ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE ... OBREGOSO...Los aceites esenciales son líquidos...

UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRÍCOLA MENCIÓN AGROINDUSTRIAL

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE

ESENCIAL DE TRES ESPECIES DE Citrus limon CONTRA Escherichia coli Y Staphylococcus aureus

TRABAJO EXPERIMENTAL

Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de

INGENIERA AGRÍCOLA MENCIÓN AGROINDUSTRIAL

AUTOR

ESPINEL OBREGOSO ANDREA JUDITH

TUTOR

Ing. MORAN BAJAÑA JOAQUIN TEODORO, M.Sc

MILAGRO – ECUADOR

2020

PORTADA

4

Dedicatoria

Quiero dedicar mi trabajo a Dios por ser el motor

fundamental en mi vida. A mis padres Francisco

Espinel y Paola Obregoso, mi abuelita Norma

Guadalupe, tías y hermano, quienes han sido mi

apoyo para poder seguir adelante en cada etapa

de mi vida.

En el cielo hay dos ángeles quienes me querían

mucho, me brindaron su apoyo y quienes confiaron

en mí, aunque no alcanzaron a verme desarrollada

en esta etapa de mi vida quiero dedicarles mi tesis

porque sé que desde el cielo me guian y cuidan, a

mi abuelito Emiro Espinel y mi tía Karola Obregoso.

5

Agradecimiento

Agradezco a Dios por las fuerzas y sabiduría

que me ha brindado para poderme desarrollar

en la vida cotidiana y lograr culminar esta etapa.

Agradezo a mi Universidad Agraria del Ecuador,

por haberme brindado enseñanzas y darme

unas hermosas experiencia para poder

desarrollarme en mi vida cotidiana y laboral.

Un agradecimiento especial para quien fue mi

guía en la elaboración de mi tesis a mi Tutor el

Ing. Joaquín Moran Bajaña, estoy muy

agradecida por su apoyo y por brindarme sus

conocimientos para poder tener un resultado

exitoso en mi trabajo experimental.

A mis amigos Cecilia, Cinthya, Andres, Paul,

Carlos, Renata y Judith quienes han sido una

ayuda fundamental en estos años de amistad,

ellos confiaron en mí y me motivaron a no

rendirme nunca.

A los profesores que de una u otra manera me

han brindado sus conocimientos y apoyo

durante esta etapa universitaria.

7

Índice general

PORTADA ......................................................................................................... 1

APROBACIÓN DEL TUTOR ................. ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN . ¡ERROR! MARCADOR

NO DEFINIDO.

Dedicatoria ........................................................................................................ 4

Agradecimiento ................................................................................................ 5

Autorización de Autoría Intelectual ..................... ¡Error! Marcador no definido.

Índice general ................................................................................................... 7

Índice de tablas ................................................................................................ 9

Indice de figuras ............................................................................................. 10

Resumen ......................................................................................................... 11

Abstract ........................................................................................................... 12

1. Introducción ............................................................................................... 13

1.1 Antecedentes del problema ..................................................................... 13

1.2 Planteamiento y formulación del problema ............................................ 14

1.3 Justificación de la investigación ............................................................. 15

1.4 Delimitación de la investigación .............................................................. 16

1.5 Objetivo general ........................................................................................ 16

1.6 Objetivos específicos ............................................................................... 16

1.7 Hipótesis .................................................................................................... 16

2. Marco teórico .............................................................................................. 17

2.1 Estado del arte........................................................................................... 17

2.2 Bases teóricas ........................................................................................... 19

2.3 Marco legal ................................................................................................ 32

8

3. Materiales y métodos ................................................................................. 34

3.1 Enfoque de la investigación ..................................................................... 34

3.2 Metodología ............................................................................................... 34

4. Resultados .................................................................................................. 41

4.1 Extracción de los aceites esenciales ...................................................... 41

4.2 Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la

especies de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus ................ 41

4.3 Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los

antibióticos comerciales ................................................................................ 42

5. Discusión .................................................................................................... 45

6. Conclusiones .............................................................................................. 47

7. Recomendaciones ...................................................................................... 48

8. Bibliografía .................................................................................................. 49

9. Anexos ........................................................................................................ 57

9.1 Anexos Analisis de varianza ................................................................... 64

9

Índice de tablas

Tabla 1: Tratamientos de evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite

esencial de tres especies de Citrus limon contra Escherichia coli y

Staphylococcus aureus ................................................................................ 35

Tabla 2. Tabla de dosificación de los aceites esenciales ............................. 36

Tabla 3. Esquema de análisis de Varianza .................................................. 40

Tabla 4. Resultados de los análisis fisicoquímico de los aceites esenciales 41

Tabla 5. Medición del halo bacteriano de Staphylococcus aureus en muestras

con aceites esenciales de C. limon y antibioticos. ....................................... 41

Tabla 6. Medición del halo bacteriano de Escherichia coli en muestras con

aceites esenciales de C. limon y antibioticos. .............................................. 42

Tabla 7. Medición del halo ........................................................................... 42

Tabla 8. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y

antibioticos. .................................................................................................. 43

Tabla 9. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y

antibioticos ................................................................................................... 43

Tabla 10. Contaje microbiano ...................................................................... 43

10

Indice de figuras

Figura 1. Diagrama de flujo de la extracción de aciete esencial de la cáscara

de limón (Citrus aurantifolia) ........................................................................ 37

Figura 2. Extraccion de los aceites esenciales ............................................ 57

Figura 3. Calibracion del peachimetro.......................................................... 57

Figura 4. Limpieza ....................................................................................... 58

Figura 5. Agar MacConkey y Agar Baird Parker .......................................... 58

Figura 6. Pesado del medio del Agar MacConkey ....................................... 59

Figura 7. Mezcla y medición de pH del Agar MacConkey ............................ 59

Figura 8. Sacando del autoclave el Agar ..................................................... 60

Figura 9. Agar MacConkey en la caja petric ................................................ 60

Figura 10. Cajas Petri en fundas ziploc y almcenadas en refrigeración. ...... 61

Figura 11. Medicón de pH del Agar Baird Parker ......................................... 61

Figura 12. Agar Baird Parker con EYT ......................................................... 62

Figura 13. Cajas Petri en las fundas Ziploc y congelación durante 24 horas 62

Figura 14. Materiales, utensilios y equipos a utilizar, para la siembre de las

bacterias (E. coli y S. aureus) ...................................................................... 63

Figura 15. Siembra de las cepas bacterianas, colocación de discos de

antibióticos y de los aceite esencial de variedades C. limon ........................ 63

file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953624file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953624file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953625file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953626file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953627file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953630

11

Resumen

Los aceites esenciales son líquidos aromáticos de aspecto fluido o espeso y de

color variable dependiendo de las plantas de las que estos son extraídos. Poseen

compuestos con efectos microbicidas, medicinales, aromatizantes y antisépticos,

los cuales son inocuos para el medio ambiente. Se planteó una investigación

cuyos objetivos fueron: Evaluar el efecto de la actividad antibacteriana de los

aceites esenciales del limón contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Extraer aceite esencial de las tres variedades de Citrus limon. Evaluar el efecto

antibacteriano del aceite esencial extraído de la especie de C. limón sobre

Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Comparar el efecto antibacteriano de

los aceites esenciales frente a los antibióticos comerciales. Se aplicó un diseño

Completamente al Azar DCA con arreglo factorial A (tres especies de limón) x B

(tres dosis de aceites esenciales) (32) + 3 testigos (total 12 tratamientos). La

comparación de medias se realizó mediante el test de Tukey (p

12

Abstract

The essential oils are aromatic liquids of fluid or thick appearance and of variable

color depending on the plants from which they are extracted have compounds

with microbicidal, medicinal, flavoring and antiseptic effects, which are harmless

to the environment. An investigation was proposed whose objectives were: To

evaluate the effect of the antibacterial activity of the essential oils of lemon

against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Extract essential oil from

the three varieties of Citrus lemon. To evaluate the antibacterial effect of the

essential oil extracted from the species of C. lemon on Escherichia coli and

Staphylococcus aureus. Compare the antibacterial effect of essential oils against

commercial antibiotics. A Randomly DCA design with factorial arrangement A

(three species of lemon) x B (three doses of essential oils) (32) + 3 controls (total

12 treatments) was applied. The comparison of means was performed using the

Tukey test (p

13

1. Introducción

1.1 Antecedentes del problema

Diversas fuentes han reportado que el hombre primitivo tuvo que desarrollar

su capacidad sensorial e intuitiva para lograr la supervivencia. Es así como se

aprendió a emplear las hierbas, frutos y raíces comestibles disponibles en su

entorno.

