CRISTINA IBARRALaboratorio de Fisiopatogenia

Departamento de FisiologíaFacultad de Medicina, UBA

CONGRESO DE NEFROLOGÍA PEDIÁTRICA 21 de Junio de 2012

ACCIÓN DE LA TOXINA SHIGA EN ÓRGANOS BLANCO. ESTRATEGIAS DE PREVENCIÓN

Historia natural de la infección bacteriana

3- 4 días

90%

6 - 8 días

EHEC ingresa al organismo

resolución

1 - 2 días

10%

SUHTrombos plaquetarios en arteriolas y capilares.Anemia hemolítica microangiopática.Hipoperfusión y microinfartos en órganos.

diarrea sanguinolenta

colitis hemorrágica

diarrea acuosadolor abdominal

Subunidad A

5 Subunidades B

Gal1

Gal2

Glc

Membrana plasmática

Receptorglicolípido Gb3

Mecanismo de acción de Stx1 y Stx2

(a) Trancitosis independiente de Gb3; (b) Transporte paracelular durante la transmigración de PMN; (c) Vía Gb3 estimulado por la infección con EHEC; (d) Traslocación por las células de Paneth; (e) Traslocación por las células M.

Vías potenciales de pasaje de Stx en la barrera intestinal

Reproducido de Schuller S. Toxins 3: 626, 2011

Acción de Stx2 en la mucosa colónica humana

Stx2

Fiorito et al Dig Dis Sc 45:480, 2000Pistone et al Braz J Med Biol Res 37: 799, 2004

Stx2 produce destrucción de la mucosa con desprendimiento de células epiteliales, vaciado de células calciformes y edema. Los linfocitos y polimorfonucleares invaden y destruyen las glándulas colónicas. H&E.200×.

95% O2 5% CO2

Cámara de Ussing

cámara transductora

Colon humano

mucososeroso

Dispositivo de detección fotoeléctrico

Control Stx2, 10 ng/ml Stx2, 100 ng/ml

EHEC altera la funcionalidad e integridad del colon humano

Gerhardt et al., VTEC2012, Amsterdam, Paises Bajos

Las cepas STEC O157 y no O157 inhiben la absorción de agua a través del colon humano in vitro

STEC O157:H7 STEC O113:H21

STEC O157: H7 y O113:H21 causan similar destrucción de la mucosa intestinal con desprendimiento de células epiteliales, vaciado de células caliciformes y edema. H&E. 200×

Efectos de Stx2 y SubAB en la mucosa colónica humana

STEC O113:H21 cepa 98NK2 y sus derivadas mutadas en Stx2 o en subtilasa –SubAB-, inhiben en la misma proporción la absorción de agua a través del colon humano in vitro.

La cepa salvaje 98NK2wt y la mutada 98NK2∆subAB causan destrucción de la mucosa intestinal y edema en el corion interglandular. En cambio, la mutada 98NK2∆stx2 destruye sólo el epitelio superficial. En todos los casos hay pérdida de células caliciformes. H&E. 200×.

98NK2∆subAB 98NK2∆stx2

98NK2wtControl

factor de von Willebrand

citoqueratina Ag memb tub. distal

CERH

CEGH

contraste de fase PECAM-1 Fusión de imágenes

Cultivos primarios de células epiteliales y endoteliales renales

600 ×

200 ×

Glomérulos2° digestión

con colagenasa

Cultivo de la suspensión

celular

1° digestión con

colagenasa

Túbulos

CEGH

CERH

A- Control, 72hs B- Stx2 10ng/ml, 24hs

C- Stx2B 100ng/ml, 24hs D- Stx2B 100ng/ml, 72hs

200×

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Control Stx2 10 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 72 h

Áre

a ce

lula

r, %

Con

trol

0

20

40

60

80

100

120

Control Stx2 10 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 72 h

Núm

ero

de c

élul

as, %

Con

trol

Stx2 altera la morfología de las células les renales-CERH

Pistone et al., Microbes and Infection 8: 410, 2006

Stx2 inhibe la viabilidad celular y síntesis de proteínas y produce apoptosis

Stx2 CERH 24h

0

25

50

75

100

10-6 10-5 10-4 10-3 10-110-2 100

Stx2 (µg/ml)

Viab

ility

(%)

