vulgaris

Col, C1G, Te, Amp,

CXM Imi, Me

Enterobacter spp Amp, FOX, AMC,C1G Col, Imi, Me

Serratia spp

Amp, AMS, C,CXM,

C1G Imi, Me

β lactamasas

Las β-lactamasas son enzimas catalíticas

que rompen el enlace amídico del anillo

betalactámico haciendo que el

antibiótico pierda su capacidad para

unirse a las proteínas de unión a la

penicilina y su acción bactericida

Clasificación de β lactamasas

Clase Molecular

Bush-Jacoby -Medeiros

(2009) Substrato

Inhibido

por

AC ó TZ

Inhibido

por

EDTA

A (serina

penicilinasa)

2a Penicilina Si No

2b

Penicilina y cefalosporinas de corto

espectro Si No

2be

Penicilina y cefalosporinas de espectro

corto y espectro extendido Si No

2br Penicilina No No

2ber

Cefalosporinas de espectro extendido,

monobactam No No

2c Carbecilina Si No

2ce Carbecilina, Cefepime Si No

2e Cefalosporinas de espectro extendido Si No

2f Carbapenemes Variable No

B (metalo β-

lactamasas

3a Carbapenemes No Si

3b Carbapenemes No Si

C (cefalosporinasas)

1 Cefalosporinas No No

1e Cefalosporinas No No

D (oxacilinasas)

2d Cloxacilina Variable No

2de Cefalosporinas de espectro extendido Variable No

2df Carbapenemes Variable No

No clasificadas 4

Karen Bush* and George A. Jacoby.Antimicrob agents and chemotherapy.2010, 54 (3); 969–976

β-lactamasas de espectro ampliado (grupo 2b) (Enzimas TEM-1,TEM-2 y SHV-1)

� Hidrolizan la penicilina y ampicilina y en menor grado

a carbecilina ó cefalotina.

� No son capaces de hidrolizar las cefalosporinas o

aztreonam y son inhibidas por el acido clavulánico.

β-lactamasas de espectro extendido - BLEE Clase A(2be) Enzimas: (SHV-2 a SHV-6, TEM-3 a TEM-26, CTX-M)

� Las BLEE derivadas de TEM-1, TEM-2 ó SHV-1 difieren

en aa.

� Hidrolizan cefalosporinas de amplio espectro, de

tercera generación, antibióticos monobactámicos y

puedan ser inhibidas por el acido clavulánico

β-lactamasas de espectro extendido - BLEE

CLSI

Según PK/PD se establecieron nuevos criterios de

interpretación para cefalosporinas

Antimicrobiano

Criterios de Interpretación

CLSI 2010

Criterios de Interpretación

CLSI 2009

Difusión en disco

(mm)

Concentración

Inhibitoria Mínima

µg/mL

Difusión en disco

(mm)

Concentración

Inhibitoria Mínima

µg/mL

S I R S I R S I R S I R

Cefotaxima ≥ 26 23-25 ≤ 22 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 23 15-22 ≤ 14 ≤ 8 16-32 ≥ 64

Cefriaxona ≥ 23 20-22 ≤ 19 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 21 14-20 ≤ 13 ≤ 8 16-32 ≥ 64

Ceftazidima ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥ 16 ≥ 18 15-17 ≤ 14 ≤ 8 16 ≥ 32

Ceftizoxima ≥ 25 22-24 ≤ 21 ≤ 1 2 ≥ 4 ≥ 20 15-19 ≤ 14 ≤ 8 16-32 ≥ 64

Aztreonam ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥16 ≥ 22 16-21 ≤ 15 ≤ 8 16 ≥ 32

Equipos automatizados Vs nuevos criterios

Laboratorio Universidad Nacional de ColombiaLaboratorio Universidad Nacional de Colombia