Algunos descubrimientos arqueológicos, tal como reportan Saz y Ortiz, (2018)

que datan del año 3500 A.C. sostienen que se realizaban destilaciones primitivas

en ollas de barro, para la obtención de los aceites esenciales, los cuales eran

utilizados para tratamientos medicinales y cosmetológicos.

Esta misma fuente acota que estos aceites contienen moléculas lipofílicas,

con un peso molecular bajo, que se sintetizan como producto del metabolismo

secundario de las plantas. La composición química de los aceites esenciales no

es siempre igual, aunque sí se mantiene una composición química similar entre

plantas de una misma especie.

Como aceites esenciales se conoce al líquido oleoso volátil, que es

insaponificable, mismos que se obtienen de las diferentes partes de una planta:

hojas, raíces, flores, semillas y frutas, por extracción de métodos físicos. Cerutti

y Neumayer (2004) refieren que la cáscara del limón (Citrus limon) contiene 0,4

% de aceite; se encuentra en sacos de forma ovalada en el pericarpio o en la

porción coloreada de la cáscara, y actúa como barrera tóxica natural contra

varios microorganismos e insectos.

Se informa que hace mucho años atrás, se descubrieron las propiedades

antifúngicos de los aceites esenciales, pero no han sido muy utilizados en el

desarrollo de productos comerciales por el motivo de que a la industria se le hace

14

más complicado encontrar, patentar y proteger productos naturales diferente a

como pasa con los productos sintéticos (Perez y otros, 2015).

En los últimos años, se han observado que los fungicidas botánicos se han

ido intensificando, desde que ha sido mostrado que puede mitigar el impacto

negativo de los fungicidas sintéticos, evitándose los residuos sobre los alimentos,

la contaminación ambiental y la resistencia de los patógenos.

1.2 Planteamiento y formulación del problema

1.2.1 Planteamiento del problema

En la actualidad se utilizan muchos productos químicos sintéticos (aditivos

alimentarios, abonos, hormonas, etc.) utilizados en la agricultura y en la industria

alimenticia. Son productos que se han empleado incontroladamente

amenazando el equilibrio del ecosistema. Los mismos, aplicados correctamente

con reglamentos, mejoran la calidad y seguridad de los productos, sin embargo,

con el pasar del tiempo afectan a la salud del ser humano.

Con el pasar del tiempo el ser humano ha convivido con los microorganismos

por lo que la relación humano-bacteria desprende consecuencias importantes

como las que causan enfermedades infecciosas (Vidal, 2014).

Ciertos autores aseguran que un gran porcentaje de enfermedades

transmitidas por alimentos (ETA´s), son transmitidas por alimentos

contaminados, mismas que provocan efectos nocivos para la salud humana,

convirtiéndose en uno de los principales problemas de salubridad en el mundo

(Guerra y otros, 2014).

Los antibióticos son una gran ayuda para prevenir la proliferación bacteriana,

el cual ha salvado muchas vidas pero con el pasar del tiempo ha ido creciendo

un nuevo problema, la resistencia bacteriana, un hecho oculto hasta ese

15

momento a los seres humanos, pero existente en el mundo microbiológico. Los

aceites esenciales tienen propiedades antibacterianas contra microorganismos

patógenos para el ser humano, así como para lo aquellos presentes en los

alimentos, bien por su implicación en toxiinfección bacteriana y también por su

capacidad para alterar las propiedades organolépticas de conservación

alimentaria (Zekaria, 2014).

1.2.2 Formulación del problema

¿Pueden los aceites esenciales del limón inhibir el crecimiento de E. coli y S.

aureus?

1.3 Justificación de la investigación

Citrus limon posee propiedades beneficiosas para la salud humana y es un

fruto abundante en el Ecuador lo cual le confiere una posición ventajosa para su

utilización. La producción de limón se concentra en las provincias del Guayas y

Manabí.

Varios reportes señalan que el aceite esencial del limón tiene características

de conservación en algunos alimentos inclusive se ha sugerido su capacidad

antimicrobiana. Precisamente esta última propiedad requiere estudios para

evaluar su efectividad como agente antagónico de los microorganismos

contaminantes en los alimentos principalmente.

La información obtenida del presente trabajo investigativo coadyuvará a

conocer el alcance de los aceites esenciales del limón en el control de bacterias

patógenas relacionadas con productos de consumo. Los productores de

alimentos, a nivel artesanal como industrial, podrán contar con estas sustancias

químicas así como entender el procedimiento tecnológico para obtenerlas y

reconocer su eficiencia inhibitoria de microorganismos patógenos.

16

1.4 Delimitación de la investigación

Espacio: Se realizó la investigación en Laboratorio de Microbiología de la

Ciudad Universitaria Milagro de la Universidad Agraria del Ecuador (CUM)

Tiempo: Se ejecutó en un tiempo de 8 meses.

Población: El producto está dirigido a personas que requiera usar aceites

esenciales como inhibidores bacterianos.

1.5 Objetivo general

Evaluar el efecto de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales del

limón contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

1.6 Objetivos específicos

• Extraer aceite esencial de tres variedades de Citrus limon

• Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la especies

de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus.

• Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los

antibióticos comerciales.

1.7 Hipótesis

Los aceites esenciales del limón poseen actividad antibacteriana.

17

2. Marco teórico

2.1 Estado del arte

(Argote (2017) evaluó la capacidad antibacteriana de aceites esenciales de

eucalipto, limón y mandarina frente a bacterias ATCC Staphylococcus aureus y

Escherichia coli , tratamientos en los que se observó que los mejores fueron el

de eucalipto y limón frente a la bacteria Gram positiva y para la Gram negativa

el aceite esencial de cáscara de mandarina.

Black, Ventura, Barrera y Bautista (2017) desarrollaron aceites obtenidos por

hidrodestilación para ser usados como antimicrobianos, los aceites de mayor

connotación fueron el aceite de canela que inhibió el crecimiento micelial de A.

alternata, mientras que, la germinación se inhibió 100 % con la presencia de

aceites de limón y epazote (0.25 y 0.5 μL∙ mL-1).

Scalvenzi (2016) evaluó dos tipos de aceites esenciales, Citrus limon y

Cymbopogon citratus, sobre el crecimiento in vitro de los hongos fitopatógenos

Rhizopus stolonifer, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, donde se

mostró una actividad antifúngica del aceite C. citratus fue de (p

18

antiinflamatoria, antidiarreica y antimicótica según los resultados afirma que dan

mejor sabor a los alimentos, al igual que su conservación y estimulación de las

enzimas digestivas. En diferentes especies pecuarias han mostrado sus

beneficios para mejorar la digestibilidad, conversión alimenticia y productividad

de los animales, como su efecto antiparasitario y antioxidante.

Rivas, Rivas, y Gamboa (2015) obtuvieron el aceite esencial del Ocimum

basilicum por hidrodestilación, en el mismo que se determinó la composición

química por medio de Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas, se

evaluó la actividad antibacteriana que contiene este aceite para las cepas de

Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

enteritidis y Staphylococcus aureus. La acción antibacteriana se cuantificó

midiendo el diámetro del halo de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor

de discos Whatman dando como resultado que las bacterias Gram positivas (B.

subtilis y S. aureus), fueron las más susceptibles al aceite esencial

Hilvay (2015) evaluó el efecto de aplicación de los aceites esenciales del

Limón, Albahaca y orégano como agente antimicrobiano en la carne de cuy,

donde se observó que no se detectó salmonella logrando mantener un color,

olor, sabor, aceptabilidad y una vida útil de 40 días.