7.7%

G2/M

G1Control, 72 h

A

G1

G2/M

Stx2, 10 ng/ml 72 h

55.4%

Perfil de fluorescencia de CERH marcadas con ioduro de propidio

Silberstein et al Pediatric Nephrol 23: 1981, 2008

Stx2 inhibe la absorción de agua de CERH

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

20

40

60

80

100 ApoptosisNecrosis

*

Tiempo (h)C

EGH

(%)

Acción de Stx2 en cultivos primarios de CEGH

Time (h)

Apoptotic cells(%)

Necrotic cells(%)

0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1 10.0 ± 3.0 19.0 ± 6.0

2 12.0 ± 3.1 22.0 ± 4.5

4 5.2 ± 0.1 41.0 ± 15.3

6 19.0 ± 16.2 12.0 ± 3.0

24 36.1 ± 14.2 69.5 ± 25.0

Stx2, 10 ng/ml

Control200×

Stx2, 24 hsStx2, 4 hs

Amaral et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos

0

25

50

75

100

10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100

Stx2 (µg/ml)

***

Stx2 CEGH 24h

Viab

ility

(%)

Contrastes de fase Gb3 fusión de imágenes

Gb3 es localizado en la superficie de las células endoteliales por inmunocitoquímica con anti-CD77

marcado con FITC y microscopio confocal

600×

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

20

40

60

80

100ApoptosisNecrosis

*

*

Tiempo (h)

CEG

H (%

)

0

25

50

75

100

10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1

SubAB (µg/ml)

* * **

100

Viab

ility

(%)

Time (h)

Apoptotic cells(%)

Necrotic cells(%)

0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1 22.0 ± 3.3 19.0 ± 4.0

2 22.3 ± 3.0 13.5 ± 3.0

4 26.0 ± 7.0 18.5 ± 7.1

6 37.4 ± 2.5 20.0 ± 5.0

24 66.1 ± 11.5 17.0 ± 5.0

SubAB, 3 µg/ml

Control200×

Control SubAB, 6h SubAB, 24h

Acción de Subtilasa en cultivos primarios de CEGH

Inhibidores específicos de la síntesis del receptor Gb3

GlcCer (GL1) LacCer Gb3

UDP-Gluc

CeramidaGlcCer sintasa

Genz-C-9 en experimentación

Miglustat Zavesca. Actelion Pharm Lab

Inhibidores de GLCer sintasa

1R, 2R)-nonanoic acid [2-(2’,3’-dihydro-benzo [1-4]dioxin-6’-yl)-2-hydroxy-1-pyrrolidin-1-ylmethyl-ethyl]-amide-L-tartaric acid salt

N-butyldeoxynojirimycin (NBDNJ)

Aprobado por ANMAT para Enfermedad de Gaucher

C-9 inhibe la síntesis del Gb3 e impide la acción de Stx2 sobre CERH

Silberstein et al J Epith Biol Pharmacol 1: 71, 2008

C-9 impide la apoptosis de CERH y protege la proliferación celular

Velazquez et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos

C9 (µM) % Viabilidad 24 h C9

% Viabilidad24 h C9 , 24 h Stx2

0 94.0 ± 1.2 54.0 ± 1.5

0.05 80.1 ± 7.3 72.1 ± 4.3

0.5 85.0 ± 3.6 87.0 ± 10.0

1 87.5 ± 3.5 87.3 ± 7.3

5 83.2 ± 8.6 93.0 ± 8.50.00 0.05 0.50 1.00 5.00 0.00 0.05 0.50 1.00 5.000

25

50

75

100C9 + Stx2 (10ng/ml)

C9 + SubAB (3µg/ml)*

C9 (µM)

Viab

ility

(%)

Amaral et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos

Ct C90.0

0.5

1.0

1.5

Gb3

( µg/

1.1

06 CEG

H)

St Gb3 CEGH

2 µg 1 µg Ctrl + C9

ensayo enzimático

fluorométrico

Cromatografía en capa delgada

C-9 inhibe los receptores Gb3 e impide la acción de Stx2 en CEGH

0 100 200 300 500 750 10000

50

100

150MGMG + Stx2 (10ng/ml)

** * * * *

MG (µM)Vi

abili

ty (%

)

Miglustat impide la acción de Stx2 en CERH y CEGH

Amaral et al, VTEC2012, Amsterdam, Países BajosVelaquez et al. VTEC2012, Amsterdam,Paises Bajos

CERHCEGH

Ratas SD fueron inoculadas con 1-4 ml sobrenadante de cultivo de E. coli recombinante que expresa Stx2 y contiene LPS (sStx2).