Antimicrobiano

Criterios Interpretación

Diluciones Concentración Inhibitoria Mínima

µg/mL

Vitek MicroScan Phoenix

Cefotaxima 1,4,16,32 2,8,16,32 4,8,16,32

Ceftazidima 1,2,8,32 1,4,8,16 0,5, 1,2

Antimicrobiano

Concentración

Inhibitoria Mínima

µg/mL

Concentración Inhibitoria

Mínima µg/mL

CLSI 2009 CLSI 2010

S I R S I R

Cefotaxima ≤ 8 16-32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥ 16

Equipos automatizados Vs nuevos criterios


Antimicrobiano

Criterios Interpretación

Diluciones Concentración Inhibitoria Mínima

µg/mL

Vitek MicroScan Phoenix

Cefotaxima 1,4,16,32 2,8,16,32 4,8,16,32

Ceftazidima 1,2,8,32 1,4,8,16 0,5, 1,2

Cefriaxona 2,4,8,16,32

Antimicrobiano

Concentración

Inhibitoria Mínima

µg/mL

Concentración Inhibitoria

Mínima µg/mL

CLSI 2009 CLSI 2010

S I R S I R

Cefotaxima ≤ 8 16-32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥ 16

β lactamasas de espectro extendido

CLSI

� Cuando se usan los nuevos criterios de

interpretación, la prueba de rutina de BLEE no es

necesaria realizarla. (No se editan resultados).

� Sin embargo hasta que el laboratorio implemente

los nuevos criterios, la prueba de BLEE puede ser

realizada como recomienda CLSI.

Detección de BLEE por el LaboratorioTamizaje ResultadosCeftriaxona 30µg ≤≤≤≤ 25 mmCefotaxima 30µg ≤≤≤≤ 27 mmCeftazidima 30µg ≤≤≤≤ 22 mmAztreonam 30µg ≤≤≤≤ 27 mm

Sospecha de BLEE

Test Confirmatorio ResultadoCeftazidima 30µgCeftazidima + AC 30/10µg

≥≥≥≥ 5 mm BLEECefotaxima 30µgCefotaxima + AC 30/10µg

Detección de BLEE por el LaboratorioTamizaje ResultadosCeftriaxona 1µg/mL ≥ 2 µg/mLCefotaxima 1µg/mL ≥ 2 µg/mLCeftazidima 1µg/mL ≥ 2 µg/mLAztreonam 1µg/mL ≥ 2 µg/mLCefpodoxima 4µg/mL ≥ 8 µg/mL

Sospecha de BLEE

Test Confirmatorio ResultadoCeftazidima 0.25-64µg/mLCeftazidima + AC 0.25/4-64/4µg/mL 3 ó más Dlnes

BLEECefotaxima 0.25-128µg/mLCefotaxima + AC 0.25/4-128/4µg/mL

Detección de BLEE por el Laboratorio

Laboratorio Universidad Nacional de Colombia


Otras Pruebas para la detección de BLEE por el Laboratorio

Prueba Doble Disco


Otras Pruebas para la detección de BLEE por el Laboratorio

Prueba E test


β-lactamasas AmpC Clase C (grupo 1) Enzimas AmpC: CMY-2, ACT-1, FOX

� También conocidas como cefalosporinasas

� Codificadas en cromosoma y unas pocas en plásmidos.

� Estas enzimas no son inhibidas por ácido clavulánico

� Son activas frente a cefalosporinas , cefamicinas,

aztreonam e Inhibidores

β-lactamasas AmpC Clase C (grupo 1) Enzimas: AmpC, CMY-2, ACT-1

� AmpC cromosómica Inducible:

- Bajos niveles de AmpC -Inducción β lactámicos

- Hiperproducción AmpC Ej Enterobacter spp

AmpC cromosómica no inducible:

- Niveles bajos -Hiperproducción AmpC Ej E. coli

� AmpC Plasmídica: R variable al Azt Ej K. pneum

Detección de AmpC por el Laboratorio

CLSI no tiene estandarizada la detección de AmpC

por el Laboratorio.

Prueba de Disco para AmpC

� Disco EDTA liberación de β lactamasa

� Disco de FOX

� E. coli ATCC 25922

� Sensibilidad 100%, especificidad 98%

Black J et al. J Clin Microbiol. 43:3110-3113.


Test Tridimensional� Cultivo en caldo a partir

de 0.5 McFarland

� Concentración de células


� Disco FOX

� Hendidura en el agarCoudron P, et al. J Clin Microbiol. 38:1791-1796.


Prueba con Agar suplementado con FOX� Agar con FOX diferentes

concentraciones

�Extracto celular

�E. coli ATCC 25922

� Pozo con extracto celular

Nasim K, Et all. J Clin Microbiol. 2004 Oct;42(10):4799-802.