Ruiz, Díaz, y Rojas (2015) desarrollaron repelentes antimicrobianos para una

plaga que afecta el espárrago (Thrips tabaci) con aceites esenciales de 10

plantas aromáticas en el cual el tratamiento con mayor porcentaje de aceite

esencial de paniculata ("matico de la sierra"), resultó más eficaz contra las plagas

debido a que logro erradicar en un 75 % dicha plaga.

Elizari (2013) utilizó aceites esenciales de orégano y tomillo como agente

antimicrobiano. Se observó que la inhibición del crecimiento bacteriano aumentó

19

con la concentración de los dos aceites esenciales. No hubo mucha diferencia

en la inhibición bacteriana, aplicándole los aceites en soluciones formadoras de

films, ni tampoco entre los aceites de orégano y tomillo, su inhibición fue alta

mientras la concentración de bacterias fue inferior a 108 log ufc/mL

2.2 Bases teóricas

2.2.1 Aceites Esenciales

Un aceite esencial es un líquido aromático de aspecto fluido o espeso y de

color variable según las plantas de las que estos son extraídos, son producidas

por células especiales que se encuentran en las hojas, como en las flores, la

madera, las raíces o semillas. Los aceites esenciales tienen compuestos con

efectos fungicidas, medicinal, aromatizantes, etc., los cuales son inocuos para el

medio ambiente, los consumidores y para el control de poscosecha (Barrera y

Garcia, 2008).

Los aceites esenciales son producidos por las plantas con la intención de ser

protegidas de plagas, enfermedades e inclusive de la invasión de otras plantas

y atraen insectos y aves (polinizantes). Su protección y atracción, se ven

reflejadas en propiedades antisépticas, antiinflamatorias, antidepresivas,

afrodisíacas y otras, presentes en mayor o menor grado en la totalidad de los

aceites (León, Osorio y Martinez, 2015).

Espinoza (2014) dice que se han analizado en la actualidad más de 300

aceites esenciales de una gran variedad de especies vegetales, se utilizan en

diferentes áreas de la industria como 200 aceites, los cuales han tenido un valor

comercial muy elevado.

Los aceites esenciales en especial de frutos cítricos tienen un poder

antimicrobiano siendo alternativas efectivas contra infecciones producidas por

20

microorganismos patógenos los que causan enfermedades y se vuelven

resistentes a los antibióticos. Los aceites son sacados de la corteza de la naranja

realizada con el método de hidrodestilación para determinar su actividad

antimicrobiana con los organismos Gram negativo y Gram positivo. Con el aceite

puro, las cepas Gram positivas fueron muy resistentes y las cepas Gram negativo

tuvieron una sensibilidad a partir con el 10 % (Guerra y otros, 2014).

2.2.1.1 Clasificación de los aceites esenciales

Los aceites esenciales se pueden clasificar con base en diferentes criterios:

consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios.

Consistencia

De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en:

esencias, bálsamos, resinas.

Las esencias, son líquidos volátiles a temperatura ambiente.

Los bálsamos, son extractos naturales obtenidos de un arbusto o un árbol. Se

caracterizan por tener un alto contenido de ácido benzoico y cinámico, así como

sus correspondientes ésteres. Son de consistencia más espesa, son poco

volátiles y propensos a sufrir reacciones de polimerización, son ejemplos el

bálsamo de copaiba, etc (Salomé y otros, 2014).

Dentro del grupo de las resinas podemos encontrar a su vez una serie de

posibles combinaciones o mezclas: Resinas, son productos amorfos sólidos o

semisólidos de naturaleza química compleja. Pueden ser de origen fisiológico o

fisiopatológico. Por ejemplo, la colofonia, obtenida por separación de la

oleorresina trementina. Contiene ácido abiético y derivados.

Oleorresinas, son mezclas homogéneas de resinas y aceites esenciales. Por

ejemplo, la trementina, obtenida por incisión en los troncos de diversas especies

21

de Pinus. Contiene resina (colofonia) y aceite esencial (esencia de trementina)

que se separa por destilación por arrastre de vapor. También se utiliza el término

oleorresina para nombrar los extractos vegetales obtenidos mediante el uso de

solventes, los cuales deben estar virtualmente libres de dichos solventes. Se

utilizan extensamente para la sustitución de especias de uso alimenticio y

farmacéutico por sus ventajas (estabilidad y uniformidad química y

microbiológica, facilidad de incorporar al producto terminado). Éstos tienen el

aroma de las plantas en forma concentrada y son líquidos muy viscosos o

sustancias semisólidas (oleorresina de pimentón, clavo, etc.) (Pizarro, 2015).

2.2.1.2 Origen de los aceites esenciales

Los aceites esenciales naturales se obtienen directamente de la planta y no

sufren modificaciones físicas ni químicas posteriores, debido a su rendimiento

tan bajo son muy costosos.

Los artificiales se obtienen a través de procesos de enriquecimiento de la

misma esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de

esencias de rosa, geranio y jazmín, enriquecida con linalol, o la esencia de anís

enriquecida con anetol. Montoya (2010), dice que los aceites esenciales

sintéticos, como su nombre lo indica, son los producidos por la combinación de

sus componentes los cuales son la mayoría de las veces producidos por

procesos de síntesis química. Estos son más económicos y por lo tanto son

mucho más utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencias de vainilla,

limón, fresa, etc.)

2.2.1.3 Naturaleza química de los aceites esenciales

El contenido total en aceites esenciales de una planta es en general bajo

(inferior al 1 %) pero mediante extracción se obtiene en una forma muy

22

concentrada que se emplea en los diversos usos industriales. La mayoría de

ellos, son mezclas muy complejas de sustancias químicas. El término quimiotipo

alude a la variación en la composición del aceite esencial, incluso dentro de la

misma especie. Un quimiotipo es una entidad químicamente distinta, que se

diferencia en los metabolitos secundarios (Salomé y otros, 2007).

2.2.2. Características de los aceites esenciales

Los aceites esenciales son volátiles y líquidos a temperatura ambiente.

Recién destilados son incoloros o ligeramente amarillos. Su densidad es inferior

a la del agua (la esencia de sasafrás o de clavo constituyen excepciones). Casi

siempre dotados de poder rotatorio, tienen un índice de refracción elevado. Son

solubles en disolventes orgánicos habituales, como éter o cloroformo, y alcohol

de alta gradación. Son liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son

arrastrables por el vapor de agua (Padrini y Lucheroni, 2015).

2.2.2.1 Acción antimicrobiana del aceite esencial

La acción antimicrobiana puede ser lograda mediante algunos compuestos

químicos naturalmente presentes en los alimentos, y en cantidades suficientes,

como la lisozima presente en el huevo y algunos ácidos orgánicos en frutas. En

algunos casos se pueden formar durante el procesamiento, como el ácido láctico

durante la fermentación de la leche para la producción del yogur (Pitarch, 2000).

Existe una amplia variedad de alimentos que contiene antimicrobianos naturales

o biocomponentes que pueden actuar como antimicrobianos, que abarcan desde

la sal común, pasando por alimentos como la zanahoria, rábanos picantes, ajo,

cebolla, entre muchos otros. Se encuentran especias y hierbas con acción contra

bacterias y mohos como: tomillo, clavo, orégano, romero, o canela, entre otras.

Los aceites esenciales de plantas y frutas también tienen una acción

23

antimicrobiana, los cuales también pueden ser agregados como antimicrobianos

naturales a los alimentos (Reyes y otros, 2014).