LD50: 3 ml que expresa 5µg Stx2 y contiene 120 ng LPS produce una mortalidad del 50% en 48 hs.

Modelo experimental de SUH en ratas

Zotta et al, Pediatric Nephrol 23: 559, 2008

*P < 0,01 ratas controles

comparadas con ratas experimentales

Ratas controles Ratas Experimentales

Tiempo de tratamiento 24 h 48 h 24 h 48 h

Peso del animal (g) 251 ± 4 (6) 245 ± 8 (6) 257 ± 5 (6) 192 ± 4* (6)

Ingesta de comida (g) 11,9 ± 0,4 (6) 12,3 ± 0,5 (6) 9,5 ± 0,6 (6) 7,4 ± 0,8* (6)

Ingesta de agua (ml/día) 42,1 ± 1 (6) 43,0 ± 2,0 (6) 57,9 ± 8,9* (6) 20,5 ± 0,1* (6)

Volumen de orina (ml/día) 25,1 ± 4,0 (6) 19,1 ± 1,8 (6) 39,2 ± 1,0*(6) 13,0 ± 3,0 (6)

Creatinina plasmática (µmol/l) 41 ± 2 (6) 43 ± 2 (10) 98 ± 2* (6) 124 ± 1,0* (10)

Urea plasmática (mmol/l) 6,1 ± 0,2 (6) 6,4 ± 0,3 (10) 24,0 ± 2,0* (6) 31,0 ± 2,0* (10)

Clearance creatinina (ml/min) 1,0 ± 0,2 (6) 1,1 ± 0,2 (6) 0,53 ± 0,01* (6) 0,10 ± 0,02* (6)

Ratas controles Ratas Experimentales

N° plaquetas (×109/l) 84 ± 0,2 (10) 33 ± 0,3* (10)

N° leucocitos (×109/l) 7,3 ± 0,1 (10) 11,2 ± 0,2* (10)

Hb (mg/100 ml) 14,5 ± 1,3 (10) 9,7 ± 2,0* (10)

Hto (%) 41,3 ± 2,6 (10) 21 ± 5* (10)

LDH (U/l) 308 ± 102 (4) 9736 ± 95* (4)

Parámetros fisiológicos en ratas con SUH

Daños histológicos en riñón

Necrosis glomerular y tubular, trombos capilares y re-duplicación de la membrana basal. 1000×.

H&E JMS

H&fosfotúngstica Control

* * *

Control

Inmunolocalización de Stx2 en riñón

Inmunolocalización de la toxina en membrana basal y citoplasma de túbulos renales y mesangio glomerular

Acción del C-9 en el modelo de SUH en ratas

Silberstein et al. Pediatric Res 69: 390, 2011.

- 2d -1d 0 1d 2d

Genz-C-9 oral10-15 mg/día/rata

Stx2

sacrificio para estudios de

órganos

sobrevivencia

C-9 evita la insuficiencia renal aguda

Control 1 día Stx2C-9 administrado 2 días antes

y 1 día después de Stx2

C-9 evita los daños histológicos producidos por Stx2

La mortalidad por Stx2 disminuye por previa incubación con Genz-C-9

- 2 - 1 + 1 + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 +70

IngestaDiarrea

Resolución espontánea ~ 85%

SUH ~ 15%

Ventana para intervenir

PREVENIR LA INFECCION POR STEC

La progresión de la infección por STEC en niños

Laboratorio de Fisiopatogenia

Investigadores

María Marta Amaral, Dra Cs BiológicaClaudia Silberstein, Dra Cs FisiológicasElsa Zotta, Dra Medicina

Doctorandos

Elizabeth Gerhardt, Lic Cs BiológicasFederico Ochoa, médicoNatalia Velazquez, Lic. Cs Biológicas

Colaboradores

Dr Horacio A RepettoDepto Pediatría, Facultad de Medicina, UBA

Dra Marta Rivas, Sección Fisipatogenia, ANLS-Malbrán

Dr Mariano Gimenez, Hospital de Clínicas, UBA

Dr James PatonUniversidad de Adelaida, Australia

Asociación Lucha contra el Síndrome Urémico Hemolítico –LuSUH-: www.lusuh.org.arLatin American Coalition for Escherichia coli Research –LACER-: http://microbiology.utmb.edu/lacer/index.html

Agradecimientos