Prueba con acido borónico

� Acido borónico entre CTX y CAZ

Resultado: Sinergia

Beesley et al

� CAZ, CTX y CAZ/APB, CTX/APB

Resultado positivo: Ampliación del halo +5mm

Pasteran et al

CASO No.1

Paciente varón de 78 años con litiasis biliar y colecistectomía, ha presentado varios

episodios de colangitis (Infección del conducto colédoco).

Acude a urgencias con fiebre de 3 días de evolución. Se tomó hemocultivo y líquido biliar

para cultivo, de los cuales se aisló E. coli.

El antibiograma por el laboratorio arrojo los siguientes resultados:

REPORTE DE LABORATORIO

Antibiótico Interpretación

Cefazolina R

Ceftazidima R

Cefotaxima I

Cefepime S

Aztreonam I

Piperacilina I

Imipenem S

Meropenem S

1. Que mecanismo de resistencia puede presentar el microorganismo?

Que prueba haría para confirmarlo?

CASO No.1Respuesta No.1

El resultado del antibiograma sugiere una resistencia a

cefalosporinas de I y III generación y resistencia a

monobactam, lo cual podría generar sospecha de la

presencia de betalactamasas de espectro extendido ó

AmpC.

Se realizaría la prueba confirmatoria de BLEE

recomendada por CLSI.

CASO No.1

La prueba confirmatoria de BLEE dio el siguiente resultado:

2. Como interpretaría esta prueba y que mecanismo de resistencia está

implicado en este caso?

3. Que pruebas adicionales podría utilizar en el laboratorio para confirmar

este mecanismo?

CASO No.1Respuesta No.2 y 3

RESPUESTA 2. Al realizar la prueba tamiz de BLEE y

observar que no amplia con acido clavulánico, podría

sugerir la presencia de AmpC.

RESPUESTA 3. Podría realizarse si el laboratorio lo desea la

prueba de disco AmpC, test tridimensional, disco con

acido borónico.

Probar la resistencia a cefoxitin, ya que es predictor de

AmpC.

Detección de Metalo β-lactamasas Clase B (grupo 3) Enzimas: IMP-1,VIM-1,CcrA, BcII , GIM

� Denominadas metalo β-lactamasas (MBLs)

� Hidrolizan carbapenemes, β lactámicos y los

inhibidores de β-lactámicos como acido

clavulánico y tazobactam. No aztreonam

� Susceptible a la inhibición de agentes quelantes

como EDTA, acido mercaptoacético y acido

mercaptopropiónico (MPA).

� Dependiente de Zinc

Detección de metalo β lactamasas por el Laboratorio

CLSI no tiene estandarizada la detección

de metalo β lactamasas por el

Laboratorio.

E test� Tira con Imipenem e Imipenem/EDTA

� Reducción ≥3 diluciones en presencia de

EDTA es positivo para MBLs

� Falsos positivos P.aeruginosa

y A. baumannii

Timothy R. Walsh,et al. J Clin Microb. 20025. 40(8): 2755-2759

Detección de metalo β lactamasas por el Laboratorio

Prueba de Sinergismo

� Suspensión del microorganismo

0.5 McFarland

� Dos discos de imipenem y

meropenem

� Se adiciona EDTA

� Varios agentes quelantes

� SinergiaSanchez A, et al. Rev Esp Quinioterap. 2004;17(4):336-340.

Detección de β lactamasas tipo Oxacilinasa Clase D (grupo 2d) OXA-1, OXA-10

� Las β-lactamasas tipo OXA son enzimas dependientes

de serina.

� β-lactamasas de espectro amplio: penicilinas y

cefalosporinas

� β-lactamasas con espectro de hidrólisis expandido:

cefalosporinas de espectro extendido y carbapenemes

� No son inhibidas por el Ac. Clavulánico

� Inhibidas por NaCl

Detección de β lactamasas tipo Oxacilinasa por el Laboratorio

CLSI no tiene estandarizada la detección de β

lactamasas tipo OXA por el Laboratorio

Literatura recomienda análisis

espectrofotométricos con extractos celulares

en presencia de NaCl.

Pruebas Moleculares

Como reconozco?

BLEE

� Neta R a cefalotina

� Sensibilidad Imi, Mer

� Amplia con acido clavulánico

� Sensible a FOX

� Afecta la CIM de penicilina, C1,2, 3 y 4G y Azt

Como reconozco?AmpC

�Neta R a cefalotina

� Sensibilidad Imi, Mer

� Resistencia ó sensibilidad disminuída a FOX

� CIM de Aztreonam y C3G (nivel bajo de R)

� C4G sensible

Detección de β lactamasas tipo Carbapenemasas Clase A (grupo 2f) Enzimas: IMI, SME y KPC

� Enzimas que hidrolizan carbapenemes,

cefalosporinas, penicilinas y aztreonam.