Los aceites esenciales son efectivos agentes antimicrobianos tanto en su fase

vapor como por contacto directo contra numerosas bacterias patógenas, Gram

negativos y Gram positivos, como mohos, levaduras e incluso moho productores

de micotoxinas (Ramos, 2014). Dichas propiedades se debe a los compuestos

químicos presentes en los aceites esenciales, siendo los monoterpenos,

sesquiterpenos y diterpenos los responsables de las propiedades antioxidantes,

aromáticas y antimicrobianas.

2.2.2.2 Características físicas de los aceites esenciales

Los aceites esenciales son volátiles y son líquidos a temperatura ambiente.

Los aceites esenciales recien destilados son incoloros o ligeramente

amarillos. Su densidad es inferior a la del agua (la esencia de sasafrás o de clavo

constituyen excepciones). Casi siempre dotados de poder rotatorio, tienen un

índice de refracción elevado. Son solubles en alcoholes y en disolventes

orgánicos habituales, como éter o cloroformo, y alcohol de alta gradación. Son

liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son arrastrables por el vapor de

agua (Navarrete y otros, 2009).

2.2.2.3 Carácter químico de los aceites esenciales

Los componentes de los aceites se clasifican en terpenoides y no terpenoides.

No terpenoides: En este grupo tenemos sustancias alifáticas de cadena corta,

sustancias aromáticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. No son

tan importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y aplicaciones.

Terpenoides: Son los más importantes en cuanto a propiedades y

comercialmente (Andrade y otros, 2017).

24

2.2.3 Aceite esencial de Citrus limon

Los aceites esenciales tienen una calidad que pueden verse afectadas por

los métodos de extracción, por factores como la variedad o tipo de limón que se

vaya a utilizar, la madurez de la fruta y su almacenamiento, también puede

afectar la presencia de luz y de oxígeno, considerando que el factor más

importante es la conservación a bajas temperaturas para evitar alteraciones.

El aceite esencial del limón (Citrus limon) es uno de los aceites más ricos

en vitaminas, contiene sobretodo vitamina C y caroteno, que es un forma de

vitamina A. Contiene también terpenos (limoneno, felandreno, pineno,

sequiterpenos, citrol, citronelol, linelol), acetatos de linalol y geraniol, aldehídos,

etc.). La esencia es obtenida presionando la parte exterior del pericarpio o

corteza de la fruta. Son necesarios 4000 limones para obtener 1 Kg de aceite

esencia (Rojas y otros, 2013).

Tiene innumerables propiedades: es el ingrediente básico en la industria de

perfumes y se utiliza además, en jabones, desinfectantes y productos similares.

También tiene importancia en la medicina, tanto por su sabor como por su efecto

calmante del dolor y su valor fisiológico. En caso de los aditivos, son combinados

con los alimentos para producir ciertas modificaciones que impliquen

conservación, color, reforzamiento del sabor y estabilización, los cuales van a

ayudar a efectuar una mejora sorprendente en nuestros suministros alimenticios,

así como a disminuir el trabajo en la cocina (Ramos, Corona y Guevara, 2015).

Los aceites esenciales de limón se pueden extraer de la cutícula de la cáscara

de limón o de destilar por completo en su totalidad, siendo el segundo con mayor

aporte brinda para tener un mejor rendimiento. Los aceites procedentes de Citrus

limón se considera que tiene más partes liquidas volátiles, obtenidas por

https://www.monografias.com/trabajos11/lasvitam/lasvitam.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos29/especialistas-medicos/especialistas-medicos.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos14/nuevmicro/nuevmicro.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos7/alim/alim.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos/fintrabajo/fintrabajo.shtml

25

destilación mediante un proceso físico, que contienen las sustancias que brindan

el aroma y el sabor característico al limón (León, 2017).

El aceite esencial de limón se producen aproximadamente 3.600 toneladas

anualmente. Este aceite esencial ocupa el segundo lugar luego de la naranja

dulce, los países donde se produce más este aceite esencial se encuentran en

Argentina, Estados Unidos e Italia de ahí van los productores de menor

importancia que están en Brasil, Costa de Marfil, Grecia, España, Israel,

Australia, Perú, Guinea, Indonesia, Venezuela y Chile. La producción de este

producto considerado GRAS (Generally Recognized as Safe), se destina, según

la demanda, al oeste de Europa (40 %), a los Estados Unidos (35 %) y a Japón

(8 %).

La cáscara del limón contiene 0,4 % de aceite, se encuentra en sacos de

forma ovalada en el pericarpio o en la porción coloreada de la cáscara, y actúa

como barrera tóxica natural contra varios microorganismos e insectos. La mayor

producción de aceite esencial de limón se realiza por prensado en frío; de menor

calidad y más económicos, son los destilados de aceites esenciales usados para

la producción de aceites libres de terpenos. Una pequeña parte de aceite de jugo

de limón es producido durante la concentración del jugo. Existen diferencias que

responden al terreno, clima y métodos de producción. En el limón, el tenor de

aceite se incrementa con la maduración del mismo y decrece justo después de

los períodos de lluvia. Los frutos blandos generalmente dan menores

rendimientos que los firmes, esto es debido a que en los blandos, la ruptura de

los sacos contenedores de aceite es ineficiente (Cerutti y Neumayer, 2004).

26

2.2.3.1 Componentes Químicos del Limón

Hesperidina

Es una flavonona glicosídica que se encuentra en frutas y vegetales, se

encuentran en los frutos cítricos como por ejemplo en las mandarinas, limones,

limas y en algunos híbridos (Escobar, 2010). Presentan beneficios para la salud.

Eriocitrina

El papel de los flavonoides y otras sustancias fenólicas en la protección frente

a los ataques por hongos puede producirse de dos formas. Cartaya y Reynaldo

(2001) afirma que es una flavonona glicosidica que se encuentra comúnmente

en los limones, es una flavonona -7-O-glucósidico entre el eriodictyol de

flavonona y el disacárido rutinosa.

2.2.4 Limón Tahiti (Citrus lantifolia)

Origen

El "Limón pérsico", también conocido como "Lima Tahití", "Tahití Lime" o

"Persian Lime" en inglés, es de origen desconocido, pero se supone que pudo

originarse en el sur este de Asia (entre Bruma y el sur de China). Se considera

un híbrido entre la lima mexicana (Citrus aurantifolia Swingle) y la sidra (Citrus

medica Linn) puesto que las flores están desprovistas de granos de polen u

óvulos viables y los frutos raras veces tienen semilla (Garcia, 2014).

Entre los que se halla el limón Tahití que seguramente no es un limón

verdadero sino una lima ácida. Es posible que sea un híbrido entre el Citrus

aurantifolia Chistom y otra especie de citrus no determinada aún (Sarango,

2015).

27

2.2.5 Limón Meyer (Citrus meyeri)

El Limón Meyer (Citrus meyeri) es un cítrico nativo de China del que se cree

que es un cruce entre el limón y la mandarina o la naranja dulce. Entre sus

características destaca su sabor, que en lugar de ser tan ácido como los limones

comunes, es dulce, por lo tanto, mucho más agradables al paladar.

El nombre de estos limones se debe a su descubridor, parece ser que fue en

1908 cuando el norteamericano Frank Meyer, empleado del Departamento de

Agricultura de Estados Unidos, descubrió este cítrico en China, donde se

cultivaban en macetas como planta ornamental y se llevó una muestra a su país,

donde el fruto adquirió gran popularidad.

Hubo un problema con los cultivos de limón Meyer en 1940, cuando se

cultivaba muchísimo en California. Cuentan que la mayoría de árboles estaban

afectados por el virus de la tristeza, así que para evitar que éste afectara al resto

de cultivos de cítricos tuvieron que destruirlos. En la década de los 50, científicos

de la Universidad de California desarrollaron esta variedad de limón mejorada y

más resistente al virus (Medina, 2007).

2.2.5.1 Composición Química

Las características de los flavonoides de Meyer limón son similares a las de

erucocitrina, hesperidina, nobiletina, narirutina, 6,8 diglucosylapigenin, 6,8

diglucosildiosmetina, diosmina es similar al limón Eureka Fue El análisis de los

componentes principales del contenido de flavonoides de cada fruta reveló que

el limón Meyer era una posición intermedia entre el limón Eureka y las

mandarinas (naranja mandarina Unshi) en el ingrediente principal primero y en

el segundo ingrediente del principal diagrama de dispersión. La cumarina 5

geraniloxi 7 metoxicoumarina, 8-geraniloxipsoraleno, 5-geraniloxipsoraleno

https://es.wikipedia.org/wiki/Virus_de_la_tristeza_de_los_c%C3%ADtricos

28

existe específicamente en el limón Eureka y no se incluyó en el limón Meyer. La

5,7 dimetoxicoumarina, de manera característica, contiene un alto contenido en

el limón Meyer y estaba contenida en frutos inmaduros del verde pericarpio

(Miyaki, Inou, y Itoigawa, 2011).

2.2.6 Limón Criollo (Citrus aurantifolia Swingle)

Origen

Su origen fue en el sur de Asia, su transportación fue hecha por los árabes a

través del norte de África y llevada a España y Portugal. Con la colonización llego

a América en el siglo 16, después de un tiempo se trasladó a otros países

antillanos, caribeños y en el sur de Florida, el cual se aclimató. Este tipo de limón

es cultivado en regiones tropicales, subtropicales y semi tropicales del planeta.

Sus principales productores son la India, México, Egipto y los países Caribeños.

Se ha adaptado muy bien y convertido en silvestre en el sur de Florida y en la

América tropical (Phillips y otros, 2015).

2.2.7 Bacteria E. coli

Taxonomía

Esta bacteria pertenece al género Escherichia, de la tribu Escherichieae,

perteneciente a Enterobacteriaceae. Estas bacterias pueden transmitirse

indirectamente a través de agua o alimentos contaminados. Se conocen

diferentes cepas capaces de producir diversos cuadros de gastroenteritis

(Gutiérrez y Sánchez, 2017).

Características

Escherichia coli se caracteriza por poseer bacilos Gram negativos, no

esporulante, producción de indol a partir de triptófano, no utilización de citrato

como fuente de carbono y no producción de acetoína. Además, fermenta la

29

glucosa y la lactosa con producción de gas. Como todas las bacteria Gram

Negativo, la cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana

citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico

constituido por péptido glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su

forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales

relativamente elevadas (Gonzalez, 2013).

Es una bacteria mesófila, su óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno

de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35 a 43 ºC). La

temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica que

un control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial

para evitar el crecimiento en los alimentos. La congelación tiene pocos efectos

sobre la población de esta bacteria en el alimento, y no garantiza la destrucción

de un número suficiente de bacterias viables para asegurar su inocuidad (Merino,

2018). Sin embargo, es sensible a temperaturas superiores a 70 ºC, a partir de

la cual son fácilmente eliminadas; por ello, es muy importante la pasteurización

de alimentos como la leche, zumos, etc., para garantizar su eliminación.

Además de la temperatura, el pH y la actividad de agua pueden influir en la

proliferación de E. coli. las condiciones óptimas de desarrollo para estos

parámetros son de 7,2 y 0,99 respectivamente. El desarrollo de E. coli se detiene

a pH extremos (inferiores a 3,8, o superiores a 9,5), y valores de aw inferiores a

0,94. Por ello, el grado de acidez de un alimento puede constituir un factor de

protección y garantizar su seguridad.

2.2.7.2 Alimentos asociados

La contaminación fecal de las redes de abastecimiento de agua y los

manipuladores de alimentos contaminados, han sido implicados muy

30

frecuentemente en brotes de enfermedad causados por E. coli

enteropatógeno (EPEC), E.coli enteroinvasor (EIEC) y E. coli

enterotoxigénico (ETEC) que produce en los tejidos del hospedador toinas

lábiles al calor (ST) (Instituo de Salud Publica, 2013). Son varios los alimentos

implicados en infecciones por este microorgaqnismos como por ejemplo

sustitutivos del café, hortalizas, ensaladas y purés de patatas, sushi, quesos

blandos madurados por mohos, carne picada insuficientemente cocida

(hamburguesas) y accidentalmente la leche fresca. Los porcentajes aproximados

de presencia de este microorganismo en alimentos es, carne de vacuno 3 a 7 %,

carne de cerdo, aves de corral y carne de cordero 1 a 3 %.

2.2.7.3 Características Coloniales

En la actualidad existen muchos medios para el cultivo de aislamiento e

identificación de enterobacterias. Soria (2009) refiere que el cultivo mencionado

fue desarrollado por MacConkey a comienzos del siglo XX. Este medio está

basado en el hecho de que las sales biliares son precipitadas por los ácidos.

Dentro de los microorganismos entéricos tenemos fermentadores de lactosa

y no fermentadores. Los microorganismos fermentadores de lactosa dan

colonias rosadas a rojas con o sin precipitado biliar, mientras que los no

fermentadores aparecen como colonias trasparentes. La presencia de sales

biliares y cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram

positivas como Enterococcus y Staphylococcus. La selección de los productos

que entran en su composición evitan el “swarming” del Proteus spp. Este medio

es utilizado con muestras clínicas en flora mixta y también es utilizado en análisis

de alimentos.

31

Las colonias de E. coli en agar Levine EMB. (Eosina y azul de metileno) tienen

2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen

brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. En agar McConkey las

colonias son rojas con halo turbio (Callicó y otros, 2004).

2.2.8 Bacteria Staphylococcus aureus

Características

Pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es Gram positivo, aunque las

cepas viejas o los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram negativo.

Tiene forma de coco y puede aparecer en parejas, en cadenas o en racimos. Su

tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de diámetro, es inmóvil y algunas cepas

producen una cápsula externa mucoide que aumenta su capacidad para producir

infección. En relación con su metabolismo, es anaerobio facultativo, coagulasa

positivo, catalasa positiva y oxidasa negativo.

S .aureus se encuentra habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas

húmedas como pliegues inguinales y axilas. “A nivel del vestíbulo nasal anterior

la adherencia parece estar mediada por el contenido en ácidos teicoicos. Se

estima que el índice de portación nasal en los adultos es de alrededor del 20-30

%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30 % de la población puede ser

portador permanente, el 50 % portador intermitente y el 20 % no es colonizado.

Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonización mayor como el

personal de salud, los pacientes en hemodiálisis, diabéticos, adictos a drogas

intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de

virulencia, puede convivir con el huésped humano formando parte de su flora

normal sin causar ningún daño. Existen ocasiones en que este equilibrio se

puede romper” (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene , 2012).

32

Desde las narinas, los portadores pueden transferir bacterias a diferentes

sectores de la piel, aunque habitualmente existe resistencia a la colonización de

la piel intacta. Sin embargo, un traumatismo (muchas veces desapercibido)

puede dar una puerta de entrada al microorganismo. En caso de infección, por

tanto, S. aureus puede ser muchas veces de origen endógeno.