� Son inhibidas por el clavulánico y tazobactam.

� Se encuentran en Enterobacter cloacae,

Serratia marcescens y K. pneumoniae.

� También en no fermentadores como P.

aeruginosa.


� Sistemas automatizados presentan

limitaciones en la detección de

carbapenemasas

� Imipenem es afectado por el inóculo


CLSI

Enterobacterias resistentes a una ó más

cefalosporinas de III generación (CIM elevada ó

reducida zona inhibición a carbapenemes)

“puede ser un aislamiento productor de

carbapenemasa”, a pesar de estar dentro del

rango de susceptible


Antibiótico Difusión en disco(mm)

Microdilución en caldo

(µg/mL)

Imipenem -- 2-4

Meropenem 16-21 2-4

Ertapenem 19-21 2

Prueba tamiz

Detección de β lactamasas tipo carbapenemasas por el Laboratorio

� Prueba Confirmatoria “Test de Hodge”


� Disco ertapenem ó meropenem

� Estría del microorganismo

Laboratorio de Microbiología Universidad Nacional


CLSI REPORTE POR EL LABORATORIO

Los aislamientos positivos con el Test de Hodge pero

susceptibles a carbapenemes:

� Reportar CIM de los carbapenemes sin interpretación “Estos

aislamientos demostraron producción de carbapenemasas. La

eficacia clínica de los carbapenemes no ha sido establecida

para el tratamiento de infecciones causadas por

Enterobacteriaceae donde las pruebas para carbapenemes

(ertapenem ≤2µg/mL, meropenem e imipenem ≤4µg/mL)

fueron sensibles, pero demostraron producción de

carbapenemasa in vivo”


CLSI REPORTE POR EL LABORATORIO

Los aislamientos negativos con el Test de

Hodge:

� Reportar el dato de la CIM de los

carbapenemes de acuerdo a los criterios de

interpretación de CLSI.

Otras Pruebas para la detección de β lactamasas tipo carbapenemasas por el Laboratorio

Prueba sinergismo con doble disco y acido borónico

� Suspensión del microorganismo al 0.5 McFarland

� Discos de imipenem, meropenem ó ertapenem y acido

borónico

� Sinergia

Pasteran F, et al. J. Clin. Microbiol. 2009 June47( 6):1631-1639

Otras Pruebas para la detección de β lactamasas tipo carbapenemasas por el Laboratorio

Prueba con acido borónico

� Suspensión del microorganismo al 0.5 McFarland

� Discos de imipenem, meropenem ó ertapenem

� Acido borónico inhibidor reversible de enzima KPC

� Incremento ≥5mm

Pasteran F, J. Clin. Microbiol. 2009 June47(6):1631 -163

CASO No.2Mujer de 45 años, VIH-positiva, fue ingresada por absceso del tubo ovárico. Durante el

procedimiento quirúrgico se tomó muestra del líquido peritoneal y se aislaron 2 fenotipos

de Klebsiella pneumoniae. Al realizar las pruebas de susceptibilidad por difusión en disco

se obtuvo el siguiente reporte para los dos fenotipos:

1. Que le sugieren a usted los resultados del antibiograma para los dos reportes?

2. Se requiere una prueba confirmatoria para el reporte No.1? En caso de ser una respuesta positiva

cual prueba realizaría para confirmarlo?

3. Se requiere una prueba confirmatoria para el reporte No.2? En caso de ser una respuesta positiva

cual prueba realizaría para confirmarlo?


Aislamiento No 1

Antibiótico (mm)/Interpretación

Ceftazidima 15(R )

Cefotaxima 19 (R )

Cefepime 12( R)

Ceftriaxona 16(R)

Imipenem 21 (S)

Meropenem 18 (S)

Ertapenem 19 (S)


Aislamiento No.2

Antibiótico Interpretación

Ceftazidima 15 (R )

Cefotaxima 19 (R )

Cefepime 12( R)

Ceftriaxona 16(R)

Imipenem 6 (R )

Meropenem 8 (R )

Ertapenem 10 (R )

CASO No.2Respuesta No.1, 2 y 3

RESPUESTA 1. El reporte 1, se observa sensibilidad a carbapenemes, de acuerdo a los

rangos sugeridos por CLSI como sospechosos de carbapenemasa, debemos sospechar de la

presencia de una carbapenemasa

El reporte 2, de acuerdo a los halos de los carbapenemes se observa una franca resistencia.