2.3 Marco legal

Ley Orgánica Del Régimen De La Soberanía Alimentaria

TÍTULO I: Principios Generales Artículo 1. Finalidad.- Esta Ley tiene por objeto establecer los mecanismos mediante los cuales el Estado cumpla con su obligación y objetivo estratégico de garantizar a las personas, comunidades y pueblos la autosuficiencia de alimentos sanos, nutritivos y culturalmente apropiados de forma permanente. El régimen de la soberanía alimentaria se constituye por el conjunto de normas conexas, destinadas a establecer en forma soberana las políticas públicas agroalimentarias para fomentar la producción suficiente y la adecuada conservación, intercambio, transformación, comercialización y consumo de alimentos sanos, nutritivos, preferentemente provenientes de la pequeña, la micro, pequeña y mediana producción campesina, de las organizaciones económicas populares y de la pesca artesanal así como microempresa y artesanía; respetando y protegiendo la agro biodiversidad, los conocimientos y formas de producción tradicionales y ancestrales, bajo los principios de equidad, solidaridad, inclusión, sustentabilidad social y ambiental. El Estado a través de los niveles de gobierno nacional y subnacionales implementará las políticas públicas referentes al régimen de soberanía alimentaria en función del Sistema Nacional de Competencias establecidas en la Constitución de la República y la Ley. Artículo 3. Deberes del Estado.- Para el ejercicio de la soberanía alimentaria, además de las responsabilidades establecidas en el Art. 281 de la Constitución el Estado¸ deberá: Fomentar la producción sostenible y sustentable de alimentos, reorientando el modelo de desarrollo agroalimentario, que en el enfoque multisectorial de esta ley hace referencia a los recursos alimentarios provenientes de la agricultura, actividad pecuaria, pesca, acuacultura y de la recolección de productos de medios ecológicos naturales; Establecer incentivos a la utilización productiva de la tierra, desincentivos para la falta de aprovechamiento o acaparamiento de tierras productivas y otros mecanismos de redistribución de la tierra; Impulsar, en el marco de la economía social y solidaria, la asociación de los microempresarios, microempresa o micro, pequeños y medianos productores para su participación en mejores condiciones en el proceso de producción, almacenamiento, transformación, conservación y comercialización de alimentos;

33

Incentivar el consumo de alimentos sanos, nutritivos de origen agroecológico y orgánico, evitando en lo posible la expansión del monocultivo y la utilización de cultivos agroalimentarios en la producción de biocombustibles, priorizando siempre el consumo alimenticio nacional; Adoptar políticas fiscales, tributarias, arancelarias y otras que protejan al sector agroalimentario nacional para evitar la dependencia en la provisión alimentaria; y, Promover la participación social y la deliberación pública en forma paritaria entre hombres y mujeres en la elaboración de leyes y en la formulación e implementación de políticas relativas a la soberanía alimentaria. TÍTULO III: Producción y Comercialización Agroalimentaria CAPÍTULO I.- Fomento a la producción Artículo 12. Principios generales del fomento.- Los incentivos estatales estarán dirigidos a los pequeños y medianos productores, responderán a los principios de inclusión económica, social y territorial, solidaridad, equidad, interculturalidad, protección de los saberes ancestrales, imparcialidad, rendición de cuentas, equidad de género, no discriminación, sustentabilidad, temporalidad, justificación técnica, razonabilidad, definición de metas, evaluación periódica de sus resultados y viabilidad social, técnica y económica (LORSA, 2008). Normas técnicas relacionadas INEN 1 529-1. Control microbiológico de los alimentos. Preparación de medios de cultivos. INEN 1 529-4. Control microbiológico de los alimentos. Recuento microbiológico. INEN 1 529-8. Numero probable de determinación de coliformes fecales y las pruebas confirmatoria de E. coli e identificación de las especies del grupo coliforme. INEN-ISO 212 (Aceites esenciales. Muestreo (ISO 212:2007, IDT)) INEN-ISO 855 (Aceite esencial de limón (Citrus limon (L.), (ISO 855:2003, IDT).

34

3. Materiales y métodos

3.1 Enfoque de la investigación

3.1.1 Tipo de investigación

El nivel de conocimiento de la investigación fue de tipo explorativa y

descriptiva.

3.1.2 Diseño de investigación

Se planteó una investigación experimental debido a que se trabajó con tres

subespecies de limones (Citrus limon ssp: aurantifolia, lantifolia y meyeri),

mismos que según se ha reportado poseen propiedades de inhibición

bacteriana.

Se extrajo los aceites de las cáscaras, con el fin de determinar las

propiedades de inhibición bacteriana a nivel in vitro.

3.2 Metodología

3.2.1 Variables

Se analizó las siguientes variables:

3.2.1.1 Variables independientes

Tres especies de limón (Citrus limon ssp. aurantifolia, lantifolia y meyeri)

Tres concentraciones de aceites esenciales

3.2.1.2 Variable dependiente

Efecto antimicrobiano del aceite esencial de cada variedad

Diámetro del halo inhibitorio

Número de halos (por cada aceite) por especie bacteriana

3.2.2 Tratamientos

Los tratamientos serán distribuidos de la siguiente manera:

35

El factor A estará compuesto de las 3 variedades de limón y el factor B lo

constituirán las 3 concentraciones de aceites esenciales obtenidas de cada una

de las variedades. Los tratamientos testigos corresponderán al antibiótico

penicilina, eritromicina y estreptomicina (Neogen, USA). Los tratamientos

evaluados se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1: Tratamientos de evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de tres especies de Citrus limon contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus

N° Factor A (Variedades) Factor B

(concentraciones de aceites) %

Combinación

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

a1:Citrus lantifolia a1:Citrus lantifolia a1:Citrus lantifolia a2:Citrus meyeri a2:Citrus meyeri a2:Citrus meyeri a3:Citrus aurantifolia a3:Citrus aurantifolia a3:Citrus aurantifolia Penicilina Eritromicina Estreptomicina

b1: 25 b2: 50 b3: 75 b1: 25 b2: 50 b3: 75 b1: 25 b2: 50 b3: 75

a1b1 a1b2 a1b3 a2b1 a2b2 a2b3 a3b1 a3b2 a3b3

Espinel, 2019

3.2.3 Diseño experimental

Se aplicó un diseño Completamente al Azar DCA A x B con arreglo factorial

32 + 3 Para el desarrollo de esta investigación. La comparación de medias de los

tratamientos se realizará con la aplicación del test de Tukey (p

36

Tabla 2. Tabla de dosificación de los aceites esenciales

Especie de limón μL

Citrus aurantifolia Swingle

5 10 15

Citrus lantifolia 5 10 15

Citrus meyeri 5 10 15

Espinel, 2019.

3.2.4 Recolección de datos

Recursos

Recursos materiales

Aceites Esenciales:

Citrus lantifolia

Citrus meyeri

Citrus aurantifolia Swingle

Equipos de Laboratorio:

Balanza (Elite 200-3)

Equipo de Destilación (Tecnal TE-2761/20)

Autoclave (Mediclife YX- 280D)

Insumos:

5 kg. de cascara de limón de cada variedad

Agua

Utensilios:

Cuchillo

Caja Petri

Reactivos:

Agar Macconkey sorbitol 500 g. (Acumedia, USA)

Agar Baird Parker (Acumedia, USA)

Discos con antibióticos (Difco, USA)

37

Cultivo de E. coli. (ATCC 25922, INSPI- Ecuador, 2019)

Cepas de S. aureus (ATCC 25923, INSPI- Ecuador, 2019)

3.2.4.2 Métodos y técnicas

Extracción de Aceite esencial de cascara de Limón (Citrus aurantifolia)

Vapor de agua 90 °C

15 kg. De limón

Aceite esencial

Recepción materia

prima

Selección y

clasificación de la MP

Pelado

Pesado

Condensado

Decantación

Envasado

Extracción

Almacenado

Separación del agua

con el aceite

Figura 1. Diagrama de flujo de la extracción de aciete esencial de la cáscara de limón (Citrus aurantifolia) Espinel, 2020

5 kg. De cáscara

38

Procedimiento:

Recepción de la materia: Se lava la materia prima, las variedades de C.

limon.

Selección y clasificación: Se procede a seleccionar los limones que

cumplan con los requisitos para elaborar los aceites esenciales.

Pelado: Se empieza a pelar la fruta ya que solo nos va a servir el epicarpio.

Pesado: Se pesa todo el epicarpio obtenido en el pelado.

Extracción: En el primer balón de destilación se agrega agua para generar

vapor. A partir del vapor que se genera (90 °C), vamos a producir un arrastre del

vapor del aceite esencial que se encuentra en la cascara del limón, el cual va

continuar en forma de vapor hasta el tubo refrigerante.

Condensación: En el tubo refrigerante se condesa el vapor convirtiéndose

en estado líquido, consigo va a llevar el aceite. Se tendrá una mezcla de agua y

el aceite esencial de limón. En un decantador se va a separar el agua del aceite

esencial.

Envasado: Se envasa el producto en un frasco de vidrio ámbar.