Las carbapenemasas son enzimas capaces de hidrolizar todos los antibióticos beta-

lactámicos incluyendo carbapenemas como imipenem, meropenem y ertapenem.

RESPUESTA 2. Si se requiere una prueba confirmatoria ya que los halos sugieren una

sospecha de carbapenemasa. Se realizaría la prueba de Hodge.

RESPUESTA 3. No se requiere una prueba confirmatoria porque CLSI recomienda “No es

necesario probar un aislamiento para carbapenemes realizando el test de Hodge, cuando

todos los carbapenemes reportados por el laboratorio son intermedios o resistentes.

CASO No.2El laboratorio realizo la prueba de Hodge para el aislamiento 1(C)

obteniéndose el siguiente resultado

1.Control Negativo

2.Control Positivo

3.Aislamiento estudiado

4. Como reportaría el aislamiento 1 y 2 al clínico? Realizaría algún cambio en

el reporte?

CASO No.2Respuesta No.4

RESPUESTA 4. El reporte 1 da una prueba de Hodge positiva. Se

reportan los carbapenemes sin la interpretación con el siguiente

comentario:

“ Este aislamiento demuestra producción de carbapenemasas. La

eficacia clínica de los carbapenemes no ha sido establecida para el

tratamiento de infecciones causadas por Enterobacteriaceae donde

las pruebas para carbapenemes (ertapenem ≤2µg/mL, meropenem

e imipenem ≤4µg/mL) fueron sensibles, pero demostraron

producción de carbapenemasa in vivo”

Para el reporte 2 se debe informar las CIM de los carbapenemes con

la interpretación de criterios de acuerdo a CLSI.

Resistencia a Quinolonas

Mecanismo de acción

� Ingreso a la célula: Porinas

� Sitio de acción: DNA girasa (Gram neg)

Topoisomerasa IV (Gram pos)

� Efecto: Cambio en el enrollamiento DNA

Mecanismo de Resistencia

� Alteración sitio blanco del AB

� Reducción permeabilidad

� Eflujo

Detección de Resistencia a Quinolonas

CLSI

Aislamientos de Salmonella spp susceptibles a

fluoroquinolonas y con una prueba a acido nalidixico

resistente pueden estar asociados con fracaso clínico ó

respuesta tardía en pacientes tratados con fluoroquinolonas

con salmonelosis extrainstestinal. “aislamientos

extraintestinales de Salmonella extraintestinal pueden ser

probados para determinar resistencia a acido nalidixico”

Resistencia en Pseudomonas aeruginosa


� Impermeabilidad (OprD)

� Bombas de eflujo: MEXAB-OprM (R a mer)

β lactámicos, C, quinol, Te, SXT

MEXXY-OprM (S a mer)

Resistencia en P. aeruginosa

� BLEE (PSE) R Tic y Pip

� Carbapenemasas adquiridas (MBLs)

� AmpC

Detección de Resistencia en Psedomonas aeruginosa

CLSI

Retira la recomendación de adicionar un comentario al

reporte en la parte de penicilinas, sugiriendo la adición de un

segundo agente antimicrobiano (ej fluoroquinolona,

aminoglucósidos) para infecciones con P. aeruginosa

Resistencia en Acinetobacter spp


� Impermeabilidad (CarO)

� Bombas de Eflujo

Resistencia en Acinetobacter

� BLEE (tipo OXA)

� Carbapenemasas (VIM, IMP)

� Cefalosporinasas (CAZ R)

Stenotrophomonas maltophilia

� Patógeno oportunista

� Brotes Hospitalarios

� Uso de AB de amplio espectro

Resistencia en Stenotrophomonas maltophilia


� Impermeabilidad

� Bombas de eflujo

Resistencia en Stenotrophomonas maltophilia

� β lactamasas inducibleL1: R a amp, R Inh β lactámicos,

R carbap, S aztreonam

� β lactamasas L2 inducible: R a amp y azt, S a carbap e

inh β lactámicos

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