Almacenado: Se lo almacena a temperatura ambiente.

Preparación del medio de cultivo agar Mac Conkey

Procedimiento

Pesar el medio, por 300 mL. de agua destilada se utiliza 15.45 g. del medio

de cultivo.

Colocar en un vaso de precipitación de litro, aforar con agua destilada hasta

completar 300ml. De agua destilada, mezclar hasta disolver.

Medir el pH 7.2 ± 0.2 a 25 °C.

Fundir en el microondas hasta que hierva (5 minutos).

39

Transferir a un Erlenmeyer de litro para colocar en el auto clave.

Autoclavar a 121 °C, 0.1 MPa por 15 minutos, dejar enfriar hasta 45 °C.

Dispensar en caja petri 20 mL por cada una.

Preparación del medio de cultivo agar Baird Parker

Procedimiento

Pesar el medio, por 300 mL. de agua destilada se utiliza 19.05 g. Del medio

de cultivo. La preparación de EYT (Egg Yolk Tellurite) se realiza para 300 mL

de agua destilada se le pone 15 g, esta preparación se le agrega en un

Erlenmeyer.

Colocar en un vaso de precipitación de litro, aforar con agua destilada hasta

completar 300 mL. De agua destilada, mezclar hasta disolver.

Medir el pH 6.8 ± 0.3 a 25 °C.

Fundir en el microondas hasta que hierva (5 minutos).

Transferir a un Erlenmeyer de litro para colocar en el auto clave.

Autoclavar a 121 °C, 0.1 MPa por 15 minutos, dejar enfriar hasta 45 °C.

Se le agrega la preparación de EYT y se lo mezcla bien.

Dispensar en caja petri 20 mL. Por cada una.

Método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por difusión

La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro se puede determinar

por varios métodos pero el método que se va a utilizar es por determinación de

sensibilidad antimicrobiana por difusión.

Preparación del Inóculo

Se esteriliza la caja Petri

Preparación del medio de cultivo y siembra la cepa, dejando incubar por 24

horas a una temperatura de 37 °C.

40

Colocar los aceites esenciales en los discos antibiograma para incluirlos en

la caja Petri para continuar con la incubación de la cepa.

Después de las 24 horas que se dejó incubar la cepa, se prepara las

diferentes concentraciones del aceite y del testigo, colocando los discos en el

cultivo.

Observar el halo de inhibición, medir el diámetro o por recuento de

microorganismos y ver resultados.

3.2.5 Análisis estadístico

Para valorar estadísticamente los efectos de los tratamientos se empleó el

análisis de varianza, cuyo esquema se indica en la Tabla 3. Los datos fueron

sometidos a pruebas de normalidad y homocedasticidad.

Tabla 3. Esquema de análisis de Varianza

Factores de Variación Grados de Libertad

Factor A (Variedades) (a-1) Factor B (Dosis) (b-1) Interacción AB (a-1) (b-1) Factorial Vs testigo 1 (f-1) Factorial vs testigo 2 (f-1) Factorial vs testigo 3 (f-1) Error experimental (ab+3) (r-1) Total tr-1

2 2 4 1 1 1

24 35

Espinel, 2020

41

4. Resultados

4.1 Extracción de los aceites esenciales

La extracción de los de aceites esenciales de las diferentes especies de C.

limon, se la trabajo por el método arrastre de vapor donde se utilizó las cortezas

de cada especie de limón con la ayuda de cantidades muy pequeñas de agua.

La corriente de vapor fue de una temperatura de entre 110 °C y 132 °C, que

arrastra de 0,1 a 1,2 % de aceite a una zona donde tiene lugar la evaporación a

muy baja presión. Se pudo observar que la extracción del aceite esencial de C.

meyeri duro 2 días, donde se extrajo 8 onzas, mientras que la especie de C.

lantifolia y C. aurantifolia, donde se extrajo 7 onzas y se demoró en su extracción

3 días.

A continuación se muestran las características físicoquímicas de los aceites

esenciales de las especie de limón bajo estudio.

Tabla 4. Resultados de los análisis fisicoquímico de los aceites esenciales

Análisis C. aurantifolia C. meyeri C. lantifolia

Índice de refracción 1,5100 1,4720 1,4760

Densidad Relativa 0,8572 0,8460 0,8462

Solubilidad en alcohol Soluble Soluble Soluble

pH 7,1 6,0 6,9

Espinel, 2019

4.2 Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la

especies de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus

Las concentraciones que mayor control inhibitorio fue de 15 µL tanto para el

aceite esencial de C. aurantifolia que presentó la mayor inhibición ante la cepa

S. aureus, mientras C. lantifolia presento mayor inhibición para E. coli.

Las mediciones de los halos presentados en los crecimientos en caja Petri son:

Tabla 5. Medición del halo bacteriano de Staphylococcus aureus en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.

42

Antibióticos Halo (mm) Aceite utilizado (15 µL) Halo (mm)

Penicilina 2.0 C. aurantifolia 2.0

Eritromicina Estreptomicina

1.0 1.0

C.lantifolia C. meyeri

1.0 1.0

Espinel, 2020

Tabla 6. Medición del halo bacteriano de Escherichia coli en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.

Antibióticos Halo (mm) Aceite utilizado (15 µL) Halo (mm) Penicilina 0 C. aurantifolia 0

Eritromicina Estreptomicina

2.0 0.25

C. lantifolia C. meyeri

1.5 0.5

Espinel, 2020

Los datos estadísticos demostrados en la Tabla 7. fueron analizados con el

programa SPSS v. 16., donde los datos estadísticos con la prueba de Tukey es

0.000 (p 0,05)

Espinel, 2020.

4.3 Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los

antibióticos comerciales

Se observo que el efecto antibacteriano de los aceites esencial C. lantifolia y

C. aurantifolia tiene un control de crecimiento bacteriano similar al de los

antibióticos, ante S. aureus y E. coli. Demostrando que es una alternativa muy

eficaz para sustituir el uso de antibióticos.

43

Tabla 8. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.

Microorganismo Aceite utilizado (15 µL)

Contaje microbiano

UFC

Antibióticos Contaje microbia

no UFC

Staphylococcus aureus

C. aurantifolia 1x10 Penicilina 10 x 10


C. lantifolia 1x10 Eritromicina 1 x 10


C. meyeri 3 x 101 Estreptomicina 1 x 103

Espinel, 2020.

Tabla 9. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos

Microorganismo

Aceite utilizado(15 µL)

Contaje microbiano

UFC

Antibióticos Contaje microbiano

UFC Escherichia coli C. aurantifolia 10x10 Penicilina 10 x 10 Escherichia coli C. lantifolia 5.0 x 10 Eritromicina 5.0 x 10 Escherichia coli C. meyeri 1.5 x 102 Estreptomicina 10 x 102

Espinel, 2020

Los datos estadísticos realizados en la Tabla 10 fueron analizados con el

programa SPSS v. 16., donde hay diferencia significativas en los resultados. Se

puede encontrar una relación más significativa entre los aceites esenciales de

“C. aurantifolia” y “C. lantifolia” y entre los antibioticos “Penicilina” (Testigo 1) y

“Estreptomisina” (Testigo 3).

Tabla 10. Contaje microbiano Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=1,20188 Error: 0,1667 gl: 24 Tratamientos Medias n E.E. T8 2,67 3 0,24 A T9 2,67 3 0,24 A Penicilina 2,33 3 0,24 A T7 2,33 3 0,24 A T6 1,00 3 0,24 B T5 1,00 3 0,24 B T1 1,00 3 0,24 B T2 1,00 3 0,24 B Eritromicina 0,67 3 0,24 B Estreptomicina0,33 3 0,24 B T4 0,00 3 0,24 B T3 0,00 3 0,24 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Espinel, 2020.

44

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil






























b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL

Factor B (Dosis)

6

30

55

80

105

Co

nte

o

C. auratifolia































b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL

Factor B (Dosis)

24

57

90

123

156

Co

nte

o

C. meyeri































b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL

Factor B (Dosis)

6

30

55

80

105

Co

nte

o

C. auratifolia

45

5. Discusión

La extracción de las diferentes especies de C. limon fueron realizados por el

método de arrastre de vapor, el cual es el método más eficaz y utilizado para la

extracción de aceites esenciales como indica la investigación de Lopez y Peredo

(2010) donde confirma que hay diferentes metodos de extracción por

disolventes, la extracción por fluidos supercitricos, por medio del uso de

microondas, entre otros, pero el mas convencional es por arrastre de vapor pero

son necesarios tiempos de extracción prolongados.

Las propiedas fisicoquimicas de los aceites esenciales o esencias son

diversas, donde los valores de estos parametros suelen variar según el tipo o

especie de materia prima, tal como lo indica Oviedo (2008). Cabe destacar que

estos valores deben estar adjuntos a los parámetros indicados por la norma ISO

855.

Las industrias de cítricos ha mostrado un crecimiento, la cual fue originada

por la gran demanda de productos a base de frutas, de acuerdo a la investigación

de Navarreta, Gil y Durango (2009), donde confirma que la producción de

productos elaborados con frutas ha conllevado a la generación de una gran

cantidad de residuos, los cuales tienen potencialidad como material de partida

para la elaboración de productos comerciales con alto valor agregado como:

aceites esenciales, aceites fijos y fibras entre otros. Este trabajo describe la

extracción y caracterización del aceite esencial de obtenido, mediante arrastre

con vapor, a partir de desechos agroindustriales. Se evaluó el efecto de la

presión de vapor, el espesor y el número de capas del material vegetal, sobre el

rendimiento y calidad del aceite esencial.

46

Se comprueba que el aceite esencial de las tres variedades de C. limon tienen

un efecto antibacteriana en menor cantidad en la bacteria E. coli, que son

bacterias Gram negativas y en mayor control en S. aureus, que son bacterias

Gram positivas, donde se demostró datos de acorde a la investigación de Argote

(2017), donde manifiesta que la capacidad antibactericida de los aceites

esenciales de eucalipto y limón, los que tuvieron mayor inhibición con las

bacterias Gram positivas y para la Gram negativa el aceite de mandarina.

El aceite esencial de C. lantifolia tuvo un mayor control contra la bacteria S.

aureus, esto se debe que esta variedad tiene mayor cantidad de monoterpenos

como el D-limoneno como indica la investigación que realizo Montero Celis

(2010), donde demuestra que el C. lantifolia es rica en monoterpenos como el D-

limoneno y por la misma naturaleza lipídica del aceite esencial, es probable que

la actividad antimicrobiana se deba a la habilidad de penetrar y romper la

estructura lipídica de la 44 pared celular de algunas bacterias, conduciendo a la

desnaturalización de las proteínas y destrucción de membranas celulares

permitiendo la salida del citoplasma, lisis celular y eventualmente muerte celular.

Las cantidades que se utilizó de los aceites fueron de 10μl y 15μl, en el cual

se demostró que tuvo mayor resultado inhibitorio fue las cantidades de 15μl como

se demuestra en la investigación de Black, Ventura, Barrera y Bautista (2017),

demoslos aceites de mayor connotación fueron el aceite de canela que inhibió el

crecimiento micelial de A. alternata, mientras que, la germinación se inhibió 100

% con la presencia de aceites de limón y epazote (0.25 y 0.5 μL∙ mL-1).

47

6. Conclusiones

Con base en los resultados obtenidos se plantean las siguientes

conclusiones:

El aceite esencial que tuvo una mayor inhibición contra S. aureus provino de

la variedad aurantifolia y el que inhibió el crecimiento de E. coli. Fue el aceite de

la variedad de lantifolia.

El aceite esencial que tuvo menor resultado inhibitorio fue el que se extrajo

de C. Meyeri tanto para E. coli, como para S. aureus.

El antibiótico (Testigo) que se observó que tuvo un mayor índice de

efectividad en E. coli, fueron los discos con penicilina y para S. aureus, fue la

Streptomicina.

En función de los resultados obtenidos y la discusión planteada se acepta la

hipótesis: “Los aceites esenciales del limón poseen actividad antibacteriana”.

48

7. Recomendaciones

Se recomienda utilizar para la extracción de aceite esencial de limón 5 kg de

cascara de de limón para obtener 7 onzas de aceite esencial.

Al analizar la efectividad de los aceites esenciales de las tres variedades de

C. limon se recomienda emplear para la inhibición de E. coli, el aceite de la

variedad C. aurantifolia (conocido como Criollo), y para S. aureus el aceite de C.

lantifolia, (conocido como limon Tahiti).

Se recomienda el uso prioritario de aceites esenciales del limon en sus

variedades C. aurantifolia y C. lantifolia, por su eficaz control frente a las

bacterias. Considerando que este compuesto yace en los ‘desechos’ -en este

caso la cáscara del limon, siendo efectiva, sin el inconveniente de que las

bacterias se vuelvan resistentes como sucede con los antibioticos.

49

8. Bibliografía

Aguilar, A., y Lopez , A. (2013). Extractos y aceite esencial del clavo de olor (

Syzygium aromaticum) y su potencial aplicación como agentes

antimicrobiano en alimentos. Puebla, Mexico: Departamento de Ingenieria

Quimica, Alimentos y Ambiental. Universidad de Puebla.

Alarcón G., Y., Trejo M., M. A., Corrales S., A., y Pascual B., S. (2015). Desarrollo

de un envase activo adicionado con aceites esenciales de cítricos para el

control de la podredumbre en fresa. Revista Iberoamericana de

Tecnología Postcosecha, 16(2), 222-227.

Alcantara, J. (2014). Extracción de aceites esenciales de la cascara de Limon

(tesis pregrado). Mexico D.F, Mexico: Instituto Politecnico Nacional.

Andrade, S., Sanchez, L., Nevárez, G., Camacho, A., y Nogueda, B. (2017).

Aceites esenciales y sus componentes como una alternativa en el control

de mosquitos vectores de enfermedades (Vol. 37). Chihuhua , Mexico:

Biomedica.

Argote, F., Suarez, S., Tobar, M., Perez , J., Hurtado, A., y Delgado, J. (2017).

Evaluacion de la capacidad inhibidora de los aceites esenciales en

Estafilococo aureo y Escherichia coli. San Juan, Colombia: Universidad

de Nariño.

Barrera, L. L., y Garcia, L. J. (2008). Actividad fungicida de aceites esenciales y

compuestos sobre el crecimeintos de Fusarium sp. aislado de Papaya.

Tlaxcala, Mexico: Centro de Desarrollo de Productos Bioticos.

Becton, D. (2014). BD Agar MacConkey Sorvitol. Heidelberg, Germania:

Dickinson and Company . Obtenido de

https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8770

50

Bejerano, R., y Suarez, L. (2015). Algunos peligros químicos y nutricionales del

consumo de los alimentos de venta en espacios publicos. (Vol. 47).

Bogota D.C, Colombia: Revista Univ Ind Santader Salud.

Benavídes, A., Cabadiana, C., y Córdova, C. (2010). Economía con mención en

Gestión Empresarial Especialización Finanzas (Tesis Pregrado).

Guayaquil, Guayas, Ecuador: Universidad ESPOL. Recuperado el 2019

Black, J., Ventura, R., Barrera , L., y Bautista, S. (2017). Caracterización química,

variabilidad composicional y modelamiento matemático del efecto de

aceites esenciales en Alternaria alternata (Vol. 35). Morelos, Mexico :

Instituto Politecnico Nacional.

Callicó, A., Cedré, B., Sifontes, S., Torres, V., Pino, Y., Callís, A., y Esnard, S.

(2004). Caracterización fenotípica y serológica de aislamientos clín

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE ... OBREGOSO...Los aceites esenciales son líquidos...

Documents

Transcript of ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE ... OBREGOSO...Los aceites esenciales son líquidos...